JPH07165795A - ヒト・インターロイキン−２受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ＩＬ−２受容体の蛋白質としての性状やその構
造遺伝子について解明する。 【構成】ヒトＩＬ−２受容体を遺伝子組み換え技術によ
り製造した。 【効果】本発明で得られたＩＬ−２受容体はＴａｃ抗原
とほぼ同様の性質を有するため、例えば該受容体を基質
として用い。また該受容体により製造される抗ＩＬ−２
受容体抗体を用いて、細胞に発現するＩＬ−２受容体数
を検出することにより白血病や免疫不全症の診断を行う
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子組み換え技術で得
られたヒト・インターロイキン−２受容体およびその製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−２（以下ＩＬ−２と
略称することがある）は、Ｔ細胞をインビトロでその機
能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持を可能にす
るほかに、胸腺細胞のマイトージェン反応を促進させた
り、ヌードマウス脾細胞のＴ細胞依存性抗原に対する抗
体産生能を回復させたり、キラー細胞の分化増殖を促進
する作用を有することが知られている（ザ・ジャーナル
・オブ・イムノロジー，第１２３巻，２９２８−２９２
９頁，１９７９年；イムノロジカル・レビュー，第５１
巻，２５７−２７８頁、１９８０年）が、これら全ての
作用には、ＩＬ−２と細胞表面に存在するＩＬ−２受容
体との相互作用が不可欠である（ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディスン，第１５４巻，１４５５
−１４７４頁，１９８１年；同誌，第１５８巻，１８９
５−１９１１頁，１９８３年；プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス，第８０
巻，６９５７−６９６１頁，１９８３年）。最近、ヒト
Ｔ細胞白血病患者血液から樹立したＩＬ−２依存性細胞
株をマウスに免疫して得られた抗Ｔａｃモノクローナル
抗体〔ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー，第１２６
巻，１３９３頁（１９８１年）〕がＩＬ−２受容体を認
識していることが示唆されたことから、抗Ｔａｃ抗体を
用いてのＩＬ−２受容体の生化学的解析が急速に進んだ
〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディス
ン，第１５８巻，１３３２頁（１９８３年）；ネイチャ
ー，第３００巻，２６７頁（１９８２年）；プロシージ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス，第８０巻，６９５７頁（１９８３年）〕。抗
Ｔａｃ抗体とＴａｃ抗原との結合部位がＩＬ−２とＩＬ
−２受容体との結合部位と同一であるか否かに関しては
疑問が残されているものの、Ｔａｃ抗原とＩＬ−２受容
体がその性状において大部分が共通することは明らかと
なった。このようなＩＬ−２とＩＬ−２受容体との相互
作用を利用してこれまでにＴ細胞やナチュラルキラー細
胞のクローン化に成功している（たとえばネイチャー，
第２６８巻，１５４−１５６頁，１９７７年；ザ・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー，第１３０巻，９８１−９
８７頁，１９８３年）。また、Ｔ細胞の白血病化とＴａ
ｃ抗原の異常発現との間に関係のあることが示唆されて
おり（ブラッド，第６２巻，５０９−５１０頁，１９８
３年）、一方、正常細胞においては抗Ｔａｃ抗体による
ＩＬ−２受容体数の減少がみられるのに対し、白血病細
胞では抗Ｔａｃ抗体によるＩＬ−２受容体数の減少がみ
られない（ダウン・レギュレーションの欠除）ことがわ
かっている（ザ・ジャーナル・オブ・ブラッド，第６１
巻，１０１４−１０１６頁，１９８３年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記したとおり、細胞
において重要な役割をなすＩＬ−２受容体であるが、Ｉ
Ｌ−２受容体の蛋白質としての性状やその構造遺伝子に
ついては実体が不明で、またＩＬ−２受容体を遺伝子組
み換え技術によって製造したとの報告はない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＩＬ
−２受容体のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝
子について研究を行い、はじめてその遺伝子をクローニ
ングすると共にＩＬ−２受容体のポリペプチドの遺伝子
組み換え技術による製造法を確立し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明はインターロイキン−２受容体活
性を有するポリペプチドをコードする新規な組み換えＤ
ＮＡを用いた遺伝子組み換え技術で得られたインターロ
イキン−２受容体およびこれらの製造法を提供するもの
である。上記ＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードす
る遺伝子については、例えば図２における１番目から２
５２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード
する遺伝子が挙げられ、とりわけ図２における１番目か
ら２５２番目のコドンで示される塩基配列からなる遺伝
子が好ましい。上記遺伝子はその５'末端にＡＴＧまた
は図２における−２１番目から−１番目のコドンからな
るシグナルペプチドをコードする塩基配列を有していて
もよい。また該遺伝子の３'末端には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
く、とりわけＴＡＧが好ましい。上記遺伝子はその上流
にプロモーターを有しているのが好ましく、該プロモー
ターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。たとえば動
物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−７，チャイニーズハムス
ター細胞ＣＨＯなど）における発現に適したＳＶ４０由
来のプロモーター，レトロウィルスのプロモーターなど
が挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好
ましい。

