CN108409848A - 丝胶蛋白多肽的制备方法及其应用 - Google Patents

丝胶蛋白多肽的制备方法及其应用 Download PDF

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CN108409848A CN201810190390.1A CN201810190390A CN108409848A CN 108409848 A CN108409848 A CN 108409848A CN 201810190390 A CN201810190390 A CN 201810190390A CN 108409848 A CN108409848 A CN 108409848A
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徐水
吴婷芳
成国涛
钟红荣
朱勇
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Abstract

本发明属于来自动物的在未确定或仅部分确定的序列中含有最多20个氨基酸的肽技术领域，具体涉及一种丝胶蛋白多肽的制备方法。所述丝胶蛋白多肽的制备方法，包括丝胶粗溶液制备、丝胶溶液的提取和丝胶蛋白多肽粉的制备；所述丝胶溶液的提取具体为用无水乙醇提取丝胶粗溶液中的丝胶蛋白，然后搅拌、静置、离心。该方法制得的丝胶蛋白多肽的纯度高，氨基酸含量总量可达96.305％‑96.309％。该方法制得的丝胶蛋白的分子量小，分子量分布宽；亲水性好；抗氧化性能优异；热稳定性好；抗菌性能优异。

Description

丝胶蛋白多肽的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于来自动物的在未确定或仅部分确定的序列中含有最多20个氨基酸的肽技术领域，具体涉及一种丝胶蛋白多肽的制备方法及其应用。
背景技术
丝胶蛋白是蚕丝中包覆在丝素外围，性状与动物胶相似，对丝素起保护和胶粘作用的一种球状蛋白，相对分子量为114-3114万Da，由18种氨基酸组成，其中的甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及酪氨酸具有药理作用、保健功能和很高的营养价值；同时，丝胶蛋白还具有良好的吸放湿性、抗氧化性、紫外线吸收性、黏着性等(“用高温高压水精练蚕丝及冻结解冻法回收丝胶的研究”，林俊雄等，蚕业科学，2004年第30卷第3期，第280-284页，公开日2004年12月31日；“丝胶蛋白粉的制备及其物理性质初探”，代君君等，畜牧兽医科学，2008年第24卷第4期，第16-18页，公开日2008年12月31日)。因此，丝胶蛋白在化妆品、医药生物材料、功能材料、食品及饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。
然而，现有方法制得的丝胶蛋白的纯度低；同时，分子量大，不能用于化妆品和护肤品。
发明内容
有鉴于此，本发明的日的在于提供一种丝胶蛋白多肽的制备方法，该方法制得的丝胶蛋白多肽的纯度高，分子量小，能够用于化妆品和护肤品。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
丝胶蛋白多肽的制备方法，包括丝胶粗溶液制备、丝胶溶液的提取和丝胶蛋白多肽粉的制备；所述丝胶溶液的提取具体为用无水乙醇提取丝胶粗溶液中的丝胶蛋白，然后搅拌、静置、离心。
进一步，所述丝胶粗溶液与无水乙醇的体积比为1∶3。
进一步，所述丝胶溶液提取的次数为2次。
进一步，所述搅拌具体为于温度为22-25℃、转速为180-220转/min条件下搅拌6-8h。
进一步，所述静置时间为30-60min。
进一步，所述离心过程的转速为6000-8000转/min，时间为20-30min。
进一步，所述丝胶粗溶液制备具体为：取蚕茧，将外层茧衣去掉，剪碎，搓洗，洗净、拧干；用沸水脱胶，待去离子水沸腾后，加入拧干的蚕茧，脱胶1h，结束后，将液体先用12层纱布过滤，取出丝素蛋白用去离子水缓慢冲洗丝素蛋白，把表面的丝胶蛋白洗脱下来，用12层纱布过滤，上述的丝素蛋白按照上述步骤再脱胶一次，收取两次脱胶的液体，即为丝胶粗溶液。
进一步，所述拧干的程度为拧干至不滴水为止。
进一步，所述脱胶过程中，蚕茧与去离子水的质量比为1∶100。
进一步，所述丝胶蛋白多肽粉的制备具体为：将提取得到的丝胶溶液，置于培养皿中，表面用一次性保鲜膜盖住，保鲜膜用注射器扎有小孔，然后冷冻干燥。
进一步，所述冷冻干燥具体为先于-20℃温度下处理6-8h，再在-80℃温度下处理10-12h，然后于-50℃温度下真空处理48h。
所述真空是指系统压力小于100微米汞柱。
本发明的目的还在于保护所述方法制得的丝胶蛋白多肽在制备化妆品和护肤品中的应用。
附图说明
图1为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的分子量分布图，M为标准带，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的分子量分布；
