CN113372426A - 丝胶蛋白萃取物、其制备方法与用途以及包含其之抗氧化组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明关于一种丝胶蛋白萃取物、其制备方法与用途以及包含其之抗氧化组合物，其制备方法包含以下步骤：预处理蚕茧；以碱液萃取蚕茧以获得丝胶蛋白初萃液；以及对丝胶蛋白初萃液进行筛选以取得丝胶蛋白萃取物，其中碱液包含金属氢氧化物及金属碳酸盐。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚕丝蛋白溶液、其制备方法与用途以及包含其之抗氧化组合物，更具体而言，是关于一种丝胶蛋白萃取物、其制备方法与用途以及包含其之抗氧化组合物。
背景技术
丝胶蛋白(sericin)是蚕或柞蚕在生产蚕丝时所分泌的一种蛋白质。蚕丝主要由丝胶蛋白及丝蛋白两种蛋白质构成。蚕丝中含有70～80％的丝蛋白及20～30％的丝胶蛋白。
蚕丝的丝胶蛋白是一种水溶性的高分子蛋白，其分子量大约为10～300kDa，且含有18种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸含量高达20％。丝胶蛋白因其良好的水溶性、促细胞黏附和增殖活性、更低的免疫原性，以及独特的原位荧旋光性、抗氧化活性和酪胺酸酶抑制作用等性能，而被广泛应用在织物整理涂层、化妆品添加剂，以及食品、医药、功能性生物材料。
丝胶蛋白在溶液中的分子量受到温度、pH、以及萃取方式的影响。不同分子量的丝胶蛋白具有不同的功效，且以不同萃取方式得到的丝胶蛋白萃取物也具有不同的功效。
发明内容
有鉴于不同分子量的丝胶蛋白具有不同的功效，且以不同萃取方式得到的丝胶蛋白萃取物也具有不同的功效，本发明提供以新的萃取方式制备丝胶蛋白萃取物的一种丝胶蛋白萃取物制备方法，其包含以下步骤：预处理蚕茧；以碱液萃取蚕茧以获得丝胶蛋白初萃液；以及对丝胶蛋白初萃液进行筛选以取得丝胶蛋白萃取物，其中碱液包含金属氢氧化物及金属碳酸盐。
优选地，丝胶蛋白萃取物中的丝胶蛋白分子量＜100kDa。
优选地，金属氢氧化物为碱金属氢氧化物且金属碳酸盐为碱金属碳酸盐。
优选地，碱金属氢氧化物与碱金属碳酸盐的重量比为2～5：1～10。
优选地，碱液包含0.2～10wt.％的碱金属氢氧化物以及0.1～5wt.％的碱金属碳酸盐。
优选地，在萃取步骤中，每克蚕茧以50mL的碱液萃取。
优选地，预处理步骤包含以80℃烘干蚕茧24小时。
根据本发明的另一态样，提供一种以上述方法制得的丝胶蛋白萃取物。
根据本发明的又一态样，提供一种上述丝胶蛋白萃取物用于制备抗氧化组合物的用途。
根据本发明的再一态样，提供一种抗氧化组合物，其包含上述丝胶蛋白萃取物。
依据上述丝胶蛋白萃取物制备方法制得的丝胶蛋白萃取物具有良好的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亚铁螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此可用于制备抗氧化组合物，而所制得的抗氧化组合物将具有优越的抗氧化功能。
附图说明
结合附图参照以下详细说明将使本发明对于所属技术领域的技术人员而言变得更加显而易见，其中：
图1为依据本案实施例的丝胶蛋白萃取物制备方法的示意性流程图；
图2为1％BHT与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的清除DPPH自由基能力的比较图；
图3为1％Vit C与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的清除ABTS自由基能力的比较图；
图4为2mg/mL EDTA-2Na与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的螯合亚铁离子能力的比较图；
图5为具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的超氧岐化酶活性的比较图；以及
图6为1％曲酸与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的酪胺酸酶抑制率的比较图。
符号说明
10:丝胶蛋白萃取物制备方法
S101～S105:步骤
具体实施方式
本发明参考其中绘示本发明例示性实施例的图式而更充分地描述。如本领域技术人员将认识到的，本发明的实施例可以各种不同方式进行形式以及细节上的修改而不脱离本揭露的精神或范围。
于本文中，用语“约”及其相似用语是作为近似用语而不是作为程度用语使用，且旨在用于计入本领域技术人员将认知到的测量或计算中的固有偏差。另外，本文描述的任何数值范围旨在包括包含在描述范围中的相同数值精确度的所有子范围。例如，“1.0至10.0”的范围旨在包括在所描述的最小值1.0与所描述的最大值10.0之间(且包含最小值及最大值)的所有子范围，亦即，具有等于或大于1.0的最小值及等于或小于10.0的最大值，例如像2.4至7.6。本文描述的任何最大数值限制旨在包括包含在本文中描述的所有较低的数值限制以及在本说明书中描述的任何最小数值限制旨在包含在本文中描述的所有较高的数值限制。
