JP2002523046A - ヒトｉｌ−１エプシロンｄｎａおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、精製かつ単離された新しいヒトＩＬ−１エプシロンポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドの組換え型の産生方法、これらのポリペプチドに対して生産される抗体、これらのポリペプチド由来の断片化ペプチド、このようなポリペプチドおよび断片化ペプチドの細胞及び免疫反応における使用並びに分子量マーカーとしての使用、このようなポリペプチド及び断片化ペプチドのペプチド断片化の対照としての使用、並びに、これらの試薬を含むキットに向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願への相互参照 ここに請求されている本出願は１９９８年８月２１日、１９９８年８月３１日
および１９９８年９月１１日に出願された各々米国仮出願Ｓ．Ｎ．６０／０９７
，４１３、Ｓ．Ｎ．６０／０９８，５９５およびＳ．Ｎ．６０／０９９，９７４
の利益を請求する。これらの出願の全開示はあてにでき、本明細書において援用
される。

【０００２】 背景技術 発明の分野 本発明は、精製され、そして単離された新規ヒトＩＬ−１エプシロンポリペプ
チド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドの組
換え体型の産生のための方法、これらのポリペプチドに対して作成された抗体、
これらのポリペプチドから誘導された断片化ペプチド、細胞性および免疫反応に
おけるおよび分子量マーカーとしてのそのようなポリペプチドおよび断片化ペプ
チドの使用、ペプチド断片化の対照としてのそのようなポリペプチドおよび断片
化ペプチドの使用、並びにこれらの試薬を含んでいるキットに関している。

【０００３】 関連分野の記載 インターロイキン−１（ＩＬ−１）はサイトカインの大きな群のメンバーであ
り、その主たる機能は免疫および炎症性応答を仲介することである。五つのＩＬ
−１ファミリーメンバーが知られており、それらにはＩＬ−１アルファ（ＩＬ−
１α）、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（
ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−１デルタ（ＩＬ−１δ、ＰＣＴ ＵＳ／９９／００５１
４に開示されているような）およびＩＬ−１８（以前はＩＧＩＦおよびある時は
ＩＬ−１ガンマとして知られていた）が含まれる。マクロファージにより分泌さ
れるＩＬ−１は、実際は大部分のＩＬ−βおよび若干のＩＬ−１αの混合物であ
る（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。最初はシグナル配列を欠いた３３
ｋＤ前駆体として産生されるＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、さらにタンパク質
分解的切断により処理され、各々約１７ｋＤの分泌活性型を産生する。加えて、
ＩＬ−１αの３３ｋＤ前駆体もまた活性である。ＩＬ−１の両型は染色体２上に
位置している二つの異なった遺伝子の産物である。二つの型はお互いに３０パー
セント未満の相同性であるが、両方とも同一のレセプターに結合し、同様の活性
を持っている。

【０００４】 ＩＬ−１の生物学的不活性型であるＩＬ−１ｒａはＩＬ−１と構造的に相同で
あり、同一のレセプターに結合する。加えて、ＩＬ−１ｒａはシグナル配列とと
もに産生されるため細胞外領域への効果的な分泌が可能であり、そこでＩＬ−１
と競合的に競争する（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。

【０００５】 ＩＬ−１ファミリーリガンドは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである二
つのＩＬ−１レセプターへ結合する。ＩＬ−１レセプターには８０ｋＤａタイプ
Ｉレセプター（ＩＬ−１ＲＩ）および６８ｋＤａタイプＩＩレセプター（ＩＬ−
１ＲＩＩ）が含まれる。このリガンドはまた、ＩＬ−１ＲＩＩの可溶性タンパク
質分解性断片（ｓＩＬ−１ＲＩ）へも結合する（Ｃｏｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１（５１２０）：４７２−７５，１９９３）。

【０００６】 ＩＬ−１の主たる供給源は活性化マクロファージまたは単核食細胞である。Ｉ
Ｌ−１を産生する他の細胞としては、上皮および内皮細胞が挙げられる（Ａｂｂ
ａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。マクロファージからのＩＬ−１の分泌は、マ
クロファージがグラム陰性菌に出会った後および消化した後に起こる。そのよう
な細菌はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）分子（内毒素としても知られている）
を細菌細胞壁に含んでいる。ＬＰＳ分子はマクロファージが腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）およびＩＬ−１を産生するのを刺激する活性成分である。この場合、ＩＬ−
１はＬＰＳおよびＴＮＦ産生に応答して産生される。低濃度において、ＬＰＳは
マクロファージを刺激し、そしてＢ細胞および微生物感染を除去するのに必要と
されるその他の宿主応答を活性化する；しかしながら高濃度では、ＬＰＳは重度
の組織損傷、ショックおよび死さえも引き起こすことができる。

【０００７】 ＩＬ−１の生物学的機能としては血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、局所
性組織破壊および発熱が含まれる（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）
。低レベルにおいて、ＩＬ−１はマクロファージおよび血管内皮細胞を刺激して
ＩＬ−６を産生し、血管内皮細胞表面上の分子を上方調節して白血球付着を増加
させ、そして単核食細胞および他の細胞を刺激することにより炎症性白血球を活
性化するある種のケモカインが産生されて間接的に炎症性白血球を活性化する。
これらのＩＬ−１機能は低レベルの微生物感染の間では決定的である。しかしな
がら、微生物感染が拡大すると、ＩＬ−１は熱を誘発し、単核食細胞を刺激して
ＩＬ−１およびＩＬ−６を産生し、肝細胞からの血清タンパク質の産生を増加さ
せ、そして凝固系を活性化することにより全身的に作用する。ＩＬ−１は腫瘍の
出血性壊死または骨髄幹細胞分裂の抑制を起こさないことも知られている。それ
にも関わらず、ＩＬ−１は高濃度ではヒトに対して致死的である。

【０００８】 ＩＬ−１の重要な機能があるとすれば、ＩＬ−１リガンドファミリーの追加の
メンバーがが技術分野において必要とされる。加えて、タンパク質研究および免
疫系において引き続いて示されている興味からみて、ヒトＩＬ−１エプシロンお
よびそのレセプターのような新規タンパク質の発見、同定および役割が現代分子
生物学および生化学の興味の中心である。知識は増大しているにもかかわらず、
細胞性および免疫応答に関与するタンパク質の正体および機能を明らかにするこ
とが未だに必要とされている。

【０００９】 本発明のさらに別の側面において、未知の試料タンパク質の一時構造、または
配列の同定は最も困難な実験過程である。未知のタンパク質試料を同定するため
に、当業者は既知の種々の技術を使用して既知のタンパク質と未知のタンパク質
試料との比較に頼ることができる。例えば、タンパク質は電気泳動、沈降、クロ
マトグラフィーおよび質量分析法のような技術を用いて日常的に分析される。

【００１０】 既知の分子量のポリペプチドと未知のタンパク質試料の比較は未知タンパク質
試料の見掛けの分子量の決定を可能にする（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ａｎｄ Ｍ．
Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））。タンパク質
分子量標準品は未知のタンパク質試料の分子量の算定を助けるために市販品とし
て入手可能である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタロ
グ：１３０−１３１，１９９５；Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｔｌｅｙ，米国特許第５，４４
９，７５８号）。しかしながら、分子量標準品は見掛けの分子量の正確な算定を
可能にするほど未知の試料タンパク質のサイズに十分密接して対応してはいない
かもしれない。分子量の算定における困難は、化学的または酵素的手段により断
片化されたタンパク質の場合に一層ひどくなる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６−１０８（Ｗｏｒｔｈ Ｂｏｏｋｓ，第２版
，１９８１））。

【００１１】 その特異的アミノ酸構成に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質
内の切断部位に関する独特の位置づけを生じる。化学的または酵素的切断による
タンパク質の特異的断片化は独特の”ペプチドフィンガープリント”を生じる（
Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２
：１１０２−１１０６，１９７７；Ｍ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．５０：３０９−３１６，１９８０）。その結果、特異的部位での
切断は与えられたタンパク質の正確な分子量のペプチドへの再現可能な断片化を
生じる。さらに、これらのペプチドは、ペプチドの等電的ｐＨを決定する独特の
荷電特性を持っている。これらの独特の特性は、種々の電気泳動的および他の技
術を使用して利用できる（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ａｎｄ Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａ
ｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７（Ｐｒ
ｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））。

【００１２】 未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られた場合、未知のタン
パク質の同定を助けるためにそれを既知のタンパク質のデータベースと比較でき
る（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５，１９９３；Ｂ．Ｔｈｉｅｄｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９６，１７：５８８−５９９
，１９９６）。ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐ
ａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、Ｐｅｐｔｉｄ
ｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉ
ｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａ
ｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト
：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂ
ｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）のような種々のコンピューターソ
フトウェァープログラムがそのような比較を当業者が容易に行うためにインター
ネットを通してアクセス可能である。これらのプログラムは示された許容誤差内
で、切断試薬および断片化ペプチド分子量を使用者が特定することを可能にする
。プログラムは試料タンパク質の同一性の評価を助けるために、これらの分子量
をタンパク質データベースと比較する。断片化ペプチドの数に関する正確な情報
およびこれらのペプチドの正確な分子量が正確な同定に必要とされる。従って、
断片化ペプチドの数およびこれらのペプチドの正確な分子量の決定における正確
さを増加させることが、未知のタンパク質同定の成功率を高める。

【００１３】 タンパク質の断片化はさらにアミノ酸組成分析およびタンパク質配列決定のた
めの断片生成、特に、”ブロックされた”Ｎ末端を持つタンパク質からの断片の
生成に用いられる（Ｐ．Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１００３５−１００３８，１９８７；Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９８８，９：８３０−８３８，１９
８８）。加えて、タンパク質の断片化は質量分析のための（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅ
ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５
０１１−５０１５，１９９３；Ｂ．Ｔｈｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９６，１７：５８８−５９９，１９９６）、免疫化の
ための、アフィニティー選択のための（Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，米国特許第５，１
５１，４１２号）、修飾部位決定のための（例えば、リン酸化）、活性な生物学
的化合物作成のための（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ａｎｄ Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ
，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ３００−３０１（Ｐ
ｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））、および相同的タンパク質の
識別のための（Ｍ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５０
：３０９−３１６，１９８０）ペプチド調製に使用できる。

【００１４】 それ故、ペプチド断片化研究での使用、分子量測定での使用、およびタンデム
質量分析を使用したタンパク質配列決定での使用に適したＩＬ−１ポリペプチド
が本分野で必要とされている。

【００１５】 発明の概要 本発明は単離されたヒトＩＬ−１エプシロン核酸およびこれらの核酸によりコ
ードされているポリペプチドを提供することにより、本分野におけるこれらの要
求を満たすことの助けになっている。具体的には、本発明は配列番号：５、配列
番号：７および配列番号：１２のＤＮＡ配列を含む単離されたヒトＩＬ−１エプ
シロン核酸分子および配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１３のアミ
ノ酸配列をコードする単離されたヒトＩＬ−１エプシロン核酸分子、ならびにこ
れらの配列に相補的な核酸分子を包含している。一本鎖および二本鎖両方のＲＮ
ＡおよびＤＮＡ核酸分子、ならびに配列番号：５、配列番号：７または配列番号
：１２に関連する変性した二本鎖ＤＮＡへハイブリダイズする核酸分子が本発明
に包含されている。配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２からイン
ビトロ突然変異誘発により誘導された単離された核酸分子、配列番号：５、配列
番号：７または配列番号：１２からの縮重である単離された核酸分子、本発明の
ヒトＤＮＡの対立変異体である単離された核酸分子、並びに本発明のＤＮＡと種
相同体である単離された核酸分子もまた包含されている。本発明はまた、これら
の核酸分子の発現を指示する組換え体ベクター、およびこれらのベクターで形質
転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も包含している。加えて、本発明は
染色体、ヒト遺伝子地図を同定するための、および免疫系を研究するためのアッ
セイにおいて前記の核酸を使用する方法も包含している。

【００１６】 本発明はまた、これらの核酸分子によりコードされている単離されたポリペプ
チド、これらの核酸分子によりコードされている合成ポリペプチド、これらのポ
リペプチドのペプチドおよび断片も包含している。これらのポリペプチドに結合
する単離されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体もまた本発明に包含さ
れている。本発明はさらに、発現を促進する条件下で宿主細胞を培養し、培養培
地からポリペプチドを回収することを含む、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドを
産生するための方法も包含している。特に、細菌、酵母、植物、昆虫および動物
細胞中でのＩＬ−１エプシロンポリペプチドの発現が本発明に包含されている。

【００１７】 一般に、本発明のポリペプチドは免疫調節、細胞増殖、細胞死および炎症応答
のような細胞過程を研究するために使用できる。加えて、ＩＬ−１エプシロンリ
ガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片
は、ＩＬ−１様リガンドおよびＩＬ−１様レセプターに関連するタンパク質を同
定するために使用できる。

【００１８】 加えて、ポリペプチド対応構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子
に会合する活性の潜在的阻害剤をスクリーニングするためにＩＬ−１エプシロン
リガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断
片を利用するアッセイ、並びにＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド対応構
造分子により仲介される疾患処置のための治療薬としてＩＬ−１エプシロンリガ
ンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片を
使用する方法が本発明に包含されている。さらに、その阻害剤の設計にＩＬ−１
エプシロンリガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよび
それらの断片を使用する方法も本発明の一つの側面である。

【００１９】 本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質試料の分子量の算定を可
能にする分子量マーカーとしてこれらのポリペプチドおよびそれらの断片化ペプ
チドを使用する方法、ならびに、電気泳動を使用する本発明の分子量マーカーを
可視化する方法も含んでいる。本発明はさらに、試料タンパク質の等電点を決定
するためのマーカーとして、ならびにタンパク質試料の断片化の程度を確立する
ために対照として本発明のポリペプチドおよびそれらの断片化ペプチドを使用す
る方法も包含している。