【０００５】本発明のＩＬ−２受容体のポリペプチドを
コードする遺伝子を含有する組み換えＤＮＡは例えば、
(イ)インターロイキン−２受容体を産生する細胞を培養
し、（ロ）培養物からインターロイキン−２受容体のポ
リペプチドをコードする伝令ＲＮＡを分離し、（ハ）該
伝令ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成
し、（ニ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、
（ホ）該プラスミドを完全二重鎖プラスミドに変換し、
（ヘ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、（ト）得られた形質転換体を培養後、形質転換体か
ら目的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、
（チ）所望により、そのプラスミドから目的とするクロ
ーン化ＤＮＡを切り出し、（リ）所望により、該クロー
ン化ＤＮＡをビークル中のプロモーターの下流に連結す
ることにより製造することができる。

【０００６】ＩＬ−２受容体をコードするｍＲＮＡとし
ては通常ヒトＴ細胞、例えばＭＴ−１細胞（ガン，第７
１巻，１５５−１５６頁，１９８０年）よりポリＡＲＮ
Ａを調製し、これを鋳型として、逆転写酵素を用い自体
公知の方法でｃＤＮＡ鎖を合成し、プラスミドに組込ん
だ後、ｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡへ変換する（モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー，第２巻，１６１
−１７０頁，１９８２年）。一方、例えば５×１０⁹個
のＭＴ−１細胞をＮＰ−４０を含む緩衝液中で可溶化
し、抗Ｔａｃ抗体またはＩＬ−２を担体に結合し、その
カラムを使ってＩＬ−２受容体を精製する。これを自体
公知の方法に従い自動アミノ酸シークエンサーで解析し
（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー，第２５６巻，７９９０−７９９７頁，１９８１
年）、Ｎ末端のアミノ酸配列を２０個程度決定する。こ
の一部のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオタイドを化学合成した後、³²Ｐでラベルしてプ
ローブとなし、自体公知の方法でコロニー・ハイブリダ
イゼーション法（ジーン，第１０巻，６３−６７頁，１
９８０年）により、アンピシリン耐性のトランスフォー
マントの中から求めるクローンを選出する。上記クロー
ン化されたＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードする
遺伝子（ＤＮＡ）を有するプラスミドはそのまま、また
は所望により制限酵素で切り出すことができる。さらに
上記遺伝子は、化学合成により製造することもできる。
またクローン化された遺伝子は前記した発現に適したビ
ークル中のプロモータの下流に連結することもできる。
なお本発明のＤＮＡは、たとえば大腸菌（２９４、ＤＨ
１、ＨＢ１０１など）を形質転換してその増殖、保存を
なすこともできる。本発明の遺伝子組み換え技術によっ
て得られたＩＬ−２受容体として、例えば図２における
１番目から２５２番目のアミノ酸配列で示されるポリペ
プチドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポリ
ペプチドはそのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい。該
ポリペプチドは糖鎖を有する糖蛋白質であることが好ま
しい。

