CN102590212A - 九味竺黄制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及九味竺黄制剂的检测方法，包括下述鉴别和/或检测方法的一种或几种：通过显微镜鉴别制剂中的药材甘草和红花的形态特征；通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别；以及检查制剂中棒嘎所含乌头碱含量；通过高效液相色谱法对制剂中红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。通过上述检测方法，可以对九味竺黄制剂进行有效的检测。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种中药制剂的检测方法。
背景技术
九味竺黄散为藏药，收载于《卫生部药品标准》藏药分册中，标准编号为WS3-BC-0248-95，由天竺黄、红花、人工牛黄、力嘎都、榜嘎、甘草、丛菔、兔耳草、檀香九味药组成。主要用于小儿流感，肺炎，上呼吸道感染。
天竺黄：收载于中华人民共和国药典2010年版一部53页。本品为禾本科植物青皮竹Bambusa textilis McClure或华思劳竹Schizostachyum chinenseRendle等杆内的分泌液干燥后的块状物。秋、冬二季采收。
红花：收载于中华人民共和国药典2010年版一部141页。本品为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花。夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干。
人工牛黄：收载于中华人民共和国药典2010年版一部5页。本品由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工而成。
力嘎都：为虎耳草科植物岩白菜属植物岩白菜Bergenia purpurascens(Hook.f.et Thoms.)Engl.var.delavayi(Franch.)Engl.et Irm.，以根状茎或全草入药。夏秋采集，挖大留小，洗去泥沙，除去靠近根头的枯朽叶片，晒干即得。
榜嘎：收载于中华人民共和国药典2010年版一部附录。为毛茛植物船盔乌头Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf或甘青乌头Aconitum tanguticum(Maxim.)Stapf的带根全草。7-9月开花果期采挖带根全草，洗净，切段，晒干或晾干。
甘草：收载于中华人民共和国药典2010年版一部80页。本品为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。春、秋二季采挖，除去须根，晒干。
索罗素扎：收载于藏药部颁第一册，标准编号：WS3-BC-0029-95，本品为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa(Maxim.)Bofsch的干燥根或全草。花盛期采收，洗净晾干。
洪连：收载于中华人民共和国药典2010年版一部249页。本品系藏族习用药材。为玄参科植物短筒兔耳草Lagotis brevituba Maxim的干燥全草。夏、秋二季花开时采收，除去杂质，洗净，阴干。
檀香：收载于中华人民共和国药典2010年版一部357页。本品为檀香科植物檀香Santalum album L.树干的心材。
从菔：收载于藏药部颁第一册29页，标准编号：WS3-BC-0029-95，本品为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa(Maxim.)Bofsch的干燥根或全草。花盛期采收，洗净晾干。
兔耳草：收载于藏药部颁第一册63页，标准编号：WS3-BC-0063-95，本品为玄参科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim.或全缘兔耳草L.integraW.Smith.的干燥全草。夏秋花盛期采收。除去杂质，洗净，阴干。
目前尚未有九味竺黄制剂的检测方法，也没有对方中的毒性成分进行含量检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法重现性好、专属性强，能够有效地检测九味竺黄制剂的质量，从而使九味竺黄制剂的质量稳定、安全、可控。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法包括下述鉴别和/或检查和/或测定方法的一种或几种：
通过显微镜鉴别制剂中药材红花和甘草的形态特征；
通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别，以及检查制中榜嘎所含乌头碱含量；
通过高效液相色谱法对制剂中的红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。
进一步地，所述显微镜鉴别包括：
取所述九味竺黄制剂置显微镜下观察，鉴别以下各味药材的形态特征，其中：
甘草的主要形态特征：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形；
红花的主要形态特征：花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔1-5个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物；
红花的定性鉴别包括：
1a)制备红花的供试品溶液、红花对照药材溶液、不含红花的阴性样品溶液；
2a)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1a)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶H薄层板上；
3a)以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，将步骤2a)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
甘草的定性鉴别包括：
1b)制备甘草的供试品溶液、甘草对照药材溶液、不含甘草的阴性样品溶液；
2b照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1b)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；
3b)以石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，将步骤2b)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
人工牛黄的定性鉴别包括：
1c)制备人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、不含人工牛黄的阴性样品溶液；
2c)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1c)所获得的供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；
3c)以三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，将步骤2c)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
榜嘎所含乌头碱含量检查包括：
1d)制备榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液；
2d)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VI B试验，分别吸取步骤1d)所获得的榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液，并点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上；
3d)以甲苯—乙酸乙酯—二乙胺为展开剂，将步骤2d)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
红花所含羟基红花黄色素A含量测定包括：
1e)制备红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、不含红花的阴性样品溶液；
2e)照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，分别吸取步骤1e)所获得的红花供试品溶液和羟基红花黄色素A对照品溶液，注入液相色谱仪，测定；
3e)以制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
更进一步地，所述红花、甘草、人工牛黄、乌头碱以及红花的供试品溶液、对照药材/对照品溶液、阴性样品溶液的制备方法包括：
(1)红花的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加丙酮，振摇处理，静置，吸取上清液，作为红花的供试品溶液；另取红花对照药材，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；
(2)甘草的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加硫酸、三氯甲烷，加热回流，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇使溶解，作为甘草的供试品溶液；另取甘草对照药材，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；
