CN109438222B - 一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 - Google Patents
一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109438222B CN109438222B CN201811392831.2A CN201811392831A CN109438222B CN 109438222 B CN109438222 B CN 109438222B CN 201811392831 A CN201811392831 A CN 201811392831A CN 109438222 B CN109438222 B CN 109438222B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- silica gel
- component
- methanol
- sample
- gradient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 title claims abstract description 21
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 183
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 92
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 92
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 92
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 52
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 30
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 30
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 27
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 22
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 20
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 8
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 8
- 238000009738 saturating Methods 0.000 claims description 8
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 7
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 6
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N Ethyl hydrogen sulfate Chemical compound CCOS(O)(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 claims description 3
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 8
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- ROAYSRAUMPWBQX-UHFFFAOYSA-N ethanol;sulfuric acid Chemical compound CCO.OS(O)(=O)=O ROAYSRAUMPWBQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- LWQAYTWMEQUUFP-UHFFFAOYSA-K [K].I[Bi](I)I Chemical compound [K].I[Bi](I)I LWQAYTWMEQUUFP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- ONBIUAZBGHXJDM-UHFFFAOYSA-J bismuth;potassium;tetraiodide Chemical compound [K+].[I-].[I-].[I-].[I-].[Bi+3] ONBIUAZBGHXJDM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- SVTBKBTZCWQLGX-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)C1=CC=C(O)C=C1 SVTBKBTZCWQLGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- HWSISDHAHRVNMT-UHFFFAOYSA-N Bismuth subnitrate Chemical compound O[NH+]([O-])O[Bi](O[N+]([O-])=O)O[N+]([O-])=O HWSISDHAHRVNMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORGPJDKNYMVLFL-UHFFFAOYSA-N Coumalic acid Chemical compound OC(=O)C=1C=CC(=O)OC=1 ORGPJDKNYMVLFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000628997 Flos Species 0.000 description 1
- 241000737253 Lygodium japonicum Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000001659 Oldenlandia diffusa Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001482 bismuth subnitrate Drugs 0.000 description 1
- 230000002279 cholagogic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015177 dried meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-N trans-4-coumaric acid Chemical class OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C51/47—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从螺旋藻中制备4‑羟基肉桂酸的方法，包括以下步骤：步骤一、甲醇粗提物浸膏的制备；步骤二、甲醇粗提物浸膏分离出组分T1，步骤三、组分T1分离出组分A和组分B；步骤四、组分A分离纯化出组分A1，组分B分离纯化出组分B11：步骤五、组分A1分离纯化出化合物X，组分B11分离纯化出化合物Y；步骤六、结构鉴定出化合物X为4‑羟基肉桂酸，即制得4‑羟基肉桂酸。本发明通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4‑羟基肉桂酸，提供了从螺旋藻中分离到了4‑羟基肉桂酸的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及4-羟基肉桂酸提取的技术领域，尤其涉及一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法。
背景技术
4-羟基肉桂酸(Coumalic acid)，化学名称为对-羟基肉桂酸，又名对4-羟基肉桂酸、4-羟基苯丙烯酸，属于羟基肉桂酸类化合物中最主要的一种，在自然界植物中广泛存在，主要分布在禾本科植物的茎干中，豆科植物含量居多，可从海金沙、白花蛇舌草等植物中提取得到。大量研究表明，4-羟基肉桂酸具有良好的生物活性，具有抗氧化、抑菌和抗病毒作用。此外，毒理学实验表明4-羟基肉桂酸还具有利胆功能，其安全范围广，作用缓和持久，临床适用于胆囊及胆道功能失调，广泛应用于医药、食品、日用品、饲料等领域。
螺旋藻为原核生物，属于蓝藻的一种，其营养成分均衡，具有蛋白含量高、脂肪和胆固醇含量低的特点，其粗提取物还可以用作开发抗癌药物的来源。螺旋藻中含有多种生物活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫力、抗衰老、降血脂、降血糖等功能，已成为当下研究的热点。目前国内外文献中关于从螺旋藻中提取得到4-羟基肉桂酸的研究仍鲜见报道。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4-羟基肉桂酸，本发明提供了从螺旋藻中分离到了4-羟基肉桂酸的新方法。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其包括以下步骤：
步骤一、称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4h，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏；
步骤二、将甲醇粗提物浸膏用硅胶粉干法拌样，上含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离；
步骤三、组分T1用适量甲醇溶解后，上含170g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B；
步骤四、组分A的分离纯化：组分A加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分A1；组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11；