图1为依据本案实施例的丝胶蛋白萃取物制备方法10的示意性流程图。如图1所示，丝胶蛋白萃取物制备方法10可包含预处理蚕茧的步骤S101、以碱液萃取蚕茧以获得丝胶蛋白初萃液的步骤S103、以及对丝胶蛋白初萃液进行筛选以取得丝胶蛋白萃取物的步骤S105。
步骤S101的预处理蚕茧的步骤可包含将收集的蚕茧清洗干净并剪成适当大小之后，将蚕茧烘干约24小时，以除去蚕茧中大部分的水分。当烘干温度过高时，可能会导致蚕茧中的丝胶蛋白变性，因此烘干蚕茧的温度不超过100℃，较佳为约70～95℃，更佳地为约80℃。
接着，在步骤S103中，透过将于步骤S101中预处理过的蚕茧与碱液混合来对蚕茧进行萃取，从而可获得丝胶蛋白初萃液，其中蚕茧(g)与碱液(mL)的比例可为约1：50。步骤S103中所用的碱液可包含金属氢氧化物以及金属碳酸盐的混合物。金属氢氧化物可为碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或其组合。碱金属氢氧化物的实例可包含但不限于氢氧化钠、氢氧化钾以及氢氧化锂，而碱土金属氢氧化物的实例可包含但不限于氢氧化镁、氢氧化钙以及氢氧化钡。金属碳酸盐可为碱金属碳酸盐或碱土金属碳酸盐。碱金属碳酸盐的实例可包含但不限于碳酸钠以及碳酸钾，而碱土金属碳酸盐的实例可包含但不限于碳酸镁以及碳酸钙。在一较佳实施例中，金属氢氧化物与金属碳酸盐的重量比约为2～5：1～10。进一步地，金属氢氧化物可两种以上不同的金属氢氧化物的混合物，举例而言，金属氢氧化物可包含碱金属氢氧化物与碱土金属氢氧化物的混合物、至少两种不同的碱金属氢氧化物的混合物或至少两种不同的碱土金属氢氧化物的混合物。在一较佳实施例中，金属氢氧化物为至少两种不同的碱金属氢氧化物的混合物，举例而言为，金属氢氧化物可为氢氧化钠以及氢氧化钾的混合物。
在一实施例中，碱液可包含0.2～10wt.％的金属氢氧化物以及0.1～5wt.％的金属碳酸盐，较佳地，可包含0.2～10wt.％的碱金属氢氧化物以及0.1～5wt.％的碱金属碳酸盐。当金属氢氧化物包含两种金属氢氧化物时(以下称为第一金属氢氧化物以及第二金属氢氧化物)，碱液可包含0.1～5wt.％的第一金属氢氧化物、0.1～5wt.％的第二金属氢氧化物、以及0.1～5wt.％的金属碳酸盐，其中，第一金属氢氧化物以及第二金属氢氧化物可分别独立地为碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，在一较佳实施例中，第一金属氢氧化物以及第二金属氢氧化物皆为碱金属氢氧化物，且第一金属氢氧化物可为氢氧化钠而第二金属氢氧化物可为氢氧化钾。在一实施例中，碱金属碳酸盐为碳酸钠，碱液可包含0.1～5wt.％的氢氧化钠、0.1～5wt.％的氢氧化钾以及0.1～5wt.％的碳酸钠。在一较佳实施例中，碱液可包含0.2～1wt.％的氢氧化钠、0.2～1wt.％的氢氧化钾以及0.2～1wt.％的碳酸钠。
在于步骤S103获得丝胶蛋白初萃液后，进行对丝胶蛋白初萃液进行筛选以取得丝胶蛋白萃取物的步骤S105，以使最后获得的丝胶蛋白萃取物中的丝胶蛋白的分子量＜100kDa，较佳地＜80kDa，最佳地为约45kDa。步骤S105可以分子筛或是重力管柱等进行。在一实施例中，在进行步骤S105之前于步骤S103获得的丝胶蛋白初萃液可先经过抽气过滤亦以及透析去除不想要的成分。
本发明的其他目的提供一种利用上述方法制得的丝胶蛋白萃取物。
本发明的另一目的提供上述丝胶蛋白萃取物用于制备抗氧化组合物的用途。
本发明的又一实施例提供一种包含上述丝胶蛋白萃取物的抗氧化组合物，上述丝胶蛋白萃取物在抗氧化组合物中的浓度可为1.00mg/mL以上，较佳者可为2.00mg/mL、3.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、6.00mg/mL、7.00mg/mL、8.00mg/mL、9.00mg/mL、10.00mg/mL、15.00mg/mL、20.00mg/mL、25.00mg/mL、30.00mg/mL、35.00mg/mL、40.00mg/mL、45.00mg/mL、50.00mg/mL以上，最佳者浓度可在2.00～50.00mg/mL、3.00～50.00mg/mL、4.00～50.00mg/mL、5.00～50.00mg/mL、6.00～50.00mg/mL、7.00～50.00mg/mL、8.00～50.00mg/mL、9.00～50.00mg/mL、10.00～50.00mg/mL、15.00～50.00mg/mL、20.00～50.00mg/mL、25.00～50.00mg/mL、30.00～50.00mg/mL、35.00～50.00mg/mL、40.00～50.00mg/mL、45.00～50.00mg/mL的范围内。