图2为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的氨基酸组成分析图，其中，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的氨基酸组成分析；
图3为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的保湿性能测试结果图，其中，1％glycerine为甘油对照组，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的保湿性能测试结果；
图4为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率测试结果图，其中，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率测试结果；
图5为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的IC50测试结果图，其中，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的IC50测试结果；
图6为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的DSC(DifferentialScanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线，其中，Tcpcrature curve为温度曲线，A为对比例1制得的丝胶蛋白多肽的DSC(Differential Scanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线图，B为实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的DSC(DifferentialScanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线图，T0为溶解温度，Tp为结晶温度，Tc为熔融温度；
图7为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的大肠杆菌生长曲线图，其中，control为对照组，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的大肠杆菌生长曲线；
图8为实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的金黄色葡萄球菌生长曲线图，control为对照组，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的金黄色葡萄球菌生长曲线。
本发明的有益效果在于：
该方法制得的丝胶蛋白多肽的纯度高，氨基酸含量总量可达96.305％-96.309％。
该方法制得的丝胶蛋白的分子量小，分子量分布宽，在42.7kDa-97.4kDa呈密集连续分布，能够用于化妆品和护肤品。
该方法制得的丝胶蛋白多肽的亲水性好，其极性侧链氨基酸丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸和酪氨酸的含量高，达89.25％。
该方法制得的丝胶蛋白多肽抗氧化性能优异，对DPPH自由基的清除能力好，对DPPH自由基的IC50为0.7440mg/mL，质量浓度为1.2mg/mL时对DPPH自由基的清除率可达62.12％。
该方法制得的丝胶蛋白多肽保湿性能良好。
该方法制得的丝胶蛋白多肽热稳定性好。
该方法制得的丝胶蛋白多肽抗菌性能优异。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
丝胶蛋白多肽的制备方法，按照以下步骤进行：
A.丝胶蛋白粗溶液的制备：
取蚕茧剪成1cm2碎片，用去离子水反复搓洗3次，将表面的灰尘去掉，经沸水脱胶2次后取脱胶液，离心过滤，得到丝胶蛋白粗溶液，立刻进行下一步实验；
B.丝胶蛋白精溶液的制备：
在烧杯中倒入丝胶蛋白粗溶液，将无水乙醇缓慢加入丝胶蛋白粗溶液中，丝胶蛋白粗溶液和无水乙醇的体积比为1∶3，然后放于磁力搅拌器上22℃、180rpm/min搅拌6h，使蛋白质充分沉淀，静置30min后，丝胶蛋白多肽沉淀在溶液底部，用注射器轻轻把溶液上半部分的澄清液吸出，然后于离心机中6000rpm/min离心20min后，取沉淀溶于水，此时得到丝胶蛋白溶液，再将该丝胶蛋白溶液倒入烧杯中，将无水乙醇缓慢加入丝胶蛋白粗溶液中，丝胶蛋白粗溶液和无水乙醇的体积比为1∶3，然后放于磁力搅拌器上22℃、180rpm/min搅拌6h，使蛋白质充分沉淀，静置30min后，丝胶蛋白多肽沉淀在溶液底部，用注射器轻轻把溶液上半部分的澄清液吸出，然后于离心机中6000rpm/min离心20min后，得到的沉淀即为提取的丝胶溶液；
C.丝胶蛋白多肽粉的制备
将步骤B提取得到的丝胶溶液，倒入直径为60mm的一次性培养皿中，表面用一次性保鲜膜盖住，保鲜膜用注射器扎有小孔，先于-20℃温度下处理6h，然后于-80℃温度下处理12h，随后于温度为-50℃、压力为60μm汞柱条件下处理48h，再用自封袋装好后，放入干燥器中。
