TWI756643B - 絲膠蛋白萃取物、其製備方法與用途以及包含其之抗氧化組合物 - Google Patents

絲膠蛋白萃取物、其製備方法與用途以及包含其之抗氧化組合物 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種絲膠蛋白萃取物製備方法，其包含以下步驟：預處理蠶繭；以鹼液萃取蠶繭以獲得絲膠蛋白初萃液；以及對絲膠蛋白初萃液進行篩選以取得絲膠蛋白萃取物，其中鹼液包含金屬氫氧化物及金屬碳酸鹽。

Description

絲膠蛋白萃取物、其製備方法與用途以及包含其之抗氧 化組合物
本發明係關於一種蠶絲蛋白溶液、其製備方法與用途以及包含其之抗氧化組合物，更具體而言，係關於一種絲膠蛋白萃取物、其製備方法與用途以及包含其之抗氧化組合物。
絲膠蛋白(sericin)是蠶或柞蠶在生產蠶絲時所分泌的一種蛋白質。蠶絲主要由絲膠蛋白及絲蛋白兩種蛋白質構成。蠶絲中含有70~80%的絲蛋白及20~30%的絲膠蛋白。
蠶絲的絲膠蛋白是一種水溶性的高分子蛋白，其分子量大約為10~300kDa，且含有18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸含量高達20%。絲膠蛋白因其良好的水溶性、促細胞黏附和增殖活性、更低的免疫原性，以及獨特的原位熒光性、抗氧化活性和酪胺酸酶抑制作用等性能，而被廣泛應用在織物整理塗層、化妝品添加劑，以及食品、醫藥、功能性生物材料。
絲膠蛋白在溶液中的分子量受到溫度、pH、以及萃取方式的影響。不同分子量的絲膠蛋白具有不同的功效，且以不同萃取方式得到之絲膠蛋白萃取物也具有不同的功效。
有鑑於不同分子量的絲膠蛋白具有不同的功效，且以不同萃取方式得到之絲膠蛋白萃取物也具有不同的功效，本發明提供以新的萃取方式製備絲膠蛋白萃取物的一種絲膠蛋白萃取物製備方法，其包含以下步驟：預處理蠶繭；以鹼液萃取蠶繭以獲得絲膠蛋白初萃液；以及對絲膠蛋白初萃液進行篩選以取得絲膠蛋白萃取物，其中鹼液包含金屬氫氧化物及金屬碳酸鹽。
較佳者，絲膠蛋白萃取物中的絲膠蛋白分子量<100kDa。
較佳者，金屬氫氧化物為鹼金屬氫氧化物且金屬碳酸鹽為鹼金屬碳酸鹽。
較佳者，鹼金屬氫氧化物與鹼金屬碳酸鹽的重量比為2~5：1~10。
較佳者，鹼液包含0.2~10wt.%的鹼金屬氫氧化物以及0.1~5wt.%的鹼金屬碳酸鹽。
較佳者，在萃取步驟中，每克蠶繭係以50mL的鹼液萃取。
較佳者，預處理步驟包含以80℃烘乾蠶繭24小時。
根據本發明的另一態樣，提供一種以上述方法製得之絲膠蛋白萃取物。
根據本發明的又一態樣，提供一種上述絲膠蛋白萃取物用於製備抗氧化組合物的用途。
根據本發明的再一態樣，提供一種抗氧化組合物，其包含上述絲膠蛋白萃取物。
依據上述絲膠蛋白萃取物製備方法製得之絲膠蛋白萃取物具有良好的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亞鐵螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此可用於製備抗氧化組合物，而所製得之抗氧化組合物將具有優越的抗氧化功能。
10:絲膠蛋白萃取物製備方法
S101~S105:步驟
結合附圖參照以下詳細說明將使本發明對於所述技術領域中具有通常知識者而言變得更加顯而易見，其中：第1圖係為依據本案實施例的絲膠蛋白萃取物製備方法的示意性流程圖；第2圖係為1%BHT與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的清除DPPH自由基能力的比較圖；第3圖係為1%VitC與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的清除ABTS自由基能力的比較圖；第4圖係為2mg/mL EDTA-2Na與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的螯合亞鐵離子能力的比較圖；第5圖係為具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的超氧岐化酶活性的比較圖；以及 第6圖係為1%麴酸與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的酪胺酸酶抑制率的比較圖。
本發明參考其中繪示本發明例示性實施例之圖式而更充分地描述。如本領域中具有通常知識者將認識到的，本發明的實施例可以各種不同方式進行形式以及細節上的修改而不脫離本揭露的精神或範圍。
