WO1997045451A1 - Anticorps anti-lect2 humains, cellules le produisant et ses procede et materiel de dosage - Google Patents

Anticorps anti-lect2 humains, cellules le produisant et ses procede et materiel de dosage Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that reacts with a novel protein, human LECT2, a contacting cell that produces the antibody, a method for measuring human LECT2, and a measurement kit.
  • LECT2 (Leukocyte-deried chemotaxin 2) was discovered during the search for chemotactic factors secreted from such cancer cells, and was obtained from the culture supernatant of T-cell leukemia cell SKW-3. It is considered to be the obtained chemotactic factor.
  • the human LECT2 was obtained by using DNA encoding LECT2 in serum present in the culture of T-cell leukemia cells SKW-3. It was newly discovered as a protein having a homology of 90% or more from the DNA library. Table 1 below shows the amino acid sequences of human LECTT2 and E. coli LECTT2 so that they can be compared. 1
  • LECT2 This human LECT2 is also considered to be a chemotactic factor similar to that of LECT2, and is expected to be applied to the treatment of pathological conditions. Wanted.
  • LECT2 was named LECT2a and LECT2b was named LECT2b, but the names were changed because the previous names were not appropriate.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has as its object to provide an antibody against human LECT2, a cell producing the same, a method for measuring the same, and a kit for measurement. Disclosure of the invention
  • the antibody according to the first aspect of the present invention is characterized in that it specifically reacts with human LECT2 (a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).
  • human LECT2 a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Such antibodies include, for example, the antibody produced by the fusion cell clone G2 A5 D7 (Accession number FERM P-1 5638) and the fusion cell clone A1 G1 C6 (Accession number F ERM P-1 5639).
  • Antibody produced by fused cell clone 5C5 (Accession number F ERM P-1 5640), fused cell clone HI 2 D10D6 (Accession number FERM P-1)
  • the second fused cell of the present invention is characterized by producing an antibody that specifically reacts with human LECT2.
  • Such fused cells include, for example, a fused cell clone G2A5D7 (accession number FERM P—15638), A1G1C6 (accession number FERM P-15639) 5C5 (accession number FERM P— 15640), H12D10D6 (accession number F ERM P-15641), and 89F2 (accession number F ERM P- 16229).
  • the method for measuring human LECT2 which is the third aspect of the present invention, is characterized by comprising the following steps a) to c) and d) to f). That is, a) After reacting human LECT2 as a standard substance with an immobilized antibody in which a first antibody that specifically reacts with human LECT2 is bound to an insoluble support, b) human LECT Reacting a hybrid antibody obtained by recognizing a second antibody that specifically reacts with 2 with a labeling substance,
  • the fourth kit for measuring human LECT2 of the present invention comprises an immobilized antibody obtained by binding a first antibody specifically reacting with human LECT2 to an insoluble support, and a human LECT2. And a recognized antibody obtained by recognizing a second antibody that specifically reacts with a labeling substance.
  • the first antibody may be an antibody produced by a fused cell clone G2A5D7 (Accession No. FERM P-15638), a fused cell clone A1G1C6 (Accession No. Antibody produced by the fused cell clone 5C5 (Accession number FERM P-1 5640), fused cell clone HI 2D10D6 (Accession number F ERM P-1) 5641) or an antibody produced by the fused cell clone 89F2 (Accession number F ERM P-16229), wherein the second antibody is any of the four antibodies. It is preferable that the antibody is different from the first antibody.
  • labeling substance for example, a substance selected from the group consisting of peroxidase, biotin, -D-galactosidase, alkaline phosphatase and microperoxidase can be used.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of detection of human LECTT2 by ELISA
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the reaction specificity of the monoclonal antibody of each clone by Western plot
  • FIG. Fig. 4 is a graph showing the relationship between the degree of ECT2 and the absorbance
  • Fig. 4 is a graph showing the measured values of human LECT2 in the acute phase and the remission phase of a patient with acute hepatitis
  • Fig. 5 is a tissue of a healthy subject. Is a photograph showing a stained image of
  • FIG. 6 is a photograph showing a stained image of the tissue of a cirrhosis patient, (A) is a magnification of 100 times, (B) ) Is a 200-times enlarged photograph.
  • human LECT 2 (a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) was cloned and used as an immunogen.
  • the immunized animal a rat, a hamster, etc. can be used in addition to a mouse which is a baby animal. Normally, mice are the most commonly used, and BA LBZc mice and other strains (strain) can be used.
  • the immunization plan and the concentration of the antigen should be selected so that a sufficient amount of antigen-stimulated lymphocytes is formed. For example, one mouse is immunized intraperitoneally three times at intervals of 2 weeks with 25 g of antigen, and then 25 / g is intravenously administered. Several days after the final immunization, spleen cells are removed for fusion.
  • the spleen cells are fused with a suitable myeloma cell by using a suitable fusion promoter.
  • the myeloma cells are preferably those derived from the same kind of baby animals as the immunized animal, but spleen cells from rats, hamsters and the like can be fused with mouse osteoblast cells.
  • the preferred ratio of splenic K cells to bone 8 tumor cells ranges from about 20: 1 to about 2: 1. Use of about 1 Omicron beta pieces for splenocytes 0. 5 to 1. 5 m I of Sawago medium is suitable.
  • fusion promoter for example, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 to 4,000 can be advantageously used, but other fusion promoters known in the art (for example, Sendai virus (also known as HVJ)) can be used. It can also be used. Cell fusion may be performed by a method using electric shock other than the method using these fusion promoters.
  • Sendai virus also known as HVJ
  • a separate container eg, microtiter plate
  • the medium used is one that is drug-resistant (for example, 8-azaguanine-resistant) and does not support unfused myeloma cells (for example, HAT medium).
  • Unmatched myeloma cells die in this selective medium. Since these unfused splenocytes are non-painful cells, they die after a certain period of time (one week later). Cells that responded to the combination can survive in the selective medium because they have the properties of parental myeloma cells and the characteristics of parental spleen cells.
  • the antibody against the human LECT2 is subjected to risk cleaning by an enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) to obtain a monoclonal antibody that specifically binds to human LECT2. Select only fused cells that produce the antibody.
  • enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • fused cells include, for example, »fused cell clone G 2 A 5 D 7 (Accession number F ERM P-15638), fused cell clone A 1 G 1 C6 (Accession number FERM P-15639), fused cell clone 5 C 5 (Accession number F ERM P—1 5640), fused cell clone HI 2 D 10 D6 (Accession number F ERM P-15641) and fused cell clone 89 F 2 (accession number F ERM P- 16229).
  • the antibody After cloning the fused cells producing the desired antibody by an appropriate method (eg, limiting dilution method), the antibody can be produced by two different methods.
  • a monoclonal antibody produced by the fused cell can be obtained from the culture supernatant by culturing the combined cells for a certain period in an appropriate medium.
  • the fused cells can be injected into the peritoneal cavity of an immunized animal having an isogenic or semi-isogenic gene.
  • Monoclonal antibodies produced by the fused cells can be obtained in the blood and ascites of the host animal after a certain period of time.
  • the antibody In order to prepare an immobilized antibody in which an antibody that specifically reacts with human and ECT 2 is bound to an insoluble support, the antibody is contacted with the insoluble support. In addition to adsorbing the antibody, the antibody can be bound by a chemical method such as a covalent bond.
  • the insoluble carrier examples include polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacryl nitrile, fluororesin, cross-linked dextran, and polysaccharide, and other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. it can.
  • the shape of the insoluble carrier can be various shapes such as a tray shape, a spherical shape, a rod shape, a fibrous shape, a fibrous shape, a container shape, a cell, and a test tube.
  • the antibody that specifically reacts with human LECT2 may be a complete antibody or a fragment such as Fab or F (ab) '2.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can be used for ordinary immunological measurement methods. Although not specified, it is preferable to use enzymes, avidin, fluorescent substances, luminescent substances, radioactive substances and the like. Enzymes are peroxidase, 1-D-galactosidase, alkaline phosphatase, microperoxidase, fluorescent substances such as fluorescein isothiocynate, phycopyriprotein and phycoerythrin, and luminescent substances such as isorcinol, lucigenin, etc., and as the radioactive substance ⁇ can be used '25 teeth 131 I, 14 C, 3 H and the like.
  • bitin when bitin is used as the labeling substance, it is more preferable to use enzyme-labeled avidin because a higher concentration can be obtained.
  • the labeling enzyme the same enzyme as that used when the antibody is recognized can be used, but peroxidase is particularly preferable.
  • a substrate and, if necessary, a color former are used to measure its activity.
  • a Peruokishidaze using H 2 0 2 as substrate 2 as coloring agent, 2 '- Ajinoji [3- Echirubenzu thiazoline sulfonic acid] Anmoniumu salt (ABT S), 5-Aminosarichiru acid, o-
  • alkaline phosphatase such as phenylenediamine (OPD), 4-aminoaminopyrine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, o-nitrophenylphosphine is used as a substrate.
  • yS-D-galactosidase is used as the enzyme, fluorosinzy (1-D-galactobyranoside), 4-methylpumbelliferyl 1 / S-D-galactobyranoside, etc. are used as substrates. be able to.
