KR101834795B1 - 초음파 병행 저온 압착법으로 추출된 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노리포좀을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의한 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 흰목이버섯과 참마를 초음파 처리를 병행하여 저온 압착법을 통해 추출하고, 이를 나노리포좀화함으로써 안정성이 높고, 피부 보습, 피부 주름 개선 및 피부 염증 완화효과가 우수한 화장료 조성물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

Description

초음파 병행 저온 압착법으로 추출된 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노리포좀을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing nanoliposome encapsulating extracts of Tremella fuciformis and Dioscorea japonica Thunb}

본 발명은 초음파 병행 저온 압착법으로 추출된 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물이 포접된 나노리포좀을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 초음파 처리 후 저온 압착법에 의해 흰목이 버섯 추출물과 참마 추출물을 제조하고, 이를 나노리포좀화하여 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다. 이 중에서 우리가 가장 쉽게 느낄 수 있는 것이 피부 노화로 이는 당뇨병, 심장병, 동맥경화, 치매, 암 등에 못지않게 중요한 것으로 인식이 되고 있으며, 개인차가 있지만 피부노화는 대개 20대 초반을 전후해서 시작되어 나이가 많아지면서 증가하는 것으로 나타난다.

피부노화는 유전적, 환경적 등의 다양한 요인에 의해 영향을 받는데 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 하나는 내인성 노화(intrinsic aging)로 이는 자연노화로써 유전정보에 따라 시간이 지나면서 일어나는 노화현상이며, 다른 하나는 외인성 노화(extrinsic aging)로 광노화(photoaging)라고도 하며, 외부환경 요인, 그 중에서도 햇빛에 존재하는 자외선에 의해 일어나는 노화 현상을 말한다.

자외선에 의해 활성산소가 발생하고 광노화가 일어나게 되는 것이다. 이들 활성산소 중 O2- 및 ㆍOH는 피부 광 손상에 있어서 중요하게 작용하여 피부 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질 및 DNA 산화, 결합 조직 성분의 사슬절단 및 비정산적인 교차결합에 의한 주름생성, 멜라닌 생성 과정 등에 참여하여 피부 노화를 가속화시킨다. 따라서 자외선으로부터 피부의 노화를 억제하고 지연시키는 것이 중요하다.

한편 피부는 유해물질 또는 유해 작용에 대한 보호막으로서의 기능도 하지만 한편으로는 효능물질에 대한 장벽으로서 작용하기도 한다. 그러므로 효능 물질을 선택적으로 피부에 침투시키기 위해서는 특수한 피부 흡수 전달시스템이 필요하며 이를 위하여 가장 많이 연구되고 있는 것 중 하나가 리포좀(liposome)이다.

리포좀은 인지질을 수용액에 현탁할 때 생기는 소포로서 지질 이중충으로 구성된 막에 의해 외막과 격리되어 있으며 막 내에 콜레스테롤 당지질 등의 지질이나 막 단백질을 이입시킬 수 있다.

리포좀은 수용액 또는 유용성 물질을 포집할 수 있어 이들 원료의 운반을 도와주는 역할을 한다. 예를 들면 민감하고 피부에 흡수되기 어려운 원료들을 리포좀에 포집시켜 운반하면 이들 원료성분이 깨지지 않고 그대로 피부에 흡수될 수 있도록 도와주는 역할을 한다.

기존의 여러 경피전달 시스템(transdermal delivery system)들 중에서 리포좀(liposome)은 생체막의 주요성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며 수용성 또는 지용성 성분 모두를 리포좀의 지질 이중층으로 구성된 내부로 포집할 수 있다는 장점이 있다.

