KR101989934B1 - 세리신 추출물의 친환경적인 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치로부터 세리신을 추출하여 얻어지는 세리신 추출물, 이의 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 약학 조성물, 화장료 조성물 및 세정 조성물을 제공한다.

Description

세리신 추출물의 친환경적인 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 조성물{Method of preparing Cocoon Sericin extract, and composition including the same}

본 발명은 세리신 추출물의 친환경적인 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치로부터 세리신을 추출하여 해양심층수 또는 온천수의 미네랄 성분과 세리신을 포함하는 추출물, 또는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치 및 상백피로부터 해양심층수 또는 온천수의 미네랄 성분, 세리신 및 상백피 추출물을 포함하는 추출물, 이의 제조방법, 및 상기 추출물을 포함하는 약학 조성물, 화장료 조성물 및 세정 조성물에 관한 것이다.

견사는 누에의 견사선(silk gland cells)에서 합성되고 견사선 세포 내강(cell lumen)에 저장되었다가 액상견(liquid silk) 상태로 분비되어 누에고치를 만든다. 누에고치 견사(silk fiber)의 구조는 중심부 코아(core)부분의 피브로인(fibroin) 단백질과 그 주위를 둘러싸고 있는 세리신(sericin) 단백질로 이루어져 있다. 세리신은 견중합체(silk polymer)에서 자연 가교(natural cross-link, natural rubber) 역할을 하여 고치의 형태를 만든다. 실크의 정련(silk degumming)은 피브로인 부분에서 세리신을 제거하여 우아한 광택과 부드러운 촉감을 위한 중요한 공정으로 주로 순수 물 또는 비누(mareseille soap; Svilokos 등 1992) 또는 소다 알칼리법(Na₂CO₃,NaOH, Na₂S₂O₄, Na₂P₃O₁₀, CH₃COOH 등; Rangam 등 2010)을 사용한다.

실크 산업에서는 피브로인 섬유만을 필요하기 때문에 세리신을 포함한 대량의 용액이 폐수(waste water)로 처리되었으나 최근의 세리신의 유효성, 기능성이 보고되면서 부산물(offshoot, by-product) 재활용하고 있다. 그러나, 정련공정에서 세리신 용해도를 높이기 위해 사용한 화학약품을 제거 분리하기 위한 단계 후에도 비누/소다 알칼리 용액에 의한 정련은 여러 불순물과 화학 시약을 포함하고 있어 순수 세리신 추출은 거의 불가능하며 중화단계, 정제 또는 투석 단계 등의 공정이 필요하다.

이에 고온고압법(high temperature and high pressure, HTHP; Sheetal 등 1994), 산정련법(Gulrajani 등 1992), 효소정련법(Sheetal 등 1994) 등을 통한 실크 정련에서 추출한 세리신이 보고되고 있지만 에너지와 시간 낭비, 폐수와 같은 문제점이 있다.

기존의 비누, 알칼리, 산 등을 정련방법은 세리신 제거에는 효과적이지만 세리신 단백질 구조의 가수분해, 유효성분의 소실 등을 초래한다. 그러므로 세리신 손상을 최소화하고 화학 시약 사용 없이 에너지 효율 높은 세리신 추출 분리법 개발이 필요하다. 세리신 정련과정 동안 세리신은 부분적 또는 전반적으로 가수분해 되고 정련 버퍼 내에 용해된다. 추출 온도와 시간 등은 세리신의 효과와 질, 양에 영향을 주며 유효한 물질을 얻기 위해 조절이 필요하다.

알려진 바와 같이 세리신은 사람 피부의 자연 보습인자와 유사한 조성을 가지고 있어 높은 보습능력과 피부각질 등에 강한 결합능력, 자외선 차단 및 주름살 방지기능, 항산화 기능 등이 보고되어 있으나 이 모든 유효 기능을 가진 분리 기술개발은 보고되어 있지 않다.

최근 환경적, 심리적 영향에 의해 피부와 두피는 활성산소 과다로 피부노화, 콜라겐과 케라틴 등이 감소하여 탈모가 발생 된다는 보고에 따라 두피의 건강을 위한 항산화 성분, 항노화, 보습, 항균 기능이 포함된 소재 분리 정제 기술 개발이 필요하다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 일예는 해양심층수 또는 온천수의 자연 탄산염을 이용하여 누에고치로부터 세리신을 추출하여 얻어지는 해양심층수로 얻어진 세리신 추출물(이하, 미네랄-세리신, Marine mineral-Sericin, MS), 이의 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 약학 조성물, 화장료 조성물 및 세정 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 정련시 사용 되는 비누, 소다수 등의 용매를 대체할 수 있는 용매로 자연 탄산 이온(CO₂ + H₂O ⇔ H₂CO₃ ⇔ H⁺ + HCO₃ ^- ⇔ H⁺ + CO₃ ^{2 -})을 포함한 해양심층수 또는 온천수를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 일예는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치로부터 세리신을 추출하여 얻어지는 미네랄과 세리신을 함유하는 미네랄-세리신 (mineral-Sericin, MS) 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치 및 상백피로부터 얻어지는, 미네랄, 세리신 및 상백피를 포함하는 추출물 (이하, 미네랄-세리신-상백피, mineral-Sericin-Morus alba (MSM)추출물) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일예는 누에고치를 고온의 알칼리 수용액으로 장시간 처리한 경우에 발생하는 세리신의 항산화, 미백 등의 기능 손실, 피브로인 및 화학 시약 성분의 혼입, 조성 아미노산과 분자량의 변화 등을 최소화 또는 감소하고자 하는 것이다. 또한, 본 발명은 해양심층수를 이용한 세리신 추출 공정에 있어 안전, 자연 친화적(폐수 전량 사용) 효율적인 과정을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 해양심층수를 이용한 세리신 추출 공정에 있어 항산화, 미백, 주름방지, 항균성, 안정성 등의 기능의 부가 향상을 위한 상백피 추출 과정을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따라 제조된 해양심층수 미네랄 세리신 추출물 또는 동결건조 분말을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일예는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여, 누에 고치를 추출원료로 하여 제조된 세리신을 포함하는 미네랄-세리신 추출물, 상기 미네랄-세리신 추출물의 제조방법, 그리고 상기 미네랄-세리신 추출물을 포함하는 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 바람직한 일 예에서, 본 발명에 따른 세리신 추출물은 해양심층수를 이용하여 누에 고치로부터 제조된 세리신 추출물일 수 있으며, 이하, 미네랄-세리신(Mineral-Sericin, MS) 추출물의 일예로 명명한다.

본 발명의 또 다른 일예는, 해양심층수 또는 온천수를 이용하여, 누에 고치와 상백피 또는 상지를 추출하여 제조된 혼합 추출물(미네랄-세리신-상백피 추출물 이라 함), 상기 혼합 추출물의 제조방법, 그리고 상기 혼합 추출물을 포함하는 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 상백피 또는 상지의 추출물은 누에고치에 상백피 또는 상지를 혼합하여 혼합 추출원료를 제조하여 함께 추출하거나, 누에 고치로부터 제조된 세리신 추출물에 상백피 또는 상지를 첨가하여 추출하거나, 또는 누에 고치로부터 제조된 세리신 추출물에, 별도로 상백피 또는 상지로부터 추출된 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 바람직한 일예에서, 본 발명에 따른 혼합 추출물은 누에 고치로부터 제조된 세리신 추출물에 상백피 또는 상지를 첨가하여 추출한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 해양심층수를 이용하여 누에 고치로부터 제조된 세리신 추출물에 상백피를 첨가하여 추출한 것으로서 이하, 미네랄-세리신-상백피(Mineral Sericin Mours bark; MSM)추출물의 일예로 명명한다.

본 발명에 따른 추출물은 추출액 자체, 농축물 및/또는 분말 형태로 사용될 수 있다. 상기 건조 분말은 동결 건조방법으로 건조된 것일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 미네랄-세리신(MS) 추출물의 제조방법은, (1)누에 고치를 준비하는 단계, (2)미네랄을 포함하는 해양심층수 또는 온천수로, 누에 고치를 추출하여 세리신을 포함하는 추출액을 제조하는 단계, 및 (3) 상기 추출액에 포함된 피브로인을 제거하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 추출물의 제조방법은 (4) 상기 단계 (3)에서 얻은 추출액을 농축하는 단계, 및/또는 (5) 상기 농축액을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물의 제조방법에 있어서 화학 시약의 사용을 배제하고 해양심층수를 이용한 자연 친화적 방법을 이용한 세리신 회수는 미래 산업의 환경보호 측면과 경제적인 파급효과로 그 응용범위가 클 것으로 예상된다. 마린 미네랄을 포함하고 있는 해양심층수 원수를 이용한 실크 생사의 정련은 최소 에너지 비용과 적은 시간으로 미네랄-세리신 추출물의 확보가 가능하면서 실크 피브로인에 대한 혼입과 손상을 최소한으로 하여 기능성 두 물질을 순수 확보하는 것이 가능하다.

본 발명은 전술한 종래 기술에서 누에 고치의 정련 시 사용되는 비누, 소다수 등의 용매를 대체할 수 있는 용매로 자연 탄산 이온(CO₂ + H₂O ⇔ H₂CO₃ ⇔ H⁺ + HCO₃ ^- ⇔ H⁺ + CO₃ ^{2 -})을 포함한 해양심층수를 제공한다. 종래에 세리신을 얻기 위한 비누, 소다 알칼리법(Na₂CO₃,NaOH, Na₂S₂O₄, Na₂P₃O₁₀, CH₃COOH 등) 후의 회수 시에 발생하는 알칼리 성분 제거 단계 제거를 위해 해양심층수 또는 온천수의 자연 탄산염 이온을 이용하여 용해하여 해양 미네랄을 포함 한 순수 세리신을 얻는다.

해수 영역에 이산화탄소가 용해되어 물리적 용해화 화학적 반응이 해수 내에서 일어나고 해수 속 광물과 반응하여 탄산염이 생성되고 이들은 다양한 종류가 있으며 그 중 하나가 탄산나트륨이 있다. 수중에서 탄산 이온들은 CO₂ + H₂O ⇔ H₂CO₃ ⇔ H⁺ + HCO₃ ^- ⇔ H⁺ + CO₃ ^{2 -} 같은 반응식과 같이 다양한 형태로 평형을 이루며 존재한다. 일반적으로 사용하는 탄산나트륨 시약은 물과 반응하여 Na₂CO₃ + H₂O ⇔ NaOH + NaHCO₃ 형태로 존재한다.