  • the immobilized antibody was allowed to react with human LECT2 as a standard substance, and then the human LECT2 that specifically reacted with the immobilized antibody was allowed to react with the recognition antibody. Measure insight. Thereby, the relationship between the amount of human LECT2 and the amount of knowledge, that is, a calibration curve is obtained.
  • the reaction medium used in this immunoassay is, for example, phosphoric acid Those containing a buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, a phosphate buffer solution and the like in the pH range of 6.0 to 8.0 are shown.
  • the sample is allowed to react with the immobilized antibody, and then with the labeled antibody. At this time, the labeled antibody reacts according to the concentration of human LECT2 contained in the specimen. Thereafter, the labeling amount of the recognition antibody is measured. By illuminating this measurement value with the calibration curve, the portability of human LECTT2 in the sample is measured.
  • the reaction medium is as described in C. above.
  • the measurement kit should be at least
  • the labeling substance of the labeled antibody is an enzyme, it usually contains a substrate for measuring the activity of the enzyme and a reaction stop solution.
  • the insoluble support and the identifiable substance are described above, and the description thereof is omitted. According to this measuring kit, the above-described measuring method can be performed.
  • Cloning of human LECT2cDNII was performed as follows. 50 g / T cell leukemia cells S KW-3 were treated with ml of PHA-P (manufactured by DIFCO) to prepare poIyA + RNA. First-strand cDNA (1 stc DNA) was synthesized using 5 ig of poIyA + RNA and primers of oIigo-dT.
  • a primer for PCR was synthesized based on the partial amino acid sequence of Pec LECT2 (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 9). That is, six types of oligonucleotides were derived from the amino acid sequence WAIICA and used as 5 ′ primers, and four types of oligonucleotides were deduced from the amino acid sequence HIENCD and used as 3 ′ primers.
  • 1 stc DNA was converted into type III, and the DNA fragment was amplified by 24 kinds of reactions which were combinations of the above primers.
  • the amplified DNA fragment is separated on an agarose gel. And analyzed by Southern blot. As a result, a DNA fragment of about 37 Obp was detected and cloned into pUC19.
  • [1 -3] Transformation of Escherichia coli with recombinant plasmid containing human LECT 2 ⁇ gene After transforming the Escherichia coli JM109 strain using the recombinant plasmid pMAL-TEV-human LECT2 obtained as described above, the obtained Escherichia coli clone has the nucleotide sequence expected by the Doxy method.
  • Exonuclease II I deletes the 5 'end of the human LECT2 cDNA cloned from Hindlll to EcoRI at the BamHI site of pUC19 to the nucleotide sequence of -14. After blunting with T4 DNA polymerase, the PstI linker was ligated, cut with PstI and BgI11, and expressed at the PstlBamHI site of the expression vector pcDL-SRa294. Cloned.
  • This recombinant expression vector was transfected into Chinese hamster CHO cells, and one strain expressing high expression of human LECT2 (C1D8— “! (Accession number FEMP-14668, also transferred to international deposit) Upon request, accession number FERM BP-5301 was assigned).
  • Recombinant human L EC T 2 (animal cell expression) is to metabolic label Te cowpea to 35 S- Mechionin were detected by applying a culture supernatant of CHO cells to SDS gel heavy gas migration. As a result, two bands with a molecular weight of about 14 kDa and 16 kDa
  • a suspension was prepared by thoroughly mixing 100 ⁇ l of the immunogenic human LECT2 prepared as in Example 1 above and 100 I of Freund's complete adjuvant, and a suspension was prepared. (LBZc) at 25 ⁇ l per animal Gave. Further, the same amount of antigen was administered 5 times every other week, and the spleen was taken out after 3 times and fusion experiments were performed.
  • the spleen cells of the excised mouse and myeloma cells of a syngeneic mouse (SP-2ZO-Ag-14) were mixed at a ratio of about 10: 1, and 50% polyethylene glycol 4000 was mixed with a desizing accelerator.
  • Cells after fusion were Kakaminato in HAT medium containing 1 0% Ushichisho such that 1 X 1 O e eel Is / ml of cell ⁇ (hypoxanthine, Amino pterin medium containing thymidine), 96 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ L's microtiter press
  • the fused cells were cultured in C0 2 incubator (5% C0 2, 3 7 ° C), the medium was exchanged with HA T medium, conditioned in the HAT medium, further 1 0% FCS- R PM I 1 6 Conditioned in 40 media.
  • Antibodies in the fusion culture cell supernatant were detected by the ELISA method using a microtiter plate on which the human LECT2 protein was immobilized. For the positive well, the cloning by the limiting dilution method was repeated twice, and five clones having reactivity to human LECT2 were selected, each of which was G2A5D7 and A1G. 1 C 6, 5 C 5, HI 2 D 10 D 6.89 F 2 (Accession number F ERM P—1 5638, F ERM P—1563 9, FE RM P—15 640, FE RM P-1 56 41, FE RM P—16 22 9).
  • the obtained clones were each suspended in 90% bovine serum containing 10% DMSO and stored in liquid nitrogen. Monoclonal antibodies produced by each clone are grown in the abdominal cavity of mice, and the protein-A Sepharose scalar Each of them was manufactured using the same method.
  • the absorbance value increased with the strain of the immobilized human LECT2, and became constant from a certain concentration, confirming that each clone specifically reacted with human LECT2.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue and indicates protein staining.
  • Lane I shows electrophoresis using a molecular weight marker and others using human LECT2 + MBP as an antigen.
  • Lanes 1 and 2 show protein staining, and others show Western blots with each monoclonal antibody.
  • Example 3 The class and subclass of each of the monoclonal antibodies obtained in Example 3 above were confirmed using a monoclonal subclass isotyping kit manufactured by American Corex Corporation. The results show that clones A1G1C6 and G2A5 The loan H12D10 was IgM. The clones 5C5 and 89F2 have not been confirmed.
  • the monoclonal antibody clone G2A5 obtained in Example 3 above was adjusted to a concentration of 5 II with 0.1 M carbonate buffer, pH 9.0, and added to each well of a 96-well microtiter plate. I was added, and the reaction was allowed to stand at 4 ° C for 20 hours. The antibody solution was discarded, PBS containing 1% BSA and 5% Shore was added to each well at 200 I and blocking was performed by allowing to stand at room temperature (20 to 25 ° C) for 2 hours. The blocking solution was discarded, and the plate was air-dried to obtain an immobilized antibody. This immobilized antibody was sealed and stored with a desiccant.
  • the human LECT2 protein was diluted with PBS to prepare a solution of 0.001 to 20 ng Zml, and 200 I of this solution was added to each well of the antibody-immobilized plate obtained in Example 6 above. After reacting for 1 hour at room temperature, each well was washed four times with PBS 300 I to remove excess PBS, and the peroxidase-labeled antibody (100 ⁇ ⁇ ) obtained in Example 7 above was added. For 1 hour, wash again with PBS, add 100 ⁇ of a solution of ⁇ ⁇ ⁇ methyl benzidine and hydrogen peroxide and react, add 100 ⁇ I of 1.5 ⁇ phosphoric acid to stop the reaction, The absorbance at a wavelength of 450 nm was measured. Table 2 and Fig. 3 show the measurement results at this time. [Table 2]
  • the content of the chemotactic factor human LECT2 in a sample can be measured, and the measurement results can be used for grasping a disease state and applying to treatment.
  • liver tissue of a healthy person and the liver tissue of a type C cirrhosis patient were collected, fixed with formalin according to a conventional method, and embedded in paraffin.
  • a tissue section was prepared using a microtome, deparaffinized according to a conventional method, and a PBS solution of an IgG fraction purified from the monoclonal antibody clone 89F2 obtained in Example 3 was used. After mounting on a section 00 ⁇ I (5 ⁇ g Xm ⁇ ), the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes, and washed with PBS.
  • Peroxidase-labeled anti-mouse IgG (manufactured by Dako) was added at 30 ° C for 30 minutes. After washing with PBS again, the cells were stained with a reaction of 3,3 ', 5,5'-diaminobenzidine and hydrogen peroxide, and the cell nuclei were stained with hematoxylin.
  • FIG. 5 is a photograph showing a stained image of a tissue of a healthy person, (A) is a photograph enlarged by 100 times, and (B) is a photograph enlarged by 200 times.
  • FIG. 6 is a photograph showing a stained image of a tissue of a liver cirrhosis patient, (A) is a 100-times enlarged photograph, and (B) is a 200-times enlarged photograph. Diffuse staining was observed in the cytoplasm of hepatocytes in the tissue sections of healthy subjects and patients with cirrhosis.
  • hepatic parenchymal cells showed granular staining of diaminobenzidine (stained in brown), but in patients with cirrhosis, a mixture of negative-positive cells was observed. The staining pattern was different from that of healthy subjects (hepatocytes were all positive in healthy subjects). No staining was observed in the connective tissue. Note that the nucleus in the photographs shown in Figs. 5 and 6 is a dotted dot. This suggests that LECT2 has some association with the cell cycle.