(3)人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加丙酮，超声处理，滤过，浓缩滤液，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；
(4)榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液
取所述九味竺黄制剂，置具塞锥形瓶中，加氨试液、乙醚，密塞，摇匀，放置，滤过，药渣加乙醚，振摇，滤过，药渣再用乙醚洗涤，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成乌头碱对照品溶液；
(5)红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，称定，加甲醇，称定重量，超声处理，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品，称定，加甲醇制成羟基红花黄色素对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液。
更进一步地，所述的检测方法包括下述步骤：
a)红花的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂1-20重量份，加80％丙酮溶液10-40体积份，密塞，振摇5-20分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0.1-10重量份，加80％丙酮溶液1-10体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(1～15∶0.5～10∶0.5～10∶0.01～1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
b)甘草的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液0.5-20体积份，再加三氯甲烷10-40体积份，加热回流0.5-2小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇0.5-5体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0.1-2重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(5～30∶5～30∶2～10∶0.1～1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c)人工牛黄的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，加丙酮10-30体积份，超声处理10-60分钟，滤过，滤液浓缩至约0.5-5体积份，作为人工牛黄的供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1体积份含0.0001-0.005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(1～10∶1～10∶0.1～1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
d)榜嘎所含乌头碱的限量检查
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液0.5-10体积份，再加乙醚10-50体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚25-100体积份，时时振摇0.5-2小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤1-5次，每次5-30体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷5-20体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷5-20体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取1-10次(10～40体积份，5～20体积份，5～20体积份，5～20体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(10～40体积份、5～30体积份、5～30体积份)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另外精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1体积份含0.0001-0.005体积份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(5～30∶2～10∶0.1～2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇20-100体积份，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10-100分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花供试品溶液；取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1体积份含羟基红花黄色素A0.0001-0.001重量份的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为10～50∶1～5∶50～150的甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液为流动相；在(403±2)nm检测波长、柱温为25-～40℃下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.005～0.02体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
又进一步地，所述的检测方法包括下述步骤：
a)红花的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，加80％丙酮溶液20体积份，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0.5重量份，加80％丙酮溶液5体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.005体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
b)甘草的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液10体积份，再加三氯甲烷30体积份，加热回流1小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0.5重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.01体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c)人工牛黄的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，加丙酮20体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2体积份，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1体积份含0.005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取所述供试品溶液、阴性溶液各0.005体积份、对照品溶液为0.002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶5∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
d)榜嘎所含乌头碱的限量检查
取所述九味竺黄制剂5重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液3体积份，再加乙醚25体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50体积份，时时振摇1小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(20体积份、10体积份、10体积份、10体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20体积份、15体积份、15体积份)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1体积份含0.001重量份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，精密吸取所述供试品溶液0.01体积份，对照品溶液0.005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，薄层板置展开缸中饱和20分钟，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定