於本文中，用語「約」及其相似用語是作為近似用語而不是作為程度用語使用，且旨在用於計入技術領域中具有通常知識者將認知到的測量或計算中的固有偏差。另外，本文描述的任何數值範圍旨在包括包含在描述範圍中的相同數值精確度之所有子範圍。例如，「1.0至10.0」的範圍旨在包括在所描述的最小值1.0與所描述的最大值10.0之間(且包含最小值及最大值)的所有子範圍，亦即，具有等於或大於1.0的最小值及等於或小於10.0的最大值，例如像2.4至7.6。本文描述的任何最大數值限制旨在包括包含在本文中描述的所有較低的數值限制以及在本說明書中描述的任何最小數值限制旨在包含在本文中描述的所有較高的數值限制。
第1圖係為依據本案實施例的絲膠蛋白萃取物製備方法10的示意性流程圖。如第1圖所示，絲膠蛋白萃取物製備方法10可包含預處理蠶繭的步驟S101、以鹼液萃取蠶繭以獲得絲膠蛋白初萃液的步驟S103、以及對絲膠蛋白初萃液進行篩選以取得絲膠蛋白萃取物的步驟S105。
步驟S101的預處理蠶繭的步驟可包含將收集的蠶繭清洗乾淨並剪成適當大小之後，將蠶繭烘乾約24小時，以除去蠶繭中大部分的水 分。當烘乾溫度過高時，可能會導致蠶繭中的絲膠蛋白變性，因此烘乾蠶繭的溫度不超過100℃，較佳為約70~95℃，更佳地為約80℃。
接著，在步驟S103中，透過將於步驟S101中預處理過的蠶繭與鹼液混合來對蠶繭進行萃取，從而可獲得絲膠蛋白初萃液，其中蠶繭(g)與鹼液(mL)的比例可為約1：50。步驟S103中所用的鹼液可包含金屬氫氧化物以及金屬碳酸鹽的混合物。金屬氫氧化物可為鹼金屬氫氧化物、鹼土金屬氫氧化物或其組合。鹼金屬氫氧化物的實例可包含但不限於氫氧化鈉、氫氧化鉀以及氫氧化鋰，而鹼土金屬氫氧化物的實例可包含但不限於氫氧化鎂、氫氧化鈣以及氫氧化鋇。金屬碳酸鹽可為鹼金屬碳酸鹽或鹼土金屬碳酸鹽。鹼金屬碳酸鹽的實例可包含但不限於碳酸鈉以及碳酸鉀，而鹼土金屬碳酸鹽的實例可包含但不限於碳酸鎂以及碳酸鈣。在一較佳實施例中，金屬氫氧化物與金屬碳酸鹽的重量比約為2~5：1~10。進一步地，金屬氫氧化物可兩種以上不同的金屬氫氧化物的混合物，舉例而言，金屬氫氧化物可包含鹼金屬氫氧化物與鹼土金屬氫氧化物的混合物、至少兩種不同的鹼金屬氫氧化物的混合物或至少兩種不同的鹼土金屬氫氧化物的混合物。在一較佳實施例中，金屬氫氧化物為至少兩種不同的鹼金屬氫氧化物的混合物，舉例而言為，金屬氫氧化物可為氫氧化鈉以及氫氧化鉀的混合物。
在一實施例中，鹼液可包含0.2~10wt.%的金屬氫氧化物以及0.1~5wt.%的金屬碳酸鹽，較佳地，可包含0.2~10wt.%的鹼金屬氫氧化物以及0.1~5wt.%的鹼金屬碳酸鹽。當金屬氫氧化物包含兩種金屬氫氧化物時(以下稱為第一金屬氫氧化物以及第二金屬氫氧化物)，鹼液可包含0.1~5wt.% 的第一金屬氫氧化物、0.1~5wt.%的第二金屬氫氧化物、以及0.1~5wt.%的金屬碳酸鹽，其中，第一金屬氫氧化物以及第二金屬氫氧化物可分別獨立地為鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物，在一較佳實施例中，第一金屬氫氧化物以及第二金屬氫氧化物皆為鹼金屬氫氧化物，且第一金屬氫氧化物可為氫氧化鈉而第二金屬氫氧化物可為氫氧化鉀。在一實施例中，鹼金屬碳酸鹽為碳酸鈉，鹼液可包含0.1~5wt.%的氫氧化鈉、0.1~5wt.%的氫氧化鉀以及0.1~5wt.%的碳酸鈉。在一較佳實施例中，鹼液可包含0.2~1wt.%的氫氧化鈉、0.2~1wt.%的氫氧化鉀以及0.2~1wt.%的碳酸鈉。
在於步驟S103獲得絲膠蛋白初萃液後，進行對絲膠蛋白初萃液進行篩選以取得絲膠蛋白萃取物的步驟S105，以使最後獲得之絲膠蛋白萃取物中的絲膠蛋白的分子量<100kDa，較佳地<80kDa，最佳地為約45kDa。步驟S105可以分子篩或是重力管柱等進行。在一實施例中，在進行步驟S105之前於步驟S103獲得之絲膠蛋白初萃液可先經過抽氣過濾亦以及透析去除不想要的成分。
本發明的其他目的提供一種利用上述方法製得之絲膠蛋白萃取物。
本發明的另一目的提供上述絲膠蛋白萃取物用於製備抗氧化組合物的用途。