  • the antibody against human LECT2 of the present invention is useful in immunotherapy, diagnosis, and related industrial fields. Further, the fused cell of the present invention is useful for obtaining an antibody against human LECT2. Further, the antibody against human LECT2 of the present invention can be used in a method for measuring human LET2 and a kit for measurement. According to this assay method and assay kit, it is possible to measure human LEC T2 (which is considered to be a chemotactic factor) contained in a sample. The effect that application becomes possible is obtained. Specifically, for example, by reacting the antibody of the present invention with a tissue or the like extracted from a patient with various diseases (for example, hepatitis or cirrhosis), LECT2-expressing cells are present anywhere in the tissue. Can be checked. This makes it possible to diagnose and treat various diseases. Depositary institution
  • C1D8-1 and MaI-human LECT2 have been deposited at the following international depository organizations with the following accession numbers and deposit dates, respectively.
  • Fusion cell coulombs G2A5D7, A1G1C6, 5C5, H12D10D6, 89F2 have been deposited with the following domestic depositary institutions with the following accession numbers and deposit dates, respectively. . Name: Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute, Ministry of International Trade and Industry Address: 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (Postal Code: 305) Deposit Number and Deposit
  • Sequence type nucleic acid
  • AAG TCT TCC AAT GAG ATC CGG ACG TGT GAC CGC CAT GGC TGT GGA CAG 329 Lys Ser Ser Asn Gl u lie Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • AAG TCT TCC AAT GAG ATC GGG ACG TGT GAC CGC CAT GGC TGT GGA CAG 329 Lys Ser Ser Asn Glu Me Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (cDNA probe)
  • N C or G Location: 9
  • N A or G Location: 15
  • Other information: N T or C Location: 21
  • N C or G Location: 24
  • N T or C Location: 27
  • N T or A Location: 30
  • N T or C Location: 39
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Description

明細書 ヒト LECT 2に対する抗体、 それを産生する細胞、 その測定法及び測定用キッ
技術分野
本発明は、 新規な蛋白質ヒト L EC T 2と反応する抗体、 その抗体を産生する 触合細胞、 ヒ卜 LECT 2の測定法及び測定用キットに関する。 背景技術
最近、 好中球の癌細胞破壊反応への関与が知られるようになり、 癌組織におい て好中球の浸潤像が観察されることから、 好中球が癌細胞の分泌する走化性因子 に応答したものと考えられている。
LECT2 (Leukocyte-deri ed chemotaxin 2) は、 このような癌細胞から分 泌される走化性因子を探索する中から見いだされたものであり、 T細胞白血病細 胞 SKW— 3の培養上清から得られた走化性因子と考えられるものである。 ヒ卜 L ECT2は、 T細胞白血病細胞 SKW— 3の培養上淸中に存在するゥシ 血清中の L EC T 2をコードする D N Aを用いてヒ卜の。 DN Aライブラリーの 中から 90%以上のホモロジ一を有する蛋白質として新たに見出されたものであ る。 下記表 1は、 ヒト L EC T 2とゥシ L EC T 2のアミノ酸配列を比較できる ように示したものである。 ほ 1】
1 5 10 15 LECT2 Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu lie Ser Thr ゥシ LECT2
20 25 30 tFLECT2 Ala Leu Ata Gly Pro Trp Ala Asn I le Cys Ala Gly lys Ser Ser ゥシ LECT2 Gly Pro Trp Ala TTe lie Cys Ala Gly Lys Ser Ser
35 40 45 hfLECT2 Asn Glu lie Arg Thr Cys Asp Arq His Gly Cys Gly Gin Tyr Ser ゥシ LECT2 Asn Glu !!e Arg Thr Cys Asp Ofy His Gly Cys Gly Gin Tyr T F
50 55 60 ヒ LECT2 Ala Gin Arg Ser Gin Arci Pro His Gin Gly Val Asp Val Leu Cys ゥシ LECT2 Ala Gin Arg Asn Gin Lys Leu His Gin Gly Val Asp Val Leu Cys
65 70 75 h LECT2 Ser Aia Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met lie Val ゥシ LECT2 Ser ¾SD Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly lie Wet
80 85 90 tFLECT2 Gly Gin Glu Lys Pro Tyr Gin Asn Lys Asn Ala Me Asn Asn Gly ゥシ LECT2 Gly Gin Glu Lys Pro Tyr Lys Asn
95 100 105 ヒ ECT2 Val Arg lie Ser Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr lie ゥシ LECT2 lie Ser Gly Gly Phe Cys TTe Lys
110 115 120 LECT2 Lys Pro I le Lys Tyr Lys Gly Pro lie Lys Lys Gly Glu Lys Leu ゥシ LECT2 Tyr Lys Gly Sir lie
125 130 135 t ECT2 Gly Thr Leu Leu Pro Leu Gin Lys Val Tyr Pro Gly I le Gin Ser ゥシ LECT2 Val Tyr Pro Gly lie Gin Ser
140 145 150 LECT2 His Val His lie Glu Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr Ala Tyr ゥシ LECT2 His Tie His lie Giu Asn Cys Asp [eu Ser Asp Pro Thr
151
ECT2 Leu
ゥシ LECT2 このヒト LECT2もゥシ L ECT2同様の走化性因子であると考えられ、 病 態の把握ゃ瘙の治療への応用が期待されることから、 このヒト LECT 2の測定 法を確立することが望まれた。
なお、 当初、 ゥシ L ECT2を LECT2 a、 ヒト LECTを LECT2 bと 称していたが、 従前の名称は相応しくないことから名称を変更した。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、 ヒ卜 LECT 2に対する抗体、 それを産生する細胞、 その測定法及び測定用キットを提供することを目的とする。 発明の開示
上記課題を解決するため、 本発明の第 1である抗体は、 ヒト LECT2 (配列 表の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質） と特異的に反応するこ とを特徴とする。 かかる抗体としては、 例えば、 融合細胞クローン G2 A5 D 7 (受託番号 FERM P-1 5638) によって産生される抗体、 融合細胞クロ ーン A 1 G 1 C6 (受託番号 F ERM P- 1 5639) によって産生される抗 体、 融合細胞クローン 5C5 (受託番号 F ERM P-1 5640) によって産 生される抗体、 融合細胞クローン H I 2 D 1 0D6 (受託番号 FERM P- 1
5641 ) 、 あるいは、 融合細胞クローン 89 F2 (受託番号 FERM P-1
6229) によって産生される抗体がある。
本発明の第 2である融合細胞は、 ヒト LECT 2と特異的に反応する抗体を産 生することを特徴とする。 かかる融合細胞としては、 例えば、 融合細胞クローン G 2 A 5 D 7 (受託番号 FERM P— 1 5638) 、 A 1 G 1 C6 (受託番号 FERM P- 1 5639) 5 C 5 (受託番号 FERM P— 1 5640) 、 H 1 2 D 1 0 D 6 (受託番号 F ERM P- 1 5641 ) , 89 F 2 (受託番号 F ERM P— 1 6229) がある。