【０００７】本発明のＩＬ−２受容体は、例えばＩＬ−
２受容体のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
組み換えＤＮＡを有する動物細胞を培養し、培養物中に
ＩＬ−２受容体を生成、蓄積せしめることにより製造す
ることができる。上記した組み換えＤＮＡを有する動物
細胞は、例えば該ＤＮＡで、適当な動物細胞、好ましく
はＣＯＳ−７、マウスＬ細胞、ヒトＢ細胞、ヒトＦＬ細
胞などの哺乳動物の細胞株を遺伝子感染（ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｉｏｎ）することにより製造することができる。
本発明のＤＮＡを有する動物細胞は、形質転換体として
製造することもできる。動物細胞の培養は、自体公知の
動物細胞用培地、例えば５〜２０％の胎児牛血清を含む
ＤＭＥＭ培地中、３０〜４０℃で１５〜６０時間行う。
かくして生成するＩＬ−２受容体のＩＬ−２との結合能
は、ＩＬ−２を用いた蛍光抗体法（ザ・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー，第１２６巻，１３９３−１３９７
頁，１９８１年）あるいはアイソトープで標識したＩＬ
−２との結合能などにより測定することができる。

【０００８】上記培養物からＩＬ−２受容体を分離精製
するには、例えば下記の方法により行うことができる。
すなわち培養細胞を遠心分離法で集めたあと界面活性剤
（たとえばＮＰ−４０，トライトンＸ−１００，ツゥイ
ーン−２０またはＳＤＳ）を含有する緩衝液や低張また
は高張の緩衝液を用いたり、超音波処理や酵素処理など
によってＩＬ−２受容体を含む細胞表面タンパクを可溶
化する。可溶化する前に放射性化合物（たとえばＮａ
¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃ−標識アミノ酸，¹⁴Ｃ−標識炭水化物，³Ｈ
−標識アミノ酸，³Ｈ−標識炭水化物，³⁵Ｓ−標識アミ
ノ酸など）を用いて予めＩＬ−２受容体をアイソトープ
標識しておいてもよい。このようにして得られるＩＬ−
２受容体を含む粗可溶化液をあらかじめ種々のタンパク
を固定化した水不溶性担体で処理して、最終標品に僅か
に混入してくる不純物質をできるだけ除去しておく。こ
の目的で用いられるタンパクとしてはウシ血清アルブミ
ン、ヒト免疫グロブリン、マウス免疫グロブリンなどが
挙げられ、通常はこれらのタンパクを固定化した架橋ア
ガロースなどをつめたカラムに上記粗可溶化液を通過さ
せてその通過液を採取することで不純物質の除去が可能
である。このようにして得られたＩＬ−２受容体を含む
溶液を、次いで非グリコシル化ＩＬ−２と水不溶性担体
を共有結合せしめた固定化ＩＬ−２〔本発明者らの一部
が発明し同日付で発明の名称「固定化インターロイキン
−２」として特許出願〕を充填したアフィニティーカラ
ムを通してＩＬ−２受容体を吸着させる。カラムを界面
活性剤（たとえばＮＰ−４０、トライトンＸ−１００、
ツゥイーン−２０またはＳＤＳ）および高濃度（０．１
〜１．０Ｍ）塩類（ＮａＣｌなど）を含む緩衝液（たと
えばトリス−塩酸緩衝液）で充分に洗浄したあと、酢酸
緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて洗浄し、次いでＩＬ−２
レセプターとＩＬ−２との結合を破壊する条件〔たとえ
ばクエン酸緩衝液（ｐＨ２．０），３Ｍ ＮａＳＣＮな
ど〕下にＩＬ−２レセプターを溶出させ、必要により溶
媒を留去することによりＩＬ−２受容体を製造すること
ができる。