取所述九味竺黄制剂4重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50体积份，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1体积份含羟基红花黄色素A0.00015重量份的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26∶2∶72的甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液为流动相；在403nm检测波长、柱温为30℃下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.01体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
上述九味竺黄制剂的原料药组成为：天竺黄20重量份、红花15重量份、人工牛黄5重量份、力嘎都50重量份、榜嘎15重量份、甘草10重量份、索罗素扎/丛菔15重量份、洪连/兔耳草15重量份、檀香7.5重量份。
上述九味竺黄制剂的剂型为散剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或丸剂。
上述述九味药材，除人工牛黄另研细粉外，其余共研成细粉，过筛，加入人工牛黄细粉，加入适量辅料混匀，即得；或取所述九味竺黄制剂，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料制成临床上可接受的口服制剂。
上述九味竺黄具有用于制备治疗小儿流感，肺炎，上呼吸道感染的药物的用途。
本发明的检测方法建立了红花、甘草的显微鉴别方法；红花、甘草、人工牛黄的薄层鉴别方法，专属性强，重现性较好；由于该制剂处方中含榜嘎，而榜嘎药材中含有乌头碱，为了保证临床用药安全性，本发明对该制剂乌头碱限量的检查方法进行了研究，并确定了限度。另外还增加了处方中红花药材有效成分羟基红花黄色素A的含量测定方法，该检测方法专属性强，且阴性无干扰。所述检测方法经多人多次反复操作，结果准确、重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以有效的检测产品的质量。
附图说明
图1为本发明所述的红花和甘草显微鉴别图，其中，1-3分别为晶鞘纤维、花粉粒、分泌细胞；
图2为本发明所述的红花鉴定薄层色谱图，其中，1-3为红花鉴定中的红花供试品，4-5为红花对照药材，6为不含红花的阴性样品；
图3为本发明所述的甘草鉴定薄层色谱图，其中，1-3为甘草鉴定中甘草的供试品，4-5为甘草对照药材，6为不含甘草的阴性样品。
图4为本发明所述的人工牛黄鉴定薄层色谱图，其中，1-3为人工牛黄供试品，4-5为胆酸对照品，6为不含人工牛黄的阴性样品。
图5为本发明所述的榜嘎所含乌头碱限量薄层色谱图，图中1-3为榜嘎供试品，4-5为乌头碱对照品，6为不含榜嘎的阴性样品。
图6为本发明所述的红花所含羟基红花黄色素A色谱图，其中，A-C分别为羟基红花黄色素A对照品、红花供试品、不含红花的阴性样品。
图7为羟基红花黄色素A的峰面积与对照品浓度的线性关系图。
具体实施方式
下述实验例和实施例进一步说明、但不限制本发明。
实验例1：红花和甘草的显微鉴别
(1)仪器
显微镜、照相机、载玻片、盖玻片、电子天平、移液管、滤纸、超声仪。
(2)试剂
水合氯醛、甘油、蒸馏水、醋酸。
(4)检验方法：
透化溶剂：水合氯醛试液、醋酸甘油试液、稀甘油等溶液为透化溶剂。
透化方法：传统加热透化方法和烘箱加热方法。
分别选择以上透化溶剂和透化方法进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了红花和甘草的专属性显微鉴别方法如下：
取所述九味竺黄制剂0.001g，加水合氯醛0.1ml，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(为甘草药材的主要特征结构)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(为红花药材的主要特征结构)。如图1所示。
实验例2：红花的薄层鉴别
(1)仪器
乳钵、电子秤、具塞锥形瓶、移液管、超声波提取仪、漏斗、滤纸、蒸发皿、点样器、硅胶H板、层析缸。
(2)对照药材
红花(批号：120907-200609)，购自中国药品生物制品鉴定所。
(3)试剂
甲醇、乙醇、甲酸、乙酸乙酯、水、丙酮。
(4)检验方法：
提取溶剂：乙醇、丙酮、80％丙酮、乙酸乙酯。
提取方法：振摇和冷浸。
展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)、乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2∶3)。分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了红花的专属性薄层鉴别方法如下：
取所述九味竺黄制剂5g，加80％丙酮溶液20ml，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0.5g，加80％丙酮溶液5ml，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.005mL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视。如图2所示，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
实验例3：甘草的薄层鉴别
(1)仪器
乳钵、电子秤、量筒、平底烧瓶、冷凝管、橡胶管、水浴锅、超声波提取仪、漏斗、滤纸、蒸发皿、分液漏斗、脱脂棉、点样器、硅胶G板、层析缸、紫外点样分析仪。
(2)对照药材
甘草对照药材(批号：120904-200914)，购自中国药品生物制品鉴定所。
(3)试剂
石油醚(60～90℃)、苯、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇、无水乙醇、三氯甲烷、蒸馏水、硫酸、无水硫酸钠。
(4)检验方法：
提取溶剂：甲醇、三氯甲烷+2.5mol/L硫酸溶液、乙酸乙酯+2.5mol/L硫酸溶液、乙酸乙酯、三氯甲烷、2.5mol/L硫酸溶液为提取溶剂。
提取方法：超声和加热回流。
展开剂：石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯(10∶20∶7)、石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)。
分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了甘草的专属性薄层鉴别方法如下：
取所述九味竺黄制剂5g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液10ml，再加三氯甲烷30ml，加热回流1小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2ml使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实验例4：人工牛黄的薄层鉴别
(1)仪器
电子天平、量筒、平底烧瓶、水浴锅、超声波提取仪、蒸发皿、点样器、硅胶G板、烘箱、层析缸、喷雾瓶、紫外点样分析仪。
(2)对照品
胆酸对照品(批号：10078-0013)，均购自中国药品生物制品检定所。
(3)试剂
三氯甲烷、丙酮、甲酸、甲醇、乙醇、硫酸。
(4)检验方法：
提取溶剂：甲醇、三氯甲烷、丙酮、乙醇为提取溶剂。
提取方法：超声和冷浸提取。
展开剂：三氯甲烷-丙酮(3∶7)、三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶5∶0.5)。
分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了人工牛黄的专属性薄层鉴别方法如下：
取所述九味竺黄制剂5g，加丙酮20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2ml，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶5∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。如图4所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实验例5：榜嘎所含乌头碱限量检查
(1)仪器
电子天平、锥形瓶、容量瓶、量筒、分液漏斗、PH试纸、玻璃棒、水浴锅、蒸发皿、点样器、硅胶G板、烘箱、层析缸、喷雾瓶、紫外点样分析仪。
(2)对照品
乌头碱对照品(批号：110720-200410)，购自中国药品生物制品鉴定所。
(3)试剂
氨水、乙醚、三氯甲烷、无水乙醇、正丁醇、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、二乙胺。
(4)检验方法：
提取溶剂：甲醇、乙醇、正丁醇、乙醚为提取溶剂。
提取方法：过夜、过夜+时时振摇1小时提取。
展开剂：甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(8∶1∶1)、甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)。
分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了榜嘎所含乌头碱限量检查的方法如下：
取所述九味竺黄制剂5g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，再加乙醚25ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50ml，时时振摇1小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、15ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为榜嘎供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含棒嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含棒嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。如图5所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