본 발명에 따라 해양 심층수를 이용하여 제조한 MS 추출물 또는 MSM 추출물의 미네랄 함량은, 종래 탄산나트륨 용액을 이용한 것보다 나트륨, 마그네슘, 칼륨, 붕소 및 스트론튬의 높다. 구체적인 예에서, 해양심층수를 이용하여 제조한 본 발명에 따른 MS 추출물 또는 MSM 추출물은 나트륨 20,000 내지 50,000 ug/g, 구체적으로 35,000 내지 45,000 ug/g, 마그네슘 15,000 내지 30,000 ug/g, 구체적으로 25,000 내지 30,000 ug/g, 칼륨 2,000 내지 20,000 ug/g, 구체적으로 5,000 내지 17,000 ug/g, 및 스트론튬이 40 내지 250 ug/g, 구체적으로 70 내지 200 ug/g 일 수 있다. 또한, MS 추출물에 비해서, MSM 추출물은 나트륨, 칼슘, 칼륨 및 붕소 함량이 더 높음을 알 수 있다.

구체적으로, 종래의 탄산나트륨을 이용한 추출물과 MS 추출물과 비교하여, 본 발명에 따른 MSM 추출물은 바실러스와 포도상구균에 대한 항균 활성이 있으며(도 7 참조). MSM 추출물은 여드름균과 비듬균에 대해 항균효과가 있으며, MS추출물은 비듬균에 대한 항균력이 있다(도 8 참조).

본 발명의 해양심층수 또는 온천수의 미네랄 성분과 누에 고치의 세리신 단백질을 포함하는 추출물을 제조함에 있어서, 항산화, 미백, 주름방지, 항균성, 안정성 등의 기능의 부가 향상을 위한 상백피 추출물을 추가로 포함하는 추출물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 기존의 비누 또는 알칼리수를 사용하지 않고 해양심층수의 자연 탄산염을 이용하여 세리신 유래 성분의 손실 없이 혹은 항산화, 미백, 항균 기능이 더 좋은 세리신을 추출 정제하는 방법을 제공에 관한 것으로 더욱 상세하게는 동해의 해양심층수 또는 온천수의 자연 탄산염을 이용하여 비누 또는 알칼리수에 비해 높은 용해도, 간단 공정(중화과정 생략), 저비용, 장기 저장 가능한 세리신을 추출 용해 정제하여, 건조 후 제조 된 것을 특징으로 한다.　 또한 상기 해양심층수 마린미네랄-세리신 추출물은 실크 아미노산, 실크 펩타이드, 해양 미네랄 및 상백피 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 화장품, 두피 세정제, 피부 도포제, 피부세정제, 구강세척제 및 식품에 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 추출물은 상기 미네랄은 추출용매인 해양심층수 또는 온천수에 포함된 미네랄 성분일 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 추출물에 포함된 미네랄 성분 및 함량은 80,000 내지 88,000 (mg/L) 범위이며 이에 포함된 나트륨, 마그네슘, 나트륨, 칼슘이 주 미네랄이며, 붕소, 규소, 아연, 스트론튬 등이 미량 원소로 포함되어 있었으며 유해인자는 없었다.

예시적인 실시형태에서, 상기 해양심층수의 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 칼륨 미네랄을 포함하는 마린미네랄 조성물과 세린(24.3 mg/g), 아스파라긴산(21.8 mg/g), 글리신 (11.6 mg/g) 외 12 종의　주요 구성 아미노산 조성 단백질을 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서,　물 또는 소다수로 추출한 세리신 추출물 또는 분말 보다 항산화, 항균성, 미백, 주름 완화 효능이 우수한 MSM 추출물 또는 분말을 제공한다.

또한, 기존의 분리된 세리신 단백질은 보존에 있어 균 증식의 우려가 있어 아지드화나트륨(sodium azide) 등의 방부제를 첨가할 필요가 있어 의약, 식품, 화장품 등에 적용이 어려우나, 본 발명에 따른 세리신 추출물은 해양심층수에 포함된 염화나트륨이 방부제 역할을 수행하여 장기간 안정하게 보관, 유통, 및 제공이 가능하다.

또한 본 발명에 따른 미네랄-세리신 분말은 세리신의 각종 기능, 효능 분석 등에 사용하는 것이 가능하다. 구체적으로 본 발명의 미네랄-세리신은 기존 세리신의 항산화, 항균, 미백 등의 5 배 이상의 효과를 가진다. 이 외에서 보습, 재생, 고영양 등의 기능으로 두발, 피부, 두피 케어에 유효하다.

본 발명의 추출물은 미네랄 성분인 나트륨(Na), 칼슘(Ca), 칼륨(K), 마그네슘(Mg)을 다량 포함하고 있어 pH조절(Na), 피부탄력(K), 피부대사(Mg, Ca)에 유효하다. 본 발명에 따른 세리신 추출에 있어 해양심층수를 이용할 경우 수율이 탄산나트륨 시약을 사용한 것에 비해 높으며, 본 발명에 따른 조추출물, 농축 추출물 및 추출물 분말의 수용액의 경우, 예를 들면 본 발명에 따른 추출물 분말의 1%(w/v) 수용액은, pH 5.5 내지 pH 7.5, 바람직하게는 pH 6.0 내지 7.0을 가져, 피부보호, 소독, 살균 등에 적합하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 추출물 분말의 1%(w/v) 수용액은 pH 6.8 및 염도 5.7로 탈모, 아토피 치료 등의 중성 또는 산성계 제품 생산에 유리하다.

따라서 본 발명에서 얻어진 미네랄-세리신은 성상이 안정하고, 효능이 우수하며 화장품 또는 식품 분야에 사용하는 것이 가능하며 청정한 해양심층수로 추출 분리 되어 버려지는 양이 적고, 또한 세리신이 제거된 피브로인은 섬유 또는 타 분야에 유용하게 응용될 수 있다. 결국, 본 발명은 새로운 세리신의 추출분리 기술과 제품 개발 효과에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에 따른 추출물은 세리신 단백질을 포함하는 추출물과 미네랄 및 뽕나무 추출물을 포함하는 추출물일 수 있다. 본 발명에 따른 추출물에 포함된 세리신 또는 이의 단편은 10 내지 250 kDa의 분자량을 가지며, 탄산나트륨 추출물은 저분자 상태로 모두 분해된 상태를 보이나 MS 추출물 및 MSM 추출물의 경우는 다양한 범위의 단백질 분포가 확인되었다(도 2). 또한, 만노스, 갈락토스가 결합된 당단백질인 세리신 추출물은 활성과 효능 유지에 유효하다.

본 발명에 따른 추출물은 세리신 단백질 및 이의 단편인 펩타이드를 포함하며, 구체적으로 아미노산 종류 및 함량을 분석한 결과, 15종의 구성 아미노산으로 분석되었으며 그 중 친수성인 세린, 아스파라긴산이 주성분이며 이 외에 포함된 아미노산 성분은 인체 표피의 천연 보습인자와 유사한 아미노산 조성이다(표 5). 또한 이러한 친수성 아미노산의 조성은 글리세린보다 50배 정도 흡습성을 높여 주는 요인으로 작용한다.

본 발명에 따른 추출물의 제조방법 및 구성 성분에 관해 하기에서 자세히 설명하고자 한다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 미네랄-세리신 추출물(MS) 또는 미네랄-세리신-상백피 추출물(MSM)의 분말을 제조하는 공정도를 개략적으로 도시한 모식도이다.

본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위한 추출대상은 세리신을 포함하는(i) 누에 고치 단독 또는 (ii)누에 고치와 상백피 및 상지로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 뽕나무와의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법에서 상기 (1) 누에 고치를 준비하는 단계는 누에고치의 불순물을 제거하고 절단하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 단계(1)은 누에고치를 95 ℃ 세척액에서 3분간 넣어 불순물을 제거할 수 있으며, 누에 고치 또는 누에고치와 뽕나무의 중량에 대해 추출 용매의 함량 비율(w/v, 또는 w/w)은 1:10 ~ 1:100, 1:20 ~ 1:100, 1:13 ~ 1:100, 1:14 ~ 1:100, 1:50 ~ 1:100, 1:20 내지 1:90, 1:30 내지 1:70, 또는 1:40 내지 1: 60 정도의 범위일 수 있다. 상기 과정을 통해 불순물, 예를 들면 고치 이외의 물질과 세균류 등을 제거하는 것이 가능하다.

누에고치는 누에과(Bombycidae)에 속하는 가잠(silkworm, Bombyx mori), 천잠(Japanese oak silkworm, Antheraea yamamai), 작잠(chinese oak silkworm, Antherae pernyi)이 토사(吐絲)하는 것을 포함한다. 이 중 가잠누에는 상엽육 또는 인공사료육 어느 것이라도 상관없다. 예를 들면 누에가 번데기에 앞서 만든 누에고치를 절개해서 이 견층을 세절(細切)한 것을 사용하는 것이 가능하다. 누에 고치의 세절은 절단물의 크기가 작을수록 용해도가 높아지며 대략 1개의 누에고치를 8-10조각 나누는 것이 바람직하다.

누에 고치에 포함된 실크의 98%가 실크 단백질이며, 이중 세리신 25 내지 30 중량%와 피브로인 70 내지 75 중량%의 비율로 구성된다. 세리신은 누에 고치의 실크 단백질의 일종으로서 섬유상의 피브로인과 함께 주요한 실크 단백질을 구성한다. 피브로인은 불용성 섬유상 단백질이며 세리신은 용해성 구형 단백질의 부정형 기반(Amorphous matrix)으로 점성(gum)을 가져 피브로인 필라멘트를 잡아주는 역할을 한다. 또한 누에고치의 내측에서 외측으로 갈수록 세리신은 17.8 중량%에서 33 중량%로 분포되고, 피브로인은 79.1 중량%에서 65 중량%로 분포되어 외측의 두꺼운 부분에 세리신이 다양하게 분포되어 있다.

세리신을 구성하는 약 80% 아미노산이 친수성 잔기(hydrophilic lateral group)를 가지기 때문에 흡습성(water absorption)이 글리세린보다 50배가 높다. 따라서, 세리신은 피부의 자연보습인자(Natural Moisture Factor, NMF)와 유사한 조성을 가지고 있어 높은 보습능력과 피부의 각질 등에 대한 강한 결합능력, 자외선 차단 및 주름살 방지기능, 항산화 기능 및 티로시나아제 활성 억제작용 등이 보고 되어 있으며, 높은 자외선 차단효과는 화장품 개발에 뛰어난 특성을 보여주고 있다.