本発明の第 3であるヒ卜 LECT 2の測定法は、 下記 a) 〜c) 及び d) ~ f ) の工程を含むことを特徴とする。 即ち、 a) ヒト L ECT 2と特異的に反応する第 1の抗体を不溶性支持体に結合せしめ てなる固相化抗体に棵準物質としてのヒト L ECT 2を反応せしめた後、 b) ヒト L ECT 2と特異的に反応する第 2の抗体を標識物質によリ摞識化した 棵雜抗体を反応させ、
c) この反応生成物の摞識量を測定することにより検量線を作成する工程、 及び
d) 前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
e) 前記標識抗体を反応させ、
f ) この反応生成物の摞識量を測定し、 前記検量線から検体中に含まれるヒト L ECT 2を測定する工程。
本発明の第 4であるヒト L ECT 2の測定用キットは、 ヒ卜 LECT 2と特異 的に反応する第 1の抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体と、 ヒト LECT 2と特異的に反応する第 2の抗体を標識物質によリ棵識化した摞識抗体 とを備えたことを特徴とする。
本発明の第 3、 第 4において、 第 1の抗体は、 融合細胞クローン G2 A5 D7 (受託番号 FERM P- 1 5638) によって産生される抗体、 融合細胞クロ —ン A 1 G 1 C 6 (受託番号 F ERM P— 1 5639) によって産生される抗 体、 融合細胞クローン 5C5 (受託番号 FERM P-1 5640) によって産 生される抗体、 融合細胞クローン H I 2D 1 0D6 (受託番号 F ERM P-1 5641 ) によって産生される抗体、 あるいは、 融合細胞クローン 89 F 2 (受 託番号 F ERM P- 1 6229) によって産生される抗体であり、 前記第 2の 抗体は前記 4つの抗体のいずれかであって第 1の抗体とは異なるものであること が好ましい。 また、 標識物質としては、 例えば、 ペルォキシダ一ゼ、 ビォチン、 ー D—ガラクトシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルォキシ ダーゼからなる群から選ばれたものを用いることができる。 図面の簡単な説明
図 1は EL I S A法によるヒ卜 L EC T 2の検出結果を表すグラフであり、 図 2はウェスターンプロットによる各クローンのモノクローナル抗体の反応特異性 を表す説明図であり、 図 3はヒト L EC T 2の濂度と吸光度との関係を表すグラ フであり、 図 4は急性肝炎患者検体の急性期と宽解期におけるヒト LECT2の 測定値を表すグラフであり、 図 5は健常者の組織の染色像を表す写真であり、
(A) は 1 00倍拡大写真、 （B) は 200倍拡大写真であり、 図 6は肝硬変患 者の組織の染色像を表す写真であり、 （A) は 1 00倍拡大写真、 （B) は 20 0倍拡大写真である。 発明を実施するための最良の形態
[ヒ卜 L EC T 2に特異的に反応する抗体、 及び、 その抗体を産生する融合細胞] ヒト L E C T 2に特異的に反応する抗体の作製について以下に説明する。
A. 抗原
抗原としてはヒト LECT 2 (配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋 白質） をクローニングし、 免疫原として使用した。
B. 上記抗原による免疫
免疫動物としては喃乳動物であるマウスのほかラッ卜、 ハムスターなども用い ることができる。 通常マウスが最も汎用され、 BA LBZcマウス、 その他の系 (s t r a i n) のマウスを用いることができる。 この際、 免疫計画及び抗原の 濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ る。 例えばマウス 1匹に 25 gの抗原を 2週間間隔で腹腔に 3回免疫後、 さら に 25/ gを静脈に投与する。 最終免疫の数日後に融合のための脾臓細胞を取り 出す。
C. 細胞融合
上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臟を無菌的に取リ出し、 そこから 単細胞懸溷液を調製する。 この脾臓細胞 （抗体産生細胞） を適当な骨髄腫細胞と 適当な融合促進剤の使用により細胞融合させる。 骨髄腫細胞としては免疫動物と 同種の喃乳動物に由来するものが望ましいが、 ラット、 ハムスター等の脾臓細胞 とマウスの骨 ¾腫細胞を融合させることもできる。 脾 K細胞と骨 «8腫細胞の好ま しい比率は約 20 ： 1〜約 2 ： 1の範囲である。 約 1 Οβ 個の脾細胞について 0. 5〜1. 5m Iの触合媒体の使用が適当である。 好ましい融合促進剤としては、 例えば平均分子置 1 000〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用で きるが、 この分野で知られている他の触合促進剤 （例えばセンダイウィルス （別 名 HVJ) ) を用いることもできる。 また、 これら融合促進剤を用いた方法以外 に電気ショックを用いる方法により細胞融合を行ってもよい。
D. 目的とする抗体を産生する融合細胞の選択
別の容器 （例えばマイクロタイタ一プレート） で未融合の脾細胞、 未融合の ϋ 髄腫細胞及び融合した融合細胞の混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択 培地で希釈し、 未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間 （約 1時間） 培養する。 培地は薬物抵抗性 （例えば 8—ァザグァニン抵抗性） で未融合の骨髄腫細胞を支 持しないもの （例えば HAT培地） が使用される。 この選択培地中では未触合の 骨髄腫細胞は死滅する。 この未融合の脾細胞は非腫痛性細胞なので、 ある一定期 間後 （1週間後） 死滅する。 これに対して敏合した細胞は、 骨髄腫の親細胞の腫 痛性と親脾細胞の性質を合わせ持っため、 選択培地中で生存できる。
かくして、 融合細胞が検出された後、 前記のヒト L EC T 2に対する抗体につ いて酵素免疫測定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay )によリスクリーニン グを行い、 ヒト L E C T 2と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融 合細胞だけを選択する。 このような融合細胞として、 例えば »合細胞クローン G 2 A 5 D 7 (受託番号 F ERM P- 1 5638) 、 融合細胞クローン A 1 G 1 C6 (受託番号 FERM P- 1 5639) 、 融合細胞クローン 5 C 5 (受託番 号 F ERM P— 1 5640) 、 融合細胞クローン H I 2 D 1 0D6 (受託番号 F ERM P— 1 5641 ) 、 融合細胞クローン 89 F 2 (受託番号 F ERM P- 1 6229) が挙げられる。
F. 目的とする抗体の取得
目的とする抗体を産生する融合細胞を適当な方法 （例えば限界希釈法） でクロ ーン化した後、 抗体は 2つの異なった方法で産生することができる。 その第 1の 方法によれば、 皸合細胞を一定期間、 適当な培地で培養することにより、 その培 養上清からその融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。 第 2の方法によれば、 融合細胞は同質遗伝子、 または半同質遺伝子を持つ免疫動物 の腹腔に注射することができる。 一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中よ リ、 その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
[ヒ卜 L ECT2の測定法]
に 固相化抗体
ヒトし E C T 2と特異的に反応する抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固 相化抗体を作成するには、 この抗体と不溶性支持体を接触させることによリ不溶 性支持体の表面に抗体を吸着させて行うほか、 共有結合等の化学的な方法によつ ても結合させることができる。
不溶性担体としては、 例えばポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリエステル、 ポリアクリル二トリル、 フッ素樹脂、 架橋デキストラン、 ポリサ ッカライドなどの高分子、 その他紙、 ガラス、 金属、 ァガロースおよびこれらの 組み合わせなどを例示することができる。 また、 不溶性担体の形状としては、 ト レイ状、 球状、 棒状、 繊維状、 继状、 容器状、 セル、 試験管など種々の形状であ ることができる。
B. 欏識抗体
ヒ卜 L ECT2に特異的に反応する抗体は、 完全抗体であってもよく、 F a b または F (a b) ' 2等のフラグメントであってもよい。
標識物質としては、 通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に限 定されるものではないが、 酵素、 アビジン、 蛍光物質、 発光物質及び放射性物質 等を使用するのが好ましい。 酵素としてはペルォキシダーゼ、 一 D—ガラク ト シダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 マイクロペルォキシダーゼ、 蛍光物質と してはフルォレツセインイソチオシァネート、 フィコピリプロテイン、 フィコェ リスリン等、 発光物質としてはイソルシノール、 ルシゲニン等、 そして放射性物 霣としては'25し 131 I、 14C、 3H等を用いることができる。 また、 標識物質 としてビ才チンを用いた場合にはさらに酵素標識アビジンを用いることによリ高 い慼度を得ることができるので、 より好ましい。 この場合の標識酵素としては抗 体に棵識した場合の酵素と同様の酵素を用いることができるが、 ペルォキシダー ゼは特に好ましい。
酵素を標識物質として用いた場合にはその活性を測定するために基質、 必要に より発色剤が用いられる。 酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、 基質 として H202を用い、 発色剤として 2, 2 ' —アジノージー [3—ェチルベンズ チアゾリンスルホン酸] アンモニゥム塩 （ABT S) 、 5—ァミノサリチル酸、 o—フエ二レンジァミン （OPD) 、 4一ァミノアンチピリン、 3, 3 ' , 5， 5 ' ーテトラメチルベンジジン等、 酵素にアルカリフォスファタ一ゼを用いる場 合は基質として o—二トロフエニルフォスフエ一ト等、 酵素に yS— D—ガラクト シダーゼを用いる場合は基質としてフルォロセインージー （ 一D—ガラク トビ ラノシド） 、 4—メチルゥンベリフェリル一/ S— D—ガラク トビラノシド等を用 いることができる。
C. 検量線の作成
固相化抗体に標準物質としてのヒ卜 LECT 2を反応せしめ、 次いで固相化抗 体と特異的に反応したヒ 卜 L EC T 2に摞識抗体を反応させ、 その後、 この標識 抗体の摞識量を測定する。 これにより、 ヒト LECT 2の量に対する棵識量の関 係、 即ち検量線が得られる。
この免疫学的測定方法において用いられる反応用媒体としては、 例えばリン酸 緩衝液、 卜リス塩酸緩衝液、 齚酸緩衝液などを含んだ pH 6. 0〜8. 0の範囲 のものが示される。