한편, 흰목이(Tremella fuciformis) 버섯은 봄부터 가을에 걸쳐 활엽수의 고목, 마른 가지 및 줄기 위에 발생하는 목재 부후성 버섯으로 한국, 일본, 중국, 인도, 유럽 및 북아메리카 등 전세계에 널리 분포하고 있다. 자실체의 형태는 겹꽃모양으로 반투성의 아교질이다. 표면은 평활한 백생이며 자실체의 가장자리는 물결모양으로 이루어져 있다. 예로부터 중국에서는 이 버섯을 상식하면 면역체계가 활성화되어 암과 노화를 막는 것은 물론 고혈압이나 동맥경화도 예방할 수 있다고 하여 인기가 높은 버섯이다. 예로부터 버섯은 인체에 중요한 각종 영양성분을 골고루 함유하고, 맛과 향이 뛰어나며, 광범위한 약리 작용을 갖고 있어서 전통식품 및 민간약의 재료로 널리 이용되어 왔다. 일반적으로 버섯의 약리학적 효과는 면역 증강작용, 인체의 항상성 유지 및 성인병 예방 효과가 있으며 최근에는 콜레스테롤의 감소, 항혈전 작용과 혈압 및 혈당강하에도 효과가 있는 것이 보고되었다. 또한 버섯은 여러 종류의 항암작용을 나타내는 물질도 함유하는 있는 것이 보고되었으며 그 주된 물질은 다당체라는 것이 밝혀졌다.

또한, 참마는 마과의 참마(Dioscorea japonica Thunb)의 뿌리로, 참마는 원산지가 한국으로 기후가 아주 추운 산간지대를 제외하고는 전국 산지에 분포를 하고 있으며, 덩굴성의 다년생 초본 식물이다. 잎은 대생하지만 간혹 호생하는 것도 있으며, 엽병이 길고, 길이 5 ~ 10cm, 폭 2 ~ 2.5cm로서 긴 타원형 또는 좁은 삼각형이며, 끝이 뾰족하다. 꽃은 자웅이주로서 6 ~ 7월에 피며, 줄기는 물체에 감기고 많은 가지가 갈라지고, 뿌리는 긴 원주형의 모양을 하고 있다. 한방에서는 예로부터 참마를 동상, 다뇨, 요실금, 피부 습진 등의 치료에 사용하여 왔으며, 최근에는 당뇨병의 치료에도 활용되고 있고, 자양, 강장, 보신 등으로 이용되어온 약재이다. 참마는 식물성 뮤신 등 다당체를 함유하고 있다.

다당체는 자연계에 널리 존재하며 생명을 유지하는데 필요한 많은 생리학적 기능과 관련이 있다. 다당류는 항암효과, 항염효과, 당대사, 항노화 등의 측면에서 특별한 역할을 가지며, 생체의 면역을 향상시키는 효과를 가지고 있다.

대한민국 공개 특허 제 2015-0013316 호 "흰목이 버섯 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물"에는 흰목이버섯 추출물의 제조방법과 주름개선 및 보습력 향상 효과를 가진다는 것이 개시되어 있다. 또한, 제2009-0055079호 "야생 참마 추출물을 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물"에는 참마 추출물의 피부보습 및 피부 주름 개선 효과를 가진다고 개시되어 있다.

이와 같이 일반적인 흰목이버섯 또는 참마추출물이 피부 상태를 개선하는 화장료 조성물로 이용된 사례가 있다. 그러나 일반적인 고온에서 추출 방법은 추출 수율이 낮고 성분의 열변성이 있다는 단점이 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 저온 압착 추출을 도입하였고 이에 추출 수율 및 고분자의 활성도를 높이고자 초음파처리를 병행하였다. 초음파의 세포파쇄기능과 물분자의 활성화를 이용하여 유용성분을 저온에서 효과적으로 추출하고 그 추출효율 및 이용률이 높아짐을 확인하였다. 또한, 이를 나노리포좀한 결과 그 안정성이 높아짐을 확인하였고 이를 화장료 조성물의 유효성분으로 사용하는 경우, 피부 보습효과와 주름개선효과, 염증완화 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의해 제조된 흰목이버섯과 참마의 혼합추출물이 포접된 나노리포좀을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의해 제조된 흰목이버섯과 참마의 혼합추출물이 포접된 나노리포좀의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 초음파 처리 병행 저온 압착법으로 추출된 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노 리포좀을 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01~15 중량% 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의한 추출은 흰목이버섯 또는 참마를 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.