实施例2
丝胶蛋白多肽的制备方法，按照以下步骤进行：
A.丝胶蛋白粗溶液的制备：
取蚕茧剪成1cm2碎片，用去离子水反复搓洗3次，将表面的灰尘去掉，经沸水脱胶2次后取脱胶液，离心过滤，得到丝胶蛋白粗溶液，立刻进行下一步实验；
B.丝胶蛋白精溶液的制备：
在烧杯中倒入丝胶蛋白粗溶液，将无水乙醇缓慢加入丝胶蛋白粗溶液中，丝胶蛋白粗溶液和无水乙醇的体积比为1∶3，然后放于磁力搅拌器上25℃、220rpm/min搅拌8h，使蛋白质充分沉淀，静置60min后，丝胶蛋白多肽沉淀在溶液底部，用注射器轻轻把溶液上半部分的澄清液吸出，然后于离心机中8000rpm/min离心30min后，取沉淀溶于水，此时得到丝胶蛋白溶液，再将该丝胶蛋白溶液倒入烧杯中，将无水乙醇缓慢加入丝胶蛋白粗溶液中，丝胶蛋白粗溶液和无水乙醇的体积比为1∶3，然后放于磁力搅拌器上25℃、220rpm/min搅拌8h，使蛋白质充分沉淀，静置60min后，丝胶蛋白多肽沉淀在溶液底部，用注射器轻轻把溶液上半部分的澄清液吸出，然后于离心机中8000rpm/min离心30min后，得到的沉淀即为提取的丝胶溶液；
C.丝胶蛋白多肽粉的制备
将步骤B提取得到的丝胶溶液，倒入直径为60mm的一次性培养皿中，表面用一次性保鲜膜盖住，保鲜膜用注射器扎有小孔，先于-20℃温度下处理8h，然后于-80℃温度下处理10h，随后于温度为-50℃、压力为30μm汞柱条件下处理48h，再用自封袋装好后，放入干燥器中。
对比例1
丝胶蛋白多肽的制备方法，按照以下步骤进行：
A.丝胶蛋白粗溶液的制备：
取蚕茧剪成1cm2碎片，用去离子水反复搓洗3次，将表面的灰尘去掉，经沸水脱胶2次后取脱胶液，离心过滤，得到丝胶蛋白粗溶液，立刻进行下一步实验；
B.丝胶蛋白多肽粉的制备
将步骤A得到的丝胶蛋白粗溶液，倒入直径为60mm的一次性培养皿中，表面用一次性保鲜膜盖住，保鲜膜用注射器扎有小孔，先于-20℃温度下处理7h，然后于-80℃温度下处理11h，随后于温度为-50℃、压力为60μm汞柱条件下处理48h，再用自封袋装好后，放入干燥器中。
性能检测
对实施例1、实施例2和对比例1制得的丝胶蛋白多肽进行分子量分布分析、氨基酸组成分析、保湿性能测试、清除DPPH自由基能力测试、热稳定性测试和抗菌性能测试，
其中，丝胶蛋白多肽的分子量分布情况是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测试的，电泳条件为：12wt％分离胶，5wt％浓缩胶；先80V衡压0.5h，再120V衡压1h，用考马斯亮蓝R250染色40min，脱色液脱色1h后，换脱色液，2h后，再换脱色液过夜；其结果图1所示，M为标准带，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的分子量分布；
氨基酸组成分析的测试方法为：用日立L-8800型全自动氨基酸分析仪对丝胶蛋白多肽粉的氨基酸组成进行分析，具体参数为：一个样品分析周期53min，配有(1)分离柱：(4.6mm×60mm)洗脱液流速0.4mL/min，柱温700C，柱压11.627MPa；(2)反应柱：茚三酮及茚三酮缓冲液流速0.35mL/min，柱温1350C，柱压1.078MPa；其结果图2所示，其中A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的氨基酸组成分析；
保湿性能的测试方法为：以甘油为参照物，测试在一定温湿度下丝胶蛋白酶解产物的保湿性能，分别取待测样品配制成水溶液，称取3g置于30mm培养皿上，放入人工培养箱中，温度22℃，湿度50％的条件下进行保湿试验，每隔2h取出称量皿称量，每个样品平行测定7次，以其平均值作为最终测试结果；根据以下公式计算其保湿率：
保湿率＝m2/m1×100％；
式中：m1为放置前样品的质量；m2为放置后样品的质量；
其结果如图3所示，其中，1％glycerine为甘油对照组，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的保湿性能测试结果；
清除DPPH自由基能力的测试方法为：以无水乙醇为溶剂，配制浓度为1×10-4mol/L的DPPH溶液，置于棕色瓶中避光保存，将丝胶蛋白及酶解产物溶液稀释成不同浓度梯度后分别作为待测样品备用；同时，配制不同浓度的抗环血酸溶液，作为阳性对照；取2mL待测样品于10mL离心管中，加入2mL DPPH溶液，混匀后避光静置30min，10000r/min离心5min，取上清液于517nm处测其吸光度D1；另取2mL待测样品于10mL离心管中，加入2mL无水乙醇，混匀后避光静置30min，10000r/min离心5min，取上清液于517nm处测其吸光度D2；再取2mL DPPH溶液于10mL离心管中，加入2mL无水乙醇，混匀后避光静置30min，10000r/min离心5min，取上清液于517nm处测其吸光度D0；
按照以下公式计算待测样品对DPPH自由基的清除率，每个样品平行测定3次，以其平均值作为最终测试结果：
清除率＝[1-(D1-D2)/D0]×100％；
式中：D0为DPPH无水乙醇溶液+无水乙醇的吸光度；