【００２０】 これらの決定を助けるためのキットもまた本発明に包含されている。 発明の詳細な説明 インターロイキン（ＩＬ−１）レセプターは、その多くが免疫系細胞（特にリ
ンパ球）の応答を仲介するサイトカインレセプターの大きなＩｇスーパーファミ
リーのメンバーである。最近、これらのレセプターへ結合するリガンドファミリ
ーのメンバーが加速されたペースで発見されている。既知のＩＬ−１リガンド数
の増加は主として遺伝子クローニングおよび配列決定技術の出現によるものであ
る。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列が、他の既知のＩＬ−１リガ
ンドと相同性を共有しているとしたらＩＬ−１リガンドを意味すると考えられる
。

【００２１】 マウスＩＬ−１エプシロンは既知のＩＬ−１遺伝子、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β
、ＩＬ−１δ（ＰＣＴ ＵＳ／９９／００５１４に開示されている）およびＩＬ
−１ｒａ、およびより最近にはＩＬ−１８（以前のある時にはＩＬ−１ガンマと
して知られていた）の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）である。マウスＩＬ−１エプシ
ロンは最初はＥＳＴデータベースを検索し、マウスＩＬ−１エプシロンに対応す
るＥＳＴを発見することにより同定された（承認番号ＡＡ０３０３２４）。”長
型”のための全読み取り枠がこのＥＳＴに含まれている。

【００２２】 マウスＩＬ−１エプシロン（長型）ＤＮＡ配列 ＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡ ＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴ ＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡ ＴＣＣ
ＴＧＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣ ＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣ ＣＡＡＧＧＡ
ＡＡＧＡ ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴ ＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧ ＡＡＣＡＴＡＡＴＧ
Ｇ ＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡ ＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡ ＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧ Ｃ
ＣＴＣＴＣＴＣＴＴ ＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧ ＡＡＧＡＧＴＧＧＴＡ ＣＡＡＣ
ＣＴＣＴＡＣ ＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴ ＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣ ＣＴＧＧＴＴＧ
ＧＴＴ ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ ＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣ
ＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧ ＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣ ＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴ ＣＴ
ＴＣＡＴＣＡＣＴ ＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡ ＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴ ＡＣＡＴＴ
ＡＡ（配列番号：１） マウスＩＬ−１エプシロン（長型）アミノ酸配列 ＭＦＲＩＬＶＶＶＣＧ ＳＣＲＴＩＳＳＬＱＳ ＱＧＫＳＫＱＦＱＥＧ ＮＩＭ
ＥＭＹＮＫＫＥ ＰＶＫＡＳＬＦＹＨＫ ＫＳＧＴＴＳＴＦＥＳ ＡＡＦＰＧＷ
ＦＩＡＶ ＣＳＫＧＳＣＰＬＩＬ ＴＱＥＬＧＥＩＦＩＴ ＤＦＥＭＩＶＶＨ＊
（配列番号：２） ＩＬ−１遺伝子と相同性を示しているが、最初に同定されたＥＳＴはＩＬ−１
様分子の３分の２のＣ末端をコードしているようである点でマウスＩＬ−１エプ
シロンは通常ではない。加えて、ＩＬ−１エプシロン発現の研究の間に、同一の
Ｎ末端であるが異なったＣ末端を持つタンパク質をコードする二つの（もしくは
スプライスされた）型のｍＲＮＡが存在することが明らかになった。これら二つ
のタンパク質のより長い方は、最初のＥＳＴによりコードされているものであっ
た。より短いものは（しばしば”アイソフォーム”と称される）典型的ＩＬ−１
ファミリー分子の約３分の１の長さである。 マウスＩＬ−１エプシロン（短型）ＤＮＡ配列 ＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡ ＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴ ＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡ ＴＣＣ
ＴＧＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣ ＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣ ＣＡＡＧＧＡ
ＡＡＧＡ ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴ ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ ＴＴＡＣＣＴＴＧＣ
Ｔ ＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡ ＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡ ＣＴＣＴＴＧＡＧＡＣ Ｇ
ＡＡＣＡＧＧＧＧＧ ＧＡＴＣＣＣＡＣＧＴ ＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴ ＧＣＡＡ
ＡＧＧＣＣＧ ＡＴＧＡ（配列番号：３） マウスＩＬ−１エプシロン（短型）アミノ酸配列 ＭＦＲＩＬＶＶＶＣＧ ＳＣＲＴＩＳＳＬＱＳ ＱＧＫＳＫＱＦＱＳＬ ＬＰＣ
ＳＨＡＮＩＷＴ ＬＬＲＲＴＧＧＩＰＲ ＴＷＥＣＫＧＲ＊（配列番号：４） 同一起源のＲＮＡ転写体で、異なってスプライスされた転写体によりコードさ
れているこれら二つのタンパク質（長および短型）は非共有結合的に会合し、”
全”ＩＬ−１様分子を形成するであろう。

【００２３】 いずれにしても、マウス長型および短型ＩＬ−１エプシロンのための混合され
たｃＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトＩＬ−１エプシロンがヒトゲノムラ
イブラリーのスクリーニングにより同定された。ヒトゲノムライブラリーから得
られたクローンの配列決定から読み取り枠を含んでいるＤＮＡの一続きが明らか
にされた（同一領域にマウスＩＬ−１エプシロンと高度に相同なタンパク質の一
部をコードしている）。読み取り枠はエキソンであるようである（コード領域の
最も３’側のエキソン）。このエキソンの５’末端でのスプライス受容部位は、
マウスＩＬ−１エプシロンの対応するエキソンのスプライス受容部位と同一の位
置に存在する。

【００２４】 ヒトＩＬ−１エプシロンに対応するこのエキソンのＤＮＡおよびアミノ酸配列
が、各々配列番号：５および配列番号：６に示されている。 ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡのヌクレオチド配列： ＧＡＡＡＡＧＧＡＴＡ ＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴ ＧＴＡＣＡＡＣＣＡＡ ＣＣＣ
ＧＡＧＣＣＴＧ ＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴ ＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣ ＣＡＣＡＧＣ
ＣＡＧＡ ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡ ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＣＴＧＴＧ
Ｇ ＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧ ＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣ ＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴ Ｃ
ＴＧＡＡＧＧＡＧＧ ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣ ＡＴＣＣＴＴＡＣＣＣ ＡＡＧＡ
ＡＣＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣ ＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴ ＴＴＧＧＧＴＴ
ＡＡＣ ＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴ ＴＡＡ（配列番号：５） 核酸配列によりコードされている好適なポリペプチドが以下に示されている： ヒトＩＬ−１エプシロンのアミノ酸配列： 適切な読み取り枠の翻訳（５’３’）： ＥＫＤＩＭＤＬＹＮＱ ＰＥＰＶＫＳＦＬＦＹ ＨＳＱＳＧＲＮＳＴＦ ＥＳＶ
ＡＦＰＧＷＦＩ ＡＶＳＳＥＧＧＣＰＬ ＩＬＴＱＥＬＧＫＡＮ ＴＴＤＦＧＬ
ＴＭＬＦ＊（配列番号：６） 完全長ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡ配列が実施例１に説明したように単離さ
れた。完全長ヒトＩＬ−１エプシロンのＤＮＡおよびアミノ酸配列が各々配列番
号：７および配列番号：８に示されている。 ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列： ＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧ ＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴ ＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴ ＣＡＧ
ＣＡＧＧＧＧＡ ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡ ＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴ ＣＧＧＧＴＧ
ＴＧＧＧ ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡ ＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣ ＡＴＡＧＣＡＧＴＣ
Ｃ ＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡ ＣＣＧＴＡＴＧＴＣＴ ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ Ｔ
ＴＧＣＣＴＴＡＡＴ ＣＴＣＡＴＧＣＣＧＡ ＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡ ＣＣＣＴ
ＴＧＡＧＡＡ ＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧ ＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴ ＡＣＣＴＧＧＧ
ＣＣＴ ＧＡＡＴＧＧＡＣＴＣ ＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣ ＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣ
ＴＡＡＡＧＴＣＧＧＧ ＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡ ＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴ ＧＡ
ＡＧＧＡＡＡＡＧ ＧＡＴＡＴＡＡＴＧＧ ＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡ ＣＣＡＡＣ
ＣＣＧＡＧ ＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴ ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ ＣＴＡＣＣＡＣＡ
ＧＣ ＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡ ＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣ ＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴ
ＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴ ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ ＡＧＣ
ＴＣＴＧＡＡＧ ＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣ ＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴ ＡＣＣＣＡＡ
ＧＡＡＣ ＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣ ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ ＧＡＣＴＴＴＧＧＧ
Ｔ ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴ ＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：７） ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長アミノ酸配列： 適切な読み取り枠の翻訳（５’から３’）： ＭＥＫＡＬＫＩＤＴＰ ＱＱＧＳＩＱＤＩＮＨ ＲＶＷＶＬＱＤＱＴＬ ＩＡＶ
ＰＲＫＤＲＭＳ ＰＶＴＩＡＬＩＳＣＲ ＨＶＥＴＬＥＫＤＲＧ ＮＰＩＹＬＧ
ＬＮＧＬ ＮＬＣＬＭＣＡＫＶＧ ＤＱＰＴＬＱＬＫＥＫ ＤＩＭＤＬＹＮＱＰ
Ｅ ＰＶＫＳＦＬＦＹＨＳ ＱＳＧＲＮＳＴＦＥＳ ＶＡＦＰＧＷＦＩＡＶ Ｓ
ＳＥＧＧＣＰＬＩＬ ＴＱＥＬＧＫＡＮＴＴ ＤＦＧＬＴＭＬＦ＊（配列番号：
８） 加えて、単一ヌクレオチド多型がヒトＩＬ−１エプシロン遺伝子で同定された
。特に、多型はヌクレオチド３５位でのアデノシンからグアノシンへの置換が含
まれていた。この多型ＩＬ−１エプシロン遺伝子によりコードされているポリペ
プチドはグルタミン残基ではなく１２位にアルギニン残基を持っている。この単
一ヌクレオチド多型を含んでいるヒトＩＬ−１エプシロン遺伝子のＤＮＡ配列は
配列番号：１２に示されており、この多型遺伝子に対応する完全長アミノ酸配列
は配列番号：１３に示されている。 多型ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列： ＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧ ＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴ ＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴ ＣＡＧ
ＣＧＧＧＧＧＡ ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡ ＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴ ＣＧＧＧＴＧ
ＴＧＧＧ ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡ ＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣ ＡＴＡＧＣＡＧＴＣ
Ｃ ＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡ ＣＣＧＴＡＴＧＴＣＴ ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ Ｔ
ＴＧＣＣＴＴＡＡＴ ＣＴＣＡＴＧＣＣＧＡ ＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡ ＣＣＣＴ
ＴＧＡＧＡＡ ＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧ ＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴ ＡＣＣＴＧＧＧ
ＣＣＴ ＧＡＡＴＧＧＡＣＴＣ ＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣ ＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣ
ＴＡＡＡＧＴＣＧＧＧ ＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡ ＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴ ＧＡ
ＡＧＧＡＡＡＡＧ ＧＡＴＡＴＡＡＴＧＧ ＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡ ＣＣＡＡＣ
ＣＣＧＡＧ ＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴ ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ ＣＴＡＣＣＡＣＡ
ＧＣ ＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡ ＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣ ＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴ
ＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴ ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ ＡＧＣ
ＴＣＴＧＡＡＧ ＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣ ＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴ ＡＣＣＣＡＡ
ＧＡＡＣ ＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣ ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ ＧＡＣＴＴＴＧＧＧ
Ｔ ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴ ＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：１２） ヒトＩＬ−１エプシロンの完全長アミノ酸配列： 適切な読み取り枠の翻訳（５’から３’）： ＭＥＫＡＬＫＩＤＴＰ ＱＲＧＳＩＱＤＩＮＨ ＲＶＷＶＬＱＤＱＴＬ ＩＡＶ
ＰＲＫＤＲＭＳ ＰＶＴＩＡＬＩＳＣＲ ＨＶＥＴＬＥＫＤＲＧ ＮＰＩＹＬＧ
ＬＮＧＬ ＮＬＣＬＭＣＡＫＶＧ ＤＱＰＴＬＱＬＫＥＫ ＤＩＭＤＬＹＮＱＰ
Ｅ ＰＶＫＳＦＬＦＹＨＳ ＱＳＧＲＮＳＴＦＥＳ ＶＡＦＰＧＷＦＩＡＶ Ｓ
ＳＥＧＧＣＰＬＩＬ ＴＱＥＬＧＫＡＮＴＴ ＤＦＧＬＴＭＬＦ＊（配列番号：
１３） ＩＬ−１エプシロンをコードするこのＤＮＡの発見は、本発明のＩＬ−１エプ
シロンポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる発現ベクター；発現ベク
ターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞；生物学的に活性なヒト
ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよび単離され精製されたタンパク質としての
分子量マーカー；並びに本発明のポリペプチドと免疫反応的な抗体の構築を可能
にした。

【００２５】 核酸分子 特定の態様において、本発明はある種の単離されたヌクレオチド配列に関して
いる。”ヌクレオチド配列”とは、少なくとも一度は実質的に純粋な形で単離さ
れ（即ち、外因性物質の夾雑がない）、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
に概説されているような方法）によるその成分ヌクレオチド配列の同定、操作お
よび回収が可能な質または濃度での、ＤＮＡまたはＲＮＡから誘導された、別々
の断片の形でのまたは大きな核酸構築物の成分としてのポリヌクレオチド分子を
意味している。そのような配列は好適には、真核生物遺伝子に典型的に存在して
いる内部非翻訳配列またはイントロンにより中断されていない読み取り枠の型で
提供および／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は読み取り枠の５’または
３’側に存在してもよいが、そこでもそれらはコード領域の操作または発現を妨
害しない。