实验例6：红花所含羟基红花黄色素A含量测定
(1)仪器
电子天平、锥形瓶、容量瓶、10ml移液管、50ml移液管、注射器、烧杯、漏斗、滤纸、滤头、高效液相色谱仪。
(2)对照品
羟基红花黄色素A(批号：111637-200905)，购自中国药品生物制品鉴定所。
(3)试剂
甲醇、乙腈、乙醇、磷酸、水。
(4)检验方法：
提取溶剂：甲醇、乙醇、25％甲醇。
提取时间：超声30分钟、40分钟、50分钟。
流动相：甲醇-水(28∶72)、甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)
分别选择以上提取溶剂、提取时间和流动相进行试验，结果如下：
在以上条件下反复试验，最终确定了红花所含羟基红花黄色素A含量测定的方法如下：
取所述九味竺黄制剂约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)试验，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，如图6所示，制剂每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
实验例7：红花所含羟基红花黄色素A含量测定—方法学考察
(1)仪器与试药
Aglient 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)：G1314A紫外可见检测器，G1314A二元泵，Agilent1100色谱工作站。
SK8200HP超声波清洗器(功率250W，频率40kHz)(上海科导超声仪器有限公司)。
乙腈(色谱纯)；甲醇(分析纯、色谱纯)。
羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-200905)，购自中国药品生物制品鉴定所。
九味竺黄样品(批号：20100818、20101104、20101209)，西藏林芝宇拓藏药有限责任公司。
(2)色谱条件
十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：Kromasil E56526-C18(4.6×250mm，5.0μm，大连依利特公司)；
流动相：甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)；
流速：1.0ml/min；
检测波长：403nm；
柱温：30℃。
(3)色谱系统适用性试验
在以上色谱条件下，羟基红花黄色素A与其余杂质峰分离效果较好，理论塔板数按羟基红花黄色素A计算应不低于3000。
(4)对照品溶液与供试品溶液的配制
I、对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A158μg的溶液，摇匀，即得。
II、供试品溶液的制备：取本品约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
III、阴性样品溶液的制备：取不含红花药材的阴性样品4g，同法制成阴性样品溶液，备用。
(6)阴性干扰试验：精密吸取供试品溶液、阴性样品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪中，由色谱图可知，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现，而阴性样品溶液在此波长无吸收，对本品中羟基红花黄色素A的含量测定无干扰。见图6所示的色谱图A、B、C。
(7)线性关系的考察
取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A220μg的溶液，摇匀，作为储备液。精密吸取上述储备溶液2ml、2.5ml、4ml、4.5ml、6ml、8ml、10ml至10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl分别注入液相色谱仪，测定峰面积，羟基红花黄色素A在0.44μg～2.2μg之间内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为y＝18.289x+15.52(r＝0.9999)。结果如表1和图7所示。
表1羟基红花黄色素A对照浓度与峰面积结果
(8)精密度试验
精密吸取同一羟基红花黄色素A对照品溶液10μl，连续进样5次，测定色谱峰的峰面积，结果见表2。
表2精密度试验结果
试验表明，精密度良好，RSD分别为0.55％。
(9)稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于0、2、4、6、12h进样，测定色谱峰的峰面积，结果见表3。
表3稳定性试验结果
试验表明，结果在0～12h内稳定性良好，RSD分别为2.96％。
(10)重现性试验
取九味竺黄样品(批号：20100818)5份，按照样品制备方法进行样品处理，进样，计算羟基红花黄色素A的含量及RSD，结果见表4。
表4重现性试验结果
试验表明，同一批样品取样5份测定，结果重现性较好，RSD为3.68％。
(11)回收率试验
取已知含量的九味竺黄样品(批号：20100818，含量为0.90mg/g)粉末约2.0g，精密称定，加入一定量的羟基红花黄色素A，依法测定，根据色谱峰峰面积值，分别求得羟基红花黄色素A的含量，计算回收率，测定结果见
表5。结果表明，本法回收率好，RSD为4.40％。
表5羟基红花黄色素A的加样回收率试验
(12)样品的测定
取九味竺黄样品约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μl，依法测定，计算羟基红花黄色素A的含量，结果见表6。
表6样品中羟基红花黄色素A的含量测定结果
根据上述多批次样品的测定结果可知，本品每1g含羟基红花黄色素A的量在0.9021～1.5220mg间，按最底含量的70％作为含量下限，即0.9021mg/g×70％＝0.6315mg/g≈0.63mg/g ，转化率为：0.63/0.98×100％＝64.3％，暂定本品含红花以羟基红花黄色素A(C27H30O15)的量计，每1g不得少于0.60mg。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
【实施例1】：九味竺黄散的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，除人工牛黄另研细粉外，其余共研成细粉，过筛，加入人工牛黄细粉，加入适量辅料混匀，即得，本品为灰棕色粉末；气微香，味甘。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄散，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄散5g，加80％丙酮溶液20ml，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材0.5g，加80％丙酮溶液5ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄散5g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液10ml，再加三氯甲烷30ml，加热回流1小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄散5g，加丙酮20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶5∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄散5g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，再加乙醚25ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50ml，时时振摇1小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、15ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花所含羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相；检测波长为403nm。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄散约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄散每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