步骤五：组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y；
步骤六、将化合物X和化合物Y称重，化合物X为3.3mg，化合物Y为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃；将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物A的核磁谱，经过对核磁谱的数据解析，得知化合物X为4-羟基肉桂酸，即制得4-羟基肉桂酸。
根据本发明的实施例，采用上述技术方案后，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4-羟基肉桂酸；相比于现有的4-羟基肉桂酸的提取方法，简化了提取工艺，降低了从螺旋藻中提取4-羟基肉桂酸的难度，为从螺旋藻中提取4-羟基肉桂酸提供了新方法。
作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
(1)硅胶粉活化
取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
(2)拌样
按照样品：硅胶粉＝1:1.2向干净的圆底烧瓶中加入硅胶粉，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀松散状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
(3)装柱
采用湿法装柱，称取1.8g硅胶用石油醚饱和后装柱；
(4)上样
采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液。
作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装石油醚：丙酮为5:1的展开剂的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪、碘显色剂和5％硫酸乙醇显色剂分别显色。
附图说明
图1是本发明化合物X的薄层层析结果；
图2是本发明化合物Y的薄层层析结果；；
图3是本发明化合物X的结构图；
图4是本发明化合物X的1H-NMR的核磁共振谱图；
图5是本发明化合物X的13C-NMR核磁共振谱图。
具体实施方式
本发明所使用的仪器设备如下表1所示：
表1实验用主要仪器和生产厂家
本发明所使用的主要试剂及药品如下表2所示：
表2实验用主要的试剂和药品
本发明所使用的显色试剂的配制：
(1)碘显色试剂：碘粒与硅胶混合比例约1:3，即10g碘粒配30g硅胶粉，配大约500ml的玻璃缸半瓶，充分的摇匀使碘蒸汽充满瓶体。
(2)5％硫酸乙醇溶液：取25ml浓硫酸加入到500ml无水乙醇中，混匀。
(3)碘化铋钾：甲液：8.35g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。乙液：8g碘化钾溶于20ml水中。两者等量混合，可长时间保存。用于生物碱显色剂时，取混合液1ml与冰醋酸2ml、水10ml混合。
实施例
本发明揭示了一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其包括以下步骤：
粗提浸膏的制备：
称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4h，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，每次先用滤纸抽滤萃取液，旋蒸仪蒸发除去溶剂。甲醇复溶，用0.5微米的膜再次抽滤除去不溶物；合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏85g。
甲醇粗提物浸膏的分离纯化：
取12.86g甲醇粗提物浸膏用硅胶粉(200-300目)干法拌样，拌至呈肉松状松散，上预先处理好的含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；将各个梯度的组分旋蒸浓缩后，分别用薄层层析TLC分析，层析展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，用紫外分析仪、碘显色、5％硫酸乙醇、碘化铋钾分别显色，比较不同显色方法的情况差异；合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2通过交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱(根据样品的量确定所用填料体积层析柱)分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离。
组分T1的分离纯化：
将组分T1(3.81g)用适量甲醇溶解后，上预先处理好的含170g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，层析展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，显色，根据紫外、碘、5％硫酸乙醇以及碘化铋钾的显色情况；合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B。
组分A和组分B的分离纯化：
组分A的分离纯化：将组分A(110mg)加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，显色，因为前两次过柱子显色时碘化铋钾没有明显差异，故后面的柱子都只使用紫外显色、碘显色、5％硫酸乙醇显色；合并相似组分，标记为组分A1。
组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11。
组分A1和组分B11的分离纯化：
组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；
组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y。
另外，本发明所采用的TLC分析是将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。
化合物的结构鉴定：
首先用重铬酸钾浸泡核磁管，浸泡12h后，甩出重铬酸钾溶液再用甲醇清洗，若甲醇洗不干净再用三氯甲烷来洗，洗干净后再用色谱级的甲醇润洗几遍，核磁管洗完后吹干称其重量，将样品用氘代甲醇溶解吸入核磁管，然后用滤纸封口放在蒸发瓶真空减压蒸干溶剂，再称其重量，通过差量法可知最后检测的化合物X的重量为3.3mg，最后采用“400MHz-NMR”测定化合物的核磁谱。化合物Y的重量为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃。
将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物X的核磁谱，化合物X核磁谱数据如表1所示。
表1化合物X的核磁谱数据
进行质谱测定后可知化合物X的ESI-MS：m/z＝165.58，综合化合物X的核磁谱数据以及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物X为4-羟基肉桂酸(C9H8O3，分子量为164.58))，其结构如图2所示。化合物4-羟基肉桂酸的1H-NMR、13C-NMR核磁共振谱图如图3及图4所示。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4小时，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4小时，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏；
步骤二、将甲醇粗提物浸膏用硅胶粉干法拌样，上含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离；
步骤三、组分T1用适量甲醇溶解后，上含170g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B；
步骤四、组分A的分离纯化：组分A加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分A1；组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11；
步骤五：组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y；
步骤六、将化合物X和化合物Y称重，化合物X为3.3mg，化合物Y为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃；将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物A的核磁谱，经过对核磁谱的数据解析，得知化合物X为4-羟基肉桂酸，即制得4-羟基肉桂酸。
2.如权利要求1所述的一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
(1)硅胶粉活化
取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
(2)拌样
按照样品：硅胶粉＝1:1.2向干净的圆底烧瓶中加入硅胶粉，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀松散状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
(3)装柱
采用湿法装柱，称取1.8g硅胶用石油醚饱和后装柱；
(4)上样
采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液。
3.如权利要求2所述的一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装石油醚：丙酮为5:1的展开剂的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪、碘显色剂和5％硫酸乙醇显色剂分别显色。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811392831.2A CN109438222B (zh) | 2018-11-21 | 2018-11-21 | 一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811392831.2A CN109438222B (zh) | 2018-11-21 | 2018-11-21 | 一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109438222A CN109438222A (zh) | 2019-03-08 |