本發明的又一實施例提供一種包含上述絲膠蛋白萃取物的抗氧化組合物，上述絲膠蛋白萃取物在抗氧化組合物中的濃度可為1.00mg/mL以上，較佳者可為2.00mg/mL、3.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、6.00mg/mL、7.00mg/mL、8.00mg/mL、9.00mg/mL、10.00 mg/mL、15.00mg/mL、20.00mg/mL、25.00mg/mL、30.00mg/mL、35.00mg/mL、40.00mg/mL、45.00mg/mL、50.00mg/mL以上，最佳者濃度可在2.00~50.00mg/mL、3.00~50.00mg/mL、4.00~50.00mg/mL、5.00~50.00mg/mL、6.00~50.00mg/mL、7.00~50.00mg/mL、8.00~50.00mg/mL、9.00~50.00mg/mL、10.00~50.00mg/mL、15.00~50.00mg/mL、20.00~50.00mg/mL、25.00~50.00mg/mL、30.00~50.00mg/mL、35.00~50.00mg/mL、40.00~50.00mg/mL、45.00~50.00mg/mL的範圍內。
本發明之抗氧化組合物可為，例如洗劑、乳霜、漿液、噴霧、氣霧劑、餅狀、軟膏、香精、凝膠、糊狀物、貼片、筆狀物、濕紙巾、面膜、棒狀、泡沫物、酏劑、濃縮液等之形式。更具體的，可為用以局部施用於肌膚上之乳液或乳霜之形式，包含但不限於，臉部、頸部、身體軀幹與/或四肢之肌膚。
本發明之抗氧化組合物可可進一步包含保養品、化妝品或藥學上可接受之適用於肌膚之載劑。所述之載劑可為常用於面膜、乳霜、精華液、化妝水等的稀釋劑、賦形劑等。載劑可包含溶液類、乳液類、凝膠類、固體類或脂質體類，但不限於此。載劑的實例可包含但不限於水、植物油、礦物油、酯類、醇類、烴油、矽油、蠟類、或上述物質之組合或混合物等。
在一實施例中，本發明之抗氧化組合物視情況可包含本發明所屬之技術領域之通常知識者所習知之用於保養品、化妝品及醫藥上之其他添加物或其他萃取物。其他萃取物可為不影響本發明之絲膠蛋白萃取物功效之任何動物性或植物性萃取物。動物性萃取物之實例包含，但不限於：膠原蛋白、水解膠原蛋白、水解蛋白、彈力蛋白、胎盤素等。植物性萃取物包含取自蘆薈、六 月雪、洋甘菊、紫蘇、銀杏、金縷梅、山桂花、鼠尾草、翠菊、印度冷杉、綠茶、稻米、熊果苷等萃取物。
以下提供具體實例以進一步說明以本發明實施例之絲膠蛋白萃取物製備方法製得之絲膠蛋白萃取物的優點。
1.絲膠蛋白萃取物的製備
將收集的蠶繭清洗乾淨並剪成1/4大小之後，在80℃烘乾24小時。
將蠶繭與包含1wt.%的氫氧化鈉、0.2wt.%的氫氧化鉀以及0.2wt.%的碳酸鈉的鹼液混合以獲得絲膠蛋白初萃液，其中混合比例為蠶繭(g)：鹼液(mL)約1：50。對絲膠蛋白初萃液進行抽氣過濾，接著再以MWCO 12000~14000透析袋進行透析。
最後分別以100kDa、50kDa以及10kDa管柱對透析過的絲膠蛋白初萃液進行篩選，取得其中包含分子量100kDa以上的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物1、其中包含分子量50~100kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物2、其中包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3以及其中包含分子量10kDa以下的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物4。
2.絲膠蛋白萃取物的分析
a.清除DPPH自由基能力分析
取1.5mL的絲膠蛋白萃取物1~4分別與3mL DPPH(0.02% w/v)混合均勻，在37℃下避光反應30分鐘，反應後以9000rpm離心3分鐘，使用分光光度計在波長為517nm測量吸光值，實驗重複進行三次。清除DPPH自由基活性以下列公式計算：DPPH自由基清除率(%)=[1-(A/B)]×100%
其中A為樣品之OD517吸光值；B為空白組之OD517吸光值。
依照上述公式計算出的結果列於以下表1。
Figure 109107911-A0305-02-0010-1
b.清除ABTS自由基能力分析
先將ABTS(7mM)與過硫酸鉀(Potassium persulfate,7.35mM)以2：1比例混合均勻，在4℃下避光反應12小時，再將反應後ABTS混合溶液使用乙醇(95%)稀釋，直到使用分光光度計在波長為750nm測量吸光值為1±0.02，之後將50mL的絲膠蛋白萃取物1~4分別與150mL調整後ABTS混合溶液混合均勻，避光反應6分鐘，使用分光光度計在波長為750nm測量吸光值，實驗重複進行三次。清除ABTS自由基活性以下列公式計算：ABTS自由基清除率(%)=[1-(A/B)]×100%