상백피(Mori Radicis Cortex)는 뽕나무(Morus alba L.) 및 뽕나무속 근녹식물 근피의 코르크층을 제거한 것으로, 겨울에 뿌리를 캐내 깨끗이 씻어 신선할 때 코르크층을 벗겨내고 세로로 갈라서 나무망치로 두드려 목부와 피부를 분리시켜 백피만 취한 것이다. 한편, 상지(Mori Ramulus)는 뽕나무속 식물의 여린 가지를 말린 것이다. 뽕나무속 식물로는 뽕나무(Morus alba, Linne), 처진 뽕나무(Morus alba for. Peldulls DIPPEL), 산 뽕나무(Morus bombycis, Koidzumi), 꼬리 뽕나무(Morus bombycis var. Caudatifolia), 섬 뽕나무(Morus bombycis var. maritima KOIDZ), 가새 뽕나무(Morus bombycis for. Kase VYKEI), 몽고 뽕나무, 왕 뽕나무, 돌 뽕나무(Morus tiliaefolia, Makino)가 있으며, 이들은 낙엽 활엽성의 교목으로 한국의 대부분 지역에 걸쳐 표고 500~1,400m에 수평적으로 분포한다.

본 발명에 따른 누에고치 및 뽕나무의 복합 추출물에 있어서 상지와 상백피각각 단독으로 또는 혼합물로 추출대상으로 사용할 수 있으며, 혼합비율을 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 상지: 상백피의 중량비를 1:9 내지 9:1 또는 2:8 내지 8:2, 구체적으로 1:1 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 상지와 상백피는 추출물 제조에 사용한 후에 건져내어 여러 번, 예를 들면 3회 정도 재사용할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법에서 상기 (2) 미네랄을 포함하는 해양심층수 또는 온천수로, 누에 고치를 추출하여 세리신을 포함하는 추출액을 제조하는 단계는, 상기 (1)단계에서 준비한 누에 고치를 해양심층수 또는 온천수에 침지하고 가열하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 해양심층수 2.5 L에 누에고치 50 g(2 %, w/v)을 98℃에서 120분간 침지하여 세리신 추출할 수 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 단계(1)에서 준비된 누에고치를 해양심층수 원수에 2 % 정도(w/v)의 비율로 95 내지 98 ℃에서 120분간 교반하며 비등한다. 예를 들면 해양심층수 2.5 L에 세절한 누에고치 5 g 정도를 98 ℃ 이상이 되지 않도록 하며 90분에서 120분간 용출한다. 상기 용출 시간은 세리신의 용해도 및 피브로인의 유입 또는 소산을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.

상기 세리신의 용해를 위한 해양심층수 또는 온천수의 사용량은 세리신 추출수율을 위하여 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 누에고치 또는 누에고치와 뽕나무 100 중량에 대해서, 해양심층수 또는 온천수의 사용량은 약 1000mL 내지 10,000mL, 2000mL 내지 9,000mL, 3000mL 내지 7,000mL, 또는 4000mL 내지 6,000mL을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 추출물은 원료 누에고치 100 중량부를 기준으로 약 10 내지 35 중량부, 또는 20 내지 30중량부의 세리신 또는 이의 단편을 포함하는 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 세리신 추출물을 가열 추출, 농축 및 건조를 통해 얻어진 추출물 분말 100중량%를 기준으로(즉, 추출물의 고형분 함량을 기준으로), 약 5 내지 20 중량%, 7 내지 18 중량부, 또는 8 내지 15 중량부의 세리신 또는 이의 단편을 포함하며, 미네랄(Marine mineral) 함량은 1 내지 10%(w/v) 또는 2 내지 8%(w/v),예를 들면 5 %(w/v)를 포함할 수 있다. 종래 실크 단백질의 정련공정에서 사용되는 수도수와 0.02M Na₂CO₃ 알칼리 용액에 비해, 본 발명에 따라 해양심층수 또는 온천수를 사용하는 경우 세리신 추출물의 용해도는 높고, pH는 약산성 범위이며, 나트륨에 의한 염조절이 가능하다. 미네랄-세리신 분말의 1% 수용액의 경우 pH 6.4 내지 6.8, 염도는 0.7 내지 0.87 로 확인 되었다(표 2).

본 발명에 따른 추출물의 제조에 사용되는 추출용매는 미네랄을 포함하는 물로서, 예를 들면 해양심층수 또는 온천수일 수 있으며, 바람직하게는 해양심층수이다. 상기 해양심층수는 원수, 농축수, 및 고미네랄 수를 포함한다. 구체적으로, 해양심층수는 동해안의 울릉도, 동해, 고성 외의 기타 수심 200 미터 등에서 취수한 원수를 사용할 수 있다.

본 발명은 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치로부터 세리신을 추출함으로써, 누에고치를 고온의 알칼리 수용액으로 장시간 처리한 경우에 발생하는 세리신의 항산화, 미백 등의 기능성 손실, 피브로인 및 화학 시약 성분의 혼입, 또는 구성 아미노산과 분자량의 변화 등의 문제점을 최소화 또는 감소할 수 있으며, 세리신 추출 공정에 있어 안전하고 자연 친화적(폐수 전량 사용)이며, 효율적인 세리신의 추출방법을 제공할 수 있다. 또한, 추출 용매로서 해양심층수 또는 온천수를 사용하여 이들에 포함된 미네랄 성분을 그대로 보유한 추출물을 얻을 수 있어, 피부청정, 피부 수분 조절, 피부대사 촉진, 모공 노폐물 및 피지제거 및 피부 진정효과의 장점이 있다.

해양심층수(Deep Sea Water)는 수심 200 m 이하의 태양광이 도달하지 않는 바닷물을 의미하는 것으로 일본 수산청의 수산 심층수 협의에서는 광합성에 의한 유기물 생성이 없고, 겨울철에 연직 혼합작용이 발생하지 않는 해수를 이른다. 해양심층수는 저온성(0-17℃), 청정성(cleanness), 안정성(stability), 부영양성(eutrophic), 숙성성(maturation) 등을 가진 유용한 해양자원으로 수산분야, 에너지, 유용물질 생산 분야 등 다양한 분야에서 활용하고 있다.

해양심층수의 미네랄 성분이 피부에 좋은 것으로 나타나면서 화장수, 컨디셔너, 샴푸 등 미용제품에도 사용되고 있다. 해양심층수 활용은 취수했을 때의 상태인 원수와 정제과정에 따라 미네랄 농축수, 고미네랄수, 탈염수로 구분되어 사용 된다. 원수는 해양심층수를 희석하거나 농축하지 않고　그 자체의 상태로 이용되고, 농축수는 해양심층수를 가열하거나 진공, 농축, 동결, 또는 막여과 등 다양한 방법으로 농축하여 원수의 염분농도가 50 psu 이상이 되도록 가공한 액상을 말하며, 탈염수는 원수의 염분 중 염화나트륨 함유량을 감소시키거나 탈염수에 미네랄농축수를 첨가하여 경도를 원수보다 낮게 액상으로 가공한 것을 사용되는 것이다.

해양심층수의 염도는 3 ‰(per mill), pH는 7.7 내지 8.2 정도의 알칼리 용액, 나트륨(Na), 칼륨(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg) 등의 유효 미네랄을 다량 포함하여 대기중의 CO₂와의 반응으로 발생 된 탄산염을 이용하여 세리신 유래 성분의 손실과 피브로인 유래 성분의 혼입을 억제하는 것이 가능하고 폐수 없이 또한 세리신 소실을 최소화하여 용해된 전량 사용이 가능하여 안정하고 효율적으로 세리신을 추출하는 것이 가능한 버퍼로 사용 가능하다.

본 발명의 해양심층수는 상기 해양심층수의 일예는 나트륨 9,000 내지 13,000mg/L (예, 11,000mg/L), 마그네슘 900 내지 1,400 mg/L (예, 1,288 mg/L), 칼슘 250 내지 450 mg/L (예, 394 mg/L), 및 칼륨 300 내지 500 mg/L (예, 414 mg/L) 로 포함할 수 있으며, 나트륨, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨의 중량비는 25 내지 28 : 2 내지 5: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5, 예를 들면 27 : 3 : 1 : 1로 구성되며, 예를 들면, 나트륨 11,000 mg/L, 마그네슘 1,288 mg/L, 칼슘 394 mg/L, 칼륨 414 mg/L 로 포함될 수 있으며, 그 외에도 규소, 붕소, 스트론튬, 아연, 알루미늄 등의 마린 미네랄이 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 적용되는 해양심층수의 일례로서, 하기 표 1의 미네랄 조성을 갖는 것일 수 있다.

온천수는 지하수가 지열에 의해 평균 기온 이상으로 더워져서 지표로 용출된 것으로, 보통 수온이 25℃ 이상이고 일정한 광물성분, 수증기, 가스 등을 포함하고 있다. 온천학상으로 넓은 뜻의 온천은, 물리적 및 화학적으로 보통의 물과는 성질이 다른 천연의 특수한 물이 지중에서 지표로 나오는 물을 의미한다. 온천의 분류는 학자나 국가에 따라 다르나, 일반적으로 온도, 온천의 용출 형태, 액성 이온 농도, 광물질의 용해도, 또는 온천의 개발 상태 등에 따라서 나눈다. 본 발명에서 온천수란 지하로부터 용출되는 섭씨 25℃ 이상의 온수로 그 성분이 인체에 유해하지 않은 미네랄 배합물을 의미하며, 바람직하게는 경상북도 지역의 덕구 온천수로서, 나트륨, 불소, 칼륨, 칼슘, 철, 탄산 등이 고함유된 약 알칼리성의 온천수일 수 있다. 일 구체예로, 본 발명의 온천수는 경상북도 울진군 북면 덕구온천로 응봉산 지역의 덕구 온천수일 수 있다.

다른 구체예로, 본 발명의 온천수는 칼륨 0.40 내지 0.60 mg/L, 나트륨 40.0 내지 43 mg/L, 칼슘 3.00 내지 3.50 mg/L, 마그네슘 0.01 내지 0.05 mg/L, 산화규소 30.00 내지 35.00 mg/L, 리튬 0.05 내지 0.10 mg/L, 스트론튬 0.01 내지 0.05 mg/L, 철 0.01 내지 0.05 mg/L, 망간 0.01 내지 0.05 mg/L, 구리 0.01 내지 0.05 mg/L, 납 0.01 내지 0.05 mg/L, 아연 0.01 내지 0.05 mg/L, 불소 8.0 내지 12.0 mg/L, 염소이온 4.00 내지 5.00 mg/L 및 황산이온 5.00 내지 6.00 mg/L 를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 온천수는 그 자체로 사용되거나 가공되어 사용될 수 있는데, 예를 들어 증발, 농축 및 건조에 의해 수득된 농축물 또는 고형분으로 사용할 수 있다. 또는 상기 온천수를 자연건조로 증발시키거나, 인공적으로 탈염 및 건조(또는 증발)시켜 얻은 농축액을 사용할 수 있다. 증발, 농축 및 건조 방법에 특별한 한정은 없으나, 예를 들면 지하 온천수를 1차, 2차 및 3차 증발기로 증발시키고 여과한 후 농축 건조하여 얻을 수 있다.