D1为待测样品液+DPPH无水乙醇溶液的吸光度；
D2为待测样品液+无水乙醇的吸光度；
其结果如图4和图5所示；其中，图4为丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率测试结果图，其中，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率测试结果；图5为丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的IC50测试结果图，其中，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的IC50测试结果；
热稳定性的测试方法为：丝胶蛋白多肽研磨成细粉，过筛后，37℃干燥3天采用HSC-1型DSC，在10mL/min的氮气氛围下，在30-350℃范围内测试丝胶蛋白多肽的DSC(Differential Scanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线，升降温速率均为10℃/min，其结果如图6所示，其中，Tcpcrature curve为温度曲线，A为对比例1制得的丝胶蛋白多肽的DSC(Differential Scanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线图，B为实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的DSC(Differential Scanning Calorimeter，即示差扫描量热法)曲线图(实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的DSC曲线发生重合)；T0为溶解温度，Tp为结晶温度，Tc为熔融温度；
抗菌性能的测试方法为：将培养至对数期(6-8h)的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(8-10h)用LB培养基稀释至107CFU/mL，取1mL稀释好的菌液加入到20mL新鲜的加有实施例1和对比例1制得的丝胶蛋白多肽的LB培养基中，同时设置对照组(以下简称control，未添加丝胶蛋白多肽的LB培养基)，每个组重复三次，以其平均值作为最终测试结果；将其于37℃、210rpm/min条件下培养，每隔两小时取样200uL，用酶标仪在595nm下测其吸光值，绘制生长曲线，其结果如图7和图8所示，其中，图7为大肠杆菌生长曲线图，control为对照组，A、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的大肠杆菌生长曲线；图8为金黄色葡萄球菌生长曲线图，其中，control为对照组，Λ、B1和B2分别为对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的金黄色葡萄球菌生长曲线；吸光值的大小直接反应菌的活性，吸光值越小，活性越差，菌数量越少，抗菌性能越好。
由图1可知，对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽均在42.7kDa-97.4kDa呈密集连续分布，甚至高于97.4kDa有条带出现；即沸水提取的丝胶蛋白和乙醇提取的丝胶蛋白的分子量是相近的，分子量分布广泛。
由图2可知，对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的极性侧链氨基酸均占总量的88％以上，其中丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸和酪氨酸的含量较高。每100g对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽中氨基酸含量分别为79.334g、96.309g和96.305g。由此证明，本发明所述方法制得的丝胶蛋白多肽的纯度较高。
由图3可知，在0-12h的时间范围内，1wt％浓度条件下，4个组别的样品的保湿性与浓度呈正相关关系，实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的保湿性优于对比例1；在0-6h，实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的保湿性基本与甘油一致，而对比例1制得的丝胶蛋白多肽的保湿性基本在2h以后就比实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的保湿性小。