【实施例2】：九味竺黄硬胶囊的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的九味竺黄硬胶囊。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄硬胶囊，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄硬胶囊2g，加80％丙酮溶液15ml，密塞，振摇5分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材2g，加80％丙酮溶液2ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(3∶1∶1.5∶0.05)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄硬胶囊5g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液10ml，再加三氯甲烷30ml，加热回流1小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄硬胶囊1g，加丙酮15ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(3∶3∶0.2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄硬胶囊1g，置具塞锥形瓶中，加氨试液1ml，再加乙醚15ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚40ml，时时振摇0.8小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤1次，每次10ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷8ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷8ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取3次(30ml、15ml、15ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(10ml、5ml、5ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇0.8ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液15μl、对照药材溶液10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(8∶3∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花所含羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(25∶2∶73)为流动相；检测波长为403nm；柱温25℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄硬胶囊约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇30ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄硬胶囊每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
【实施例3】：九味竺黄颗粒的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的九味竺黄颗粒。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄颗粒，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄颗粒10g，加80％丙酮溶液30ml，密塞，振摇10分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材1g，加80％丙酮溶液5ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(10∶5∶3∶0.2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄颗粒0.5g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液2ml，再加三氯甲烷10ml，加热回流0.5小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(7∶15∶6∶0.2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄颗粒5g，加丙酮20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶5∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄颗粒3g，置具塞锥形瓶中，加氨试液2ml，再加乙醚20ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚60ml，时时振摇1.2小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤2次，每次20ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷15ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷15ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取2次(40ml、20ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(30ml、30ml、30ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1.2ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(10∶6∶0.3)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花所含羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(27∶1.8∶71.2)为流动相；检测波长为403nm；柱温30℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄颗粒约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄颗粒每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
【实施例4】：九味竺黄片的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的九味竺黄片。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄片，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄片5g，加80％丙酮溶液20ml，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材0.5g，加80％丙酮溶液5ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄片1.5g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液6ml，再加三氯甲烷20ml，加热回流1.2小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各12μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(16∶28∶9∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄片3g，加丙酮25ml，超声处理40分钟，滤过，滤液浓缩至约1.5ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液8μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(2∶1∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄片7g，置具塞锥形瓶中，加氨试液5ml，再加乙醚35ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚80ml，时时振摇1.5小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤4次，每次25ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷18ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷18ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(10ml、5ml、5ml、5ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20ml、10ml、10ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1.5ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液8μl、对照品溶液4μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(16∶8∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花所含羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(24∶2.2∶73.8)为流动相；检测波长为403nm；柱温35℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄片约6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇65ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄片每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