本发明的抗氧化组合物可为，例如洗剂、乳霜、浆液、喷雾、气雾剂、饼状、软膏、香精、凝胶、糊状物、贴片、笔状物、湿纸巾、面膜、棒状、泡沫物、酏剂、浓缩液等的形式。更具体的，可为用以局部施用于肌肤上的乳液或乳霜的形式，包含但不限于，脸部、颈部、身体躯干与/或四肢的肌肤。
本发明的抗氧化组合物可进一步包含保养品、化妆品或药学上可接受的适用于肌肤的载剂。所述的载剂可为常用于面膜、乳霜、精华液、化妆水等的稀释剂、赋形剂等。载剂可包含溶液类、乳液类、凝胶类、固体类或脂质体类，但不限于此。载剂的实例可包含但不限于水、植物油、矿物油、酯类、醇类、烃油、硅油、蜡类、或上述物质的组合或混合物等。
在一实施例中，本发明的抗氧化组合物视情况可包含本发明所属技术领域的技术人员所公知的用于保养品、化妆品及医药上的其他添加物或其他萃取物。其他萃取物可为不影响本发明的丝胶蛋白萃取物功效的任何动物性或植物性萃取物。动物性萃取物的实例包含，但不限于：胶原蛋白、水解胶原蛋白、水解蛋白、弹力蛋白、胎盘素等。植物性萃取物包含取自芦荟、六月雪、洋甘菊、紫苏、银杏、金缕梅、山桂花、鼠尾草、翠菊、印度冷杉、绿茶、稻米、熊果苷等萃取物。
以下提供具体实例以进一步说明以本发明实施例的丝胶蛋白萃取物制备方法制得的丝胶蛋白萃取物的优点。
1.丝胶蛋白萃取物的制备
将收集的蚕茧清洗干净并剪成1/4大小之后，在80℃烘干24小时。
将蚕茧与包含1wt.％的氢氧化钠、0.2wt.％的氢氧化钾以及0.2wt.％的碳酸钠的碱液混合以获得丝胶蛋白初萃液，其中混合比例为蚕茧(g)：碱液(mL)约1：50。对丝胶蛋白初萃液进行抽气过滤，接着再以MWCO 12000～14000透析袋进行透析。
最后分别以100kDa、50kDa以及10kDa管柱对透析过的丝胶蛋白初萃液进行筛选，取得其中包含分子量100kDa以上的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物1、其中包含分子量50～100kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物2、其中包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3以及其中包含分子量10kDa以下的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物4。
2.丝胶蛋白萃取物的分析
a.清除DPPH自由基能力分析
取1.5mL的丝胶蛋白萃取物1～4分别与3mL DPPH(0.02％w/v)混合均匀，在37℃下避光反应30分钟，反应后以9000rpm离心3分钟，使用分光亮度计在波长为517nm测量吸光值，实验重复进行三次。清除DPPH自由基活性以下列公式计算：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A/B)]×100％
其中A为样品的OD517吸光值；B为空白组的OD517吸光值。
依照上述公式计算出的结果列于以下表1。
表1
b.清除ABTS自由基能力分析
先将ABTS(7mM)与过硫酸钾(Potassium persulfate,7.35mM)以2：1比例混合均匀，在4℃下避光反应12小时，再将反应后ABTS混合溶液使用乙醇(95％)稀释，直到使用分光亮度计在波长为750nm测量吸光值为1±0.02，之后将50mL的丝胶蛋白萃取物1～4分别与150mL调整后ABTS混合溶液混合均匀，避光反应6分钟，使用分光亮度计在波长为750nm测量吸光值，实验重复进行三次。清除ABTS自由基活性以下列公式计算：
ABTS自由基清除率(％)＝[1-(A/B)]×100％
其中A为样品组的OD750吸光值；B为空白组的OD750吸光值。
依照上述公式计算出的结果列于以下表2。
表2
c.螯合亚铁离子能力分析
取4mL的丝胶蛋白萃取物1～4分别与0.4mL氯化铁(Ferric chloride,2mmol/L)混合均匀，再加入0.8mL菲洛嗪(Ferrozine,5mmol/L)混合均匀，避光反应10分钟，反应后以9000rpm离心3分钟，使用分光亮度计在波长为562nm测量吸光值，实验重复进行三次。亚铁螯合能力以下列公式计算：
亚铁螯合能力(％)＝[1-(A/B)]×100％
A为样品组的OD562吸光值；B为空白组的OD562吸光值。
依照上述公式计算出的结果列于以下表3。
表3
| 样品 | 浓度 | 亚铁螯合能力(％) |
| 丝胶蛋白萃取物1 | 2.5mg/mL | 30.17±0.07 |
| 丝胶蛋白萃取物2 | 2.5mg/mL | 86.55±0.28 |