【００２６】 本発明の特に好適なヌクレオチド配列は上に示したような配列番号：５、配列
番号：７および配列番号：１２である。本発明はさらに配列番号：５、配列番号
：７および配列番号：１２から誘導される単離された断片およびオリゴヌクレオ
チドも包含している。本発明の範囲内の核酸配列には中程度のまたは高度のスト
リンジェンシー条件下、本明細書に開示されている天然のヌクレオチド配列にハ
イブリダイズし、そして本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする、単
離されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。これらの単離されたＤＮＡおよび
ＲＮＡ配列はまた、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードする完全長ＤＮＡ
またはＲＮＡを含んでいる。

【００２７】 本明細書中で使用される場合、中程度のストリンジェンシーとは、当業者には
既知であるように、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１
巻，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に定義されているように、５ＸＳ
ＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のニトロセルロー
スフィルターの前洗浄溶液、５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、４２℃でのハイ
ブリダイゼーション条件（またはスターク溶液のような他の類似のハイブリダイ
ゼーション溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃で）、および約６０℃、０．５
ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件の使用を含んでいる。高ストリンジェンシ
ー条件は、前記のハイブリダイゼーション条件および６８℃、０．２ＸＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳでの洗浄で定義される。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度を、
プローブの長さのような因子に従い、必要に応じて調節できることを認識するで
あろう。

【００２８】 既知の遺伝子コード縮重から、一つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードで
き、ＤＮＡ配列は配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２に示された
配列を変更でき、それでも各々配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１
３のアミノ酸配列を持っているポリペプチドをコードしているようにできる。そ
のような変異体ＤＮＡは沈黙突然変異から生じるか（例えば、ＰＣＲ増幅の間に
起こる）、または天然配列の計画的突然変異誘発の産物であろう。

【００２９】 それ故、本発明は（ａ）天然の哺乳動物遺伝子のコード領域に由来するＤＮＡ
；（ｂ）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のヌクレオチド配列
を含むｃＤＮＡ；（ｃ）配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のポ
リペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）中程度のストリンジェンシー条件下で（
ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ
）で定義されたＤＮＡについての遺伝子コードの結果として縮重し、本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、から選択される、本発明のポリペプチドをコー
ドする同等な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）単離されたＤＮＡ配列を提供する。もち
ろん、そのような同等なＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドは本発
明に含まれる。

【００３０】 配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のＤＮＡ配列と同等なＤＮ
Ａは中程度のストリンジェンシー条件下、配列番号：６、配列番号：８または配
列番号：１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする二本鎖天然ＤＮＡ
配列へハイブリダイズするであろう。そのようなＤＮＡによりコードされている
ポリペプチドの例には、以下に説明するような不活性化Ｎ−グリコシル化部位、
不活性化プロテアーゼプロッセッシング部位または保存的アミノ酸置換を含んで
いるポリペプチド断片およびポリペプチドが含まれるが、それらに制限されるわ
けではない。ＤＮＡが配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のＤＮ
Ａの相補体にハイブリダイズするであろう、他の哺乳動物に由来するＤＮＡによ
りコードされているポリペプチドもまた包含される。

【００３１】 発現 本発明のポリペプチドをコードしている核酸配列はよく知られている方法を使
用して組換え発現ベクター内へ挿入できる。発現ベクターは哺乳動物、微生物、
ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するもののような、適切な転写または翻訳調節
ヌクレオチド配列に機能可能なように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋ
ｅｄ）本発明のＤＮＡ配列を含んでいる。調節配列の例には転写プロモーター、
オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、転写および翻
訳の開始および終止を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が本発明のＤＮ
Ａ配列に機能的に関係している場合、ヌクレオチド配列は”機能可能なように連
結”されている。従って、もしプロモーターヌクレオチド配列が本発明のＤＮＡ
配列の転写を制御するならば、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に機
能可能なように連結されている。所望の宿主細胞で複製する能力は通常複製起点
により与えられ、および、形質転換体が同定される選択遺伝子を付加的に発現ベ
クター内へ取り込ませることができる。

【００３２】 加えて、本発明のポリペプチドには天然には付随されていない適したシグナル
ペプチドをコードしている配列を発現ベクター内へ取り込ませることができる。
例えば、ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻
訳されるように、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡ配列を本発
明のヌクレオチド配列の読み枠内へ融合できる。意図する宿主細胞中で機能的で
あるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプ
チドは、細胞からポリペプチドが分泌されるとポリペプチドから切断できる。

【００３３】 本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高
等な真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用する
ために適したクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅ
ｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８５）、に記載されて
いる。本明細書に開示したＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用して、本発
明のポリペプチドを産生させるのに細胞を含まない翻訳系もまた用いることがで
きるであろう。

【００３４】 原核生物系 原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物体が含まれる。形質転換に適し
た原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびバシ
ラス、シュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコッカス属内の種々
の他の種が含まれる。大腸菌のような原核生物宿主細胞において、本発明のポリ
ペプチドは、原核生物宿主細胞での組換え体ポリペプチドの発現を容易にするた
めにＮ末端メチオニン残基を含むことができる。Ｎ末端Ｍｅｔは発現された組換
え体ポリペプチドから切断できる。

【００３５】 原核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターはまた、一般に一つまたはそ
れ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子も含んでいる。表現型選択可能マーカー
遺伝子とは、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは自己栄養要求性を供給するタ
ンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用である発現ベクタ
ーの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のよう
な市販品として入手可能なプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３
２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、
従って、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を
使用して発現ベクターを構築するには、適切なプロモーターおよび本発明のＤＮ
Ａ配列がｐＢＲ３２２ベクター内へ挿入される。他の市販品として入手可能なベ
クターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。他の市販
品として入手可能なベクターには、タンパク質の発現のために特別に設計された
ものが挙げられる；これらには、マルトース結合タンパク質に融合されたタンパ
ク質の発現に使用されるｐＭＡＬ−ｐ２およびｐＭＡＬ−ｃ２ベクターが含まれ
る（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ
）。

【００３６】 組換え体原核生物宿主細胞発現ベクターに通常使用されるプロモーター配列に
はβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄ
ｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）
、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，１９８２）が含まれる。
特に有用な原核生物宿主細胞発現系はファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８
５７ｔｓ熱不安定性レプレッサー配列を用いている。λＰ_Lプロモーターの誘導
体を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株Ｊ
ＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）に存在する）およびｐＰＬｃ２８ （大腸菌Ｒ
Ｒ１（ＡＴＣＣ ５３０８２）に存在する）が含まれる。

【００３７】 本発明のＤＮＡは通常の細菌発現ベクターの多クローニング部位内へイン−フ
レームでクローン化できる。理想的には、誘導剤の添加が研究者が選択した時期
での組換え体タンパク質の高レベル産生を導くように、ベクターはクローニング
部位上流の誘導可能プロモーターを含んでいる。いくつかのタンパク質について
は、プロモーターおよび初期の遺伝子の間に（ヘキサヒスチジンのような）融合
パートナーをコードしているコドンを取り込ませることにより、発現レベルを押
し上げることができる。

【００３８】 組換え体タンパク質の発現では、前もって決定されている光学密度に到達する
まで増殖培地中で細菌細胞を増殖させる。続いて、組換え体タンパク質が例えば
、ｌａｃオペレーター／プロモーターを含んでいるプラスミドからのタンパク質
発現を活性化するＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）
の添加により誘導される。インキュベーション後（典型的には１−４時間）、細
胞を遠心分離（例えば、４℃、５，０００ｘＧで２０分）によりペレット化して
採取する。

【００３９】 発現されたタンパク質の回収のため、ペレット化細胞を１０容量の５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１Ｍ ＮａＣｌに再懸濁し、フレンチプレスを２また
は３回通過させる。ほとんどの高度に発現された組換え体タンパク質は封入体と
して知られている不溶性凝集体を形成する。封入体は４℃、５，０００ｘＧで２
０分遠心分離してペレット化することにより可溶性タンパク質を除去して精製で
きる。封入体ペレットは５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１％トリトンＸ−
１００で洗浄し、次に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／８Ｍ尿素／０．１Ｍ
ＤＴＴに溶解させた。溶解できない物質を遠心分離により除去する（２０℃、
１０，０００ｘＧで２０分）。ほとんどの場合、問題とするタンパク質は得られ
た透明化上清中にもっとも豊富なタンパク質であろう。このタンパク質は５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭ ＣａＣｌ₂／５ｍＭ Ｚｎ（ＯＡｃ）₂／
１ｍＭ ＧＳＳＧ／０．１ｍＭ ＧＳＨに対して透析することにより活性なコン
ホメーションへ”再折り畳み”される。再折り畳み後、イオン交換またはゲル濾
過のような種々のクロマトグラフィー法により精製を実施できる。いくつかのプ
ロトコールでは最初の精製は再折り畳み前に実施されるであろう。例えば、ヘキ
サヒスチジン−タグ付け融合タンパク質は、固定化ニッケル上で部分的に精製さ
れるであろう。

【００４０】 前記の精製および再折り畳み法は、タンパク質が封入体から最もよく回収され
ることを仮定しているが、当業者は多くの組換え体タンパク質は細胞溶解液の可
溶性分画から最もよく精製されることを認識するであろう。これらの場合、再折
り畳みはしばしば必要とされず、標準クロマトグラフィー法による精製が直接的
に実施されるであろう。

【００４１】 酵母系 本発明のポリペプチドはあるいは、酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス
属から（例えば、Ｓ．セレビジエ）、中で発現できる。ピキア、Ｋ．ラクチスま
たはクルイベロミセスのような酵母の他の属もまた用いることができる。酵母ベ
クターはしばしば２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲ
Ｓ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列
、および選択可能マーカー遺伝子を含んでいるであろう。酵母ベクターに適した
プロモーター配列には、中でも、メタロチオネイン、３−ホスホグリセラートキ
ナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：
２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およ
びＨｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８
）のためのプロモーターが含まれる。酵母発現で使用するための他の適したベク
ターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌ
ｅｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０７：２８５−１９５（１９９１）；およ
びｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
８：１３５−１３９（１９９０）にさらに記載されている。別の代替物はＲｕｓ
ｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８
２）およびＢｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８
２）に記載されているグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。酵母お
よび大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌中での選択および複
製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を
前記の酵母ベクター内へ挿入することにより構築できる。

【００４２】 酵母α因子リーダー配列が本発明のポリペプチドの分泌を指示させるために用
いることができる。α因子リーダー配列はしばしばプロモーター配列および構造
遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ
３０：９３３，１９８２；Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４；米国特許第４，５４６
，０８２号；およびＥＰ ３２４，２７４を参照されたい。酵母宿主からの組換
え体ポリペプチドの分泌を容易にするための適した他のリーダー配列は当業者に
は既知である。リーダー配列は一つまたはそれ以上の制限部位を含ませるために
その３’末端近傍を修飾できる。このことは構造遺伝子へのリーダー配列の融合
を容易にするであろう。

【００４３】 酵母形質転換プロトコールは当業者には既知である。そのようなプロトコール
の一つがＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８、に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプ
ロトコールは選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換体を選択しており、ここで選択培地
は０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／
ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルから成っている。

【００４４】 ＡＤＨ２プロモーター配列を含んでいるベクターにより形質転換された酵母宿
主細胞は”リッチ”培地中で発現を誘導するために増殖できる。リッチ培地の例
は８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した、１％酵母
抽出物、２％ペプトンおよび１％グルコースから成るものである。ＡＤＨ２プロ
モーターの抑制はグルコースが培地から使い尽くされた場合に起こる。

【００４５】 哺乳動物および昆虫系 あるいは、本発明の組換えポリペプチドを発現させるために哺乳動物又は昆虫
宿主細胞培養系を用いることができる。昆虫細胞における異種タンパク質産生の
ためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）、により概説されている。哺乳動
物起源の確立された細胞株もまた使用できる。適した哺乳動物宿主細胞株にはサ
ル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、
３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、ヒーラー細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、並
びに、ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９
１）により記載されているアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ７０）から誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１０４７８）が含まれる。

【００４６】 哺乳動物細胞内へＤＮＡを導入するための確立された方法が報告されている（
Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９）。細胞をトランスフェ
クトするためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓのような市販品として入手可能な試薬を使用
する別の方法が使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７，１９８７）。加え
て、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１−３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、に記
載されているような慣用の方法を使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクトす
るためにエレクトロポレーションが使用できる。安定な形質転換体の選択は例え
ば、細胞毒性薬剤への耐性のような、本分野では既知の方法を使用して実行でき
る。Ｋａｕｆｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１８５：４８７−５ｌｌ，１９９０、はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ
）耐性のようないくつかの選択スキームを記載している。ＤＨＦＲ選択に適した
宿主株は、ＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であろう（Ｕｒｌａｕ
ｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７：４２１６−４２２０，１９８０）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプ
ラスミドが株ＤＸ−Ｂ１１内へ導入でき、プラスミドを含んでいる細胞のみが適
切な選択培地中で増殖できる。発現ベクター内へ取り込ませることができる選択
可能マーカーの別の例には、Ｇ４１８およびヒグロマイシンＢのような抗生物質
に対して耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。ベクターを含んでいる細胞はこれら
の化合物への耐性に基づいて選択できる。

【００４７】 哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列はウイルスゲ
ノムから切り出すことができる。普通に使用されるプロモーター配列およびエン
ハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイル
スゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プ
ロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位が哺乳動物
宿主細胞における構造遺伝子配列発現のための他の遺伝子要素を提供するために
使用できる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方ともウイルスゲノム
からウイルス複製起点も含むことができる断片として容易に得ることができるの
で特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３
，１９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９
０）。ＳＶ４０ウイルス由来複製起点中に位置しているＨｉｎｄＩＩＩ部位から ＢｇｌＩ 部位にわたる約２５０ｂｐ配列が含まれていれば、より短いまたはより
長いＳＶ４０断片もまた使用できる。