【实施例5】：九味竺黄软胶囊的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的九味竺黄软胶囊。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄软胶囊，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄软胶囊15g，加80％丙酮溶液35ml，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材1.5g，加80％丙酮溶液8ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(12∶7∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄软胶囊3g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液15ml，再加三氯甲烷35ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇3ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1.2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(21∶30∶5∶0.8)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄软胶囊7g，加丙酮30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约3ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(6∶4∶0.1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄软胶囊5g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，再加乙醚25ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50ml，时时振摇1小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(20ml、15ml、15ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(28∶2∶70)为流动相；检测波长为403nm；柱温40℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄软胶囊约8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇90ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)80分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄软胶囊每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
【实施例6】：九味竺黄丸剂的鉴别
天竺黄20g、红花15g、人工牛黄5g、力嘎都50g、榜嘎15g、甘草10g、索罗素扎/丛菔15g、洪连/兔耳草15g、檀香7.5g。
以上九味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的九味竺黄丸剂。
A.甘草和红花的显微鉴别
取上述九味竺黄丸剂，制片，置显微镜下观察：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形(甘草)。花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物(红花)。
B.红花的薄层鉴别
取上述九味竺黄丸剂18g，加80％丙酮溶液40ml，密塞，振摇20分钟，静置，吸取上清液，作为供试品溶液；另取红花对照药材2g，加80％丙酮溶液10ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各20μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(14∶8.5∶9.5∶0.8)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。
C.甘草的薄层鉴别
取上述九味竺黄丸剂8g，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液20ml，再加三氯甲烷40ml，加热回流1.8小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇4.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1.8g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-苯-乙酸乙酯-冰乙酸(27∶8∶3∶0.3)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
D.人工牛黄的薄层鉴别
取上述九味竺黄丸剂8g，加丙酮30ml，超声处理60分钟，滤过，滤液浓缩至约4.5ml，作为供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液15μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶7∶0.8)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。
E.棒嘎所含乌头碱限量检查
取上述九味竺黄丸剂9.5g，置具塞锥形瓶中，加氨试液8ml，再加乙醚45ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚100ml，时时振摇2小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤5次，每次30ml，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷20ml使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷20ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取3次(20ml、20ml、20ml)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次(15ml、15ml、15ml)，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1.8ml使溶解，作为供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液10μl、对照品溶液10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(21∶7∶0.8)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点。
F.红花羟基红花黄色素A含量测定
照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相；检测波长为403nm；柱温30℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取上述九味竺黄丸剂约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
九味竺黄丸剂每1g含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.60mg。
Claims (9)
1.一种九味竺黄制剂的检测方法，所述方法包括下述鉴别和/或检查和/或测定方法的一种或几种：
通过显微镜鉴别制剂中药材红花和甘草的形态特征；
通过薄层层析对制剂中的红花、甘草、人工牛黄进行定性鉴别，以及检查制剂中榜嘎所含乌头碱含量；
通过高效液相色谱法对制剂中红花所含羟基红花黄色素A的含量进行测定。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述显微镜鉴别包括：
取所述九味竺黄制剂，制片，置显微镜下观察，鉴别以下各味药材的形态特征，其中：
甘草的主要形态特征：纤维成束，或纤维周围薄壁细胞中含有草酸钙方晶形成纤维，结晶方形或棱形；
红花的主要形态特征：花粉粒圆球形或椭圆形，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔1-5个，分泌细胞单列纵向连接而成分泌管，细胞内充满红棕色物；
红花的定性鉴别包括：
1a)制备红花的供试品溶液、红花对照药材溶液、不含红花的阴性样品溶液；
2a)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1a)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶H薄层板上；
3a)以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，将步骤2a)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