D. 検体に含まれるヒト L EC T 2の測定
固相化抗体に検体を反応せしめ、 次いで標識抗体を反応させる。 このときに検 体中に含まれるヒト L EC T 2の ¾度に応じて標識抗体が反応する。 その後、 こ の摞識抗体の標識量を測定する。 この測定値を検量線に照らすことにより、 検体 中のヒト L EC T 2の港度が測定される。 尚、 反応用媒体については、 上記 C. で述べた通りである。
[ヒト LECT 2の測定用キット]
測定用キットは、 少なくとも、
(1 ) ヒ卜 L E C T 2と特異的に反応する第 1の抗体を不溶性支持体に結合せし めてなる固相化抗体、
(2) ヒト LECT 2と特異的に反応する第 2の抗体を棵識物質によリ橾識化し に標 体
を含み、 その他に、 反応用媒体を含んでいてもよいし、 あるいは、 標準物質 (ヒ卜 LECT2) を含んでいてもよい。 尚、 標識抗体の檁識物質が酵素の場合 には、 通常、 酵素の活性を測定するための基質及び反応停止液を含む。 また、 不 溶性支持体、 摞識物質については上述したのでその説明は省略する。 この測定用 キッ卜によれば、 上述の測定法を実施することができる。
以下に、 本発明の好適な実施例を図面に基づいて説明する。 尚、 本発明の実施 の形態は、 下記の実施例に何ら限定されるものではなく、 本発明の技術的範囲に 属する限り種々の形態を採り得ることはいうまでもない。
[実施例 1 ] 免疫原 （ヒ ト L E C Τ 2 ) の作製
[1 - 1 ] ヒト LECT 2のクローニングおよびクローニングされたヒ卜 L EC Τ 2のヌクレオチド配列の決定
ヒト L ECT2 c DN Αのクローニングは次のようにして行った。 50 g/ mlの P H A— P (DIFCO 社製） で T細胞白血病細胞 S KW— 3を処理し p o I y A+ R N Aを調製した。 5 ig の p o I y A+ R N Aを用い、 o I i g o— d T をプライマ一にしてファーストストランド c DN A ( 1 s t c D N A) を合成 した。
次に、 ゥシ L EC T 2 (配列番号 9にそのアミノ酸配列を示す） の部分アミノ 酸配列を基に P C Rのプライマーを合成した。 即ち、 アミノ酸配列 WA I I CA より 6種類のオリゴヌクレオチドを演»して 5 ' のプライマーとし、 アミノ酸配 列 H I E N C Dより 4種類のオリゴヌクレオチドを演繹して 3 ' のプライマーと した。 PC R法により、 1 s t c D N Aを錶型とし上記プライマーの組み合わ せである 24種類の反応にて D N A断片の増幅を行った。 アミノ酸配列 DV L C S DG S T V Y A P Fを基に D N Aプローブ （GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GT CT/CACT/AGTC/6TATGCT/CCCT/CTT. 配列番号 4参照） を使い、 增幅された D N A 断片をァガロースゲルで分離し、 サザンブロットにより解析した。 その結果、 約 3 7 Obpの D N A断片が検出され、 それを p U C 1 9にクローニングした。
ヒト肝臓 c D N Aライブラリーを、 クローニングされた c D N A断片をプロ一 ブとしてスクリーニングしたところ、 1 30万個のクローン中 1 2クローンの暘 性クローンを得た。 それぞれのクローンはすべて、 制限酵素の解析により 2種類 に分けられることがわかリ、 それぞれのグループの一番長い c D N A断片のク口 ーンの塩基配列の決定をした。 その結果、 2種類の c D N Aは同一の遺伝子由来 で 3 ' 側に存在する 2種類の p o I y Aシグナルにより生じることが推定された。 また、 コードされたタンパク質のァミノ酸配列よリウシ L E C T 2の決定された アミノ酸 E列に約 90%のホモロジ一を有することが判明し、 このコードされる と考えられるタンパク質をヒト L EC T 2と命名した。 このヒ ト L EC T 2のァ ミノ酸配列及び塩基配列を配列番号 1及び 2に示す。
[ 1 —2] ヒト L E C T 2遺伝子を含む組換えプラスミ ドの構築
クローニングされたヒト L E C T 2 c D N Aをもとに、 5 ' 側のプライマー として GGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG (配列番号 5参照） ， 3 * 側のプライマーとして CGGAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG (配列番号 6参照） をそ れぞれ用い、 熱変性： 94°C、 1分間、 アニーリング： 55°C、 2分間、 伸長反 応： 72°C、 3分間、 の 25サイクルの PC R法にてヒト L ECT2の c DNA を含む DN A断片を増幅させた。 Ec oR I、 H i n d I II での処理後、 この断 片を pMA LTM— C (Biolab Inc. ) の E c o R I / \ n d 111 部位にクロー ニングした。 この組換えプラスミドを、 pMAL— TEV—ヒト LECT2と命 名した。 この発現ベクターは、 I PTG存在下で、 t a cプロモーターの制御下 マル！ ^一ス結合タンパク質 （maltose-binding— protein) とヒト L E C T 2の融 合タンパク質を産生させることができ、 その連結部分に T EVプロテアーゼ （Ta bacco Etch Virus由来） の切断部位が入っているので特異的な切断ができること が特徴である。
また、 クローニングされたヒト L EC T 2 c DNAをもとに、 5' 側のブラ イマ一として GCGGGATCCCGGGGCCATGGGCTAATAT (配列番号 7参照） 、 3' 側のプ ライマーとして CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG (配列番号 8参照） をそれぞれ用 しゝ、 熱変性： 94°C、 1分間、 アニーリング： 55° (、 2分間、 伸長反応： 72 °C、 3分間、 の 25サイクルの PCR法にてヒ卜 LECT 2の c DNAを含む D N A断片を增幅させた。 BamH Iで処理後、 この断片を pGEX— 3 X (Phar macia Inc. ) の BamH I部位にクローニングした。 この組換えプラスミ ドを、 pGEX— X a—ヒト LECT2と命名した。 この発現ベクターは、 I PTG存 在下で、 t a cプロモーターの制御下グルタチオン一 S—トランスフ: rラーゼと ヒ卜 L ECT 2の融合タンパク質を産生させることができ、 その連結部分に X a プロテアーゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴であ る。
[1 -3] ヒト LECT 2遗伝子を含む組換えプラスミドによる大腸菌の形質転 換 上記のようにして得られた組換えプラスミ ド pMAL— TEV—ヒト LECT 2を用いて大腸菌 JM1 09株を形質転換後、 得られた大腸菌クローンを、 デォ キシ法により期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニングし、 期待 される DN A断片を持つ大腸菌クローン Ma I—ヒ ト LECT 2 (受託番号 FE RM P— 1 4669、 なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号 F E R M BP— 5302が付された） を得た。
[1—4] 動物細胞によるヒト LECT2の産生
p U C 1 9の BamH I部位に H i n d lll から Ec oR Iの方向でクロー二 ングされたヒト L EC T 2 c DNAの 5' 側をェキソヌクレア一ゼ II I により —1 4の塩基配列まで欠失させ、 T4 DNAポリメラーゼで平滑末端にした後、 Ps t I リンカ一をライゲーシヨンし、 Ps t I と Bg I 11で切断し、 発現べク ター p c D L— SRa 294の Ps t l B amH I部位にクローニングした。 この組換え発現ベクターをチャイニーズハムスター C HO細胞にトランスフエク シヨンし、 ヒ ト LECT 2を高発現する株 1株 （C 1 D8— "！） （受託番号 FE M P— 1 4668、 なお国際寄託へ移管請求したことにより受託番号 F ER M BP— 5301が付された） を得た。
(分子量の決定）
リコンビナントヒト L EC T 2 (動物細胞発現） は、 35S—メチォニンによつ てメタボリックラベルし、 C H O細胞の培養上清を S D Sゲル重気泳動にかける ことにより検出した。 その結果、 分子量が約 1 4kDa と 1 6kDa の 2本のバンド
(1 6kDa が主要であり、 2つのパンドはプロセッシングの違いにより生じると 考えられる） が得られた。
[実施例 2] 免疫
上記実施例 1のように作製した免疫原ヒト LECT2 1 00 μ Ι とフロイン トの完全アジュバント 1 00 I を良く混合して懸濁液を作製し、 この懸溷液を 2匹のマウス （雄 BA LBZc) の腹腔に 1匹当たり抗原として 25 μ Iずつ投 与した。 さらに 1週間おきに同量の抗原を 5回投与し、 その 3曰後に脾臓を取り 出し融合実験を行った。
別に、 家兎 2羽に対しても同様に免疫し、 採決して血清を分離した後、 常法に 従い吸収操作を行い、 I g G分画を分離してポリクローナル抗体を得た。
[実施例 3 ] 細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞の 選択と取得
摘出したマウスの脾臓細胞と、 同系マウスの骨髄腫細胞 （S P— 2ZO— A g 一 1 4) とを約 1 0 ： 1の割合で混合し、 5 0%ポリエチレングリコール 400 0を皸合促進剤として細胞融合を行った。 融合後の細胞は 1 X 1 Oe eel Is/mlの 細胞溏度となるように 1 0%牛血消を含む H A T培地 （ヒポキサンチン、 ァミノ プテリン、 チミジンを含む培地） に懸港し、 96ゥエルのマイクロタイタープレ
-ト （ヌンク社製マキシソープ、 以下同じ） に 1ゥエルあたり ^ Ο θ μ \ずつ分 注した。
融合細胞は、 C02 インキュベータ （5%C02 、 3 7°C) 中で培養し、 HA T培地で培地交換を行い、 H A T培地中で馴化し、 さらに 1 0%F C S— R PM I 1 6 40培地で馴化した。
融合培養細胞上清中の抗体は、 ヒト L E C T 2蛋白質を固相化したマイクロタ イタ一プレートを用いて E L I S A法により検出した。 陽性となったゥエルに対 しては限界希釈法によるクローニングを 2回緣リ返し、 ヒ ト L E C T 2に対する 反応性を有するクローンを 5種類選択し、 それぞれを G 2 A 5 D 7、 A 1 G 1 C 6、 5 C 5、 H I 2 D 1 0 D 6. 89 F 2 (受託番号 F ERM P— 1 5638、 F ERM P— 1 56 3 9、 F E RM P— 1 5640、 F E RM P- 1 56 4 1、 F E RM P— 1 6 22 9) と命名した。