【０００９】

【作用】本発明により得られるＩＬ−２受容体は、公知
の天然型ヒトＩＬ−２受容体やＴａｃ抗原と実質的に同
様の活性を有する。ここでヒトＩＬ−２受容体やＴａｃ
抗原と実質的に同様の活性とは、例えば以下の生物学的
および免疫学的活性をいう。すなわち、ＩＬ−２を結合
することにより正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞を
その機能を保持させたまま増殖させる活性を有する。し
たがって、本来ＩＬ−２受容体を有さない各種動物細胞
（Ｂ細胞など）を、本発明で用いられているＤＮＡで遺
伝子感染または形質転換してＩＬ−２受容体を産生せし
めることができるので、Ｔ細胞と同様に、これら細胞を
ＩＬ−２含有培地中で培養することにより、インビトロ
で長期にわたり増殖、継代したり、株化したり、クロー
ン化することができる。 上記ＤＮＡを用いて増殖等が
可能となった上記動物細胞を大量に培養することによ
り、これら細胞が本来産生する各種有用物質を大量に取
得することができる。また前記したとおりＴ細胞の白血
病化とＴａｃ抗原の異常発現との間に関係のあることが
知られているが、本発明のＩＬ−２受容体はＴａｃ抗原
とほぼ同様の性質を有するため、例えば該受容体を基質
として用い。また該受容体により製造される抗ＩＬ−２
受容体抗体を用いて、細胞に発現するＩＬ−２受容体数
を検出することにより白血病や免疫不全症の診断を行う
ことができる。

【００１０】本願明細書および図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＮｏｍｅｎｅｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：伝令リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン

【００１１】

【発明の効果】本発明で用いられているＩＬ−２受容体
のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組み換え
ＤＮＡは、これを本来ＩＬ−２受容体を有さない各種動
物細胞に導入することにより該細胞にＩＬ−２受容体を
産生させることができるため、Ｔ細胞などと同様にこれ
ら細胞の増殖、株化等が可能となり、それ故これらの細
胞が産生する各種有用物質を大量に取得することができ
る。また、本発明のＩＬ−２受容体またはこれにより製
造される抗ＩＬ−２受容体抗体は、細胞の白血病化にお
いて異常発現するＩＬ−２受容体を検出することがで
き、白血病や免疫不全症の診断薬として用いることがで
きる。

【００１２】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお参考例の（vii)に開示した形質転換体
エシェリヒア コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌ
ｉ）ＨＢ１０１／Ｔａｃ−２（ＩＦＯ−１４３６４）
は、昭和５９年８月２１日から通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−７７９６として寄託されている。