甘草的定性鉴别包括：
1b)制备甘草的供试品溶液、甘草对照药材溶液、不含甘草的阴性样品溶液；
2b照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1b)所获得的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；
3b)以石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，将步骤2b)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
人工牛黄的定性鉴别包括：
1c)制备人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、不含人工牛黄的阴性样品溶液；
2c)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1c)所获得的供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液，并点样于同一硅胶G薄层板上；
3c)以三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，将步骤2c)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
榜嘎所含乌头碱含量检查包括：
1d)制备榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液；
2d)照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，分别吸取步骤1d)所获得的榜嘎供试品溶液、乌头碱对照药品溶液，并点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上；
3d)以甲苯—乙酸乙酯—二乙胺为展开剂，将步骤2d)所获得的薄层板放置在展开缸中饱和、展开、取出、晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
红花所含羟基红花黄色素A含量测定包括：
1e)制备红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、不含红花的阴性样品溶液；
2e)照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，分别吸取步骤1e)所获得的供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，测定；
3e)以制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述红花、甘草、人工牛黄、榜嘎供试品溶液、对照药材溶液/对照品溶液、阴性样品溶液的制备方法包括：
(1)红花的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加丙酮，振摇处理，静置，吸取上清液，作为红花的供试品溶液；另取红花对照药材，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；
(2)甘草的供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加硫酸、三氯甲烷，加热回流，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；
(3)人工牛黄的供试品溶液、胆酸对照品溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，加丙酮，超声处理，滤过，浓缩滤液，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；
(4)榜嘎供试品溶液、乌头碱对照品溶液
取所述九味竺黄制剂，置具塞锥形瓶中，加氨试液、乙醚，密塞，摇匀，放置，滤过，药渣加乙醚，振摇，滤过，药渣再用乙醚洗涤，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为榜嘎供试品溶液；另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成对照品溶液；
(5)红花的供试品溶液、羟基红花黄色素A对照品溶液、阴性样品溶液
取所述九味竺黄制剂，称定，加甲醇，称定重量，超声处理，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品，称定，加甲醇制成羟基红花黄色素对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液。
4.如权利要求1-3任一项所述的检测方法，包括下述步骤：
a)红花的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂1-20重量份，加80％丙酮溶液10-40体积份，密塞，振摇5-20分钟，静置，吸取上清液，作为红花供试品溶液；另取红花对照药材0.1-10重量份，加80％丙酮溶液1-10体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇，体积比1～15∶0.5～10∶0.5～10∶0.01～1为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0-40分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
b)甘草的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液0.5-20体积份，再加三氯甲烷10-40体积份，加热回流0.5-2小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇0.5-5体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0.1-2重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸，体积比5～30∶5～30∶2～10∶0.1～1为展开剂，薄层板置在展开缸中饱和0～40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c)人工牛黄的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，加丙酮10-30体积份，超声处理10-60分钟，滤过，滤液浓缩至约0.5-5体积份，作为人工牛黄的供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1体积份含0.0001-0.005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸，体积比1～10∶1～10∶0.1～1为展开剂，薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
d)榜嘎所含乌头碱的限量检查
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液0.5-10体积份，再加乙醚10-50体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚25-100体积份，时时振摇0.5-2小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤1-5次，每次5-30体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，蒸干，残渣加三氯甲烷5-20体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷5-20体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取1-10次：10～40体积份，5～20体积份，5～20体积份，5～20体积份，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再用三氯甲烷提取3次：10～40体积份、5～30体积份、5～30体积份，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2体积份使溶解，作为榜嘎乌头碱供试品溶液；另外精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1体积份含0.0001-0.005体积份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎乌头碱的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎乌头碱阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VI B试验，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各0.001-0.02体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-二乙胺，体积比5～30∶2～10∶0.1～2为展开剂，将薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定