본 발명에 적용되는 온천수의 일례로서, 하기 표 2의 미네랄 조성을 갖는 것일 수 있다. 대한온천학회에 의뢰하여 덕구온천수의 성분을 분석 결과를 표 에 기재하였다. 단위는 mg/L 이다.

성분	함량(mg/L)
칼륨(K)	0.47
나트륨(Na)	42.3
칼슘(Ca)	3.1
마그네슘(Mg)	0.02
산화규소(SiO2)	32.7
리튬(Li)	0.08
스트론튬(Sr)	0.03
철(Fe)	0.02
망간(Mn)	0.01
구리(Cu)	0.03
납(Pb)	0.05
아연(Zn)	0.03
알루미늄(Al)	0.05
불소(F)	9.8
염소이온(Cl-)	4.9
황산이온(SO4 2 -)	5.82
총고형물(TS)	160

본 발명에 따른 추출물 제조방법에서 상기 (3) 상기 추출액에 포함된 피브로인을 제거하는 단계는 누에 고치로부터 얻어지며 세리신을 포함하는 추출물에 포함된 피브로인의 제거는 다양한 방법, 예를 들면 건져내는 방법 및/또는 여과 필터로 여과하여 제거할 수 있다. 구체적으로, 상기 추출물을 유리 또는 플라스틱 필터에 광목(Cotton cloth, 무명지)으로 여과하고, 추출 잔여물과 분리해서 정제한다. 상기 정제액에는 10 내지 250 kDa의 분자량을 갖는 세리신이 함유되는 한편 피브로인은 완전히 제거된다. 본 발명에 따른 추출물에 피브로인이 혼입될 경우, 용해도가 떨어지거나 알러지 유발 등의 문제점이 있어, 추출액에 포함된 피브로인을 제거하여야 한다. 상기 여과방법으로 피브로인을 제거하는 경우, 추출액에 포함된 불순물인 침전물을 함께 제거할 수 있어 더욱 효과적이다.

상기 제거된 피브로인은 물로 세척하고 건조하여 견직물, 재생의료, 화장품 등에 이용할 수 있다.

종래에 비누 또는 알칼리수를 이용하여 세리신 추출물을 제조하는 방법에서는 높은 pH(9.0 이상) 버퍼, 고온고압에 의한 피브로인 단편의 혼입, 고가의 효소사용 등의 이유로 인해, 상기 피브로인이 제거 후 추출액을 중화 또는 버퍼 교환 또는 투석 또는 효소 제거 등의 공정이 필수적이다. 그러나, 본 발명에 따라 해양심층수 또는 온천수를 추출 용매로 사용하여 세리신 추출물을 제조하는 방법에 있어서는, 투석 공정을 필요로 하지 않다. 해양심층수 원수 또는 미네랄 농축수로의 투석과정은 항산화 기능 저하, pH 상승, Na 과부하, 미생물 오염 등의 문제를 야기시킬 수 있다. 또한, 세리신 추출물을 여과하여 피브로인을 제거한 후에, 투석 과정을 생략하므로 시간, 노력, 경제적 절약이 가능하다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법은, (4) 상기 얻은 추출액을 농축하는 단계 및 (5) 상기 농축액을 건조하는 단계로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단계 (4)을 수행하여 농축액을 얻거나, 단계 (4) 및 (5)을 수행하여 농축액을 건조한 분말로 추출물을 얻을 수 있다.

상기 단계(3)에서 얻어진 추출물을 그대로 다양한 용도로 사용할 수도 있으나, (4)농축단계를 수행하여 농축물로 사용하거나, (4) 농축단계 및 (5) 건조단계를 수행하여 분말형태로 사용할 수도 있다. 상기 농축물은 냉장온도(예, 4 ℃)에서 1 내지 2 개월 정도 보관하여 용도에 따라 사용 가능하고, 상기 건조물은 냉동 온도 조건에서 (예, -20 ℃ 내지 0 ℃)으로 1년 이상 저장 가능하다. 또한, 세리신 추출액의 용액 또는 가용성 분말은 세리신의 각종 기능해석 등에 다양한 분야에 이용 가능하다.

상기 (4) 추출액을 농축하는 단계는 추출물을 가열하여 수행할 수 있으며, 가열 온도는 예를 들면, 85℃ 이상, 바람직하게는 90℃, 93℃ 또는 95℃ 이상의 온도 하한 수치와, 온도범위에서 90℃ 이하, 93℃ 이하, 95℃이하, 97℃이하, 또는 98℃이하일 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 농축 가열 온도는 85℃ 내지 90℃, 85℃ 내지 93℃ 이하, 85℃ 내지 95℃이하, 85℃ 내지 97℃이하, 또는 85℃ 내지 98℃이하이거나, 90℃ 내지 93℃ 이하, 90℃ 내지 95℃이하, 90℃ 내지 97℃, 또는 90℃ 내지 98℃이하이거나, 93℃ 내지 95℃이하, 93℃ 내지 97℃, 또는 93℃ 내지 98℃이하이거나, 95℃ 내지 97℃, 또는 95℃ 내지 98℃이하일 수 있다. 상기 농축 단계에 소요되는 시간은 최종 농축물의 요구하는 농도에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 30 내지 120분, 30 내지 90분 또는 50 내지 60분 동안 수행할 수 있다.

상기 (5) 건조단계는 추출물의 활성을 손상시키지 않고 분말화 가능한 다양한 건조방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 동결 건조 방법으로 수행될 수 있다. 상기 동결 건조 방법은 통상의 단백질을 포함하는 용액의 동결 건조 조건과 대동 소이하다.

본 발명의 일예에 따른 추출물의 제조방법은, (1)누에 고치를 절견하여 번데기를 제거하고 고치를 세절하여, 절단된 고치를 준비하는 단계, (2)탄산이온 및 미네랄을 포함하는 해양심층수 또는 온천수로, 추출 대상인 누에 고치로부터 세리신을 포함하는 추출물을 제조하는 단계, 및 (3) 상기 추출액에 포함된 피브로인을 제거하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 추출물의 제조방법은 (4) 상기 단계 (3)에서 얻은 추출액을 농축하는 단계, 및/또는 (5) 상기 농축액을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 설명하면, 상기 1) 누에고치를 준비하는 단계는, 누에고치를 절견 및 세절하고, 물에 세절된 누에고치를 1 내지 50 % (w/v), 바람직하게는 5% (w/v) 내지 20 %(w/v), 예를 들면 10 %(w/v)을 첨가하여 85℃이상의 온도, 예를 들면 99℃에서 침지하여 불순물 제거하여 수행할 수 있다.

상기 단계 2)의 추출하는 단계는, 해양심층수 또는 온천수에 누에 고치를 0.5 내지 30 %(w/v), 예를 들면 2 % (w/v)을 85℃ 내지 98℃, 예를 들면 98℃에서 60 내지 180분간, 예를 들면 120분간 침지하여 세리신 추출할 수 있다.

본 발명의 미네랄-세리신-상백피(MSM) 추출물의 제조방법은, (1)누에 고치를 준비하는 단계, (2)미네랄을 포함하는 해양심층수 또는 온천수로, 누에 고치를 추출하여 세리신을 포함하는 추출액을 제조하는 단계, 및 (3) 상기 추출액에 포함된 피브로인을 제거하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 추출물의 제조방법은 (4) 상기 단계 (3)에서 얻은 추출액을 농축하는 단계, 및/또는 (5) 상기 농축액을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 3) 피브로인 섬유를 제거한 후 세리신 용액에 상백피와 상지를 첨가하여 추출 및 농축하여 마린미네랄-세리신-상백피 추출물을 제조할 수 있다.

그리고 해양심층수 및 세리신이 포함된 추출물에 상백피(Morus alba)를 첨가하여 가열하는 과정을 수행하여 추출물의 수분 증발에 따른 농축과 상백피의 추출을 동시에 수행하며, 기존의 세리신의 항균, 항산화, 미백 등의 기능을 더욱 높일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 해양심층수 미네랄 세리신(Marine mineral Sericin; MS) 추출물 또는 분말의 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 해양심층수 미네랄 세리신에 상백피(Mours bark) 추출물 추가된 유효성분(Marine mineral Sericin Mours bark; MSM)으로 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 미백, 항산화 또는 항균 활성을 가지며, 구체적으로 항균활성은 그람 음성 세균, 비듬균 및 여드름균에 대한 항균 활성일 수 있으며, 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물 또는 비듬 예방 또는 개선용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 미네랄-세리신(MS) 추출물 또는 미네랄-세리신-식물(MSM) 추출물을 포함하는 화장료 조성물은, 투여 경로에 따라서, 피부 외용, 경피 또는 피하 투여, 헤어 투여가 가능하며, 바람직하게는 피부 외용 또는 경피, 모발, 보다 바람직하게는 피부, 모발에의 외용 투여가 가능한 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부, 두피, 모발에 경피적으로 적용될 수 있고, 구체적인 예로서 두발 케어제품, 피부 케어제품, 세안제, 스킨토너, 로션, 마스크팩 등일 수 있다. 예를 들면, 기초 화장품, 메이크업 화장품, 바디 제품(바디 클렌져, 바디로션 등), 면도용 제품, 모발 제품(샴푸, 린스, 헤어 에센스 등) 등의 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나, 그 형태에 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션(고체 타입, 액체 타입 또는 스프레이 타입 등), 파우더, 메이크업 제거제(클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등) 및 세정제(클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등) 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 치아 케어제품 (구강제품)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 화장료 제품은, 두피샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 모발보호제, 면도용비누, 비누, 피부세안제, 손비누, 페이셜로션, 스킨토너, 마스크팩, 치아세정제, 치아미백제 등을 포함한다.

본 발명에 따른 일예는, 상기 미네랄-세리신(MS) 추출물 또는 미네랄-세리신-식물(MSM) 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 구체적으로 상기 약학 조성물은 항균 활성을 가지며, 구체적으로 기 항균활성은 그람 음성 세균, 비듬균 및 여드름균에 대한 항균 활성일 수 있으며, 여드름 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 비듬 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다. 미네랄-세리신(MS) 추출물 또는 미네랄-세리신-식물(MSM) 추출물에 대해서는 상술한 바와 같다.