【００４８】 哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示されている
別の制御配列には、ＣＨＯ細胞から誘導された発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（
Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４）およびアデノウイルス２からの三分割リー
ダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５−１３４９１，１９８２）が含まれ
る。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列はジシストロンｍ
ＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする（Ｏｈ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００，１９９３；Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．
，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００
，１９９６）。選択可能マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の遺伝子に続くジシスト
ロンｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクト可
能性および異種ｃＤＮＡの発現を改良することが示されている（Ｋａｕｆｒｎａ
ｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）。ジシストロンｍＲＮ
Ａを用いる発現ベクターの例は、Ｍｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１，１９９７、により記載されているｐＴＲ
−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４、により記載されて
いるｐ２Ａ５Ｉである。

【００４９】 有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ５９：３３５−３４８，１９８９、に記載されている。哺乳動物宿主細胞
で使用するための他の発現ベクターはＯｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）により開示されているように
構築できる。Ｃ１２７マウス乳腺上皮細胞での哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベ
ル発現に有用な系はＣｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
３：９３５，１９８６）によりおおむね記載されているように構築できる。Ｃｏ
ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４、により説
明されている有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ３９８
９０として寄託されている。別の有用な哺乳動物発現ベクターはＥＰ−Ａ−０３
６７５６６、および１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７
０１，４１５号（本明細書において援用される）に記載されている。ベクターは
レトロウイルスから誘導できる。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４
，９６５，１９５号に記載されているＩＬ−７のためのシグナル配列；Ｃｏｓｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されて
いるＩＬ−２レセプターのためのシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載さ
れているＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載さ
れているタイプＩ ＩＬ−１レセプターシグナルペプチド；およびＥＰ ４６０
，８４６に記載されているタイプＩＩ ＩＬ−１レセプターシグナルペプチドの
ような異種シグナル配列が付加できる。

【００５０】 別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧが使用できる。ＦＬＡＧ技術は低分子量
（１ｋＤ）、親水性、ＦＬＡＧマーカーペプチドのｐＦＬＡＧ−１^TM発現ベクタ
ー（１）（ＩＢＩ Ｋｏｄａｋから入手した）により発現される組換え体タンパ
ク質のＮ末端への融合を中心に行われる。

【００５１】 本発明のポリペプチド 前に示したように、本発明はまた単離されおよび精製されたポリペプチドも含
んでいる。本明細書で使用される場合、本発明の”ポリペプチド”とは配列番号
：６、配列番号：８または配列番号：１３のアミノ酸配列を有するタンパク質、
ならびに、そのようなアミノ酸配列と高い程度の類似性（少なくとも９０％の相
同性）を持っているタンパク質（およびそれらのタンパク質は生物学的に活性で
ある）をさらに包含するポリペプチド類を意味している。加えて、本発明のポリ
ペプチドは配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２のヌクレオチドの
遺伝子産物を意味している。

【００５２】 単離および精製 本明細書で使用される場合、用語”単離および精製された”とは本発明のポリ
ペプチドまたは断片が、例えば、組換え体宿主細胞培養の精製生成物として、ま
たは、非組換え体源からの精製された生成物として、本質的に他のタンパク質ま
たはポリペプチドが会合していないことを意味している。本明細書で使用される
場合、用語”実質的に精製された”とは、本発明のポリペプチドまたは断片を含
む混合物が、他のタンパク質またはポリペプチドと本質的に会合していないが、
特異的抗体を使用して除去できる既知のタンパク質が存在することを指しており
、そして実質的に精製されたポリペプチドまたはその断片は分子量マーカーとし
て使用できる。用語”精製された”とは本発明のポリペプチドの”単離および精
製された”型または本発明のポリペプチドの”実質的に精製された”型のどちら
か一方を指している（両方ともここに説明されている）。

【００５３】 本発明に従って単離および精製されたポリペプチドは、前記のように組換え体
発現系により産生できるか、または、天然に存在する細胞から精製できる。 一つの好適な態様において、組換え体ＩＬ−１エプシロンポリペプチドの発現
は、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードする配列と、本発明のポリペプチ
ドの精製を助けるための別のポリペプチドをコードする配列との融合を利用して
達成できる。そのような融合の例は、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコード
している配列とＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．のｐＭＡＬ
−ｃ２ベクターのｍａｌＥ遺伝子産物をコードする配列への融合である。そのよ
うな融合は、融合タンパク質のアフィニティー精製、ならびに、精製後の本発明
のポリペプチドからの融合タンパク質のマルトース結合タンパク質部分の分離を
可能にしている。

【００５４】 ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードするＤＮＡのｐＭＡＬ−ｃ２ベクタ
ー内への挿入は、既知の分子生物学技術を使用した種々の方法により達成できる
。挿入の好適な構築では、本発明のポリペプチドのカルボキシ終端コドンに隣接
している終止コドンが含まれている。加えて、挿入の好適な構築は、本発明のポ
リペプチドのアミノ末端の、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクター中のファクターＸａ切断部
位カルボキシ末端への直接的な融合を生じている。ＤＮＡ断片は、本発明のＤＮ
Ａを鋳型として、および二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ
により発生できる。オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、慣用の方法により
単離できるＤＮＡの平滑末端化断片を生成する。このＰＣＲ生成物は慣用の手段
を使用してｐＭＡＬ−ｐ２と結合できる（制限エンドヌクレアーゼＸｍｎＩで切
断して）。陽性クローンは通常の手段により同定できる。融合タンパク質の発現
の誘導および精製は使用説明書に従っておよび前に示したように実施できる。こ
の構築は、使用説明書どおりの単純なプロテアーゼ処理を利用する融合マルトー
ス結合タンパク質からの本発明のポリペプチドの正確な分離を容易にする。この
様式により、精製されたＩＬ−１エプシロンポリペプチドを得ることができる。
さらに、そのような構築ベクターはさらなる融合タンパク質を作成させるため、
既知の分子生物学的技術を使用して容易に修飾できる。もちろん、前に示したよ
うに、多くの異なったベクターおよび技術が本発明のポリペプチドの発現および
精製に使用できること、そしてこの態様は本発明の範囲を制限するものではない
ことを理解されたい。

【００５５】 細菌培養で産生された組換え体タンパク質は、常法（凍結−融解サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含んでいる）による宿主細胞
の初期破壊、遠心分離、もし不溶性ポリペプチドならば細胞ペレットからの、ま
たはもし可溶性ポリペプチドならば上清液からの抽出、続いての１回またはそれ
以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマト
グラフィー工程により通常単離される。当業者には既知であるように、組換え体
タンパク質を精製する方法は、用いられた宿主細胞の型、および組換え体タンパ
ク質が培養培地中へ分泌されるかどうかの様な因子に従って変化するであろう。
例えば、組換え体タンパク質を分泌する発現系が用いられた場合、培養培地は最
初に、市販品として入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏ
ｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット、を使用して
濃縮できる。濃縮工程に続き、濃縮液はゲル濾過媒質のような精製マトリックス
が応用できる。あるいは、陰イオン交換樹脂が使用できる、例えば、ぶら下がっ
た（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つマトリックス
または基質。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セル
ロースまたはタンパク質精製で普通に用いられる他の型であろう。もしくは、陽
イオン交換工程が使用できる。適した陽イオン交換物にはスルホプロピルまたは
カルボキシメチル基を含んでいる種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホ
プロピル基が好適である。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ）媒質（例えば、ぶら下がったメチルまたは他の脂肪族基を持って
いるシリカゲル）を用いた１回またはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣが、ポリペプチ
ドをさらに精製するために使用できる。いくつかのまたは全部の前記精製工程（
種々に組み合わされた）はよく知られており、単離および精製された組換え体タ
ンパク質を提供するために使用できる。

【００５６】 本発明のポリペプチドに対して作成したモノクローナル抗体のような本発明の
ポリペプチド−結合タンパク質を含むアフィニティーカラムを利用して、発現ポ
リペプチドをアフィニティー精製することも可能である。これらのポリペプチド
は通常の技術を使用して（例えば、高塩溶出液中に溶出し、次に使用するために
低塩緩衝液で透析するかまたは、利用されたアフィニティーマトリックスに依存
してｐＨまたは他の成分を変えることにより）アフィニティーカラムから除去す
ることができる。

【００５７】 本発明のこの側面において、本発明の抗ポリペプチド抗体または本発明のポリ
ペプチドと相互作用するであろう他のタンパク質のようなポリペプチド結合タン
パク質は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、あるいは本発明のポリペプ
チドをその表面に発現する細胞の同定、分離または精製に適した類似の基質のよ
うな固相支持体に結合できる。本発明のポリペプチド−結合タンパク質の固相接
触表面への付着は任意の手段（例えば、磁性マイクロスフェアはこれらのポリペ
プチド−結合タンパク質で被覆でき、磁場によりインキュベーション容器に保つ
ことができる）により達成できる。細胞混合物の懸濁液を、その表面にそのよう
なポリペプチド−結合タンパク質を持つ固相と接触させる。表面に本発明のポリ
ペプチドを持っている細胞は固定されたポリペプチド−結合タンパク質に結合さ
れ、非結合細胞は洗い流す。このアフィニティー結合法は、溶液からそのような
ポリペプチド発現細胞を精製、スクリーニングまたは分離するために有用である
。固相から陽性で選択された細胞を放出させる方法は本分野で知られており、例
えば、酵素の使用を含んでいる。そのような酵素は好適には細胞に対して無毒お
よび非傷害性であり、好適には細胞表面結合相手を切断するように方向付けられ
ている。

【００５８】 あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含んでいると思われる細胞の混合
物を最初に、本発明のビオチニル化ポリペプチド結合タンパク質とインキュベー
トしてもよい。インキュベーション期間は本発明のポリペプチドへの十分な結合
を確実にするため、典型的には少なくとも１時間持続される。得られた混合物は
次にアビジン被覆ビーズを詰めたカラムを通過させると、アビジンに対するビオ
チンの高親和性によりポリペプチド結合細胞のビーズへの結合が起こる。アビジ
ン被覆ビーズの使用は本分野で既知である。Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。
非結合物質の洗浄および結合細胞の放出は、常法を使用して実施される。

【００５９】 上に説明した方法において、適したポリペプチド結合タンパク質は抗ポリペプ
チド抗体および、本発明のポリペプチドへ高親和性で結合できる他のタンパク質
である。好適なポリペプチド結合タンパク質は抗ポリペプチドモノクローナル抗
体である。

【００６０】 好適な態様において、形質転換された酵母宿主細胞は、精製を簡単にするため
、分泌されるポリペプチドとして本発明のポリペプチド発現するように用いられ
る。酵母宿主細胞発酵により分泌された組換え体ポリペプチドはＵｒｄａｌ ｅ
ｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）（精製のた
め２回の連続した逆相ＨＰＬＣ工程の使用が示されている）により記載されてい
る方法と類似の方法で精製できる。

【００６１】 変異体 本発明はまた本発明のポリペプチドの変異体を含んでいる。本明細書において
ポリペプチド”変異体”とは本発明の天然のポリペプチドと実質的に相同的であ
るが、一つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、本発明の天然のポリ
ペプチド（ヒト、マウスまたは他の哺乳動物種）とは異なったアミノ酸配列を持
つポリペプチドを意味している。変異体アミノ酸配列は好適には少なくとも８０
％が天然のポリペプチドアミノ酸配列と同一である。ポリペプチドまたは断片が
好適なポリペプチドまたはその断片と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％
同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．
９％同一であるアミノ酸配列を含んでいる態様も企図される。パーセント同一性
は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１２：３８７，１９８４）により記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ
ＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使
用して配列情報を比較することにより決定できる。ＧＡＰプログラムはＳｍｉｔ
ｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２，１
９８１）により改訂された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用してい
る。ＧＡＰプログラムの好適なデフォルトパラメーターには以下の項の値が含ま
れる：（１）ヌクレオチドの単項比較マトリックス（同一には１および非同一に
は０の値を含んでいる）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，
編，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９により記載されているよ
うなＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４：６７４５，１９８６の重り付き比較マトリックス；（２）各々の不一
致に対して３．０のペナルティーおよび各々の不一致における各々のシンボルに
対して追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端不一致にはペナルティー
なし。

【００６２】 変異体は保存的に置換された配列を含むことができ、定められたアミノ酸残基
が類似の物理化学的特性を持っている残基で置換されることを意味している。保
存的置換の例には一つの脂肪族残基の別のＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ
のような他の残基での置換、または一つの極性残基の別のもう一つのものによる
置換（ＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間
のような）が含まれる。他のそのような保存的置換、例えば類似の疎水特性を持
っている全領域の置換、がよく知られている。天然に存在する変異体もまた本発
明に含まれている。そのような変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング、
ＩＬ−１エプシロンポリペプチドのタンパク質分解的切断、または異なった対立
遺伝子からの転写／翻訳により生じたタンパク質である。タンパク質分解に帰す
ことができる変異体には、例えば、異なった型の宿主細胞での発現によるＮまた
はＣ末端の相違、本発明のポリペプチドからの一つまたはそれ以上のアミノ酸の
タンパク質分解的除去（一般に、１−５の末端アミノ酸）によるものが含まれる
。

【００６３】 オリゴマー 本発明のポリペプチドは、共有結合で連結されたまたは非共有結合的に連結さ
れたダイマーまたはトライマーのようなオリゴマーとしても存在できる。オリゴ
マーは、異なったポリペプチド上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド
結合により連結できる。

【００６４】 本発明の一つの態様において、ポリペプチドダイマーは本発明のポリペプチド
を抗体（例えば，ＩｇＧ１）のＦｃ領域へ、これらのポリペプチドの生物学的活
性を妨害しないような様式で融合することにより作り出せる。Ｆｃ領域は好適に
は本発明の可溶性ポリペプチドのＣ末端へ融合されて、Ｆｃ融合またはＦｃポリ
ペプチドを形成する。本明細書で使用される場合、用語”Ｆｃ融合タンパク質”
または”Ｆｃポリペプチド”とは天然型およびムテイン型、ならびに二量化を促
進するヒンジ領域含む短縮型Ｆｃポリペプチドを含んでいる。前記のＦｃポリペ
プチドを作製する方法の例は、米国特許第５，４２６，０４８および５，７８３
，６７２号（両方とも本明細書において援用される）に開示されている。