상기 흰목이버섯과 참마 혼합추출물은 초음파 병행 저온 압착법에 의한 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 각각 1~5:5~1의 중량비율로 혼합하여 이루어진다.

상기 화장료 조성물은 피부보습용, 피부주름 개선용 및 피부 염증완화용 화장료 조성물이다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)a1)흰목이 버섯을 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 흰목이버섯 추출물을 제조하는 단계; a2)참마를 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 흰목이버섯 추출물을 제조하는 단계; B)상기 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 1~5:5~1의 비율로 혼합하는 단계; C)상기 흰목이버섯과 참마 혼합추출물, 레시틴을 정제수에 용해시키는 단계; 및 D)고압 유화기에 투입하여 압력 1,000~1,500 bar에서 유화시키는 단계를 포함하는 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노 리포좀의 제조방법이 제공된다.

상기 B)단계에서 상기 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 1:3의 비율로 혼합하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조되는 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노리포좀은 제형 내에서 활성성분의 안정성을 높이고, 피부 흡수력을 증가시켜 우수한 피부보습효과, 주름개선효과 및 염증완화효과를 나타내므로, 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 나노리포좀의 사진도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 추출물의 Hyaluronic acid 생성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 추출물의 HAS mRNA 발현효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따르면, 초음파 처리 병행 저온 압착법으로 추출된 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노 리포좀을 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01~15 중량% 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의한 추출은 흰목이버섯 또는 참마를 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 유효성분의 효율적인 추출을 위해 초음파 추출법과 저온 압착추출법을 병행 사용한다. 이때, 건조된 흰목이버섯과 참마를 그대로 사용하거나, 분쇄하여 표면적을 넓혀서 사용할 수도 있다. 이어 추출효율을 높이기 위해 정제수에 침지하여 swelling 하는데, 정제수의 양은 4~6배, 침지시간은 24~48시간으로 하는 것이 그 효율이 높다. 흰목이 버섯과 참마를 불린(swelling) 후, 초음파 처리한다. 바람직하게는 추출효과를 높이기 위해 10~15분간 3~4회 반복하여 수행한다. 초음파 처리 후, 저온(상온)에서 압착하여 각각의 추출물을 제조한다. 본 명세서에서 저온이란 가열하거나 냉각하지 않은 상태의 온도로 15~25℃를 의미한다. 이와 같이 초음파 및 저온 압착추출법을 사용하므로, 통상적인 열수추출방법에 비해 성분의 변질 및 손실도를 줄일 수 있다는 장점을 가진다.

상기 흰목이버섯과 참마 혼합추출물은 초음파 병행 저온 압착법에 의한 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 각각 1~5:5~1의 중량비율로 혼합하여 이루어진다. 각각의 추출물을 제조한 뒤에 상기 비율로 혼합하거나, 흰목이버섯과 참마를 상기 비율로 혼합하여 추출함으로써 제조된다. 이때, 흰목이버섯 추출물과 참마추출물을 1:3으로 혼합하는 경우에 그 상승작용에 의하여 가장 우수한 피부 개선 활성을 나타내었다.

상기 제조된 흰목이버섯과 참마의 혼합추출물은 나노리포좀 형태로 화장료 조성물에 함유된다. 이 경우, 나노리포좀의 제조 방법은 제한되지 않으며, 통상의 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제조된 흰목이버섯과 참마의 혼합추출물, 레시틴을 혼합하여 정제수에 용해시킨다. 글리세린이나 부틸렌글라이콜을 추가적으로 첨가할 수 있으며, 유화보조제로서 계면활성제를 사용할 수 있다. 용해물을 고압 유화기에 투입하여 압력 1,000 bar 이상, 바람직하게는 1,000~1,500 bar에서 유화시켜 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노리포좀을 제조한다. 나노리포좀 제조시 흰목이버섯과 참마 혼합추출물은 5 ~ 50 중량%를 포함할 수 있다. 이때 5% 미만으로 포함하는 경우 그 효과가 미비하게 되고, 50% 초과하여 포함하는 경우 나노리포좀의 안정성이 감소한다.