상기 화장료 조성물 또는 약학적 조성물 유효성분 이외에, 통상의 제품화 또는 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 항료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 효소, 식물 또는 미네랄오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 및 왁스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화장료에 허용 가능한 추가 성분 또는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 상기 화장료 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 세리신 추출물의 친환경적인 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 해양심층수 또는 온천수를 이용하여 누에고치 단독 또는 누에고치와 뽕나무로부터 세리신을 추출하여 해양심층수 또는 온천수의 미네랄 성분과 세리신을 포함하는 추출물, 또는 미네랄 성분, 세리신 및 뽕나무 추출물을 포함하는 추출물, 이의 제조방법, 및 상기 추출물을 포함하는 약학 조성물, 화장료 조성물 및 세정 조성물에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따라, 마린미네랄-세리신 추출물(MS) 또는 마린미네랄-세리신-상백피 추출물(MSM)의 분말을 제조하는 공정도를 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 10, 12, 및 15 % SDS-PAGE 전기영동 후 CBB(Coomassie brilliant blue)를 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, 레인M은 단백질 마커, 레인1은 실시예1에서 얻어진 세리신 조추출물이고, 레인 2 내지 5는 실시예1의 마린미네랄-세리신 추출물 분말을 용해한 1%, 2.5%, 5%와 10% 수용액이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 단백질의　N-glycan 수식 유무 확인을 위한 periodic acid?chiff(PAS) 염색과 수식된 단당류를 확인을 위한 몇 가지의 렉틴 항체 ConA(Canavalis ensifomis, α-linked mannose) DBA(Dolichos biforus, α 1,3-N-acetygalactose) RCA120(Ricinus communis, β-galactose)를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, M은 마커이고, CS는 0.02M 탄산염(Na2CO3, sodium carbonate)에 용해된 2.5 % 세리신, MS는 해양심층수를 이용해 녹인 2.5% 세리신, MSM은 MS에 상백피가 첨가된 2.5% 세리신이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라, 물, 비교예1(0.02M 탄산염), 실시예 1 및 2에서 얻은 해양심층수를 이용한 세리신 추출물 분말을 4℃에서 6개월 저장 후 1% 용액에 대한 대장균, 포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아, 효모, 곰팡이 이외 미생물 등에 의한 보관 안정성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일예에 따라, 물, 비교예1(0.02M 탄산염), 실시예 1 및 2에서 얻은 해양심층수를 이용한 세리신 추출물의 항산화 활성 분석결과이다.
도 6은 도 5의 항산화 효과의 EC₅₀(half maximal effective concentration)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일예에 따라, 물, 비교예1(0.02M 탄산염), 실시예 1-1 및 1-2에서 얻은 해양심층수를 이용한 세리신 추출물의 항균성 실험결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일예에 따라, 비교예1(0.02M 탄산염), 실시예 1-1 및 1-2에서 얻은 해양심층수를 이용한 세리신 추출물의 여드름균과 비듬균을 대상으로 항균실험 결과를 나타낸다.
도 9은 마우스 피부세포 B16F10 세포를 대상으로 독성 실험결과를 나타낸다.
도 10는 사람피부세포 hs895.sk 세포를 대상으로 독성 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 마우스 피부 세포 B16F10 세포에서 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 제거능을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12은 마우스 피부 세포 B16F10 세포에서 세리신 추출물의 미백 기능을 분석한 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 10에 따라 세포내에서의 Total antioxidant capacity(TAC) 분석 결과를 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기에 기재된 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 미네랄-세리신 추출물(MS)의 제조

해양심층수를 이용하여 누에고치로 세리신을 추출하여 마린미네랄 및 세리신을 포함하는 추출물을 제조하기 위하여, 추출대상인 누에고치 가잠 유래의 고치를 절견하여 번데기를 제거하고 8 내지 10 조각으로 세절하였다. 상기 세절된 누에고치를 95 ℃ 온도의 물로 3 내지 5 분간 세척하여 불순물 및 세균류를 제거하고, 다시 흐르는 물로 세척하여 세절된 누에 고치를 준비하였다.

상기 세절된 누에 고치는 95 내지 98 ℃의 온도를 갖는 해양심층수에 첨가하고 90 내지 120 분간 교반하여 세리신을 추출하였다. 상기 세절된 고치의 첨가량은 해양심층수의 중량비를 기준으로 (누에고치: 해양심층수의 중량비) 1:50로 수행하였다. 상기 추출물에서 섬유상의 피브로인은 건져내어 제거하여 마린미네랄-세리신 추출물을 얻었다. 상기 제거된 피브로인은 물로 세척하고 건조하여 견직물, 재생의료, 화장품 등에 이용할 수 있다.

상기 마린미네랄-세리신 추출물을 95 내지 98 ℃ 온도범위에서 50 내지 60분 동안 가열하여 농축하였다.

상기 농축 추출물을 유리 또는 플라스틱 필터에 광목 또는 목면을 넣어 침전물 또는 남아있는 피브로인이 포함되지 않도록 2 내지 3차례 여과하였다. 상기 여과 과정은 가열된 2.5 내지 3 L의 농축 추출물의 경우 약 5 내지 10분 동안 수행하였다. 상기 여과된 농축 추출물을 액상 상태로 보관하거나 또는 동결건조를 수행하여 추출물을 분말화하여 이후 실험에 사용하였다. 해양심층수 2.5L에 50 g의 세절된 누에고치에서 순수한 세리신 단백질이 포함하는 130 g의 마린미네랄-세리신 추출물의 분말을 얻었으며, 이 중에서 세리신 또는 이의 단편은 13g으로서 추출물의 고형분 함량을 기준으로 약 10% (w/w)의 세리신 단백질의 추출 수율을 나타낸다(표 3 참조).

본 실시 예에 따른 MS 추출물의 추출 단계별 추출용매 양, 시료 양, 소요시간을 하기 표 3에 나타냈으며, 누에고치 50g에 해양심층수 2,500mL을 첨가형 120 분 동안 1단계에서 열수 추출을 진행하여 조추출물 2,000 mL을 수득하였으며, 상기 조추출물을 60분간 가열하여 농축을 진행하여 1,400 mL의 농축 추출물을 얻었으며, 농축 추출물을 동결 건조하여 최종 130g의 MS 추출물 분말을 제조하였다.

본 실시예에 사용된 추출 온도 및 시간 조건, 추출 과정 중의 추출 수율, 얻어진 추출물의 pH 및 1% 용액에서의 salinity를 하기 표 4에 나타냈다. 표 4에서는 4가지 추출용매로서 물을 사용한 추출물(비교예 1), 탄산염 수용액을 사용한 추출물(비교예 1), 및 해양심층수를 사용한 실시예 1 및 2의 추출물을 개시하고 있으며, 화학적 방법인 탄산염 수용액으로 추출한 것과 비교하여, 본원 발명에 따라 환경친화적인 해양심층수를 사용한 추출물의 경우, 추출 원료 대비 동등 또는 더욱 높은 수준의 세리신 단백질 또는 이의 단편을 얻었다.

본 발명에 따라 해양심층수를 이용한 세리신 추출법은, 종래 추출 방법보다 순수 세리신 확보, 중화단계 생략, 장기 보관, 효능, 효율 향상 등의 효과가 있다(표 3). 세리신 추출에 있어 해양심층수를 이용할 경우 수율이 탄산나트륨 시약을 사용한 것에 비해 높으며 1% 추출물 용액의 경우 pH 약 6.8, 염도 약 0.87 정도로 피부보호, 소독, 살균 등에 적합한 pH와, 염도를 가졌다(표 4). 상기 표 4에 기재된 상기 세리신 단백질의 수율은 사용한 원료 누에고치 100 g을 기준으로 추출물에 포함된 세리신 단백질 함량(중량)을 표시한 것이다.

실시예 2: 마린미네랄 -세리신-상백피 추출물( MSM )의 제조

실시예 1의 마린미네랄-세리신(MS) 추출물의 제조방법에 실질적으로 동일하게 세절된 누에고치를 준비하고, 상기 세절된 누에 고치를 해양심층수를 이용하여 추출하고, 섬유상의 피브로인을 1차적으로 제거하여 미네랄-세리신 추출물을 얻었다.

상백피(Morus bark)와 상지(Morus branch)의 1 : 1 (w/w) 혼합물을, 상기 얻어진 미네랄-세리신 추출물에 1: 50 (w/v)으로 첨가하고, 95 내지 98 ℃ 온도범위에서 50 내지 60분 동안 가열하여, 상백피 및 상지 추출물이 포함된 마린미네랄-세리신 추출물을 얻었으며 동시에 추출물의 농축도 수행되어, 상백피 및 상지 추출물이 포함된 마린미네랄-세리신-상백피(MSM) 추출물을 얻었다.

상기 농축 MSM 추출물을 유리 또는 플라스틱 필터에 광목 또는 목면을 넣어 침전물 또는 남아있는 피브로인이 포함되지 않도록 2 내지 3 차례 여과하였다. 상기 여과 과정은 가열된 2.5 내지 3 L의 농축 추출물의 경우 약 5 내지 10분 동안 수행하였다. 상기 여과된 농축 추출물을 액상 상태로 보관하거나 또는 동결건조 하여 가용성 세리신 분말화하여 이후 실험에 사용하였다.

본 실시예에 따른 MSM 추출물의 추출 단계별 추출용매 양, 시료 양, 소요시간을 하기 표 3에 나타냈으며, 누에고치 50g에 해양심층수 2,500mL을 첨가형 120 분 동안 1단계에서 열수 추출을 진행하여 조추출물 2,000 mL을 수득하였으며, 상기 조추출물에 상지와 상백피를 1:1 중량비로 혼합한 총 50g의 뽕나무를 첨가하고 60분간 가열하여 뽕나무 추출 및 농축을 진행하여 1,400 mL의 농축 추출물을 얻었으며, 농축 추출물을 동결 건조하여 최종 130g의 MSM 추출물 분말을 제조하였다. 해양심층수 2.5L에 50 g의 세절된 누에고치에서 순수한 세리신 단백질이 포함된 130 g의 마린미네랄-세리신 분말을 얻었다. 일반적 추출 방법보다 순수세리신 확보, 중화단계 생략, 장기 보관, 효능, 효율 향상 등의 효과가 있다(표 3).

실시예에 사용된 추출 온도 및 시간 조건, 추출 과정 중의 추출 수율, 얻어진 추출물의 pH 및 1% 용액에서의 salinity를 하기 표 4에 나타냈다. 표 4에서는 4가지 추출용매로서 물을 사용한 추출물(비교예 1), 탄산염 수용액을 사용한 추출물(비교예 1), 및 해양심층수를 사용한 실시예 1 및 2의 추출물을 개시하고 있으며, 화학적 방법인 탄산염 수용액으로 추출한 것과 비교하여, 본원 발명에 따라 환경친화적인 해양심층수를 사용한 추출물의 경우, 추출 원료 대비 동등 또는 더 높은 수준의 세리신 단백질 또는 이의 단편을 얻었다.