【００６５】 抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）へ融合された異種
ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの一般製法は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚ
ｉ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）およびＢ
ｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）（本明細書
において援用される）に記載されている。本発明のポリペプチド：Ｆｃ融合タン
パク質をコードする遺伝子融合物は、適した発現ベクター内へ挿入される。ポリ
ペプチド：Ｆｃ融合タンパク質はよりふさわしい抗体分子を組み立てることを可
能にし、それにより鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、本
発明の２価ポリペプチドが得られる。もし融合タンパク質が抗体の重鎖および軽
鎖の両方を持つように形成されたら、４つもの数のポリペプチド細胞外領域を持
つポリペプチドオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、ペプチドリ
ンカーで２つの可溶性ポリペプチドドメインを連結できる。

【００６６】 変更法 上述のように、本発明は、単離され、かつ精製されたポリペプチド、並びに、
その組換え及び非組換え断片を提供する。天然のポリペプチドの変異体及び誘導
体は、天然のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得
られる。天然のアミノ酸配列の変換は多数の慣用法のいずれによっても遂行され
得る。天然配列の断片にライゲーション可能にする制限部位が近接する、突然変
異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異は特定の部
位に導入され得る。ライゲーションに続いて、結果として生じた再構築配列は、
所期のアミノ酸挿入、置換、もしくは欠失を有する類似体をコードする。

【００６７】 或いは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発法が、予め決定さ
れたコドンが置換、欠失、もしくは挿入によって変換され得る変換遺伝子を提供
するのに使用され得る。上記の変換を作成する例示的な方法が、Ｗａｌｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．
（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
，Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１），Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８，１９８５），Ｋｕｎｋｅｌ
ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９
８７）；並びに、米国特許 第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２
号によって開示され、これらはすべて参考文献として援用される。

【００６８】 本発明のポリペプチドは、グリコシル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
群、脂質、リン酸、アセチル基及び同様のもののような、他の化学成分と共有結
合体もしくは凝集体を形成することによって、ポリペプチド誘導体を創るように
修飾されることも可能である。本発明のポリペプチドの共有結合誘導体は、本発
明のポリペプチドもしくはその細胞外ドメインの、ポリペプチドアミノ酸側鎖上
のあるいはＮ末端またはＣ末端の官能基に化学成分を連結させることによって提
供され得る。本発明の範囲内で、ポリペプチドの他の誘導体は、これらのポリペ
プチドもしくはペプチド断片と他のタンパク質もしくはポリペプチドとの共有結
合体または凝集体、例えばＮ末端もしくはＣ末端融合のような組換え培養中の合
成による結合体、を含む。例えば、結合体は、本発明のポリペプチドのＮ末端に
、シグナルもしくはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセスのα因
子リーダー）を含み得る。シグナルもしくはリーダーペプチドは、翻訳と同時に
または翻訳後に、合成部位から細胞膜もしくは細胞壁の内または外への結合体の
転移を指示する。

【００６９】 ポリペプチド結合体は、本発明のポリペプチドの精製及び同定を容易にするた
めに加えられるペプチドを含むこともできる。このようなペプチドは、例えば、
ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、または、米国特許庁第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４，１９８８に 記載された抗原同定ペプチドを含む。

【００７０】 本発明は、更に、天然型のグリコシル化を伴うもしくは伴わない、本発明のポ
リペプチドを含む。酵母または哺乳類の発現系（例えば、ＣＯＳ−１もしくはＣ
ＯＳ−７細胞）に発現されたポリペプチドは、発現系の選択によって、分子量及
びグリコシル化の型が天然ポリペプチドと同様あるいは有意に異なることもあり
得る。大腸菌のような細菌発現系では、本発明のポリペプチドの発現は、非グリ
コシル化分子を提供する。グリコシル基は、慣用法で、特にグリコペプチダーゼ
を使用して除去され得る。一般に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル
過剰量のグリコペプチダーゼ（ベーリンガー マンハイム）でインキュベートさ
れ得る。

【００７１】 同様に、アミノ酸残基もしくは配列の様々な付加または置換、あるいは、末端
もしくは内部の残基または配列の欠失をコードする、同等のＤＮＡ構成物が、本
発明に含まれる。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位
は、グリコシル化を妨げる様に修飾され、哺乳類及び酵母の発現系において、還
元された炭水化物類似体の発現を可能にし得る。真核細胞のポリペプチドのＮ−
グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙで特徴付けられ、Ｘ
は、Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸であり、Ｙは、ＳｅｒもしくはＴｈｒである
。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列への適切な置換、付加、
もしくは欠失は、Ａｓｎ側鎖に炭水化物残基の付着するのを妨げる結果となるで
あろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸に変換されるように選ばれる、１つの
ヌクレオチドの変換は、Ｎ−グリコシル化部位を不活化するのに十分である。タ
ンパク質のＮ−グリコシル化部位を不活化する既知の手法は、米国特許庁第５，
０７１，９７２号及びＥＰ第２７６，８４６号に記載された手法を含み、本明細
書に参考文献として援用される。

【００７２】 他の例では、生物学的活性に重要ではないＣｙｓ残基をコードする配列が、Ｃ
ｙｓ残基を欠失する、または、他のアミノ酸で変換するように、変換され、再生
における誤った分子内ジスルフィド橋の形成を妨げることが可能である。他の同
等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系で発現を増強するように、
近接したニ塩基アミノ酸残基を修飾することによって提供される。ＥＰ第２１２
，９１４号は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活化
するために部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ａｒｇ
−Ｌｙｓ、及びＬｙｓ−Ａｒｇ対を変換するように、かつ、これらの近接する塩
基残基の発生を除去するように、残基を欠失、付加、あるいは置換することによ
って、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、不活化される。Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ対は、比較的にＫＥＸ２分解をあまり受けやすくないので、Ａｒｇ−Ｌｙｓ
もしくはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活化す
るのに保守的な好ましい方法を代表する。

【００７３】 断片とその使用 本発明の更に別の側面では、本発明のポリペプチドは、化学的及び酵素的方法
によって、ペプチドに断片化され得る。このように産生された断片は分子量マー
カーおよび等電点マーカーを含む、様々な目的に使用され得る。ポリペプチドと
ペプチド断片は、断片化の程度の解析にも使用され得る。そのため、本発明は、
これらのポリペプチド及びペプチド断片、並びに、試料タンパク質の明らかな分
子量及び等電点の決定を助けるキットおよび試料タンパク質の断片化の程度を評
価するキットも含む。

【００７４】 断片化のすべての方法が本発明に含まれるけれども、化学的断片化が好ましい
態様であり、特異的分解がメチオニン残基に起こるような、中性もしくは酸性条
件下で分解するために臭化シアンの使用を含む（Ｅ．Ｇｒｏｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１：２３８−２５５，１９６７）。これは、さらに、シ
ステイン残基を不応性の種類へ変換するカルボキシメチレーションの工程のよう
な、付加的工程を含み得る。

【００７５】 酵素的断片化は、もう一つの好ましい態様であり、慣用的条件下で、Ａｓｐａ
ｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅ
ｐｔｉｄａｓｅ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ，Ｔｒｙ
ｐｓｉｎ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ，Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ，もしくは、Ｅｎｄｏｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅ Ｌｙｓ−Ｃのようなプロテアーゼの使用を含み、結果として特
異的なアミノ酸残基での分解に至る。Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐ
ｔｉｄａｓｅは、本発明のポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のカルボ
キシル側で特異的に分解し得る。Ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ
は、これらのポリペプチド内に存在するアルギニン残基のカルボキシル側で特異
的に分解し得る。Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉは、ポリ
ペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る（Ｓａ
ｋｉｙａｍａ ａｎｄ Ｎａｋａｔ，米国特許庁第５，２４８，５９９号；Ｔ．
Ｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６６
０：４４−５０，１９８１；Ｔ．Ｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６６０：５１−５５，１９８１）。トリプシンは、
本発明のポリペプチド内に存在するアルギニンおよびリジンのカルボキシル側で
特異的に分解し得る。酵素的断片化は、多数のアミノ酸残基で分解するプロテア
ーゼを用いても起こり得る。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ Ｖ８ プロテアーゼは、ポリペプチド内に存在するアスパラギン酸および
グルタミン酸残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る（Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅ
ｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：１１０２−１１０６，１９７７）。Ｅ
ｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎは、ポリペプチド内に存在するアスパ
ラギン残基のアミノ側で特異的に分解し得る。Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｌｙｓ−Ｃは、本発明のポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側
で特異的に分解し得る。他の酵素的及び化学的処理は、これらのポリペプチドを
特異的ペプチドの特有のセットへ特異的に断片化するのに同様に使用され得る。

【００７６】 当然、本発明のペプチド及びポリペプチド断片は当該技術分野で良く知られて
いる慣用的組換え法及び合成法によっても産生され得る。組換え法に関しては、
本発明に含まれるポリペプチド及びペプチド断片は、それらが発現される宿主細
胞次第で様々な分子量を有し得る。様々な細胞型における、本発明のポリペプチ
ド及びペプチド断片のグリコシル化は、修飾の程度に応じて、結果として様々な
分子量の小片に成り得る。これらの小片のサイズは、ポリペプチドの細胞外部分
に由来するポリペプチド断片で最も不均一であり得る。一定したポリペプチド及
びペプチド断片は、膜貫通部及び細胞質部分にもっぱら由来するポリペプチドを
使用すること、グリコシル化を除去するためにＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅで前処理
すること、あるいは、細菌宿主にポリペプチドを発現させることによって得られ
うる。

【００７７】 これらのポリペプチドの分子量は、本発明のポリペプチドのアミノ及びカルボ
キシル末端の双方に付加的ペプチド配列を融合させることによって様々に成り得
る。本発明のポリペプチドのアミノ及びカルボキシル末端に付加的ペプチド配列
を融合させることは、これらのポリペプチドの発現を増強させるために、あるい
は、タンパク質の精製を助けるために使用され得る。更に、本発明のポリペプチ
ドのアミノ及びカルボキシル末端に付加的ペプチド配列を融合することは、酵素
的もしくは化学的処理によって生じたポリペプチドの断片化ペプチドのいくつか
を、たいてい全部ではないが、変えるであろう。当然、、突然変異は、日常的な
かつ既知の分子生物学的技術を使用して、本発明のポリペプチドに導入され得る
。例えば、突然変異は、特異的酵素によるタンパク質融解分解部位あるいは特異
的化学的断片化誘発法による分解部位を除去するように、設計され得る。この部
位を除去することは、特異的酵素的もしくは化学的手法を用いた断片化における
本発明のポリペプチドのペプチドフィンガープリントを変えるだろう。

【００７８】 それぞれの小片の特有なアミノ酸配列は分子量を明示するので、これらの小片
は、その後は、試料タンパク質、ポリペプチドもしくはその断片の分子量の決定
を助けるための解析技術を用いて、分子量マーカーとして役立ち得る。本発明の
分子量マーカーは、類似した明白な分子量を有する試料タンパク質の明白な分子
量の推定のための分子量マーカーとしてとりわけ良く役立ち、結果として、タン
パク質の明白な分子量の決定に正確さを増すことが可能である。

【００７９】 本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合に、それらのマー
カーは、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸サイズである。より好ましくは、
これらの断片化ペプチド分子量マーカーは１０から１００アミノ酸サイズまでの
間である。さらに好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０から５０
アミノ酸サイズまでの間であり、特に好ましくは、１０から３５アミノ酸サイズ
までの間である。最も好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０から
２０アミノ酸サイズまでの間である。

【００８０】 分子量を決定する方法には、沈降法、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー、
及び、マススペクトロメトリーがある。特に好ましい態様は、変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法である（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ２２７：
６８０−６８５，１９７０）．慣用的に、その方法は、ドデシル硫酸ナトリウム
を含むゲルの２つの分かれたレーンを使用し、アクリルアミドの濃度は６から２
０％の間である。同一の条件下で、マーカーと試料を同時に溶解する能力は、正
確さを増すことを可能とする。多くの異なる技術が、本発明のポリペプチドを使
用して試料タンパク質の分子量を決定するために使用され得ること、及び、この
態様が決して本発明の範囲を限定することはないことは、当然、理解される。

【００８１】 さらに、本発明のポリペプチド及び断片化されたペプチドは、特有の荷電の特
徴を有していて、それゆえ、等電位焦点法のような技術を使用して、試料タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは断片化ペプチドの等電点を決定するのを助ける特異
的マーカーとして役立ち得る。これらのポリペプチドもしくは断片化ペプチドマ
ーカーは、本発明のポリペプチドもしくは断片化ペプチドマーカーの等電点に近
接した明白な等電点を有する試料タンパク質の明白な等電点の推定に、特に良く
役立つ。

【００８２】 等電位焦点法技術は、タンパク質を、分子量と荷電とに基いて同時に分ける、
ゲル電気泳動法のような、他の技術と更に結び付けられ得る。同一条件下で、こ
れらのポリペプチドもしくは断片化ペプチドマーカー及び試料タンパク質を同時
に溶解する能力は、試料タンパク質の明白な等電点の決定に正確さを増すことを
可能とする。これは、２次元電気泳動（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ａｎｄ Ｍ．Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ７６−
７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，６ｔｈ ｅｄ．１９９１））のような技術
において特に興味深く、この技術においては、手法の本質は、いかなるマーカー
も試料タンパク質と同時に溶解されるべきであることを要求する。さらに、この
ような方法を用いて、これらのポリペプチド及びそれの断片化ペプチドは、試料
タンパク質もしくはその断片化ペプチドの等電点及び分子量の双方の決定を助け
ることが可能である。