이와 같이 제조된 흰목이버섯과 참마 혼합추출물을 포접하는 나노리포좀은 화장료조성물 총 중량에 대하여 0.005~50 중량%, 바람직하게는 0.01~15 중량% 함유된다. 활성성분으로서 상기 흰목이버섯과 참마 혼합추출물을 포접하는 나노리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 안정성이 우수하고, 피부 흡수율이 증가되므로, 보다 우수한 피부 보습, 주름개선 및 염증완화효과를 나타내었다.

본 발명의 화장료를 함유하는 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

제조예 1: 흰목이버섯 추출물 제조

건조 흰목이버섯 200g을 5배 중량에 해당하는 정제수에서 80℃로 3시간 2회 반복 추출하여 여과한 후, 이를 감압 농축하고 동결 건조하여 흰목이버섯 추출물을 제조하였다.

제조예 2: 참마 추출물 제조

건조 참마 200g을 5배 중량에 해당하는 정제수에서 80℃로 3시간 2회 반복 추출하여 여과한 후, 이를 감압 농축하고 동결 건조하여 참마 추출물을 제조하였다.

제조예 3: 초음파 처리 병행 저온 압착에 의한 흰목이버섯 추출물 제조

건조 흰목이버섯 200g을 5배 중량에 해당하는 정제수에 침지하여 48시간동안 swelling을 한 후, 초음파기기를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 15분, 3회 반복 조건으로 처리 후, 9 kg/cm²의 압력으로 상온에서 압착하여 흰목이버섯 추출물을 제조하였다.

제조예 4: 초음파 처리 병행 저온 압착에 의한 참마 추출물 제조

건조된 참마 200g을 5배 중량에 해당하는 정제수에 침지하여 48시간동안 swelling을 한 후, 초음파기기를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 15분, 3회 반복 조건으로 처리 후, 9 kg/cm²의 압력으로 상온에서 압착하여 참마 추출물을 제조하였다.

실시예 1~5: 초음파 처리 병행 저온 압착에 의한 흰목이버섯과 참마 혼합추출물 제조

상기 제조예 3과 4에서 제조한 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 하기 표 1과 같은 중량 비율로 혼합하여 동일 중량의 흰목이버섯 및 참마 혼합추출물을 제조하였다.

	제조예 3	제조예 4
실시예 1	1	1
실시예 2	1	3
실시예 3	1	5
실시예 4	3	1
실시예 5	5	1

시험예 1: Hyaluronic acid 생성량 측정

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 추출물을 사용하여 Hyaluronic acid 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 50ug/ml씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 회수한 배양액은 ELISA kit를 이용하여 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의해 제조된 흰목이버섯 추출물과 참마추출물의 효과가 제조예 1, 2의 통상적인 방법의 열수 추출물보다 우수하였다. 또한 초음파 처리 병행 저온 압착법에 의해 제조된 흰목이버섯 추출물과 참마추출물을 혼합한 실시예의 혼합물은 그 상승작용에 의하여 더 높은 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 나타내었으며, 특히 1:3의 중량비로 혼합된 실시예 2에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 2: HAS mRNA 발현에 미치는 효과

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 추출물의 HAS mRNA 발현효과를 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 50ug/ml씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 hyaluronic acid synthase(HAS) mRNA 발현량을 조사하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. HAS mRNA 발현을 조사한 결과, HAS-1, HAS-2 모두 모든 시료 처리군에서 mRNA 발현이 증가하였으며, HAS-1의 경우 실시예 2, 3, 4, 5에서, HAS-2의 경우 실시예 2와 3에서 발현이 현저하게 증가하였다.

시험예 3: MMP-1 생성 억제 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 시료를 serum이 없는 DMEM 배지에 농도 별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit(Amersham, USA)를 사용하여 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 transforming growth factor-β(TGF-β)을 사용하였다.