| 丝胶蛋白萃取物3 | 2.5mg/mL | 92.31±0.04 |
| 丝胶蛋白萃取物4 | 2.5mg/mL | 25.92±0.12 |
d.超氧岐化酶(SOD-like)活性分析
将0.2mL的丝胶蛋白萃取物1～4分别与5.7mLTris-EDTA缓冲液(pH 7.4，含有1mMEDTA的0.05M Tris-HCl缓冲液)混合均匀，再加入0.1mL苯三酚(Pyrogallol,60mM)混合均匀，使用分光亮度计在波长为325nm测量吸光值，每30秒测量一次，总共纪录5分钟，超氧歧化酶活性以下列公式计算：
超氧岐化酶活性(U/mL)＝(ΔA_0/T-ΔA/T)/((ΔA_0/T)×0.5)×Vt/Vs×N
其中ΔA_0为空白组吸光值变化速率；ΔA：样品吸光值变化速率；T为反应时间；Vt为反应总体积；Vs为加入样品体积；N为稀释倍数；0.5为达50％的氧化速率。
依照上述公式计算出的结果列于以下表4。
表4
e.酪胺酸酶抑制分析
取0.4mL的丝胶蛋白萃取物1～4分别与0.4mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.2mol/L)混合均匀，再加入0.1mL的酪胺酸(Tyrosine,0.025％)震荡混合10分钟，之后加入0.1mL的酪胺酸酶(50U)，使用分光亮度计在波长为475nm测量初始吸光值，接下来在室温反应25分钟，反应后再使用分光亮度计在波长为475nm测量吸光值。酪胺酸酶抑制率以下列公式计算：
酪胺酸酶抑制率(％)＝[(B_t-B_0)-(A_t-A_0)]/(B_t-B_0)×100％
其中A0为样品初始OD475吸光值；At为样品反应后OD475吸光值；B0为空白组初始OD475吸光值；B0为空白组反应后OD475吸光值。
依照上述公式计算出的结果列于以下表5。
表5
| 样品 | 浓度 | 酪胺酸酶抑制率(％) |
| 丝胶蛋白萃取物1 | 30mg/mL | 29.77±0.56 |
| 丝胶蛋白萃取物2 | 30mg/mL | 66.97±0.62 |
| 丝胶蛋白萃取物3 | 30mg/mL | 98.72±1.72 |
| 丝胶蛋白萃取物4 | 30mg/mL | 54.67±0.52 |
由以上表1至表5所示的结果可以发现，其中包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3具有最佳的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亚铁螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率。
接着对包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3以SDS-PAGE进行分析，发现包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3在45kDa位置有明显条带，表示包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3中包含大量分子量为45kDa的丝胶蛋白。
3.不同浓度的丝胶蛋白萃取物能力分析
由以上关于丝胶蛋白萃取物的分析可以看出包含分子量10～50kDa的丝胶蛋白的丝胶蛋白萃取物3具有最佳的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亚铁螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此以下将以不同浓度的丝胶蛋白萃取物3续行分析。
a.清除DPPH自由基能力分析
利用与上述2.a类似的方式，对1％的2,6-二丁基羟基甲苯(BHT)与浓度分别为1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、40mg/mL、以及50mg/mL的丝胶蛋白萃取物3的清除DPPH自由基能力进行分析，分析结果如图2所示。
b.清除ABTS自由基能力分析
利用与上述2.b类似的方式，对1％的维他命C(Vit C)与浓度分别为1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL以及25mg/mL的丝胶蛋白萃取物3的清除ABTS自由基能力进行分析，分析结果如图3所示。
c.螯合亚铁离子能力分析
利用与上述2.c类似的方式，对2mg/mL的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)与浓度分别为1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL以及25mg/mL的丝胶蛋白萃取物3的螯合亚铁离子能力进行分析，分析结果如图4所示。