【００８３】 ポリペプチド及び断片化ペプチドは、試料タンパク質及び分子量マーカーの間
の区別を可能とする２つの異なる方法を使用して可視化され得る。１つの態様に
おいては、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチド分子量マーカーは、これら
のマーカーに対して産生された抗体を使用して、慣用的なイムノブロッチング法
を使用して可視化され得る。この検出は、試料タンパク質の検出に結果として至
らない慣用的条件下で行なわれる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含ま
ない可能性があるので、本発明のすべてのポリペプチド断片に対する抗体を産生
するのは可能ではないかもしれないことは理解される。さらに、必ずしもすべて
の抗体がこのアッセイでうまく動くとは限らないであろうことも理解される。し
かしながら、本発明のポリペプチド及び断片に結合できる抗体は、慣用的技術を
使用して容易に決定され得る。

【００８４】 試料タンパク質も、慣用的染色手法を使用することによって可視化される。本
発明のポリペプチドもしくは断片ペプチド分子量マーカーに対してモル過剰量の
試料タンパク質は、慣用的染色手法によって有力に検出されるようなものである
。これらのポリペプチドもしくは断片化ペプチド分子量マーカーのレベルは、慣
用的染色法によって、ほとんどまたは全く検出不可能のような程度である。本発
明のポリペプチド分子量マーカーに対する好ましいモル過剰量の試料タンパク質
は、２倍から１０００００倍の間である。より好ましくは、これらのポリペプチ
ド分子量マーカーに対する好ましいモル過剰量の試料タンパク質は、１０倍から
１００００倍の間であり、特に好ましくは、１００倍から１０００倍の間である
。

【００８５】 これらのポリペプチド分子量マーカー及びそれのペプチド断片を使用して、試
料タンパク質、ポリペプチド及びそれの断片化ペプチドの分子量および等電点を
決定並びに検出するために、多数の技術が使用されること、また、これらの態様
は本発明の範囲を決して限定するものではないことは、当然理解される。

【００８６】 もう１つの態様においては、断片化反応の時間もしくは温度を変えることによ
るような、本発明のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性の断片化の解析（
Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２
：１１０２−１１０６，１９７７）が、試料タンパク質の分解の程度の対照とし
て使用され得る。例えば、同一条件下で同量のポリペプチドと試料タンパク質の
分解を行なうと、断片化の程度を直接比較することが可能となる。ポリペプチド
の完全な断片化を結果として生じる条件は、試料タンパク質の完全な断片化も生
じ得る。

【００８７】 本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドの分子量マーカーとしての特定の使
用に関しては、本発明の好ましいポリペプチドの、臭化シアンを用いた断片化が
、グリコシル化の存在しない状態で、約６９３３、６２５及び２３８ダルトンの
分子量を有する断片化ペプチド分子量マーカーの特有のセットを生ずる。開始メ
チオニン存在下では、１４９ダルトンの追加断片が生ずる。臭化シアンによる配
列番号８の分解は、１４９．２，２６０．３，２０１７．４，３９５４．６，４
４４２．１、及び６９３２．７の分子量を有する断片を生ずる。臭化シアンによ
る配列番号１３の分解は、１４９．２，２６０．３，２０１７．４，３９５４．
６，４４７０．１、及び６９３２．７の分子量を有する断片を生ずる。メチオニ
ン残基の配置は、各ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定し、各ペプチドの特有
のアミノ酸組成は、その分子量を決定する。

【００８８】 さらに、本発明の好ましい単離かつ精製されたポリペプチド（配列番号６、配
列番号８、及び配列番号１３）は、グリコシル化の存在しない状態で、順に、約
７８１０（ポジション１にメチオニンの付加後は７９４１ダルトン）、１７６８
４、及び１７７１２ダルトンの、算定分子量を有する。既知のＩＬ−１ポリペプ
チドの実測分子量は、１７、２５、３１、３３、及び３５キロダルトンを含むの
で、これらの決定に使用する一定範囲の分子量を提供する。

【００８９】 タンパク質がそのまま（ｉｎｔａｃｔ）使用されると、これらのポリペプチド
分子量マーカーの使用は、７８１０，１７６８４、もしくは１７７１２ダルトン
に近接する明白な分子量を有するタンパク質の明白な分子量の決定に正確さを増
すことが可能である。断片が使用される場合は、断片の分子量の範囲にわたる分
子量の決定に正確さを増す。

【００９０】 最後に、本発明に含まれるキットに関しては、このようなキットの構成要素は
様々であり得るが、典型的には、ポリペプチド及び断片化ペプチド分子量マーカ
ーを含む。また、このようなキットは、断片化に必要な部位が除去されたポリペ
プチドを含み得る。さらに、キットは、ポリペプチド及び試料タンパク質の化学
的もしくは酵素的分解による特異的分解のための試薬を含み得る。キットは、さ
らに、本発明のポリペプチドもしくはその断片に対して方向付けられた抗体を含
み得る。

【００９１】 センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド 本発明の更に別の態様においては、標的ｍＲＮＡ配列に結合できる（２重構造
を形成する）または２本鎖ＤＮＡらせんの配列に結合できる（３重らせんを形成
する）、一本鎖核酸配列（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）から成るアンチセンスもしく
はセンスオリゴヌクレオチドが、本発明によって作成され得る。アンチセンスも
しくはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ｃＤＮＡコード領域の断
片を含む（配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号１２）。このような断片
は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０ヌ
クレオチドまでを含む。与えられたタンパク質のｃＤＮＡ配列に基いて、アンチ
センスもしくはセンスオリゴヌクレオチドを創ることができることは、例えば、
Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１
９８８ 及びｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ６：９５８，１９８８に開示されている。

【００９２】 標的核酸配列へのアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、
二重構造の分解促進、転写もしくは翻訳の早期終結、または他の方法を含む幾つ
かの方法の一つによって、翻訳（ＲＮＡ）もしくは転写（ＤＮＡ）をブロックす
る複合体の形成を生ずる。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発
明のポリペプチドの発現をブロックするために使用され得る。アンチセンスもし
くはセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖−ホスホジエステル骨格
（あるいはＷＯ９１／０６６２９に開示されているような他の糖連結）を有する
オリゴヌクレオチドを含み、このような糖連結はそこにおいて内因性ヌクレア−
ゼに抵抗性である。抵抗性糖連結を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで安定している（すなわち、酵素分解に抵抗できる）が、標的ヌク
レオチド配列に結合可能な配列特異性は保持している。センスもしくはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１０４４８に開示されたような
有機成分、および、ポリ−（Ｌ−リジン）のような、標的核酸配列に対するオリ
ゴヌクレオチドの親和性を増す他の成分に、共有結合するオリゴヌクレオチドを
含む。さらには、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスもしくはセンスオ
リゴヌクレオチドの結合特異性を修飾するために、センスもしくはアンチセンス
オリゴヌクレオチドに、エリプチシンのような介在試薬、及び、アルキル化剤ま
たは金属複合体を付着し得る。

【００９３】 アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄−媒
介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはＥｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒウィルスのような遺伝子導入ベクターの使用による方法を含む、い
ずれの遺伝子導入法によっても、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。アン
チセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適切なレトロウィ
ルスベクターへアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドを挿入した後、
挿入配列を含むレトロウィルスベクターと細胞をｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ
ｖｉｖｏで接触させることによって、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適
切なレトロウィルスベクターは、マウスのレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ，Ｎ２（
Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）、またはＤＣＴ５Ａ，ＤＣＴ５ＢおよびＤ
ＣＴ５Ｃと呼ばれるダブルコピーベクター（ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＵＳ９０／０２６５６参照）を含むが、これに限定されない。

【００９４】 あるいは、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０
４７５３に開示されるような、リガンド結合分子との結合体の形成によっても標
的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る。適切なリガンド結合分子は、細
胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、もしくは細胞表面受容体に結合す
る他のリガンドを含むがこれに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の
結合は、その相当分子もしくは受容体に結合するというリガンド結合分子の能力
とは実質上干渉せず、あるいは、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドまたはその結合型の細胞への進入をブロックしない。

【００９５】 更に別の態様では、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ
９０／１０４４８に開示されるようなオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成に
よって、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。センスもしくはアンチセンス
オリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞
内で解離される。

【００９６】 染色体マッピング さらに別の態様においては、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号１２の
すべてまたは一部分を表すオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ファミリーメンバー
、例えば、ＩＬ−１エプシロンのＤＮＡを含む、ヒト２番染色体及びその特異的
部位を同定する良く知られている技術を使用して、当業者によって使用され得る
。下記のように、配列番号５、配列番号７、及び、配列番号１２は、２番染色体
の長腕（２ｑ）に、放射線ハイブリッドマッピングによって、マッピングされた
。その領域は、非限定的に、緑内症、外胚葉異形成、インスリン依存性糖尿病、
ｗｒｉｎｋｌｙ皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンフォーマ、喘息、及び、脛筋ジ
ストロフィーを含む特定の疾患に関与する。このように、配列番号５、配列番号
７、配列番号１２もしくはこれらの配列の断片は、２番染色体に関する上記疾患
及び他の異常を研究するために良く知られている技術を使用して、当業者によっ
て使用され得る。これは、このマーカーが再構成されるまたは欠失される条件を
区別することを可能にするであろう。さらに、配列番号５、配列番号７、配列番
号１２、もしくは、その断片は、部位未知の他のヒト遺伝子をマッピングするた
めの部位マーカーとして使用され得る。

【００９７】 治療的及び研究的使用 本発明の別の態様は、ＩＬ−１エプシロンの治療的使用に関する。ＩＬ−１リ
ガンドは、感染防御並びに免疫及び炎症反応促進に中心的役割を果たし、細胞内
シグナル伝達、活性化血管内皮細胞及びリンパ球、炎症性サイトカインの誘導、
急性期タンパク質、造血、発熱、骨吸収、プロスタグランジン、メタロプロテイ
ネ−ス、及び接着分子を含む。既知のＩＬ−１ファミリーメンバーの数の持続的
増加に伴って、適切な分類体系は、機能（活性化及び調節性）並びにポリペプチ
ド構造を比較することに基くものである。このように、ＩＬ−１エプシロンは、
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１８のように、上記の機能の多くに含まれ
るようである。更に、ＩＬ−１エプシロンは、炎症反応促進に含まれるようであ
り、それゆえ、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、及び乾癬のような炎症性及び
／または自己免疫性疾患の原因並びに維持に不可欠に含まれている可能性がある
。このため、ＩＬ−１エプシロンのようなＩＬ−１ファミリーメンバーの発現及
び／または活性化の変更は、シグナル伝達の変化に基く細胞特異的反応、増殖、
及び炎症反応の、活性化あるいは阻害、を含むがこれに限定されない、多くの細
胞作用に十分な効果を有する可能性がある。

【００９８】 したがって、ＩＬ−１エプシロンは、感染を防御するような、並びに、免疫及
び炎症反応が不適切もしくは不応性の個体において、免疫及び炎症反応を生じさ
せるような、治療的使用を有する。例えば、ＩＬ−１エプシロンは、免疫系が抑
制されている個体の免疫系を刺激するのに使用され得る。同様に、ＩＬ−１エプ
シロンは炎症反応を促進するようであり、炎症性及び／または自己免疫性疾患の
原因並びに維持に含まれるので、ＩＬ−１エプシロンのアンタゴニストは、炎症
性及び／または自己免疫性疾患の阻止あるいは治療に有用である。

【００９９】 ＩＬ−１媒介細胞シグナリングは、しばしば分子活性化カスケードを含み、そ
の間、受容体は、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化する
ことによって、リガンドー受容体媒介シグナルを伝達し、結果として転写因子Ｎ
ＦκＢ並びにプロテインキナーゼＪｕｎ Ｎ末端キナーゼ及びｐ３８マップキナ
ーゼの活性化を生じる。これらの基質は、それら自身が、リン酸化に伴って活性
化されるキナーゼであり得る。或いは、それらはリン酸化に伴ってタンパク質−
タンパク質相互作用を通して下流のシグナリングを容易にするアダプター分子で
あり得る。

【０１００】 ＩＬ−１エプシロンは、アンタゴニストとして作用し、免疫及び炎症反応に阻
害効果を有する可能性がある。例えば、ＩＬ−１エプシロンは、単離されかつ精
製されたＩＬ−１ｒａの機能のような機能を有する可能性がある。本発明のＩＬ
−１エプシロンポリペプチドもしくはその断片は、シグナルを阻害し並びに炎症
性及び／または自己免疫性疾患を治療する治療薬として有用であり得る。しかし
ながら、下記実施例ＩＩＩに示されたデータに与えられたように、例えばＩＬ−
１αもしくはＩＬ―１８のように、ＩＬ−１エプシロンはよりアゴニストである
ようである。上記のように、このようなアゴニストは、自身の免疫系が不適切に
反応する個人の免疫及び炎症反応を促進するのに有用である。ＩＬ−１エプシロ
ン活性に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ）目的で、ＩＬ−１エプシロンの
阻害剤が、当該技術分野で知られている技術を使用して、企図されもしくは設計
されることが可能である。ＩＬ−１エプシロン阻害剤を含む、本発明のポリペプ
チドは、タンパク質を経静脈的に投与することによる、または、特定の細胞型を
標的としたモノクローナル抗体に結合させることによる、ような良く知られた方
法によって、細胞外環境に導入され、それによって、シグナリングに影響を与え
得る。