取所述九味竺黄制剂0.5-10重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇20-100体积份，称定重量，功率250W，频率40kHz超声处理10-100分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为羟基红花黄色素A红花供试品溶液；取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1体积份含羟基红花黄色素A0.0001-0.001重量份的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为10～50∶1～5∶50～150的甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液为流动相；在403±2nm检测波长、柱温为25～-40℃下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；分别精密吸取对照药材溶液和供试品溶液各0.005～0.02体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
a)红花的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，加80％丙酮溶液20体积份，密塞，振摇15分钟，静置，吸取上清液，作为红花的供试品溶液；另取红花对照药材0.5重量份，加80％丙酮溶液5体积份，同法制成红花对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含红花的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.005体积份，分别点于同一硅胶H薄层板上，以体积比7∶2∶3∶0.4的乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置日光下检视，供试品色谱中，在与红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
b)甘草的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，置平底烧瓶中，加2.5mol/L的硫酸溶液10体积份，再加三氯甲烷30体积份，加热回流1小时，滤过，滤液移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置水浴上蒸干，加入无水乙醇2体积份使溶解，作为甘草供试品溶液；另取甘草对照药材0.5重量份，同法制成甘草对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含甘草的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含甘草的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，吸取上述三种溶液各0.01体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比10∶20∶7∶0.5的60～90℃石油醚-苯-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，薄层板置在展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
c)人工牛黄的定性鉴别
取所述九味竺黄制剂5重量份，加丙酮20体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2体积份，作为人工牛黄供试品溶液；另取胆酸对照品，加丙酮制成每1体积份含0.005重量份的溶液，作为胆酸对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含人工牛黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含人工牛黄的阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，分别吸取所述供试品溶液、阴性溶液各0.005体积份、对照品溶液为0.002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比5∶5∶0.5的三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与胆酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
d)榜嘎所含乌头碱的限量检查
取所述九味竺黄制剂5重量份，置具塞锥形瓶中，加氨试液3体积份，再加乙醚25体积份，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚50体积份，时时振摇1小时，滤过，药渣再用乙醚洗涤3次，每次15体积份，滤过，合并上述滤液与洗液，在60℃的水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷10体积份使溶解，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷10体积份分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次(20体积份、10体积份、10体积份、10体积份)，合并酸液，加氨试液调节PH值至9，再分别用20体积份、15体积份、15体积份的三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇1体积份使溶解，作为榜嘎供试品溶液；精密称取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每1体积份含0.001重量份的溶液，作为乌头碱对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含榜嘎的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成不含榜嘎阴性样品溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010版一部附录VIB试验，精密吸取所述供试品溶液0.01体积份，对照品溶液0.005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为14∶4∶1的甲苯-乙酸乙酯-二乙胺为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上出现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点；
e)红花所含羟基红花黄色素A的含量测定
取所述九味竺黄制剂4重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50体积份，称定重量，功率250W，频率40kHz超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为红花的供试品溶液；另取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1体积份含羟基红花黄色素A0.00015重量份的溶液，作为羟基红花黄色素A对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含红花的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成红花阴性样品溶液；照高效液相色谱法《中国药典》2010版一部附录VID试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26∶2∶72的甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液为流动相；在403nm检测波长、柱温为30℃下测定，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000；分别精密吸取对照药材溶液和供试品溶液各0.01体积份，注入液相色谱仪，测定，制剂每1重量份含红花以羟基红花黄色素A计，不得少于0.0006重量份。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的原料药组成为：天竺黄20重量份、红花15重量份、人工牛黄5重量份、力嘎都50重量份、榜嘎15重量份、甘草10重量份、索罗素扎/丛菔15重量份、洪连/兔耳草15重量份、檀香7.5重量份。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的剂型为散剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或丸剂。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂的制备方法为：取所述九味药材，除人工牛黄另研细粉外，其余共研成细粉，过筛，加入人工牛黄细粉，加入适量辅料混匀，即得；或取所述九味竺黄制剂，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料制成临床上接受的口服制剂。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述九味竺黄制剂具有用于制备治疗小儿流感，肺炎，上呼吸道感染的药物的用途。
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| CN201210013513.7A CN102590212B (zh) | 2012-01-16 | 2012-01-16 | 九味竺黄制剂的检测方法 |
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