또한, 세리신 추출에 있어 해양심층수를 이용할 경우 수율이 탄산나트륨 시약을 사용한 것에 비해 비교적 높으며 1% 용액의 경우 pH 약 6.4, 염도 약 0.7 정도로 피보 보호, 소독, 살균 등에 적합한 pH와, 염도를 가졌다(표 4)

비교예 1: 탄산나트륨염 수용액을 이용한 추출물의 제조

종래에 탄산나트륨을 이용하여 누에고치로 세리신을 추출하기 위하여, 먼저추출대상인 누에고치 가잠 유래의 고치를 절견하여 번데기를 제거하고 8 내지 10 조각으로 세절하였다. 상기 세절된 누에고치를 95 ℃ 온도의 물로 3 내지 5 분간 세척하여 불순물 및 세균류를 제거한 하고, 다시 흐르는 물로 세척하여 세절된 누에 고치를 준비하였다.

상기 세절된 누에 고치는 95 내지 98 ℃의 온도를 갖는 0.02 M 탄산나트륨 용액에 첨가하고 90 내지 120 분간 교반하여 세리신을 추출하였다. 상기 세절된 고치의 첨가량은 해양심층수의 중량비를 기준과 동일하게 (누에고치: 해양심층수의 중량비) 1:50로 사용하였다. 상기 추출물에서 섬유상의 피브로인은 건져내어 제거하여 세리신 추출물을 얻었다.

상기 세리신 추출물 95 내지 98 ℃ 온도범위에서 50 내지 60분 동안 가열하여 농축하였다.

상기 농축 추출물을 유리 또는 플라스틱 필터에 광목 또는 목면을 넣어 침전물 또는 남아있는 피브로인이 포함되지 않도록 2 내지 3차례 여과하였다. 상기 여과 과정은 가열된 2.5 내지 3 L의 농축 추출물의 경우 약 5 내지 10분 동안 수행하였다. 상기 여과된 농축 추출물을 액상 상태로 보관하거나 또는 동결건조 하여 가용성 세리신 분말화하여 이후 실험에 사용하였다.

본 비교 예에 따라 누에 고치로부터 세리신을 제조하는 과정에서 추출 온도 및 시간 조건, 추출 과정 중의 추출 수율, 얻어진 추출물의 pH 및 1% 용액에서의 salinity를 하기 표 4에 나타냈다.

비교예 2: 물을 이용한 세리신 추출물의 제조

비교예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 세절된 누에 고치를 준비하고, 탄산 나트륨 용액 대신에 물을 사용하여 추출하여, 세리신 물추출물을 제조하였다.

본 비교예에 따라 누에 고치로부터 세리신을 제조하는 과정에서 추출 온도 및 시간 조건, 추출 과정 중의 추출 수율, 얻어진 추출물의 pH 및 1% 용액에서의 salinity를 하기 표 4에 나타냈다. 물을 이용하여 세리신을 추출한 경우, 탄산염 및 해양심층수를 사용한 추출물에 비해, 세리신 단백질의 추출 수율이 낮아짐을 확인하였다.

실시예 3: 세리신 추출물의 분석

3-1: 미네랄-세리신 추출물의 전기영동분석

실시예 1의 제조방법으로 제조된 미네랄-세리신 추출물에 포함된 단백질을 분석하고자, 상기 추출물 용액을 각각 10 %, 12 %, 및 15 % 겔함량을 갖는 세가지 종류의 SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 Coomassie Brillaiant Blue(CBB) 염색하여 단백질의 분자량 분포를 확인하였다. 정확한 분포를 보기 위해, 실시예1에서 얻은 MS 추출물 분말을 1　%, 2.5　%, 5　% 및 10　% 농도의 수용액을 제조하여 전기영동을 수행하였으며 그 결과를 도 2에 나타냈다.

도 2는 실시예 1에서 제조한 마린미네랄-세리신 추출물에 포함된 단백질을 분석한 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과를 나타내며, CBB(Coomassie brilliant blue)를 사용한 분석 결과를 도시한 사진이다. 레인M은 단백질 마커, 레인1은 실시예 1에서 제조한 세리신 조추출물(농축공정을 수행하지 않음), 레인 2는 마린미네랄-세리신(MS) 분말의 1% 수용액, 레인 3은 마린미네랄-세리신 분말의 2.5% 수용액, 레인 4는 마린미네랄-세리신 분말의 5% 수용액 및 레인 5는 마린미네랄-세리신 분말의 10% 수용액을 나타낸다. 상기 실시예 1에서 얻어진 마린미네랄-세리신 추출물에 포함된 단백질은 대략적으로 10 내지 250 kDa 분자량 범위에서 확인되었다(도 2).

3-2: 단백질의 N- glycan 당쇄수식 확인

비교예 1에 따라 탄산염을 이용한 누에고치로부터 추출한 세리신 추출물(CS)과, 실시예 1 및 2에 따라 해양심층수를 이용한 누에고치로부터 추출한 2종의 세리신 추출물 (MS, MSM)에 포함된 세리신 단백질 대해, 특이적인 당쇄에 반응하는 렉틴(lectin)을 이용하여 당쇄 구조를 예측하였다.

구체적으로, 분리를 위한 버퍼에 따라 세리신 단백질의 N-glycan 당쇄 수식을 확인하기 위해, 상기 실시예 3-1에서 얻어진 SDS-PAGE 전기영동한 겔을 Periodic Acid Schiff(PAS) 염색액를 이용하여 밴드를 확인하였으며, 실험결과를 도 3에 나타냈다.

도 3은 본 발명의 예시적인 실시 예에 따라, 분리한 세리신 단백질의　N-glycan 수식 유무 확인을 위한 periodic acid?chiff(PAS) 염색과 수식된 단당류를 확인을 위한 몇 가지의 렉틴 항체 ConA(Canavalis ensifomis, α-linked mannose) DBA(Dolichos biforus, α 1,3-N-acetygalactose) RCA120(Ricinus communis, β-galactose)은 로 확인한 결과이다. M은 마커이고, CS는 비교예 1에 따른 0.02M 탄산염(Na2CO3, sodium carbonate)으로 용해된 2.5 % 세리신을 나타내고, MS는 실시예 1에 따른 2.5% 세리신 용액, MSM은 실시예2에 따른 2.5% 세리신 용액이다.

도 3의 결과로부터, SDS-PAGE 겔에 전기영동 및 Coomassie Brillaiant Blue(CBB) 염색 결과에 의하면, 비교예 1에 따라 Na₂CO₃(Sodium Carbonate, CS)를 이용하여 얻어진 세리신 추출물은 주로 250 kDa와 20 kDa 분자량에서 진하게 관찰되었다. 또한, 실시예 1 및 2에서 제조한 MS 추출물과 MSM 추출물은 10 내지 250 kDa 분자량 범위에서 단백질 위치가 확인되었다.

또한, N-glycan에 반응하는 3개의 렉틴(ConA, DBA, RCA120)을 이용하여 분석한 결과, 만노스(mannose)에 반응하는 ConA를 이용한 실험에서는 종래 탄산염을 이용한 추출법(비교예 1)과 본 발명에 따른 해양심층수를 이용한 추출법으로 얻어진 추출물에서 각각 분리된 세리신은 대부분 만노스가 결합되어 있을 것으로 예상되었다.

O-glycan의 경우는 N-acetylgalactosamine(GalNAc)에 반응하는 DBA와 β-galactose(β-gal)에 반응하는 RCA120의 분석 결과, 본원 발명에 따라 해양심층수에서 분리한 세리신에서 반응하는 것으로 확인되었다(도 3).

3-3: 추출물의 아미노산 분석

시험 시료에 0.05 %(w/v) 2-mercaptoethanol을 함유한 6 M 염산을 1000 부피비로 첨가한 후에, 110 ℃ 온도에서 24시간 진공상태로 가수분해하였다. 상기 얻어진 가수분해물을 드라이아이스 및 에탄올로 동결하고, 탈기장치에 장착하여 융해 및 동결을 반복하며 충분히 탈기(degastification)하였다.

상기 탈기된 가수분해물을 시험관에 넣고, 110 ℃ 온도에서 22 ~ 24 시간 2차로 가수분해하였다. 상기 시험관을 열어 감압하여 40 ℃에서 건조하여 염산을 제거하였다. 상기 시험관에 0.2 N　구연산나트륨완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산용액을 첨가하여 시험용액을 제조하고, 멤브레인 필터로 여과한 후에, 액체크로마토그래피(Agilent LC system, USA)를 사용해 아미노산 성분 분석을 수행하였다. 상기 아미노산 성분 분석 결과를 하기 표 5에 나타냈다.

아미노산	세리신	비교예2	비교예1	실시예 2
Asp	17.8	20.5	23.4	20.0
Thr	8	6.7	5.2	7.4
Ser	31	23.9	21.3	28.1
Glu	4.4	9.2	7.9	6.3
Pro	0.4	1.2	1.1	1.3
Gly	19.1	11.3	11.6	11.4
Ala	3.8	4.5	5.2	3.5
Cys	<0.05	-	-	-
Val	3.1	3.2	4.4	2.9
Met	<0.05	-	-	-
Ile	0.4	0.9	1.3	0.8
Leu	0.8	1.5	2	1.3
Tys	3.3	2.8	3.4	4.5
Phe	0.2	0.8	0.9	0.5
Lys	1.0	5.9	4.3	4.0
His	2.7	1.8	2.3	2.4
Arg	3.9	4.8	5.2	4.9
합계	99.9	99	99.5	99.3

상기 표 5에서 세리신은 Abhilasha, 2015 (Abhilasha Rangi and Lalit Japura (2015) The Biopolymer Sericin: Extraction and Applications. Department of Fashion Technology, BPS Mahila Vishwavidyalaya, Sonepat, India) 및 TingTing, 2016 (Ting-TingCaoYu-QingZhang (2016) Processing and characterization of silk sericin from Bombyx mori and its application in biomaterials and biomedicines. Silk Biotechnology Laboratory, School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, RM702-2303, No. 199, Renai Road, Dushuhu Higher Edu. Town, Suzhou 215123, PR China)에 기재된 방법으로 제조된 것이며, 물을 이용하여 추출한 세리신(WS, 비교예2), 탄산나트륨 시약을 이용하여 추출한 세리신(비교예1), 실시예 2에서 얻은 해양심층수를 이용한 세리신 MSM 추출물의 아미노산은 세린, 아스파라긴산, 글리신이 동일하게 많았으며, 타 아미노산의 조성도 비슷한 것으로 확인되었다.

3-4: 추출물의 미네랄 분석

미네랄 성분인 무기 원소를 분석하기 위해 실시예 1 및 2에서 얻어진 추출물의 분말을 물에 용해하여 1 %(w/w) 용액으로 제조하여 유도결합플라즈마 발광분광기(Inductiviely Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP-AES)로 성분분석을 수행하였다(한국고분자시험연구소, KOPTRI).