【０１０１】 治療薬として使用される場合、本発明のポリペプチドは、既知の方法によって
医薬組成物に処方され得る。ポリペプチドは、単一の活性物質としてもしくは他
の既知の活性物質と共に、医薬的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
酢酸塩、リン酸塩）、防腐剤（例えば、チメロサ―ル、ベンジルアルコール、パ
ラベン）、乳化剤、溶解剤、補強剤及び／または担体と混ぜ合わせて結合され得
る。適切な担体及びそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．１９８０，Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。更に、このような組成物は、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体をつくったり、ポリ酢酸
、グリコール酸、ヒドロゲル等のような多量体化合物に組み入れられたり、ある
いは、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層膜胞、赤
血球陰影または球状芽球に組み入れられたりした、ポリペプチドを含み得る。こ
のような組成物は、本発明のポリペプチドの物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ
ｖｉｖｏ放出割合、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス率に影響を与えるであろ
う。

【０１０２】 組成物の容量は、当業者によって容易に決定され得る。投与量及び投与回数は
、実験的に決定可能であり、治療される病気並びに治療される患者の年齢及び体
格も考慮に入れるだろう。

【０１０３】 治療は、経静脈的、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、鞘内、筋肉内、皮下
、局所的には、扁桃、鼻腔内、腟内、及び経口的投与を含む、当業者に良く知ら
れたいずれの方法による組成物の投与も含む。組成物は、特定の場所に筋肉内も
しくは皮下注射することによるように、局所的に与えられることも可能である。

【０１０４】 さらに、本発明のポリペプチドに対するＤＮＡ，ポリペプチド及び抗体は、様
々な研究プロトコールにおける試薬として使用され得る。このような研究プロト
コールのサンプルは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ． Ｖ
ｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示される。例えば、これらの試薬は、ＲＮＡもし
くはタンパク質の、細胞特異的または組織特異的発現のマーカーとして役立ち得
る。同様に、これらの試薬は、ＲＮＡもしくはポリペプチドの構成的及び一時的
発現を調べるのに使用され得る。上記のように、このＤＮＡは、ＤＮＡの染色体
上の位置を決定するため、及び、この染色体上の位置に関して遺伝子をマッピン
グするために使用され得る。このＤＮＡは、遺伝子疾患に関するリスクを同定す
るために、並びに、遺伝子フィンガープリンテイングのような技術を使用して遺
伝子の不均一性及び遺伝性を調べるためにも使用され得る。このＤＮＡは、更に
、この遺伝子に関連する付加的遺伝子を同定するために、及び、配列の比較に基
く進化の系図を確立するために使用され得る。このＤＮＡ及びポリペプチドは、
サザンブロッテイング及びイムノブロッテイングのような陽性スクリーニング手
法、並びに、サブトラクションのような陰性スクリーニング手法を通して、この
ＤＮＡもしくはポリペプチドに相同な遺伝子もしくはタンパク質を選択するため
に使用され得る。

【０１０５】 さらに、ＩＬ−１エプシロンは、リガンドであるため、少なくとも一つのタン
パク質、すなわち、その受容体との、タンパク質―タンパク質相互作用に参加す
る。そのため、本発明のポリペプチド及び断片は、（ａ）ポリペプチドが制御す
るタンパク質、及び、（ｂ）それが相互作用する可能性のあるタンパク質を同定
するための試薬として使用され得る。それゆえ、ＩＬ−１エプシロンリガンドも
しくはＩＬ−１エプシロンリガンドの成分を含むポリペプチドは、親和性マトリ
ックスに再構成タンパク質を結合することによって、または、十分確立された分
子生物学的技術に従って酵母２−ハイブリッド系でそれらを“えさ”として使用
することによって、本発明のポリペプチドと直接相互作用するタンパク質を同定
するために使用され得る。更に、本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチド及び
断片は、ＩＬ−１受容体及び／またはＩＬ−１エプシロン受容体をの発見をめざ
す研究に使用を見出す。例えば、ＩＬ−１エプシロンポリペプチド及び、ＩＬ−
１エプシロンポリペプチド断片は、受容体発現細胞を同定する結合研究に使用さ
れ得る。適切な結合研究は当該技術分野で知られており、当業者の知識内で十分
である。同様に、本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチド及びポリペプチド断
片は、発現クローニング技術を使用して、受容体のクローニングに更なる使用を
見出す。

【０１０６】 ポリペプチド及びその断片は、ＩＬ−１及びＩＬ−１Ｒ相同体もしくはファミ
リーメンバーによって使用されるシグナル経路の研究及び／またはそれらのシグ
ナル経路のブロッキングに、試薬として使用され得る。このような新しいＩＬ−
１受容体相同体は、シグナル伝達経路に含まれる新しい分子を同定し、細胞及び
組織発現を特徴づけ、発生、免疫、及び炎症反応におけるそれらの役割を理解し
、並びに、制御分子及び生理学的に適切なタンパク質基質を同定するために、試
薬として特異的に使用され得る。

【０１０７】 或いは、本発明のポリペプチドは、ポリ―ＨｉｓもしくはＦＬＡＧのような標
識とともに発現に先立って設計され、その後、発現され、それぞれ、ニッケルキ
レートクロマトグラフィーもしくはレジンに結合した抗ＦＬＡＧ抗体を使用して
精製され得る。一度レジンに結合すると、本発明のポリペプチドは、良く確立し
た技術を使用して、二価性クロスリンキング試薬を使用して共有結合的に付着さ
れ得るレジンに共有結合したポリペプチドは、その後、本発明のポリペプチドの
親和性を通して、細胞溶解産物もしくは細胞上清から分子を（様々な試薬の処理
を経て）精製するのに使用され得る。

【０１０８】 抗体 本発明の治療及び研究面の範囲内で、本発明のポリペプチド及びそのアミノ酸
配列に基づいたペプチドは、そのポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製す
るのに使用され得る。“抗体”という言葉は、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体、Ｆ（ａｂ’）₂，及びＦａｂ断片のような、その断片、並びに、あら
ゆる組換え産生結合パートナーを含むこととなっている。抗体は、もしそれらが
本発明のポリペプチドと約１０⁷Ｍ^-1より大きい又は同等のＫａで結合するなら
ば、特異的に結合していると定義される。結合パートナーもしくは抗体の親和性
は慣用技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）によって記載された方法を使用して
容易に決定され得る。

【０１０９】 ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ
、ウサギ、マウス、もしくはラットのように様々なものから、当該技術分野にお
いてよく知られている手法を使用して、容易に産生され得る。一般的には、本発
明の精製ポリペプチド、もしくは、適切に結合がなされた、本発明のポリペプチ
ドのアミノ酸配列に基くペプチドは、典型的には、非経口的注入によって宿主動
物に投与される。これらのポリペプチドの免疫原性はアジュバント、例えば、Ｆ
ｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全アジュバントの使用によって増強され得る。追
加免疫に続いて、血清の少量のサンプルが収集され、ポリペプチドに対する反応
性がテストされる。このような決定に有用な様々なアッセイの例は、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ
Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているもの、並びに、向流免疫電
気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡ），ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチ
アッセイのような手法を含む。米国特許第４，３７６，１１０号及び４，４８６
，５３０号参照。

【０１１０】 モノクローナル抗体は、良く知られている手法を使用して容易に作製され得る
。例えば、米国特許庁第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，
５４３，４３９号、及び、第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ
ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１
９８０に記載された手法参照。簡単に述べると、Ｂａｌｂ／ｃマウスのような宿
主動物は、本発明の単離及び精製ポリペプチドもしくは結合ポリペプチドを、任
意にアジュバントの存在下で、少なくとも一度、好ましくは約３週間間隔で少な
くとも２度腹腔内注入される。本発明の単離精製ポリペプチド１０μｇもしくは
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基くペプチドが、ＲＩＢＩアジュバント
（ＲＩＢＩＣｏｒｐ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）の存在下に注入さ
れる。その後、どの動物が最高レベルの抗体を産生するのか、及び、どれの脾臓
細胞が融合の最高の候補であるのかを決定するために、慣用的ドットブロット法
もしくは抗体捕捉法（ＡＢＣ）によって、マウス血清がアッセイをされる。ほぼ
２−３週間後、マウスは、無菌的ＰＢＳに浮遊された３μｇのようなポリペプチ
ドもしくは結合ポリペプチドの静脈内追加免疫を与えられる。マウスは後に殺さ
れて、脾臓細胞が、確立されたプロトコールに従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣ
Ｃ）のような、商業的に利用可能なミエローマ細胞と融合される。簡単に述べる
と、ミエローマ細胞は、媒質の中で数回洗われ、一つのミエローマ細胞に約３個
の脾臓細胞の割合で、マウスの脾臓細胞に融合される。融合試薬は、例えば、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ），もしくは、より好ましくは、５０％ＰＥＧ：
１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）のような当該技術分野において使用されるいかな
る適切な試薬でも可能である。融合体は、ＨＡＴ補足ＤＭＥＭミデイウムのよう
な、適切なミデイウムを含む、例えば２０個の９６穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ）に平板培養され、８日間増殖させられる。生じたハイブリドーマからの上
清が収集され、例えば、最初にヤギ抗マウスＩｇでコートされた９６穴プレート
に６０分間加えられる。洗浄に続いて、本発明の１２５Ｉ―ポリペプチドもしく
はペプチドは、それぞれのウェルに加えられ、室温で６０分間インキュベートさ
れ、４回洗われた。陽性のウェルはその後Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ Ｓ ｆｉ
ｌｍを使用して−７０℃でオートラジオグラフィ−を行なうような、慣用法で検
出され得る。陽性クローンは、巨大培地で増殖し得て、上清がその後Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通すような方法で精製される。多く
の技術が、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドに対する抗体の産生に使用
され得ること、及び、この態様が本発明の範囲を決して限定することはないこと
は、当然理解される。

【０１１１】 本発明のモノクローナル抗体は、本明細書に参考文献として援用される、Ａｌ
ｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｂｉｄ Ａｌｔｅｒ
ｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ３：１−９（１９９０）に記載されるよう
な別の技術を使用しても産生され得る。同様に、結合パートナーは、特異的結合
抗体をコードする遺伝子の可変部位を組み入れる組換えＤＮＡ技術を使用して、
構成され得る。このような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：３９４（１９８９）に記載されている。

【０１１２】 他の型の“抗体”は、当該技術分野の知識の状態に関連して、本明細書に提供
された情報を使用して産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドに特異的に
結合できるヒト抗体の要素を含むように設計された抗体も、本発明の範囲に含ま
れる。

【０１１３】 一度単離かつ精製されると、本発明のポリペプチドに対する抗体は、確立され
たアッセイプロトコールを使用して、資料中のポリペプチドの存在を検出するの
に使用され得る。更に、本発明の抗体は、治療的にあるいは研究目的で、ポリペ
プチドに結合してその活性をｉｎ ｖｉｖｏ もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害
するように使用され得る。

【０１１４】 本発明のポリペプチドと免疫反応性のある抗体、及び、特に、これらのポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体は、本発明によって今や使用可能になる。こ
のような抗体は、ポリペプチド活性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害するために、及び、
資料中の本発明のポリペプチドの存在を検出するために有用であり得る。

【０１１５】 別の態様においては、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドに対して生成
される抗体は、試料タンパク質の明白な分子量及び等電点を決定するためにこれ
らの分子量マーカーの使用において正確さを増すように、本発明のポリペプチド
もしくは断片化ペプチド分子量マーカーと共同して使用され得る。本発明のポリ
ペプチドもしくは断片化ペプチド分子量マーカーは、モル過剰量の試料タンパク
質と混合され、混合物は慣用的方法によって２次元電気泳動によって分解され得
る。ポリペプチドは、慣用法によって、ニトロセルロースのような適切なタンパ
ク質結合膜にトランスファーされ、本発明の抗体によって検出され得る。

【０１１６】 薬剤の発見 本発明による精製ポリペプチドは、、このようなポリペプチドの阻害剤の発見
を容易にするであろう。本発明の精製ポリペプチドの、その潜在的阻害剤のスク
リーニングにおける使用は重要であり、不純物との干渉反応の可能性を消失もし
くは減少させ得る。

【０１１７】 更に、本発明のポリペプチドは、ポリペプチド阻害剤の、構造に基く設計に使
用され得る。このような構造に基く設計は、“合理的薬剤設計”としても知られ
ている。ポリペプチドは、例えば、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴もしくは相同性モデ
リングのような、いずれも良く知られた方法によって、３次元的に解析され得る
。阻害剤の設計及び阻害剤―ポリペプチド相互作用を助けるために、ポリペプチ
ドの構造の情報を分子モデリングソフトウェアシステムに使用することも、本発
明の範囲に含まれる。このようなコンピューター援助モデリング及び薬剤設計は
、化学構造解析、分子の静電位、タンパク質折りたたみ構造等のような情報を使
用し得る。例えば、メタロプロテイネ−スのクラス特異的阻害剤の設計の多くは
、触媒亜鉛原子をキレートするあるいは結合する試みに集中した。合成阻害剤は
、特定のプロテアーゼの特異的ポケットに合うように設計された一連の他の群に
付着するように、負に荷電された成分を含むようにたいてい設計されている。本
発明の特別な方法は、基質の想定される結合部位として本発明のポリペプチドの
３次元構造を解析し、予想される反応部位を組み込んだ新しい分子を合成し、及
び、上記の新しい分子をアッセイすることを含む。