得られたクローンはそれぞれ 1 0%DMS Oを含む 90%牛血清中に懸渴させ、 液体窒素中に保存した。 各クローンの産生するモノクローナル抗体は、 クローン をマウスの腹腔内で增殖させ、 その腹水中からプロテイン一 Aセファロースカラ 厶を用いてそれぞれを糫製した。
[実施例 4] モノクローナル抗体の特異性の確認
(DE L I s A法による特異性の確認
ヒ卜 LECT2の PBS溶液 （1〜1 O O O n gZm l ) を翻製し、 この溶液 でヒト LECT2を固相化したマイクロタイタープレー卜に各クローンの抗体溶 液を反応させた後、 ペルォキシダーゼ棵識抗マウスィムノグロブリン （カベル社 製） を反応させ、 オルトフヱ二レンジァミンと過酸化水素の溶液を基質として波 長 492 nmにおける吸光度を測定した。 その結果を図 1に示す。
吸光度の値は固相化したヒト L E C T 2の漉度に伴って上昇し、 ある濃度から は一定になることから、 各クローンともヒト L E C T 2に特異的に反応すること が確認された。
②ウェスターンブロットによる特異性の確認
ヒ卜 L ECT 2とマルトース結合タンパク質 （MBP) の混合物を抗原として SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （PAG E) (1 6. 5%モノアクリ ルアミ ド ビスァクリルアミ ド； 3%ビス モノアクリルアミ ド +ビス） を行い、 泳動後ウェスターンブロットにより反応の特異性を確認した。 各クローンのモノ クローナル抗体とも約 1 6 k Dに反応性を認め、 MBPとは反応しなかった。 こ の結果を図 2に示す。
尚、 図 2で CBBはクマーシーブリリアントブル一の略で蛋白染色を示す。 第 I レーンは分子量マーカー、 他はヒト LECT2+MBPを抗原として泳動し、 第 1 レーン、 第 2レーンは蛋白染色、 他は各モノクローナル抗体によるゥヱスタ —ンブロットを示す。
[実施例 5] EL I S A法によるサブクラスの確認
上記実施例 3で得られた各モノクロ一ナル抗体について、 アメリカンコーレツ クス社製モノクローナルサブクラスイソタイピングキッ卜を用いてクラス ·サブ クラスを確認した。 結果はクローン A 1 G 1 C6及び G 2A5が I gG2 b、 ク ローン H 1 2 D 1 0が I gMであった。 尚、 クローン 5 C 5、 89 F 2について は未確認である。
[実施例 6] 抗体固相化
上記実施例 3で得られたモノクローナル抗体クローン G 2 A 5を 0. 1 M炭酸 緩衝液 p H 9. 0で 5 I Iの濃度に調製し、 96ゥエルのマイクロタイタ 一プレートの各ゥエルに 1 00 Iずつ加え、 4 °Cで 20時間静置反応させた。 抗体溶液を捨て、 1 %B SA、 5%ショ耱を含む PB Sを各ゥエルに 2 00 I ずつ加え、 室温 （20〜25°C) で 2時間静置してブロッキングを行った。 ブロ ッキング液を捨て、 プレートを風乾し、 固相化抗体を得た。 この固相化抗体は乾 燥剤と共に密封して保存した。
[実施例 7] 標識抗体の作製
上記実施例 2で得たポリクローナル抗体の精製 I g G l mg当たり 0. 056 Uのフイシンを添加し、 3 7 °Cで 8時間反応させた後、 U l t r o g e l AC A 44を用いてゲルろ過し、 F a b ' 分画を得た。 この F a b ' 分画にマレイミ ド法によりペル才キシダ一ゼを標識し、 ペルォキシダーゼ標識抗体とした。 なお、 標識は医学 S院刊、 石川栄治著、 「酵素免疫測定法第 3版」 に従って行った。
[実施例 8] ヒ ト L E C T 2の測定
ヒト L E C T 2蛋白質を P B Sで希釈して 0. 00 1 〜20 n gZm lの溶液 を調製し、 この液 200 I を上記実施例 6で得た抗体固相化プレートの各ゥェ ルに添加し、 室温で 1時間反応させた後、 各ゥエルを P B S 300 Iで 4回洗 浄し、 余分の PB Sを除き、 上記実施例 7で得たペルォキシダーゼ標識抗体 （1 00 μ \ ) を加え、 室温で 1時間反応させ、 再度 PB Sで洗浄し、 亍トラメチル ベンジジンと過酸化水素の溶液 1 00〃 I を加えて反応させ、 1 . 5 Νリン酸 1 00 μ I を加えて反応を停止し、 波長 450 n mにおける吸光度を測定した。 こ のときの測定結果を表 2及び図 3に示す。 【表 2】
Figure imgf000018_0001
これにより、 ヒト LECT 2の量に対する標識量の関係、 即ち検量線が得られ, この検量線を用いることにより検体中のヒト L E C T 2の量に対する摞識量の関 係、 即ち、 検量線が得られ、 この検量線を用いることによリ検体中のヒト L EC T 2の含有量を知ることができる。 急性肝炎の患者検体について、 その急性期と寛解期における測定値の比較を行 つたデータを表 3及び図 4に示す。
【表 3】
Figure imgf000019_0001
測定系に関する予備的検討の結果、 検体中のヒト L E C T 2は比較的早期にそ の抗原性を喪失すること、 特に血清では速やかに抗原性が消失することが明らか となったことから、 検体として血漿を用い、 各血漿は採血後速やかに分離するこ とによって得たあと、 測定時までは一 2 0 °C以下で凍結保存した。 また、 検体の 希釈率が 5倍以下の場合、 測定値に影響を与える可能性があることから、 検体は 1 0倍希釈して測定した。 各検体の急性期及び宽解期の測定値を比較すると、 明らかに寛解期において測 定値が低下していることから、 検体中のヒ卜 L E C T 2の濃度は患者の病態を反 映しているものと判断した。
このように、 検体中の走化性因子ヒト L EC T 2の含有量を測定することがで きるため、 その測定結果を利用して病態の把握や治療への応用が可能となる。
[実施例 9] 免疫組織染色
健常者の肝臓組織及び C型肝硬変患者の肝臓組織を取り、 常法に従いホルマリ ン固定し、 パラフィン包埋した。 このパラフィン包埋組織からミクロトームを用 いて組織切片を作製し、 常法に従い脱パラフィンを行い、 実施例 3で得たモノク ローナル抗体クローン 89 F 2より精製した I gG分画の PB S溶液約 1 00 μ I (5 μ gXm \ を切片にのせ、 37 °Cで 30分間反応させた後、 P B Sで洗 浄した。 これにペルォキシダーゼ標識抗マウス I gG (ダコ社製） を 37°Cで 3 0分間反応させ、 再度 PBSで洗浄した後、 3， 3 ' ， 5， 5 ' —ジァミノベン ジジンと過酸化水素の溶液を反応させ染色した。 細胞の核はへマトキシリンで染 色した。
図 5は、 健常者の組織の染色像を表す写真であり、 （A) は 1 00倍拡大写真、 (B) は 200倍拡大写真である。 また、 図 6は、 肝硬変患者の組織の染色像を 表す写真であり、 （A) は 1 00倍拡大写真、 （B) は 200倍拡大写真である。 健常者、 肝硬変患者の組織切片とも、 肝細胞の細胞質にびまん性の染色を認め た。 具体的には、 健常者、 肝硬変患者とも肝実質細胞にジァミノべンジジンの顆 粒状の染色 （茶色に染まっている） が認められたが、 肝硬変患者では陰陽性の細 胞の混在が認められ、 健常者とは異なる染色パターン （健常者では肝実質細胞が すべて暘性） を示した。 結合組織には染色は認められなかった。 なお M図 5及び 図 6の写真中、 靑く点状に染まっているのは核である。 このことは、 L ECT 2 が細胞周期と何らかの関連を持っていることを示唆している。 産業上の利用可能性
本発明のヒト L ECT 2に対する抗体によれば、 免疫治療や診断、 及びこれら に関連した産業分野において有用である。 また、 本発明の融合細胞によれば、 ヒ 卜 LECT 2に対する抗体を入手するうえで有用である。 更に、 本発明のヒト L ECT 2に対する抗体は、 ヒト LET 2の測定法及び測定用キッ卜に用いること ができる。 この測定法及び測定用キットによれば、 検体中に含まれるヒト LEC T2 (走化性因子と考えられる） を測定することができるため、 その測定結果を 利用して病態の把握や治療への応用が可能となるという効果が得られる。 具体的 には、 例えば種々の疾患 （例えば肝炎や肝硬変など） の患者から取り出した組織 等に対し、 本発明の抗体を反応させて、 LECT 2を発現している細胞が組織の どこに存在しているかを調べることができる。 これにより各種疾患の診断や治療 へつなげることが可能となる。 寄託機関
C 1 D 8 - 1及び M a I —ヒト LECT2は、 以下の国際寄託機関に、 それぞ れ下記の受託番号と寄託日で寄託されている。
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305)
受託番号及び寄託曰
( 1 ) C 1 D 8 - 1
FERM B P— 5301 ： 1 994年 1 1月 25日
(2) Ma I —ヒ卜 LECT2
FERM BP— 5302 ： 1 994年 1 1月 25日
融合細胞クーロン G 2 A 5 D 7、 A 1 G 1 C6、 5C5、 H 1 2D 1 0D6、 89 F 2は、 以下の国内寄託機関に、 それぞれ下記の受託番号と寄託日で寄託さ れている。 名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住所： 曰本国茨城粲つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305) 受託番号及び寄託曰
(1 ) 融合細胞クーロン G 2 A 5 D 7
F E RM P— 1 5638 ： 1 996年 5月 21 日
(2) 融合細胞クーロン A 1 G 1 C6
F E RM P- 1 5639 ： 1 996年 5月 21 日
(3) 融合細胞クーロン 5C5
FERM P— 1 5640 ： 1 996年 5月 21 日
( 4 ) 融合細胞クーロン H 1 2 D 1 0 D 6
FERM P- 1 5641 : 1 996年 5月 21 日
(5) 融合細胞クーロン 89 F 2
F ERM P- 1 6229 ： 1 997年 5月 1 9日
【配列表】
配列番号： 1
配列の長さ ： 151
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク
配列の特徴
存在位置： 58
他の情報： Xaa=Valまたは I le
配列
Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu l ie Ser Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn l ie Cys Ala Gly Lys Ser Ser Asri Giu
20 25 30 lie Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gin Tyr Ser Ala Gin Arg
35 40 45
Ser Gin Arg Pro His Gin Gly Val Asp Xaa Leu Cys Ser Ala Gly Ser