【００１３】参考例 ＩＬ−２受容体遺伝子含有ＤＮＡ
の製造 (ｉ)ＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａの製造 ヒトＴ細胞白血病細胞であるＭＴ−１をＲＰＭＩ１６４
０培地（１０％の牛胎児血清を含む）中、３７℃で培養
した。この培養した細胞１×１０⁹個を５Ｍグアニジン
チオシアネート、５％メルカプトエタノール、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４％にな
るように加え、均質化した混合物を５．７Ｍ塩化セシウ
ム溶液（５．７Ｍ塩化セシウム，０．１Ｍ ＥＤＴＡ）
６ｍｌ上に重層し、ベックマンＳＷ２８のローターを用
いて１５℃で２４０００ｒｐｍ４８時間遠心処理を行
い、ＲＮＡ沈澱を得た。このＲＮＡ沈澱を０．２５％Ｎ
−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後
でエタノールで沈澱させ、１０ｍｇのＲＮＡを得た。こ
のＲＮＡを高塩溶液〔０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．
３％ ＳＤＳ〕中でオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに
吸着させ、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．３％ ＳＤＳ）で溶出させることにより、ポリ
（Ａ）を含むｍＲＮＡ３０μｇを分取した。 (ii)単鎖ＤＮＡの合成 上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い自体公知の
方法で単鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、２０μｌの反
応液（５μｇのｍＲＮＡ，１．４μｇベクター・プライ
マーＤＮＡ，５ユニットの逆転写酵素，２ｍＭずつのｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ，８ｍＭ
ＭｇＣｌ₂，３０ｍＭ ＫＣｌ，０．３ｍＭジチオスレイ
トール，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３）中
で３７℃で２０分間インキュベートした後、２μｌの
０．２５Ｍ ＥＤＴＡと１μｌの１０％ＳＤＳを加えて
反応を止めた後、フェノールで除蛋白し、エタノールで
沈澱させた（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー，第２巻，１６１−１７０頁，１９８２年）。 (iii)ｄＣ鎖の付加 上記沈澱を１５μｌの反応液（１ｍＭ ＣｏＣｌ₂、３０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，１４０ｍＭカコジ
レートナトリウム，０．１ｍＭジチオスレイトール，
０．２μｇポリ（Ａ），６６μＭ ｄＣＴＰ）に溶か
し、１８ユニットのターミナルトランスフェラーゼを加
え、３７℃で５分間インキュベートした。次に、１μｌ
の０．２５ＭＥＤＴＡおよび０．５μｌの１０％ＳＤＳ
を加えて反応を止め、フェノールで除蛋白し、エタノー
ルで沈澱させた（モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー，第２巻，１６１−１７０頁，１９８２
年）。 (iv)ＨｉｎｄIIIによる切断 沈澱を１０μｌのＨｉｎｄIIIバッファーに溶かし、
２．５ユニットのＨｉｎｄIIIを加え、３７℃で１時間
消化した。次にフェノール処理した後エタノールで沈澱
させ、１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．
３，１ｍＭＥＤＴＡに溶かし、３μｌのエタノールを加
えた。 (ｖ )ｄＧ鎖付リンカーＤＮＡによる環状化 上記ＤＮＡ １μｌを７ｎｇのオリゴｄＧ付リンカーＤ
ＮＡと共に１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ ＮａＣｌ中で６
５℃、５分、次いで４２℃で３０分インキュベートした
後０℃に冷やした。これに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）４ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１０ｍＭ(ＮＨ₄)₂Ｓ
Ｏ₄，０．１Ｍ ＫＣｌ，０．１ｍＭ β−ＮＡＤ，５０
μｇ／ｍｌ ＢＳＡになるように加え、０．６μｇ大腸
菌ＤＮＡリガーゼと共に１２℃で一晩インキュベートし
た。 (vi)二重鎖ＤＮＡの合成 上記反応液に４０μＭ ｄＴＴＰ、４０μＭ ｄＧＴＰ、
４０μＭ ｄＣＴＰ、４０μＭ ｄＡＴＰ、０．１５ｍＭ
β−ＮＡＤになるように加え（最終液量１０４μ
ｌ）、０．４μｇの大腸菌ＤＮＡリガーゼ、０．３μｇ
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、１ユニットの大腸菌ＲＮ
ａｓｅＨと共に１２℃１時間、次いで２５℃で１時間イ
ンキュベートした後、大腸菌の形質転換に用いた。 (vii)ｃＤＮＡ含有プラスミドの単離 このようにして４×１０⁵個のアンピシリン耐性株が単
離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィル
ターの上に固定した。次いでＭＴ−１細胞より精製され
たＩＬ−２受容体蛋白質のアミノ酸配列をもとにして、
アミノ酸Ｎｏ．４〜８（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ）(配列番号：２）に対応する塩基配列（^3'
ＣＴＲＣＴＲＣＴＲＧＧＮＧＧ ^5'）（配列番号：３、
ＲはＡまたはＧを表し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれか
を表す）をトリエステル法（プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス Ｕ
ＳＡ，第７５巻，５７６５−５７６９頁，１９７８年）
により化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対して
Ｔ４ポリヌクレオチドカイネースを用いて５０μｌの反
応液（オリゴヌクレオチド０．２０μｇ，５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，
１０ｍＭメルカプトエタノール，５０μＣｉｒ−³²ＰＡ
ＴＰ、３ユニットＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中
で１時間３７℃で反応させ、５'末端を³²Ｐで標識し
た。この標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとし
てＨａｎａｈａｎらの方法（ジーン，第１０巻，６３−
６７頁，１９８１年）に従って上記のニトロセルロース
フィルター上に固定したＤＮＡに会合させ、オートラジ
オグラフィーによって上記のオリゴヌクレオチドプロー
ブに反応する菌株を２個（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／
Ｔａｃ−１およびＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／Ｔａｃ−
２）単離した。これらの菌株の各々の菌体からプラスミ
ドＤＮＡをアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ Ｈ．Ｃ．
ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第７巻，１５
１３−１５２４頁，１９７９年）によって単離した。こ
れらのプラスミドをＴａｃ−１およびＴａｃ−２と名づ
けた。Ｔａｃ−１とＴａｃ−２はＴａｃ−２の方がその
５'末端の塩基配列が１６塩基長いことを除いて同一で
あった。Ｔａｃ−２の制限酵素地図を図１に示す。次に
このＴａｃ−２プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの配列
の一次構造（塩基配列）をジデオキシヌクレオチド法と
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によって決定した。その
一次構造（配列番号：４）は図２に示した。この塩基配
列により規定されるペプチドはその合成開始信号〔Ｎ
ｏ．１７５〜１７７のＡＴＧ（コドン−２１）〕から始
まって２７２個のアミノ酸から成る。この中Ｎ末端から
２１個のアミノ酸（アミノ酸−２１〜−１）はシグナル
ペプチドと考えられる。上記の一次構造から、このプラ
スミドはヒトＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードす
る塩基配列を全部持っていることが判明した。また上記
塩基配列から推定されるＩＬ−２受容体のアミノ酸配列
（配列番号：５）を図２に示した。 (viii)発現型プラスミドの製造 参考例の（vii)で得たプラスミドＴａｃ−２（２０μ
ｇ）からヒトＩＬ−２受容体遺伝子部分を制限酵素Ｐｓ
ｔＩ（部分分解）およびＰｖｕII（完全分解）で切断し
た後、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動で分離
し、２μｇのＤＮＡを得た。このＤＮＡの単鎖部分をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼ反応でうめた後、フェノール処理
し、エタノール沈澱を行った。このＤＮＡを２０μｌの
ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ７．６，６．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１０ｍＭ ＤＴＴ，
６６μＭ ＡＴＰ）に溶解し、５'末端をりん酸化した
０．５μｇの合成オリゴヌクレオチドリンカー（Ｈｉｎ
ｄIIIリンカー）^5' ｐＣＡＡＧＣＴＴＧと５ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼとを混合し、１４℃、１７時間反応
させてＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードする遺伝
子とオリゴヌクレオチドリンカーを結合させた。リガー
ゼを６５℃、１０分間の熱処理によって失活させた後、
３倍量の蒸留水を加え、さらに制限酵素ＨｉｎｄIIIの
緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．９，６ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１００μｇ／ｍｌ
牛血清アルブミン中２０ユニットのＨｉｎｄIII）で１
時間処理した。セファロース４Ｂカラム（０．５ｃｍ直
径、２０ｃｍ長さ）で切断されたリンカー部分とリンカ
ーを結合したＩＬ−２受容体ＤＮＡを分離し、エタノー
ル沈澱によりリンカーを結合したＩＬ−２受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子含有ＤＮＡを回収した。一
方、プラスミドｐＫＣＲＨ２（ネイチャー 第３０７
巻，６０４−６０８頁，１９８４年）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIIで切断し、上記リンカーを結合させた二重鎖ＤＮ
ＡをＳＶ４０プロモーターの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結させ発現型プラスミドｐＫＣＲ・Ｔａｃ−２・Ａ
を構築した。この場合ＩＬ−２受容体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子がプロモーターと逆向きに連結したもの
も単離され、これをｐＫＣＲ・Ｔａｃ−２・Ａｉと名付
けた。同様に、プラスミドＴａｃ−２より得られたＨｉ
ｎｄIII−ＰｖｕIIＤＮＡ断片（ＩＬ−２受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含む）にＨｉｎｄIIIリ
ンカーを結合し、ｐＫＣＲＨ２のＨｉｎｄIIIサイトに
挿入した発現型プラスミドも構築しｐＫＣＲ・Ｔａｃ−
２と名付けた。