d.超氧岐化酶活性分析
利用与上述2.d类似的方式，对浓度分别为1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、40mg/mL、以及50mg/mL的丝胶蛋白萃取物3的超氧岐化酶活性进行分析，分析结果如图5所示。
e.酪胺酸酶抑制分析
利用与上述2.e类似的方式，对1％曲酸与浓度分别为1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、以及40mg/mL的丝胶蛋白萃取物3的酪胺酸酶抑制进行分析，分析结果如图6所示。
图2为1％BHT与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的清除DPPH自由基能力的比较图。由图2可看出，浓度在50mg/mL时，清除DPPH自由基能力高达约66.51％，且经过进一步实验后发现，浓度在约19.39mg/mL时，清除DPPH自由基能力即可达约50.00％。图3为1％Vit C与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的清除ABTS自由基能力的比较图。由图3可看出，浓度为1mg/mL的丝胶蛋白萃取物即具有与1％Vit C相当的清除ABTS自由基能力，表示本案实施例的丝胶蛋白萃取物具有强清除ABTS自由基能力。图4为2mg/mL EDTA-2Na与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的螯合亚铁离子能力的比较图。由图4可看出，浓度为5mg/mL的丝胶蛋白萃取物具有与2mg/mL EDTA-2Na相当的螯合亚铁离子能力，表示具有强螯合亚铁离子能力。图5为具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的超氧岐化酶活性的比较图。由图5可以看出，在浓度为50mg/mL时，丝胶蛋白萃取物超氧岐化酶活性会大幅提升。图6为1％曲酸与具有不同浓度的根据本案实施例的丝胶蛋白萃取物的酪胺酸酶抑制率的比较图。由图6可以看出，浓度为25mg/mL的丝胶蛋白萃取物具有与1％曲酸相当的酪胺酸酶抑制率，且进一步研究可发现，当浓度为3.57mg/mL时，酪胺酸酶抑制率即可达约50.00％。
由以上实验结果可以看出依据本案实施例的丝胶蛋白萃取物制备方法制得的丝胶蛋白萃取物具有良好的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亚铁螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此可用于制备抗氧化组合物，而所制得的抗氧化组合物将具有优越的抗氧化功能。
Claims (10)
1.一种丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
预处理蚕茧；
以碱液萃取所述蚕茧以获得丝胶蛋白初萃液；以及
对所述丝胶蛋白初萃液进行筛选以取得丝胶蛋白萃取物，
其中所述碱液包含金属氢氧化物及金属碳酸盐。
2.如权利要求1所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，所述丝胶蛋白萃取物中的丝胶蛋白分子量＜100kDa。
3.如权利要求1所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，所述金属氢氧化物为碱金属氢氧化物且所述金属碳酸盐为碱金属碳酸盐。
4.如权利要求3所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，所述碱金属氢氧化物与所述碱金属碳酸盐的重量比为(2～5)：(1～10)。
5.如权利要求4所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，所述碱液包含0.2～10wt.％的所述碱金属氢氧化物以及0.1～5wt.％的所述碱金属碳酸盐。
6.如权利要求1所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，在所述步骤中，每克所述蚕茧以50mL的所述碱液萃取。
7.如权利要求1所述的丝胶蛋白萃取物制备方法，其特征在于，所述预处理步骤包含以80℃烘干所述蚕茧24小时。
8.一种丝胶蛋白萃取物，其特征在于，以如权利要求1至7中任一项所述的制备方法制成。
9.一种如权利要求8所述的丝胶蛋白萃取物用于制备抗氧化组合物的用途。
10.一种抗氧化组合物，包含如权利要求8所述的丝胶蛋白萃取物。
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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