50 55 60
Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met lie Val Gly Gin Glu Lys Pro 65 70 75 80
Tys Gin Asn Lys Asn Ala lie Asn Asn Gly Val Arg l ie Ser Gly Arg
85 90 95
Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr l ie Lys Pro l ie し ys Tyr Lys Gly
100 105 110
Pro l ie し ys し ys Gly Glu Lys し eu Gly Thr Leu Leu Pro し eu Gin Lys
115 120 125
Val Tyr Pro Gly lie Gin Ser His Val His lie Glu Asn Cys Asp Ser
130 135 140
Ser Asp Pro Thr Ala Tyr Leu
145 150 配列番号： 2
配列の長さ ： 1092
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源： ヒト 細胞の種類：肝臟 配列の特徴：
特徴を表す記号： 5' UTR 存在位置： 1..200
特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： 3'UTR 存在位置： 657. · 1092 特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 201..656
特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： mutation 存在位置： rep lace (372. "a") rep I ace (748, g ) replace (961. "c") replace (967, "c") 特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： polyA signal 存在位置： 684..689
1060. · 1065 特徴を決定した方法： E 配列 AAATCAAATA GCTATCCATG GAATATTAGA ACTT6ACTTG CTCCATCCTC TTAAACTTTT 60 T6TGTCTCAC ACTAAAGAAA TGAGA6AT6C AGAATTCTAA GGCTAAATAG CTAGGAAGTA 120 TTCATTCAAA CTTGAATATC TTCAAAGAGA GTGTGGGGGC AACTCTAATC AGAGGAAGAA 180 ACTAAAGGAA GTAAAACCAG ATG TTT TCC ACC AAA GCC CTC CTT TTG GCT GGT 233
Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly
1 5 10
CTG ATT TCT ACC GCA CTG GCA GGG CCA TGG GCT AAT ATA TGT GCT GGC 281 Leu l ie Ser Thr Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn l ie Cys Ala Gly
15 20 25
AAG TCT TCC AAT GAG ATC CGG ACG TGT GAC CGC CAT GGC TGT GGA CAG 329 Lys Ser Ser Asn Gl u l ie Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gin
30 35 40
TAC TCT GCT CAA AGA AGT CAG AGG CCT CAC CAG GGT GTG GAC GTC TTG 377 Tyr Ser Ala Gin Arg Ser Gin Arg Pro His Gin Gly Val Asp Val Leu
45 50 55
TGC TCT GCT GGA TCT ACT GTG TAC GCA CCA TTC ACT GGA ATG ATT GTG 425 Cys Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met l ie Val 60 65 70 75
GGC CAG GAG AAA CCT TAT CAA AAC AAG AAT GCT ATC AAT AAT GGT GTT 473 Gly Gin Glu Lys Pro Tyr Gin Asn Lys Asn Ala l ie Asn Asn Gly Val
80 85 90
CGA ATA TCT GGA AGA GGT TTT TGT GTC AAA ATG TTC TAC ATT AAG CCA 521 Arg l ie Ser Gly Arg Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr l ie Lys Pro
95 100 105
ATT AAG TAT AAA GGT CCT ATT AAG AAG GGA GAA AAA CTT GGA ACT CTA 569 l ie Lys Tyr Lys Gly Pro l ie Lys Lys Gly Glu Lys Leu Gly Thr Leu 110 115 120
TTG CCC TTG CAG AAA GTT TAT CCT GGC ATA CAA TCG CAT GT6 CAC ATT 617 Leu Pro Leu Gin し ys Val Tyr Pro Gly l ie Gin Ser His Val His l ie
125 130 135
GAA AAC TGT GAC TCG AGT GAC CCT ACT GCA TAG CTG TAAATCGAAG 663 Glu Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr Ala Tyr Leu
140 145 150
GCCAATG6TC AGATCTTCAA AATAAAAAGT CATCTTAAAA ACCTGGATGC ATACCCTTCT 723 CTTCAAGAAA TTTGTGTTCA CAAAAGAAAA AT6CATGAAG GGATGGATAC CCCATTTTCC 783 AT6ACATGAT TATTACACAT TGCATGCCTG TATCAAAACA TCTCACGTAC CTCATAAACA 843 TATACACCTA TGTACCCACA AAAATTTTTT AATTAAAAAA AGGAAATTTG AGTTTAAATA 903 GAAACATGAT AAATGCAA6A AAGAAAACAT TTT6ATTTTA ACTCATTGTC ACTCTGATGT 963 TCATGTGAAC TGGTTGCTTC GG6CTCTTT6 ATCTGTCACC TATGGAATCT GAGTGGTTTT 1023 ATTTTTTAGA TTTCTCA6TC CCAAAGATCT AAGATAAATA AACAAGA6AA CTTAAAAAAA 1083 AAAAAAAAA 1092 配列番号： 3
配列の長さ ： 1092
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源： ヒト
細胞の種類：肝臟
配列の特徴：
特徴を表す記号： 5' UTR 存在位置： 1..200
特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： 3' UTR
存在位置： 657..1092
特徴を決定した方法： P 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 201..656
特徴を決定した方法： P 特徴を表 3記号： mutation
存在位置： rep lace (372, "a")
rep I ace (748. g )
replace (961 , "c")
repiace(9o7, "c ')
特徴を決定した方法： E 特徴 ¾：表す SS号： polyA signal
存在位置： 684. · 689
1060..1065
特徴を決定した方法： E
配列
AAATCAAATA GCTATCCATG GAATATTAGA ACTT6ACTT6 CTCCATCCTC TTAAACTTTT 60 TGTGTCTCAC ACTAAAGAAA TGAGAGATGC A6AATTCTAA GGCTAAATA6 CTAGGAAGTA 120 TTCATTCAAA CTTGAATATC TTCAAAGAGA GTGTGGGGGC AACTCTAATC AGAGGAAGAA 180 ACTAAAGGAA GTAAAACCAG ATG TTT TCC ACC AAA GCC CTC CTT TTG GCT GGT 233
Met Phe Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Gly
1 5 10
OTG ATT TCT ACC GCA CT6 GCA GGG CCA T6G GCT AAT ATA TGT GCT GGC 281 Leu lie Ser Thr Ala Leu Ala Gly Pro Trp Ala Asn lie Cys Ala Gly
15 20 25
AAG TCT TCC AAT GAG ATC GGG ACG TGT GAC CGC CAT GGC TGT GGA CAG 329 Lys Ser Ser Asn Glu Me Arg Thr Cys Asp Arg His Gly Cys Gly Gin
30 35 40
TAC TCT GCT CAA AGA AGT CAG AGG CCT CAC CAG GGT GTG GAC ATC TTG 377 Tyr Ser Ala Gin Arg Ser Gin Arg Pro His Gin Gly Val Asp lie Leu
45 50 55
TGC TCT GCT GGA TCT ACT GTG TAC GCA CCA TTC ACT GGA ATG ATT GTG 425 Cys Ser Ala Gly Ser Thr Val Tyr Ala Pro Phe Thr Gly Met l ie Val 60 65 70 75
GGC CAG GAG AAA CCT TAT CAA AAC AAG AAT GCT ATC AAT AAT GGT GTT 473 Gly Gin Glu Lys Pro Tyr Gin Asn Lys Asn Ala lie Asn Asn Gly Val
80 85 90
CGA ATA TCT GQA AGA GGT TTT TGT GTC AAA ATG TTC TAC ATT AAG CCA 521 Arg lie Ser Gly Arg Gly Phe Cys Val Lys Met Phe Tyr I le Lys Pro
95 100 105
ATT AAG TAT AAA GGT CCT ATT AAG AAG GGA GAA AAA CTT GGA ACT CTA 569 l ie Lys Tyr Lys Gly Pro l ie し ys Lys Gly Glu Lys し eu Gly Thr Leu
110 115 120