| CN109438222B true CN109438222B (zh) | 2021-08-31 |
Family
ID=65553410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811392831.2A Active CN109438222B (zh) | 2018-11-21 | 2018-11-21 | 一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109438222B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1562943A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-01-12 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种水华蓝藻提取γ－亚油酸的方法 |
| CN101781191A (zh) * | 2009-12-04 | 2010-07-21 | 朱秋娅 | 对羟基肉桂酸的制备方法 |
| CN103553902A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-02-05 | 陕西源邦生物技术有限公司 | 一种米糠来源的天然阿魏酸的制备方法 |
| CN108358772A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-08-03 | 湖北工业大学 | 一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法及其应用 |
-
2018
- 2018-11-21 CN CN201811392831.2A patent/CN109438222B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1562943A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-01-12 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种水华蓝藻提取γ－亚油酸的方法 |
| CN101781191A (zh) * | 2009-12-04 | 2010-07-21 | 朱秋娅 | 对羟基肉桂酸的制备方法 |
| CN103553902A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-02-05 | 陕西源邦生物技术有限公司 | 一种米糠来源的天然阿魏酸的制备方法 |
| CN108358772A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-08-03 | 湖北工业大学 | 一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Inhibition of Enzymatic and Oxidative Processes by Phenolic Extracts from Spirulina sp. and Nannochloropsis sp.;Priscila Tessmer Scaglioni等;《Food Technol.Biotechnol.》;20180930;第56卷(第3期);第344-353页 * |
| Isolation, identification, and inhibitory enzyme activity of phenolic substances present in Spirulina;Jian Li等;《Journal of food biochemistry》;20200705;第44卷(第9期);第1-9页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109438222A (zh) | 2019-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104897843B (zh) | 一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法 | |
| CN107505427B (zh) | 一种中药材掌叶大黄的薄层色谱检测方法 | |
| CN107823237A (zh) | 一种牛蒡根总黄酮的提取方法 | |
| Dobson | Analysis of flower and pollen volatiles | |
| CN104458975A (zh) | 一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法 | |
| CN102590212A (zh) | 九味竺黄制剂的检测方法 | |
| CN109438222B (zh) | 一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法 | |
| CN114478521A (zh) | 喹诺里西啶类生物碱及其制备方法和用途 | |
| CN114516893B (zh) | 罗汉果新黄酮类化合物、其制备方法及在蜜蜂引诱剂中的应用 | |
| CN111308032A (zh) | 一种小罗伞药材的质量控制方法 | |
| Turner et al. | Effects of sample treatment on chromatographic analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L.(Cannabaceae) | |
| CN109912582A (zh) | 从芒果叶中提取芒果苷的方法 | |
| CN109776515A (zh) | 从扁桃叶中提取芒果苷的方法 | |
| Sjödin et al. | Effects of toxic metabolites produced by Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. on protoplasts, cells and plants of hosts and non-hosts of the pathogen | |
| CN110028531B (zh) | 一种从土壤中提取分离黄酮类物质的方法 | |
| CN103933125A (zh) | 连翘中抗肿瘤活性物质的提取方法及其产品和应用 | |
| Zeevaart | Gibberellin-like substances in Bryophyllum daigremontianum and the distribution and persistence of applied gibberellin A 3 | |
| CN113466385A (zh) | 垫状卷柏总黄酮提取制备及hplc指纹图谱检测方法 | |
| CN114617913A (zh) | 一种黄芪茎叶总皂苷的提取分离纯化方法 | |
| CN101780130A (zh) | 一种亳菊花的工业提取方法 | |
| CN110432262A (zh) | 一种植物腊叶标本的制备及保存方法 | |
| CN116491526B (zh) | 二月兰的杀螨用途、防治朱砂叶螨用途及其杀螨剂 | |
| CN112666302A (zh) | 一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法 | |
| CN113416123B (zh) | 一种多孢木霉菌株分离的单体化合物、制备方法及应用 | |
| CN113391019B (zh) | 一种黄蜀葵花药材、提取物或制剂的薄层色谱检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231007 Address after: No. 183 Yinjiang Road, Jimei District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 (Jimei University Sports College) Patentee after: Xiamen Jida International Academic Exchange Co.,Ltd. Address before: No. 185 Yinjiang Road, Jimei District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee before: JIMEI University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240619 Address after: Room 2015, Shanglou Building, No. 185-1 Yinjiang Road, Jimei District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee after: Xiamen Hongyuan Education Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No. 183 Yinjiang Road, Jimei District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 (Jimei University Sports College) Patentee before: Xiamen Jida International Academic Exchange Co.,Ltd. Country or region before: China |