其中A為樣品組之OD750吸光值；B為空白組之OD750吸光值。
依照上述公式計算出的結果列於以下表2。
Figure 109107911-A0305-02-0010-2
Figure 109107911-A0305-02-0011-3
c.螯合亞鐵離子能力分析
取4mL的絲膠蛋白萃取物1~4分別與0.4mL氯化鐵(Ferric chloride,2mmol/L)混合均勻，再加入0.8mL菲洛嗪(Ferrozine,5mmol/L)混合均勻，避光反應10分鐘，反應後以9000rpm離心3分鐘，使用分光光度計在波長為562nm測量吸光值，實驗重複進行三次。亞鐵螯合能力以下列公式計算：亞鐵螯合能力(%)=[1-(A/B)]×100%
A為樣品組之OD562吸光值；B為空白組之OD562吸光值。
依照上述公式計算出的結果列於以下表3。
Figure 109107911-A0305-02-0011-4
d.超氧岐化酶(SOD-like)活性分析
將0.2mL的絲膠蛋白萃取物1~4分別與5.7mLTris-EDTA緩衝液(pH 7.4，含有1mM EDTA的0.05M Tris-HCl緩衝液)混合均勻，再加入0.1mL苯三酚(Pyrogallol,60mM)混合均勻，使用分光光度計在波長為325nm測量吸光值，每30秒測量一次，總共紀錄5分鐘，超氧歧化酶活性以下列公式計算：超氧岐化酶活性(U/mL)=(ΔA_0/T-ΔA/T)/((ΔA_0/T)×0.5)×Vt/Vs×N
其中ΔA_0為空白組吸光值變化速率；ΔA：樣品吸光值變化速率；T為反應時間；Vt為反應總體積；Vs為加入樣品體積；N為稀釋倍數；0.5為達50%之氧化速率。
依照上述公式計算出的結果列於以下表4。
Figure 109107911-A0305-02-0012-5
e.酪胺酸酶抑制分析
取0.4mL的絲膠蛋白萃取物1~4分別與0.4mL磷酸鹽緩衝液(pH 6.8，0.2mol/L)混合均勻，再加入0.1mL的酪胺酸(Tyrosine,0.025%)震盪混合10分鐘，之後加入0.1mL的酪胺酸酶(50U)，使用分光光度計在波長為475nm測量初始吸光值，接下來在室溫反應25分鐘，反應後再使用分光光度計在波長為475nm測量吸光值。酪胺酸酶抑制率以下列公式計算： 酪胺酸酶抑制率(%)=[(B_t-B_0)-(A_t-A_0)]/(B_t-B_0)×100%
其中A0為樣品初始OD475吸光值；At為樣品反應後OD475吸光值；B0為空白組初始OD475吸光值；B0為空白組反應後OD475吸光值。
依照上述公式計算出的結果列於以下表5。
Figure 109107911-A0305-02-0012-6
Figure 109107911-A0305-02-0013-7
由以上表1至表5所示之結果可以發現，其中包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3具有最佳的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亞鐵螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率。
接著對包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3以SDS-PAGE進行分析，發現包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3在45kDa位置有明顯條帶，表示包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3中包含大量分子量為45kDa的絲膠蛋白。
3.不同濃度的絲膠蛋白萃取物能力分析
由以上關於絲膠蛋白萃取物的分析可以看出包含分子量10~50kDa的絲膠蛋白的絲膠蛋白萃取物3具有最佳的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亞鐵螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此以下將以不同濃度的絲膠蛋白萃取物3續行分析。
a.清除DPPH自由基能力分析
利用與上述2.a類似的方式，對1%的2,6-二丁基羥基甲苯(BHT)與濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、40mg/mL、以及50mg/mL的絲膠蛋白萃取物3的清除DPPH自由基能力進行分析，分析結果如第2圖所示。