21 종의 무기 원소 Na, Mg, Ca, K, B, Sr, Tl, Fe, Mn, Al, Cd, Co, Cr, Cu, Ga, In, Li Ni, Pb, Zn, Cs 등을 측정하기 위한 표준품(1,000 ppm) 10 ml 취하여 20% (v/v) 질산용액을 더하여 100 ml 만든 후 희석하여 사용하였다. 표준용액과 공시험용액을 유도결합플라즈마 발광분광기에 주입하여 표준용액의 발광강도를 측정하고 농도와 발광강도간의 일차함수로부터 검량선을 작성함으로 회귀방정식을 산출하였다.

상기 제조한 실시예 1 및 2에서 얻어진 추출물의 분말은 물에 용해하여 1 중량%의 용액을 각각 유도결합플라즈마 발광분광기에 주입하여, 21개 원소에 대한 발광강도를 측정하고 검량선의 회귀방정식에 대입하여 관심원소의 농도를 정량하였다. 유도 결합 플라즈마에서 검액 중 관심원소에 대한 농도가 정량 되면 시료 중 관심 원소의 농도는 다음식에 따라 계산하였다. 상기 방법에 따라 얻어진 미네랄 분석 결과를 표 6에 나타냈다.

시료 중 원소 농도 (ug/g) = 분석값 (ug/ml) x 희석배수/시료채취량 (g)

하기 표 6에서 사용한 시료는 CS는 비교예 2에 따라 탄산나트륨 시약으로 추출한 세리신 추출물이고, MSM은 실시예 2에서 얻어진 추출물이다. 하기 표 4에서 미량원소는 As, Ba, Be, Cd, Co, Cr, Cu, Ga, Ge, In, Li, Mn, Mo, Nb, Ni, Pb, Rb, Re, Sb, Sc, Se, Sn, Ta, Ti, Tl, V, W, Y 및 Zr를 말한다. 표 6의 시료 중 원소 농도는 단위 (ug/g)로 표시하였다.

성분	비교예1 (탄산나트륨 추출물)	실시예1 (MS 추출물)	실시예2 (MSM 추출물)
Na	17,000	39,500	40,400
Mg	1,730	28,740	28,600
Ca	4,980	3,841	6,470
K	362	8,145	12,700
B	0	51	98.6
Sr	26.3	101	171
Al	102	8	9
Si	257	101	114
Zn	80.4	7	8
기타 미량원소	불검출	불검출	불검출
합계	24.648	80,502	88,580

표 6에 나타낸 바와 같이, 총 미네랄 함량은 해양심층수를 이용한 세리신 추출이 탄산나트륨 용액을 이용한 것보다 약 4배 이상의 필수 미네랄이 포함되어 있음을 확인하였다. 특히, 비교예 1에 비해, 실시예 1 및 2의 추출물이 나트륨, 마그네슘, 칼륨, 붕소 및 스트론튬의 함량이 월등히 높았다. 실시예 1의 추출물에 비해, 칼륨, 붕소 및 스트론튬의 함량이 실시예 2의 추출물이 다량 포함하고 있었다. 나트륨(Na)은 피부청정 및 pH 조절 효과, 칼륨(K)은 피부수분 조절, 칼슘(Ca)은 아미노산과 단백질 생성, 마그네슘(Mg)은 피부대사촉진, 붕소(B)는 비타민 D 활성, 스트론튬(Sr)은 효소활성을 돕는 등의 작용이 있어, 본원 발명에 따른 추출물은 피부보호제, 두피 보호제 및 바디 케어제 등의 유효하다.

실시예 4: 미생물 보관안정성 시험

본 발명에서 얻어진 세리신 추출물에 대해 위생지표세균 및 특정 식중독균의 존재여부 및 정량분석을 위해, 실시예 1 및 2에서 얻어진 세리신 추출물의 동결건조 분말을 물에 용해하여 1% 또는 10% 균질 용액으로 시료를 제조하였다. 또한 비교예 1의 추출물 분말을 물에 용해하여 1% 균질 용액으로 시료를 제조하였다.

상기 1 mL의 시료 용액을 대장균(Escherichia coli, E.coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus), 리스테리아(Environmental Listeria), 효모(yeast) 및 곰팡이(Fungi)와 일반세균(rapid aerobic count) 측정용 petrifilm^TM(3M, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 또한 대장균, 포도상구균, 리스테리아는 정량분석을 수행하였다. 정량분석은 3M 사의 petrifilm을 이용하였으며 농도별로 1mL 필름에 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 형성된 콜로니 수를 확인하였다. 전형적인 집락을 보이는 균주 x 희석배수로 계산하였으며, 상기 1% 시료 용액을 이용한 미생물 배양 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4는 물, 0.02 M 탄산염, 실시예 1의 세리신 분말을 4℃에서 6개월 보관한 후에, 각 시료의 1% 용액에 대한 대장균, 포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아, 효모, 곰팡이 이외 미생물 등의 오염 정도를 분석한 결과를 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 미네랄-세리신(MS) 추출물 및 미네랄-세리신-상백피(MSM)추출물은 대장균, 포도상구균, 리스테리아, 효모, 곰팡이에 대해 안전함을 확인하였다. 그러나, 비교예에 따라 탄산나트륨 시약으로 추출한 세리신에서는 이외의 기타 미생물의 서식이 확인되었다.

실시예 5: 추출물의 항산화 활성 분석

자유 라디칼(free radical)의 하나인 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 자유라디칼 소거 활성 분석을 시행하였다.

구체적으로, 실시예 1 및 2에서 얻어진 추출물 분말을 멸균수에 용해하여 다양한 농도의 시료 용액을 제조하고, 메탄올 또는 물 1 mM에 DPPH를 용해하여 stock 용액을 제조하고, 분석 실험에는 100 uM 농도로 희석하여 사용하였다. 상기 0.1 내지 3 % 시료 용액 100 uL를 96 well plate에 분주하고 양성 대조군으로 아스코르브산(vit C)를 사용하였다. 100 uM DPPH를 100 uL로 상기 웰 플레이트에 첨가하고 차광하여 실온에서 10-30분간 방치한 후에, 517 nm에서 흡광도를 측정했다. 음성 대조군으로 메탄올 또는 물에 100 uL DPPH를 처리하여 흡광도를 측정하여 영점 처리를 수행하였다. 상기 흡광도를 측정한 후 아래 식으로 계산하였으며, 실험결과를 도 5에 나타냈다.

scavenging activity (%) = (1-OD sample/OD blind) x 100

도 5는 비교예 1에 따라 종래의 0.02M 탄산염을 이용하여 제조한 세리신 추출물과 실시예 1 및 2에 따라 해양심층수를 이용한 세리신 추출물의 항산화 효능을 분석한 것이다. 상기 분석 결과로부터, 종래 탄산염에 의한 세리신 추출물보다 실시예 1에서 얻어진 해양심층수 세리신 추출물의 항산화 활성이 높으며, 특히 상백피 첨가된 실시예 2의 추출물은 1 % 용액에서 88.4 %의 항산화 활성수치를 나타내어 매우 우수한 항산화 효과를 나타내고, 농도 의존적 방식으로 항산화 활성을 증가함을 확인하였다.

또한, 상기 분석 결과에 기초하여 EC₅₀ 값을 얻어 도 6에 나타냈다. 도 6은 도 5에 나타낸 항산화 효과의 EC₅₀(half maximal effective concentration)을 나타낸 것이다.

도 6의 EC₅₀ 값에 나타낸 바와 같이, 비교예 1에 따라 탄산나트륨으로 추출한 세리신 추출물, 실시예 1에서 얻어진 MS 추출물, 실시예 2에서 얻어진 MSM 추출물의 EC₅₀ 값이 2.3%, 1.8% 또는 0.08 % 이며 실시예 2의 MSM 추출물이 더 적은 양으로 높은 항산화 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: 추출물의 항균 활성 분석

실시예 1의 MS 추출물 및 실시예 2의 MSM 추출물의 항균 활성을 시험하고자, 그람 양성균, Bacillus cereus(B. cereus), Bacillus megaterium(B. megaterium, ATCC 14579), Staphylococcus aureus(S. aureus, ATCC 12600), Listeria monocytogenes(L. monocytogenes, ATCC 15313) 그람음성균, Pseudomonas flurorescens(P. flurorescens, ATCC 13525), Escherichia coli(E. coli, ATCC 11775), Salmonella enteritidis(S. enteritidis, ATCC 31194), Vibrio parahaemolyticus(V. parahaemolyticus, ATCC 17802)을 시험균주로 사용하였다.

또한 여드름균인 Propionibacterium acnes (ATCC 6919)와 비듬균 Malassezia furfur (ATCC 14521)을 시험균주로 사용하였다.

구체적으로, 상기 시험균주를 LB 배지에 37℃, 24시간 전배양(pre-culture)하였다. 1% LB agar을 20 mL씩 분주하여 응고하여 평판배지를 제조하고, 상기 전배양한 시험균을 200 uL 첨가하여 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포하고, 도포한 시험균을 30분 정도 건조하였다. 상기 시험균이 도포 및 건조된 배지 위에 페이퍼 디스크(8 mm, Toyo Roshi Kaicha Ltd, Japan)를 놓고, 실시예 1 및 2의 추출물 분말을 1% 또는 10% 균질 용액으로 시료 용액을 제조하고, 시료 용액 30 uL를 주입한 후,　37℃ 온도에서 24시간 동안 배양하여 페이퍼 디스크 주변의 억제환(inhibition clear zone)의 직경을 측정하여 항균성을 분석하였다.

상기 항균 활성 분석 결과를 도 7 및 도 8에 나타냈다. 도 7은 비교예 1에 따라 0.02M 탄산염을 이용하여 제조한 세리신 추출물과 실시예 1 및 2에 따라 해양심층수를 이용한 세리신 추출물의 항균 효능을 분석한 것이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 종래의 탄산나트륨을 이용한 추출물과 비교하여, 실시예 2의 MSM 추출물은 바실러스와 포도상구균에 대한 항균 활성이 관찰되었다.

도 8은 여드름균과 비듬균을 대상으로 항균실험을 한 것으로서 실시예 2의 MSM 추출물은 여드름균과 비듬균에 대해 항균효과가 있으며, 실시예 1의 MS추출물은 비듬균에 대한 항균력이 확인되었다.

실시예 7: 세포주 독성 실험

세포주 독성 실험은 Cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo)을 이용하여 측정하였다. 실험에 이용한 세포주는 쥐의 melanoma 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475 )와 사람 피부세포 hs295T(ATCC CRL-7233) 및 hs895.sk(ATCC CRL-7636)와 사람 비만세포 3T3-L1(ATCC CRL-3242)를 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM) 배지를 이용하여 각각 10 % fetal bovine serum(FBS), 1% Penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양 하여 실험에 사용하였다.