【００１４】実施例 ＣＯＳ−７細胞におけるＩＬ−２
受容体のポリペプチドをコードする遺伝子の発現 ５×１０⁵個のＣＯＳ−７細胞（セル 第２３巻 １７５
−１８２頁，１９８１年）を５％の牛胎児血清を含むダ
ルベッコ・ミニマル・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地を
用いて直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュにまき、２
０時間後、培地を交換した。さらに４時間後、４０μｇ
／ｍｌのプラスミドＤＮＡを含む１／１０量のトランス
フェクション溶液（プロシーディング・オブ・ナショナ
ルアカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ 第７６巻，
１３７３−１３７６頁，１９７９年）を加え、１２時間
インキュベートした後、２．５％グリセロールで１分間
処理した。細胞を洗った後、８％の胎児牛血清を含むＤ
ＭＥＭで３７℃、４８時間培養した。次に、細胞をマウ
ス抗Ｔａｃモノクローナル抗体とＦＩＴＣ（蛍光色素）
標識ヤギ抗マウス抗体で染めた（ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー 第１２６巻，１３９３−１３９７頁，１９
８１年）。対照実験では抗Ｔａｃ抗体のかわりに抗体の
一種であるネズミ・ミエローマ蛋白Ｘ５５６３を用い
た。ＩＬ−２受容体のポリペプチドをコードする遺伝子
の発現はスペクトラムIIIを用いたフロー・サイトメト
リーで測定した。結果を表１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：251 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：たんぱく質 配列 Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys 5 10 15 Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly 35 40 45 Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp 85 90 95 Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn 100 105 110 Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr 115 120 125 Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu 130 135 140 Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln 145 150 155 160 Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu 165 170 175 Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys 180 185 190 Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr 195 200 205 Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly 210 215 220 Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp 225 230 235 240 Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 245 250。