b.清除ABTS自由基能力分析
利用與上述2.b類似的方式，對1%的維他命C(Vit C)與濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL以及25mg/mL的絲膠蛋白萃取物3的清除ABTS自由基能力進行分析，分析結果如第3圖所示。
c.螯合亞鐵離子能力分析
利用與上述2.c類似的方式，對2mg/mL的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)與濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL以及25mg/mL的絲膠蛋白萃取物3的螯合亞鐵離子能力進行分析，分析結果如第4圖所示。
d.超氧岐化酶活性分析
利用與上述2.d類似的方式，對濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、40mg/mL、以及50mg/mL的絲膠蛋白萃取物3的超氧岐化酶活性進行分析，分析結果如第5圖所示。
e.酪胺酸酶抑制分析
利用與上述2.e類似的方式，對1%麴酸與濃度分別為1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、以及40mg/mL的絲膠蛋白萃取物3的酪胺酸酶抑制進行分析，分析結果如第6圖所示。
第2圖係為1%BHT與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的清除DPPH自由基能力的比較圖。由第2圖可看出，濃度在50mg/mL時，清除DPPH自由基能力高達約66.51%，且經過進一步實驗後發現，濃度在約19.39mg/mL時，清除DPPH自由基能力即可達約50.00%。第3圖係為1%Vit C與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的清除ABTS自由基能力的比較圖。由第3圖可看出，濃度為1mg/mL的絲膠蛋白萃取物即具有與1%Vit C相當的清除ABTS自由基能力，表示本案實施例的絲膠蛋白萃取物具有強清除ABTS自由基能力。第4圖係為2mg/mL EDTA-2Na與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的螯合亞鐵離子能力的比較圖。由第4圖可看出，濃度為5mg/mL的絲膠蛋白萃取物具有與2mg/mL EDTA-2Na相當的螯合亞鐵離子能力，表示具有強螯合亞鐵離子能力。第5圖係為具有不同濃度的根據本案實施例 的絲膠蛋白萃取物的超氧岐化酶活性的比較圖。由第5圖可以看出，在濃度為50mg/mL時，絲膠蛋白萃取物超氧岐化酶活性會大幅提升。第6圖係為1%麴酸與具有不同濃度的根據本案實施例的絲膠蛋白萃取物的酪胺酸酶抑制率的比較圖。由第6圖可以看出，濃度為25mg/mL的絲膠蛋白萃取物具有與1%麴酸相當的酪胺酸酶抑制率，且進一步研究可發現，當濃度為3.57mg/mL時，酪胺酸酶抑制率即可達約50.00%。
由以上實驗結果可以看出依據本案實施例的絲膠蛋白萃取物製備方法製得之絲膠蛋白萃取物具有良好的清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、亞鐵螯合能力、超氧岐化酶活性以及酪胺酸酶抑制率，因此可用於製備抗氧化組合物，而所製得之抗氧化組合物將具有優越的抗氧化功能。
10:絲膠蛋白萃取物製備方法
S101~S105:步驟

Claims (6)

  1. 一種絲膠蛋白萃取物製備方法，其包含以下步驟：清洗一蠶繭後，以80℃烘乾該蠶繭24小時；以一鹼液萃取該蠶繭以獲得一絲膠蛋白初萃液；以及對該絲膠蛋白初萃液進行篩選以取得一絲膠蛋白萃取物，其中該鹼液包含0.2~10wt.%的一鹼金屬氫氧化物及0.1~5wt.%的一鹼金屬碳酸鹽。
  2. 如請求項1所述之絲膠蛋白萃取物製備方法，其中該絲膠蛋白萃取物中的絲膠蛋白分子量<100kDa。
  3. 如請求項1所述之絲膠蛋白萃取物製備方法，其中在該萃取步驟中，每克該蠶繭係以50mL的該鹼液萃取。
  4. 一種絲膠蛋白萃取物，其係以如請求項1至3中任一項所述之製備方法製成。
  5. 一種如請求項4所述之絲膠蛋白萃取物用於製備抗氧化組合物的用途。
  6. 一種抗氧化組合物，包含如請求項4所述之絲膠蛋白萃取物。
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