비교예 1에 따라 0.02M 탄산염을 이용하여 제조한 세리신 추출물과 실시예 1 및 2에 따라 해양심층수를 이용한 세리신 추출물을 각각 0.1%, 1% 및 5% 농도의 시료 용액을 제조하였다.

상기 세포주를 24 well plate에 well 당 5 x 10³개의 세포를 분주한 다음 12-24 시간 배양하고, 각 추출 시료를 농도 별로 분주하여 24, 48 또는 72 시간 동안 배양하였다. 상기 배양물에 CCK-8을 첨가하고 2 내지 4 시간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 무처리군을 100%로 하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하였으며, 상기 세포주 독성 실험결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다. 도 9은 마우스 피부세포 B16F10 세포를 대상으로 독성 실험을 한 것이며, 도 10은 사람피부세포 hs895.sk 세포를 대상으로 독성 실험 결과이다.

도 9에 나타낸 마우스 피부세포인 B16F10세포의 독성 실험에서, 5% 농도의 시료 용액에서 72시간까지 모두 독성이 없는 것으로 확인되었으나, 비교예 1에 따른 0.2 M의 Na₂CO₃ 를 이용한 세리신 추출물은 5% 농도에서 독성이 확인되었다. 사람의 hs295T 세포의 독성테스트에서는 비교예 1에 따른 0.2 M의 Na₂CO₃을 이용한 세리신 추출물, 실시예 1에서 얻은 MS추출물, 실시예 2에서 얻은 MSM 추출물 용액에서 0.1%, 1% 및 5% 농도에서 모두 독성이 없었으므로, 이들 시료는 5% 농도까지는 독성이 없는 것으로 확인되었다(도 10)

실시예 8: 세포주를 이용한 항산화 활성 분석

8-1: Superoxide radical 소거활성

첫 번째 항산화 활성 분석 실험은, Superoxide radical 소거활성은 Nishikimi 등(1972)의 방법에 따라 측정하였다. 실험에 이용한 세포주는 실시예 6에서 사용한 쥐의 melanoma 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475 )이었다.

희석한 세리신 시료가 처리된 세포 또는 무처리 세포 마쇄액 20 uL에 60 uM nitro blue tetrazoliu(NBT)과 98 uM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)를 함유한 20 mM Tris 용액(pH 8.0) 800 uL를 혼합한 다음, 20 mM Tris 용액 80 uL와 33 uM phenazine methosulfate(PMS) 100 uL를 각각 첨가하였다. 비효소적으로　PMS/NADH로 유발된 superoxide radical의 formazan 측정은 560 nm에서 10분 동안 반응물의 흡광도를 측정하고 아래 식으로 계산하였다.

Superoxide radical scavenging ability = [(A-B)/A] x 100

A, absorbance of not added sample

B, absorbance of added sample

상기 실험결과를 도 11에 나타냈으며, 쥐의 melanoma 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475 )에 대한 항산화 분석은 5% MSM에서 albutin 1%와 같은 항산화 효과가 있음이 확인 되었다(도 11).

8-2: Total antioxidant capacity

두 번째 항산화 활성 분석 실험은, Total antioxidant capacity assay kit(ab65329, USA)를 사용하였다. 이용한 세포주는 실시예 6에서 사용한 쥐의 melanoma 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475 )와 사람 피부세포 hs295T(ATCC CRL-7233)이었다.

총항산화능(Total antioxidant capacity,TAC)는 Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 방법을 수정한 Erel 방법에 쥐의 B16F10세포와 사람의 hs 295T 세포를 6 well plate에 2 x 10⁶ 분주하고에 시료를 농도별 처리한 후 시간별로 세포를 수집하여 PBS로 세척하고 100ul 증류수로 재부유하여 피펫팅 후 10분동안 얼음에 방치한다. 세포를 스핀 다운하여 상청액을 새로운 튜브에 옮기고 CU^{2 +} 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 정도 방치한 후 570 nm에서 흡광도 측정하여 분석하였다.

구체적으로, 실시예 7과 동일하게 준비한 쥐의 B16F10세포와 사람의 hs 295T 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 96 well plate에 2 x 10⁶ 을 분주하고 시료를 12 - 24 시간 배양 후, 시료를 처리하였다. 각 시간 또는 일자별과 농도에 따라 처리된 세포를 수집하여 10 % sodium phosphate buffer(PBS, pH 6.8)로 세척, 원심 한 후, 증류수 100 uL를 넣어 준비하였다. Positive 대조군(Vitamin C)와 샘플을 각 100 uL 준비하는 동시에 스탠다드(Trolox)를 96 well에 넣고, Cu^{2 +} 100 uL를 위에 넣어준다. 혼합 후 실온에서 1.5 시간 배양하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 9: 세포주 내에서의 멜라닌 정량 분석

멜라닌 정량 분석을 위해, 실시예 7에서 사용한 쥐의 B16F10세포와 사람의 hs 295T 세포를 10% FBS가 포함 된 DMEM 배지에서 배양하였다.

6 well plate에 3 x 10⁵ 량 분주하고 세포를 12- 24 시간 배양 후, 비교예 1에 따른 0.2 M의 Na₂CO₃을 이용한 세리신 추출물, 실시예 1에서 얻은 MS추출물, 실시예 2에서 얻은 MSM 추출물 용액 및 Arbutin 용액의 1% 용액을 처리하고 24, 48 또는 72 시간 동안 배양하였다. 각 시간별로 세포를 수집하여 10 % DMSO 가 첨가 된 1 N NaOH 에서 용해한 후 80℃에서 1시간 동안 배양하고 475 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 결과를 도 12에 나타냈다.

쥐의 B16F10세포의 미백효과 분석은 1% MS와 MSM에서 albutin 1%와 같은 항멜라닌 효과가 있음이 확인되었다(도 12).

실시예 10: 세포내에서의 Total antioxidant capacity(TAC) 분석

세포내에서 항산화 활성 측정을 위해, 실시예 7에서 사용한 쥐의 B16F10세포와 사람의 hs 295T 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 6 well plate에 5 x 10⁵ 량 분주하고 시료를 12 내지 24 시간 배양 후, 비교예 1에 따른 0.2 M의 Na₂CO₃을 이용한 세리신 추출물, 실시예 1에서 얻은 MS추출물, 실시예 2에서 얻은 MSM 추출물 용액 및 대조구로 항산화와 미백의 기능을 가진 Arbutin 용액의 5% 용액을 처리하였다. 처리한 후에 48시간 경과 후, 세포를 수집하여 10 % sodium phosphate buffer(PBS, pH 6.8)에서 용해한 후, Cu^{2 +} 용액과 혼합하여(abcam, USA) 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 배양하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.　이때 Trolox를 이용하여 검정곡선을 그리고 대입 후 항산화 활성(%)를 구했다.

쥐의 B16F10, 사람의 hs295T 세포에서 해양심층수 이용 세리신 추출물(MS, MSM)의 경우 알부틴과 유사한 항산화 효과가 확인되었지만 탄산나트륨 시약의 경우 효과가 없었다(도 13).

Claims (18)

1. 추출대상인 누에고치를, 추출용매로서 탄산이온 및 미네랄을 함유하는 해양심층수를 이용하여 추출하여 제조되며, 미네랄과 세리신을 포함하는 추출물로서.
   상기 추출물의 미네랄은 나트륨 20,000 내지 50,000 ㎍/g, 마그네슘 15,000 내지 30,000 ㎍/g, 칼륨 2,000 내지 20,000 ㎍/g, 및 스트론튬 40 내지 250 ㎍/g 을 포함하는 것인, 미네랄과 세리신을 포함하는 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은, 상백피 및 상지로 이루어지는 군에서 1종 이상의 뽕나무 추출물을 추가로 포함하는 추출물.
3. 제2항에 있어서, 상기 상백피 또는 상지를 추가로 포함하는 추출물은, 누에고치로부터 제조되는 미네랄과 세리신을 포함하는 추출물에 상백피 또는 상지를 첨가하여 추출한 것인 추출물.
4. 제3항에 있어서, 상기 추출물 제조에 사용된 (i) 누에고치 및 (ii) 상백피 및 상지로 이루어지는 군에서 1종 이상 뽕나무의 혼합 중량비는 1:9 내지 9:1인 추출물.
5. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 누에고치에 포함된 피브로인이 제거된 것인 추출물.
6. 제1항에 있어서, 상기 추출물에 포함된 나트륨, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨의 중량비는 25 내지 28 : 2 내지 5: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5인 것인, 추출물.
7. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 10 내지 250 kDa 분자량 범위를 갖는, 세리신 또는 이의 단편을 포함하는 것인 추출물.
8. 누에 고치 절단물을 준비하는 단계,
   상기 누에 고치 절단물에, 추출용매로서 탄산이온 및 미네랄을 함유하는 해양심층수를 이용하여 95℃ 내지 98℃ 온도범위에서 세리신을 추출하여 세리신 추출물을 얻는 단계, 및
   상기 추출물에서 피브로인을 제거하는 단계를 포함하는, 미네랄과 세리신을 포함하는 추출물을 제조하는 방법으로서,
   상기 미네랄은 나트륨 20,000 내지 50,000 ㎍/g, 마그네슘 15,000 내지 30,000 ㎍/g, 칼륨 2,000 내지 20,000 ㎍/g, 및 스트론튬 40 내지 250 ㎍/g 을 포함하는 것인, 미네랄과 세리신을 포함하는 추출물을 제조하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 세리신 추출물을 얻는 단계 이후에, 상기 추출물을 95℃ 내지 98℃ 온도범위에서 가열하여 농축하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 세리신 추출물을 얻는 단계에서 상기 세리신 추출물에 상백피 및 상지로 이루어지는 군에서 1종 이상의 뽕나무를 첨가하여 95℃ 내지 98℃의 온도범위에서 가열하여 뽕나무 추출물을 추가로 포함하는 추출물을 제조하는 단계를 수행하는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 추출용매는 미네랄을 제거하기 위한 투석처리를 수행하지 않은 해양심층수인 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 추출물을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 추출물을 포함하는, 화장료 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백, 항산화 또는 항균 활성을 갖는 것인 화장료 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 항균 활성은 그람 음성 세균, 비듬균 및 여드름균에 대한 항균 활성인 것인 화장료 조성물.
16. 제13항에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 두발 케어제품, 피부 케어제품, 세안제 또는 치아 케어제품인 화장료 조성물.
17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 추출물을 포함하는, 여드름 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 추출물을 포함하는, 비듬 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.

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