【０１１８】 下記の実施例は、本発明のより十分な理解を促進するために提供される。しか
しながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例Ｉ 新しいヒトＩＬ−１リガンドの単離及び同定 我々は、マウスＩＬ−１エプシロンの全コード配列に相当する³²Ｐ−標識１本
鎖ＤＮＡプローブの混合物を使用して、ヒトゲノムファージライブラリー（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ ＃９４６２０５）をスクリーニングした。
低ストリンジェンシーの洗浄（低ストリンジェンシーの洗浄というのは、０．２
Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，室温、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．２，ｐ．１０．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９
６）で定義されている）の後、強度のハイブリダイゼーションシグナルを有する
陽性クローンが同定された。このクローン由来でサザン解析に供されたＤＮＡは
、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローンされシークエンスされた５．５ｋｂＳ
ａｌＩ−Ａｓｐ７１８制限断片を同定した。ＵＷＧＣＧコンピュータープログラ
ム“ベストフィット”を使用した５．５ｋｂ断片の相同性解析は、クローン内の
２１２ｂｐ領域が、マウスＩＬ−１エプシロンの３プライムエクソンにヌクレオ
チドレベルで７４％類似していることを見出した。図３に示したように、この２
１２ｂｐ配列は、マウスＩＬ−１エプシロンの３プライムエクソンに６６％の類
似性（６４％の同一性）を有する７０アミノ酸のオープンリーディングフレーム
を含む。

【０１１９】 ヒトＩＬ−１エプシロン部位周囲のゲノム配列は、製造者の指示書に従ってＧ
ｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから利用可）を使用
して５‘方向に更に５ｋｂ広げられた。この上流領域の配列の解析は、更に３つ
の推定上のエクソンを明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲが、４つの異なるヒト組織（
胸腺、扁桃、並びに細胞株ＨＬ−６０及びＴＨＰ−１）由来のＲＮＡに、これら
のエクソンの発現及び単一のＩＬ−１エプシロンｃＤＮＡへのそれらの連結を確
認するために使用された。更に、ｃＤＮＡクローンが、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｒｒａｙ Ｉ
から得られ、これも３つの３’の大部分のエクソンの結合を示した。Ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｒｒａｙ ＩからのｃＤ
ＮＡクローンは、オープンリーディングフレームの５’末端には広がらない特別
なクローンであった。全長ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡ配列は、配列番号７及
び配列番号１２に開示される。配列番号７及び配列番号１２によってコードされ
るポリペプチドは、順に、配列番号８及び配列番号１３に開示される。図４に示
すように、配列番号８及び配列番号１３のアミノ酸５１−１５９はマウスＩＬ−
１エプシロン（長型）と５３％の類似性（４９％の同一性）を共有する。

【０１２０】 実施例ＩＩ 放射性ハイブリッドマッピングによるヒトＩＬ−１エプシロンの染色体マッピ
ング ＰＣＲは、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４ ｐａｎ
ｅｌ ｏｆ ９３ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
／ｈｕｍａｎ−ＳＴＳ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎ
ｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）を使用して実施された。プライマーは、推定上ヒ
トＩＬ−１エプシロン３プライムエクソンの中にあるもので、かつ、ヒトゲノム
ＤＮＡからの１９５ｂｐ産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しな
いものが使用された。ＰＣＲの結果は、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）上 Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ Ｒａｄｉ
ａｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｓｉｔｅに提示されたデータベクターに変換され
た。データは、計算され、放射線ハイブリッドマップ上の既知のＳｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ｔａｇ Ｓｉｔｅ（ＳＴＳ）に関係のある染色体割り当て及び配置が提供さ
れた。その結果によると、ヒトＩＬ−１エプシロンは２番染色体上の、ＳＴＳ
Ｄ２Ｓ１２１から１１．５４ｃＲ及びマーカーＣＨＬＣ．ＧＡＡＴ１１Ｃ０３か
ら４．３ｃＲの部位にある。下記のｗｅｂ ｓｉｔｅは、放射線ハイブリッドマ
ッピングについて更なる情報を提供する：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ
．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ−Ｓ
ＴＳ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ． 実施例ＩＩＩ ヒトＩＬ−１エプシロンによるヒト細胞におけるシグナリング分子の活性化 ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び他の炎症性サイトカインによって活性化されるの
と同様の、ストレス反応に含まれるシグナリング分子の幾つかを、ＩＬ−１エプ
シロンが活性化できるのか否かを決定するために遂行されたテストと結果を、以
下に述べる。

【０１２１】 ヒトＩＬ−１エプシロンは、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトされた。トラ
ンスフェクションの数日後、馴化培地（一時的に発現されたＩＬ−１エプシロン
を含む）が収穫された。テスト細胞は、この馴化培地、もしくは、替わりに、空
の発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの馴化培地でインキ
ュベートされた。インキュベーションして約１０分後、細胞抽出物がテスト細胞
から作製されて、活性化されたシグナル分子の存在が、ＩＫＢα（Ｓｅｒ３２で
リン酸化）、ｐ３８ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ１８０及びＴｈｒ１８２でリ
ン酸化）、及びＳｔｒｅｓｓ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａ
ｓｅ（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５でリン酸化）のリン酸
化型に特異的な抗体の使用によってアッセイされた（抗体は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから得られた）。これらのシグ
ナル伝達分子は、ＵＶ照射、エンドトキシン、及びＩＬ−１βを含む炎症性サイ
トカインのような刺激に対する広範囲の細胞反応に含まれることが知られている
。対照馴化培地に比較して、ＩＬ−１エプシロンを含む馴化培地は、Ｈｕｍａｎ
Ｆｏｒｅｓｋｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ及びＨｕｍａｎ Ｕｍｂｅｌｉｃ
ａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
７３０）を含む多数のヒト細胞株においてＩＫＢα及びｐ３８ＭＡＰ ｋｉｎａ
ｓｅのリン酸化を活性化した。非ホジキンリンホーマ細胞株Ｋ２９９において、
ヒトＩＬ−１エプシロンは、ＪＮＫ／ＳＡＰＫリン酸化を特異的に活性化した。
これらの結果はＩＬ−１エプシロンが、ストレス反応シグナリング経路に含まれ
ることを示す。

【０１２２】 実施例ＩＶ ヒトＩＬ−１エプシロンの組織分布 ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡの組織分布は、１本鎖ｃＤＮＡ鋳型のパネル
からＰＣＲ増幅を使用して調べられた。具体的には、エクソン２に前向きプライ
マー、及び、エクソン４に後向きプライマーを使用して、共同して、ＩＬ−１エ
プシロンの４５０塩基対断片を増幅させて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ Ｐａｎ
ｅｌをスクリーニングした。ＰＣＲ反応は、６０℃のアニーリング温度で３５サ
イクル施行された。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドを使用してアガロース
ゲル上に検出された。

【０１２３】 ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡは、脾臓、リンパ節、胸腺、扁桃、及び白血
球組織に検出された。ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡの最高レベルを有する組
織は、扁桃である。

【０１２４】 実施例Ｖ ヒトＩＬ−１エプシロンによるヒト細胞におけるＩＣＡＭ−１レベルの活性化
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び他の炎症性サイトカインによって活性化されるの と同様の、ストレス反応に含まれる細胞表面分子の幾つかを、ＩＬ−１エプシロ
ンが活性化できるのか否かを決定するために遂行されたテスト及び結果を、以下
に記載する。

【０１２５】 ヒトＩＬ−１エプシロンがＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトされた。トラン
スフェクション数日後、馴化培地（一時的に発現したＩＬ−１エプシロンを含む
）が収穫された。ヒト包皮ファイブロブラスト（ＨＦＦ）細胞は、新鮮０．５％
血清含有培地で１：１に希釈されたこの馴化培地で、あるいは、替わりに、新鮮
０．５％血清含有培地で１：１に希釈された、空の発現ベクターでトランスフェ
クトされた対照ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地で、３７℃１８時間インキュベー
トされた。

【０１２６】 ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地を用いた処理に続いて、ＨＦＦ細胞は、ＰＢＳ
で２回洗われ、ｖｅｒｓｅｎｅ（非トリプシン試薬）で組織培養容器から除去さ
れた。細胞表面ＩＣＡＭ−１レベルは、氷上で１時間、抗ＣＤ５４−ＰＥ抗体（
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色して測定され、引き
続き、洗浄され、ＦＡＣＳに基いて検出された。

【０１２７】 対照ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地でインキュベートされたＨＦＦ細胞は、未
処理細胞に比して、ＩＣＡＭレベルにわずかな上昇を示した。一方、ＩＬ−１エ
プシロンを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地で処理
されたＨＦＦ細胞は、細胞表面ＩＣＡＭ−１レベルにおいて２倍の上昇を示した
。ＩＬ−１エプシロン処理ＨＦＦ細胞上に見られたＩＣＡＭ−１染色のレベルは
、精製ＩＬ−１βによって同細胞上に誘発されたものと同等であった。

【０１２８】 本明細書は、本明細書に参考文献として援用されている、本明細書に引用され
た参考文献の教示を考慮すると、非常に良く理解される。本明細書の中の態様は
、本発明の態様の実例を提供するものであって、本発明の範囲を制限するものと
解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が、請求された本発明に含
まれることを認識している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明のヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡのヌクレオチド
配列、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２である。

【図２】 図２は、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２のヌ
クレオチド配列によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列、各々、配
列番号：６、配列番号：８および配列番号：１３、である。

【図３】 図３は、ヒトＩＬ−１エプシロンおよびマウスＩＬ−１エプシロ
ン（長型）の３’エキソン間のアミノ酸相同性を示している。

【図４】 図４は、ヒトＩＬ−１エプシロン（アミノ酸５１−１５９）およ
びマウスＩＬ−１エプシロン（長型）間のアミノ酸相同性を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/545 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/545 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｐ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０９９，９７４ (32)優先日 平成10年９月11日(1998．9．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA26 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QQ03 QQ42 QQ53 QR55 QS34 4B064 AG04 AG27 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA08 BA20 BA22 BA23 CA53 DA13 NA14 ZB072 ZB092 ZB112 ZC422 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA03 EA22 EA50 FA72 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のＤＮＡ配列； （ｂ）配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３の配列を含むアミノ
   酸配列をコードする単離された核酸分子； （ｃ）６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を伴う、５０％ホ
   ルムアミドおよび６ＸＳＳＣ、４２℃での中程度のストリンジェンシー条件下、
   （ａ）または（ｂ）の核酸配列を含む変性された、二本鎖ＤＮＡのどちらかの鎖
   へハイブリダイズする単離された核酸分子； （ｄ）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２からインビトロ突然
   変異誘発により誘導される単離された核酸分子； （ｅ）遺伝子コード結果として配列番号：５、配列番号：７または配列番号：
   １２と縮重される単離された核酸分子；および （ｆ）ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡ、ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの対立
   遺伝子変異体、およびＩＬ−１エプシロンＤＮＡの種相同体から成る群より選択
   される単離された核酸分子； から成る群より選択される単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 請求項１の核酸分子の発現を指示する組換え体ベクター。
3. 【請求項３】 請求項１の核酸分子によりコードされている単離されたポリ
   ペプチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリペプチド、および生理学的に受容可能な希釈
   剤、添加剤または担体を含む組成物。
5. 【請求項５】 非グリコシル化形の請求項３の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリペプチドへ結合する抗体。
7. 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。
8. 【請求項８】 配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のアミノ
   酸配列を含む単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３に示され
   たアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたＩ
   Ｌ−１エプシロンポリペプチド。
10. 【請求項１０】 該ポリペプチドが配列番号：６、配列番号：８または配列
    番号：１３に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列
    を含む、請求項９のＩＬ−１エプシロンポリペプチド。
11. 【請求項１１】 該ポリペプチドが配列番号：６、配列番号：８または配列
    番号：１３に示されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
    を含む、請求項９に記載ののＩＬ−１エプシロンポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項２のベクターでトランスフェクトまたは形質導入さ
    れた宿主細胞。
13. 【請求項１３】 発現を促進させる条件下で請求項２の宿主細胞を培養し、
    そして培養培地からポリペプチドを回収することを含む、ＩＬ−１エプシロンポ
    リペプチドを産生するための方法。
14. 【請求項１４】 宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細
    胞から成る群より選択される請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 試料タンパク質の分子量決定のための方法であって、試料
    タンパク質の分子量と請求項８のポリペプチドの分子量を比較することを含む； ここで分子量の比較は、試料タンパク質およびポリペプチドのアクリルアミド
    ゲルへの注入、電流を使用した試料タンパク質およびポリペプチドの分割、およ
    び試料タンパク質およびポリペプチドを染色する検出試薬のゲルへの添加を含む
    、 前記方法。
16. 【請求項１６】 試料タンパク質のペプチド断片の分子量決定のためのキッ
    トであって、以下の： 容器； 請求項８のポリペプチド； アスパラギニルエンドペプチダーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、アクロ
    ムボバクタープロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ、
    エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮおよびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから成
    る群より選択される少なくとも一つの酵素； インビトロ突然変異誘発による、該ポリペプチドからの突然変異したポリペプ
    チド、ここで選択された酵素による酵素的切断部位は除去されている；並びに 選択された酵素による酵素的切断により該ポリペプチドから誘導される断片化
    ペプチド； ここで該ポリペプチドおよび該試料タンパク質を選択されたプロテアーゼと接
    触させ；およびここでタンパク質、ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、タン
    パク質、ポリペプチドおよび断片化ペプチドのアクリルアミドゲルへの注入、電
    流を用いたタンパク質、ポリペプチドおよび断片化ペプチドの分割、タンパク質
    、ポリペプチドおよび断片化ペプチドを染色する検出試薬のゲルへの添加により
    可視化される を含む、前記キット。
17. 【請求項１７】 患者にＩＬ−１エプシロンのアンタゴニストを投与するこ
    とを含む、患者の炎症性または自己免疫疾患を治療する方法。
18. 【請求項１８】 ＩＬ−１エプシロンのアンタゴニストが請求項６の抗体で
    ある、請求項１８に記載の方法。
19. 【請求項１９】 免疫抑制された患者に請求項３のポリペプチドを投与する
    ことを含む、免疫抑制された患者の免疫系を刺激する方法。
20. 【請求項２０】 免疫抑制された患者に請求項４の組成物を投与することを
    含む、免疫抑制された患者の免疫系を刺激する方法。