TTG GCC TTG CAG AAA GTT TAT CCT GGC ATA CAA TCG CAT GTG CAC ATT 617 Leu Pro Leu Gin Lys Val Tyr Pro Gly Me Gin Ser His Val His lie 1 25 130 1 35
GAA AAC TGT GAC TCG AGT GAC CCT ACT GCA TAC CTG TAAATCGAAG 663 G l u Asn Cys Asp Ser Ser Asp Pro Thr A l a Tyr Leu
140 145 150
GCCAATGGTC AGATCTTCAA AATAAAAAGT CATCTTAAAA ACCT6GATGC ATACCCTTCT 723 CTTCAAGAAA TTTGTGTTCA CAAAAGAAAA ATGCATGAAG GGAT6GATAC CCCATTTTCC 783 ATGACATGAT TATTACACAT TGCATGCCTG TATCAAAACA TCTCACGTAC CTCATAAACA 843 TATACACCTA TGTACCCACA AAAATTTTTT AATTAAAAAA AGGAAATTTG AGTTTAAATA 903 GAAACAT6AT AAATGCAAGA AAGAAAACAT TTTGATTTTA ACTCATTGTC ACTCTGATGT 963 TCATGTGAAC TGGTTGCTTC GGGCTCTTTG ATCTGTCACC TATGGAATCT GAGTGGTTTT 1023 ATTTT丌 AGA TTTCTCAGTC CCAAAGATCT AAGATAAATA AACAAGAGAA CTTAAAAAAA 1083 AAAAAAAAA 1092 配列番号： 4
配列の長さ ： 41
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (cDNAプローブ）
配列の特徴
存在位置： 6
他の情報： N=Cまたは G 存在位置： 9
他の情報： N=Aまたは G 存在位置： 15 他の情報： N=Tまたは C 存在位置： 21
他の情報： N=Cまたは G 存在位置： 24
他の情報： N=Tまたは C 存在位置： 27
他の情報： N=Tまたは A 存在位置： 30
他の情報： N二 Cまたは G 存在位置： 36
他の情報： N=Tまたは C 存在位置： 39
他の情報： N=Tまたは G 配列
GATGTNCTNT GCTCNGATGG NTCNACNGTN TATGCNCCNT T
1234567890 1 234567890 1234567890 1234567890 1 配列番号： 5
配列の長さ ： 47 配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (プライマー） 配列
GGCGAATTCG AAAACCTGTA TTTTCAGGGG CCCTGG6CTA ATATAT6
配列番号： 6
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (プライマー） 配列
CGCAAGCTTT TACA6GTAT6 CAGTA6
配列番号： 7
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (プライマー） 配列
GCGG6ATCCCCGGGCCATGG6CTAATAT 配列番号： 8
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状 JM1 OJd
96 06 98
dsy J as naつ dsy sAg usy n|g 9| | S!H 9| | S!H J3S U|0 Θ| | A|g OJJ
08 9Z. 0 99 丄 |B/\ 9| I J as A|9 βλ 」Λ上 sA"| 9| | SAQ a^d AI0 ΛΙ0 ΛΙ9 jaS 8I I
09 95 09 usy δΛ 」Λ丄 OJd sAq n|g u|g A|g a\ \ A|g 丄 si OJJ B|V 丄
Sfr Ofr 9
|ΒΛ Ji J9S Λ|9 dsy J8S SAQ Π9， |ΒΛ dsy |B/\ A|g u|g S !H ηθη βΑη
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91 01 S I
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S l /L6dT/13d lSPSt/L6 OAV

Claims

請求の範囲
1. 新規蛋白質ヒト L ECT2 (配列表の配列番号 1で表されるアミノ酸配列を 有する蛋白質） と特異的に反応することを特徴とする抗体。
2. 触合細胞クローン G 2 A 5 D 7 (受託番号 F ERM P- 1 5638) によ つて産生される請求の範囲第 1項記載の抗体。
3. 融合細胞クローン A 1 G 1 C6 (受託番号 F ERM P- 1 5639) によ つて産生される請求の範囲第 1項記載の抗体。
4. 融合細胞クローン 5C5 (受託番号 FERM P- 1 5640) によって産 生される請求の範囲第 1項記載の抗体。
5. 融合細胞クローン H 1 2 D 1 0 D 6 (受託番号 FERM P- 1 5641 ) によって産生される請求の範囲第 1項記載の抗体。
6. 融合細胞クローン 89 F 2 (受託番号 F ERM P— 1 6229) によって 産生される請求の範囲第 1項記載の抗体。
7. 請求の範囲第 1項記載の抗体を産生することを特徴とする触合細胞。
8. 融合細胞クローン G 2 A 5 D 7 (受託番号 FERM P- 1 5638) 、 A 1 G 1 C 6 (受託番号 FERM P— 1 5639) 、 5C5 (受託番号 FERM
P— 1 5640) 、 H 1 2 D 1 0 D 6 (受託番号 F ERM P— 1 5641 ) 及び 89 F 2 (受託番号 FERM P— 1 6229 ) の群から選ばれた一つであ る請求の範囲第 7項記載の融合細胞。
9. 下記 a) 〜c) 及び d) 〜 f ) の工程を含むことを特徴とするヒト LECT 2の測定法。
a) ヒ卜 LECT2と特異的に反応する第 1の抗体を不溶性支持体に結合せしめ てなる固相化抗体に棵準物質としてのヒト L EC T 2を反応せしめた後、 b) ヒト L ECT2と特異的に反応する第 2の抗体を摞識物質によリ標識化した 標識抗体を反応させ、 c ) この反応生成物の摞識量を測定することにより検量線を作成する工程、 及び
d) 前記固相化抗体に検体を反応せしめた後、
e) 前記標識抗体を反応させ、
f ) この反応生成物の標識量を測定し、 前記検量線から検体中に含まれるヒト L ECT2を測定する工程。
1 0. 前記第 1の抗体は請求の範囲第 2項〜第 6項のいずれかに記載された抗体 であり、 前記第 2の抗体は請求の範囲第 2項〜第 6項のいずれかに記載された抗 体であって前記第 1の抗体とは異なるものであることを特徴とする請求の範囲第 9項記載のヒト L E C T 2の測定法。
1 1. ヒ卜 L EC T2と特異的に反応する第 1の抗体を不溶性支持体に結合せし めてなる固相化抗体と、
ヒト L ECT2と特異的に反応する第 2の抗体を摞識物質によリ棵識化した摞 識抗体と
を備えたことを特徴とするヒト LECT2の測定用キッ卜。
1 2. 前記第 1の抗体は請求の範囲第 2項〜第 6項のいずれかに記載された抗体 であり、 前記第 2の抗体は讅求の範囲第 2項〜第 6項のいずれかに記載された抗 体であって前記第 1の抗体とは異なるものであることを特徴とする請求の範囲第 1 1項記載のヒト L E C T 2の測定用キッ卜。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110646615A (zh) * 2019-08-27 2020-01-03 南方医科大学 肝纤维化的生物学标志物、治疗靶点及其用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4378439B2 (ja) * 1998-12-22 2009-12-09 国立感染症研究所長 骨吸収抑制剤
DE60328870D1 (de) 2002-03-15 2009-10-01 Schering Corp Verfahren zur modulierung von cd200-rezeptoren
CN102552882A (zh) * 2011-12-22 2012-07-11 宁波大学 Lect2蛋白及lect2蛋白变体在制药中应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08140683A (ja) * 1994-11-28 1996-06-04 Kazuo Suzuki 新規な白血球活性化因子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08140683A (ja) * 1994-11-28 1996-06-04 Kazuo Suzuki 新規な白血球活性化因子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS PREVIEWS ON DIALOG, BIOSIS, Biosis Number: 98396665, YAMAGOE S. et al., "Novel Homologous Polymorphonuclear Leukocytes Activating Proteins (LECT2) Derived from Human T-Cell Leukemia SKW-3 Cells"; & 9TH INTERNATIONAL CONGRESS OF IMMUNOLOGY, 23-29 July 1995. *
IMMUNOLOGY LETTERS, (August 1996), Vol. 52, No. 1, YAMAGOE S. et al., "Purification and Primary Amino Acid Sequence of a Novel Neutrophil Chemotactic Factor LECT2", pages 9-13. *
JOURNAL OF INTERFERON RESEARCH, (1993), Vol. 13, YAMAGOE S. et al., "Identification of a Novel Chemotactic Protein for Polymorphonuclear Leukocytes Produced by a Human T Cell Leukemia Cell Line", page S76. *
See also references of EP0908466A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110646615A (zh) * 2019-08-27 2020-01-03 南方医科大学 肝纤维化的生物学标志物、治疗靶点及其用途
CN110646615B (zh) * 2019-08-27 2021-07-13 南方医科大学 肝纤维化的生物学标志物、治疗靶点及其用途

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