【００１７】配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００１８】配列番号：3 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGNGGRTCRT CRTC 14。

【００１９】配列番号：4 配列の長さ：1309 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 AACTCCTGAC TCCGATAGAG ACTGGATGGA CCCGCAAGGG TGGCAGCCCA GGCGGACCGA 60 TCTTCCCATC CCACATCCTC CGGCGCGATG CCAAAAAGAG GCTGACGGCA ACTGGGCCTT 120 CTGCAGAGAA AGACCTCCGC TTCACTGCCC CGGCTGGTCC CAAGGGTCAG GAAGATGGAT 180 TCATACCTGC TGATGTGGGG ACTGCTCACG TTCATCATGG TGCCTGGCTG CCAGGCAGAG 240 CTCTGTGACG ATGACCCGCC AGAGATCCCA CACGCCACAT TCAAAGCCAT GGCCTACAAG 300 GAAGGAACCA TGTTGAACTG TGAATGCAAG AGAGGTTTCC GCAGAATAAA AAGCGGGTCA 360 CTCTATATGC TCTGTACAGG AAACTCTAGC CACTCGTCCT GGGACAACCA ATGTCAATGC 420 ACAAGCTCTG CCACTCGGAA CACAACGAAA CAAGTGACAC CTCAACCTGA AGAACAGAAA 480 GAAAGGAAAA CCACAGAAAT GCAAAGTCCA ATGCAGCCAG TGGACCAAGC GAGCCTTCCA 540 GGTCACTGCA GGGAACCTCC ACCATGGGAA AATGAAGCCA CAGAGAGAAT TTATCATTTC 600 GTGGTGGGGC AGATGGTTTA TTATCAGTGC GTCCAGGGAT ACAGGGCTCT ACACAGAGGT 660 CCTGCTGAGA GCGTCTGCAA AATGACCCAC GGGAAGACAA GGTGGACCCA GCCCCAGCTC 720 ATATGCACAG GTGAAATGGA GACCAGTCAG TTTCCAGGTG AAGAGAAGCC TCAGGCAAGC 780 CCCGAAGGCC GTCCTGAGAG TGAGACTTCC TGCCTCGTCA CAACAACAGA TTTTCAAATA 840 CAGACAGAAA TGGCTGCAAC CATGGAGACG TCCATATTTA CAACAGAGTA CCAGGTAGCA 900 GTGGCCGGCT GTGTTTTCCT GCTGATCAGC GTCCTCCTCC TGAGTGGGCT CACCTGGCAG 960 CGGAGACAGA GGAAGAGTAG AAGAACAATC TAGAAAACCA AAAGAACAAG AATTTCTTGG 1020 TAAGAAGCCG GGAACAGACA ACAGAAGTCA TGAAGCCCAA GTGAAATCAA AGGTGCTAAA 1080 TGGTCGCCCA GGAGACATCC GTTGTGCTTG CCTGCGTTTT GGAAGCTCTG AAGTCACATC 1140 ACAGGACACG GGGCAGTGGC AACCTTGTCT CTATGCCAGC TCAGTCCCAT CAGAGAGCGA 1200 GCGCTACCCA CTTCTAAATA GCAATTTCGC CGTTGAAGAG GAAGGGCAAA ACCACTAGAA 1260 CTCTCCATCT TATTTTCATG TATATGTGTT CATTAAAGCA TGAATGGTA 1309。