由图4可知，抗坏血酸(AA)、对比例1制得的丝胶蛋白溶液(A)、实施例1制得的丝胶蛋白溶液(B1)和实施例2制得的丝胶蛋白溶液(B2)对DPPH自由基的清除能力的回归系数分别是0.9834、0.9814、0.9944和0.9944。由此证明，抗坏血酸(AA)、对比例1制得的丝胶蛋白溶液(A)和实施例制得的丝胶蛋白溶液(B)对DPPH自由基的清除效果依次增强。与对比例1制得的丝胶蛋白多肽相比，实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除能力明显较强，在质量浓度为1.2mg/mL时，实施例1制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率达到62.12％；而对比例1制得的丝胶蛋白多肽对DPPH自由基的清除率则仅为42.29％。在质量浓度大于1.6mg/mL时，二者对DPPH的清除率增加趋于平缓。
由图5可知，抗坏血酸(AA)、对比例1制得的丝胶蛋白溶液(A)、实施例1制得的丝胶蛋白溶液(B1)和实施例2制得的丝胶蛋白溶液(B2)对DPPH自由基的IC50(清除50％自由基时所需的样品浓度)分别为0.0023mg/mL、1.3283mg/mL、0.7440mg/mL和0.7440mg/mL。由此证明，对比例1制得的丝胶蛋白溶液、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白溶液均有清除DPPH自由基的能力。
由图6可知，对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽分别在107.7℃、91.2℃和91.2℃出现吸热峰，丝胶蛋白多肽吸热分解，随着温度的升高，分子发生结构重组，形成稳定的结构；对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽分别在318.6℃、321.6℃和321.6℃出现结晶峰，再随温度的升高，发生熔融。由此证明，实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的热稳定性明显优于对比例1。
由图7和图8可知，对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抗菌作用，随着培养时间的增加，添加对比例1、实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽的LB培养基培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线均在对照组的下方。但两种菌的生长曲线有区别，实施例1和实施例2制得的丝胶蛋白多肽对大肠杆菌的生长抑制作用相比金黄色葡萄球菌的生长抑制作用更明显。由此证明，本发明所述方法制得的丝胶蛋白多肽均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抗菌作用。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.丝胶蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包括丝胶粗溶液制备、丝胶溶液的提取和丝胶蛋白多肽粉的制备；所述丝胶溶液的提取具体为用无水乙醇提取丝胶粗溶液中的丝胶蛋白，然后搅拌、静置、离心。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述丝胶粗溶液与无水乙醇的体积比为1∶3。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌具体为于温度为22-25℃、转速为180-220转/min条件下搅拌6-8h。
4.根据权利要求1、2或3所述的制备方法，其特征在于，所述静置时间为30-60min。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的制备方法，其特征在于，所述离心过程的转速为6000-8000转/min，时间为20-30min。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的制备方法，其特征在于，所述丝胶粗溶液制备具体为：取蚕茧，将外层茧衣去掉，剪碎，搓洗，洗净、拧干；用沸水脱胶，待去离子水沸腾后，加入拧干的蚕茧，脱胶1h，结束后，将液体先用12层纱布过滤，取出丝素蛋白用去离子水缓慢冲洗丝素蛋白，把表面的丝胶蛋白洗脱下来，用12层纱布过滤，上述的丝素蛋白按照上述步骤再脱胶一次，收取两次脱胶的液体，即为丝胶粗溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脱胶过程中，蚕茧与去离子水的质量比为1∶100。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的制备方法，其特征在于，所述丝胶蛋白多肽粉的制备具体为：将提取得到的丝胶溶液，置于培养皿中，表面用一次性保鲜膜盖住，保鲜膜用注射器扎孔，然后冷冻干燥。
9.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥具体为先于-20℃温度下处理6-8h，再在-80℃温度下处理10-12h，然后于-50℃温度下真空处理48h。
10.权利要求1-9任一项所述方法制得的丝胶蛋白多肽在制备化妆及护肤品中的应用。
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