시료 농도 ㎍/㎖	MMP-1 생성억제율(%)
	제조예				실시예					TGF-β
	1	2	3	4	1	2	3	4	5
50	9.3	11.8	13.7	16.7	17.7	28.6	26.6	25.0	26.8	22.3
100	13.6	19.3	20.4	26.2	32.3	47.7	46.9	45.5	47.4	48.1
500	24.1	37.5	42.3	43.6	44.4	68.9	64.2	62.0	64.4	65.8
1000	36.6	43.9	55.8	56.3	57.1	84.8	82.5	82.0	82.7	83.6

MMP-1 생성 억제 효과를 살펴본 결과, 단독 추출물인 제조예 1~4 보다 혼합하여 적용한 실시예 1~5 에서 MMP-1 생성 억제 효과가 더 우수하였다. 그 중에서도 실시예 2에서 가장 높은 억제율을 나타내었으며 대조군인 TGF-β 보다도 우수한 경향의 효과를 보여주었다.

시험예 4: 엘라스테이즈 활성 억제 효과 시험

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

시료 농도 ㎍/㎖	Halo diameter (cm)
	제조예				실시예					Elastase	Retinol Crystal
	1	2	3	4	1	2	3	4	5
100	1.8	1.8	1.6	1.7	1.7	1.5	1.6	1.6	1.5	1.9	0.9
500	1.7	1.6	1.5	1.6	1.6	1.2	1.4	1.5	1.3
1000	1.6	1.6	1.2	1.4	1.3	1.0	1.1	1.2	1.1

헤일로 직경(Halo diameter)이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 특히 실시예 2, 3, 5에서 헤일로 직경(halo diameter)이 감소하여 우수한 엘라스타제 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시험예 5: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시료 농도 ㎍/㎖	procollagen 발현율(%)
	제조예				실시예					TGF-β
	1	2	3	4	1	2	3	4	5
0	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61
100	13.79	17.74	25.22	28.19	35.00	42.98	41.00	41.70	41.53	43.96
500	29.71	34.96	48.29	47.86	50.44	58.78	56.87	58.43	57.96	59.73
1000	63.52	69.29	83.44	82.90	88.92	98.54	96.15	97.61	96.09	98.94

실시예 2~5에서 우수한 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 2에서 가장 우수한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내었다.

시험예 6: TNF-α 생성량

염증매개인자 발현억제 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다.

TNF-α는 macrophage와 fibroblast에 의해 분비되어 endothelial cell, neutrophil 및 B cell 등을 자극함으로써 chemokines, prostaglandins, proteases 및 growth factors 등의 분비를 촉진하는데, UV에 의해서 유의하게 증가된 HaCaT cell의 TNF-α를 하기 표 5에서 보는 바와 같이 실시예 2에서 가장 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.

시료 농도 ㎍/㎖	TNF-α 발현율(%)
	제조예				실시예					UV 조사
	1	2	3	4	1	2	3	4	5
100	79.84	77.30	71.84	69.49	61.22	51.28	54.35	57.46	53.29	100
500	44.19	45.33	39.24	38.70	35.09	29.97	31.63	33.10	30.55
1000	21.73	23.82	17.45	18.37	13.53	9.44	10.59	14.65	11.07

실시예 6: 초음파처리 병행 저온 압착 추출물을 함유하는 나노리포좀 제조

상기 시험예에서 초음파 병행 저온 압착 방법으로 추출한 혼합 추출물 중 가장 바람직한 혼합 추출물로 확인된 실시예 2의 혼합추출물을 함유하는 나노리포좀을 하기 표 6의 함량비로 조합하여 제조하였다. 고압균질기(microfluidizer)를 통과시켜 나노화함으로써 이중층 구조의 나노리포좀을 제조하였다.

원료	함량(중량 %)
글리세린	45
부틸렌글라이콜	8
레시틴	2
흰목이버섯 및 참마 혼합추출물 (실시예 2)	12
정제수	33

상기 표 6의 순서대로 투입 후 70℃까지 가열하여 균일하게 혼합 및 용해시킨 후, 1000bar의 압력조건에서 고압균질기에 3회 반복 통과시켜 나노리포좀을 수득하였다(도 1).

비교예 1: 혼합추출물 함유 제형제조

상기 표 6에서, 실시예 2의 혼합추출물 대신에 제조예 1, 2의 추출물을 1:3 중량비로 혼합한 혼합추출물을 사용하여 70℃까지 가열하여 균일하게 혼합 및 용해시켰다.

시험예 7: 나노리포좀 제조에 따른 안정성 확인

상기 실시예 6과 비교예 1의 조성물을 대상으로 나노 입자의 형성에 따라 안정성에 미치는 영향을 측정하였다.

측정은 각 샘플을 45℃로 유지되는 항온 챔버에 비치하고, 각각 1주, 2주, 3주, 4주 경과 시 나노 입자의 변화를 관찰하는 방법으로 수행하였다.

그 결과 나노리포좀으로 형성하지 않은 경우, 3주 경과시부터 입자가 연갈색으로 변화한 반면 나노리포좀으로 형성하여 보관한 경우, 4주 경과시까지 입자의 색이 변화하지 않고 초기 색깔을 그대로 유지함으로써 나노리포좀 형성을 통해 활성성분인 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물이 안정화되었음을 알 수 있었다.

실시예 7: 나노리포좀을 함유하는 크림 제조

상기 실시예 2, 실시예 6과 비교예 1을 포함한 크림을 하기 표 7의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	대조예	비교예 2	비교예 3	실시예 7
비교예 1	-	3.0	-	-
실시예 2	-	-	3.0	-
실시예 6	-	-	-	3.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100

시험예 8: 피부 보습 개선 효과 확인

초음파 처리 병행 저온 압착 혼합추출물을 함유하는 나노리포좀을 포함하는 화장료 조성물의 보습효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 40명을 대상으로 시험하였다.

피부 보습 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 2주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 2부위를 정하고 피부의 수분량을 각각 3회에 걸쳐 측정한 후 2주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 수분함량 측정 장치를 이용하여 각질층 바로 아래의 표피층의 수분을 측정하였다. 상기 측정결과를 표 8에 정리하였다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균	수분 증가량(%)
대조예	34	38	10
비교예 2	34	44	29
비교예 3	35	46	31
실시예 7	36	52	44

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 초음파 처리 병행 저온압착 혼합 추출물을 나노리포좀화한 실시예 6을 함유한 실시예 7에서 가장 높은 보습효과를 나타내었다.

시험예 9: 피부 주름 개선 효과 확인

초음파 처리 병행 저온압착 혼합추출물을 함유하는 나노리포좀을 포함하는 화장료 조성물의 피부주름 개선효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 40명을 대상으로 시험하였다.

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 9에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
대조예	9
비교예 2	31
비교예 3	35
실시예 7	48

상기 표 9로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 초음파 처리 병행 저온압착 혼합추출물을 나노리포좀화한 실시예 6을 함유한 실시예 7에서 가장 높은 주름 개선 효과를 나타내었다.

실시예 8: 유연 화장수

본 발명의 초음파 처리 병행 저온압착 혼합추출물을 포접하는 나노리포좀(실시예 6)을 포함한 유연 화장수를 하기의 표 10의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 8
실시예 6	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 9: 영양 화장수(밀크로션)

본 발명의 초음파 병행 저온압착 혼합추출물을 함유하는 나노리포좀(실시예 6)을 포함한 영양 화장수를 하기의 표 11의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 9
실시예 6	2.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. A)a1)흰목이 버섯을 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 흰목이버섯 추출물을 제조하는 단계; a2)참마를 정제수에 침지하여 24~48시간 불리고(swelling), 초음파를 10~15분, 3~4회 반복으로 처리 한 후, 압착하여 참마 추출물을 제조하는 단계;
   B)상기 흰목이버섯 추출물과 참마 추출물을 1~5:5~1의 비율로 혼합하는 단계;
   C)상기 흰목이버섯과 참마 혼합추출물, 레시틴을 정제수에 용해시키는 단계; 및
   D)고압 유화기에 투입하여 압력 1,000~1,500 bar에서 유화시키는 단계를 포함하는 흰목이버섯과 참마 혼합추출물이 포접된 나노 리포좀의 제조방법.

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