【００２０】配列番号：5 配列の長さ：272 配列の型：アミノ酸 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：たんぱく質 配列 Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val 1 5 10 15 Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 20 25 30 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 35 40 45 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 65 70 75 80 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 85 90 95 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 100 105 110 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 130 135 140 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 145 150 155 160 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln 180 185 190 Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu 195 200 205 Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr 210 215 220 Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 225 230 235 240 Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 260 265 270。

【図面の簡単な説明】

【図１】 参考例の（vii)で得たプラスミドＴａｃ−２
のＩＬ−２受容体活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子部位の制限酵素地図（斑点部分はシグナルペプ
チドをコードする部分を、黒塗り部分およびそれに挟ま
れた斜線部分はＩＬ−２受容体活性を有するポリペプチ
ドをコードする部分を表わす）である。

【図２−１】 上記ＩＬ−２受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造（塩基配列）ならびにＩＬ−２受容体
のアミノ酸配列の最初の部分を示す。

【図２−２】 上記ＩＬ−２受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造（塩基配列）ならびにＩＬ−２受容体
のアミノ酸配列を示し、図２−１に続く部分である。

【図２−３】 上記ＩＬ−２受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造（塩基配列）ならびにＩＬ−２受容体
のアミノ酸配列を示し、図２−２に続く部分である。

【図２−４】 上記ＩＬ−２受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造（塩基配列）ならびにＩＬ−２受容体
のアミノ酸配列を示し、図２−３に続く部分である。

【図３】 参考例の（viii)に記載した発現型プラスミ
ドｐＫＣＲ・Ｔａｃ−２・Ａの構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子組み換え技術で得られた式 GluLeuCysAspAspAspProProGluIleProHisAlaThr PheLysAlaMetAlaTyrLysGluGlyThrMetLeuAsnCys GluCysLysArgGlyPheArgArgIleLysSerGlySerLeu TyrMetLeuCysThrGlyAsnSerSerHisSerSerTrpAsp AsnGlnCysGlnCysThrSerSerAlaThrArgAsnThrThr LysGlnValThrProGlnProGluGluGlnLysGluArgLys ThrThrGluMetGlnSerProMetGlnProValAspGlnAla SerLeuProGlyHisCysArgGluProProProTrpGluAsn GluAlaThrGluArgIleTyrHisPheValValGlyGlnMet ValTyrTyrGlnCysValGlnGlyTyrArgAlaLeuHisArg GlyProAlaGluSerValCysLysMetThrHisGlyLysThr ArgTrpThrGlnProGlnLeuIleCysThrGlyGluMetGlu ThrSerGlnPheProGlyGluGluLysProGlnAlaSerPro GluGlyArgProGluSerGluThrSerCysLeuValThrThr ThrAspPheGlnIleGlnThrGluMetAlaAlaThrMetGlu ThrSerIlePheThrThrGluTyrGlnValAlaValAlaGly CysValPheLeuLeuIleSerValLeuLeuLeuSerGlyLeu ThrTrpGlnArgArgGlnArgLysSerArgArgThrIle（配列番
   号：１） で表されるアミノ酸配列を含有するインターロイキン−
   ２受容体。
2. 【請求項２】式 GluLeuCysAspAspAspProProGluIleProHisAlaThr PheLysAlaMetAlaTyrLysGluGlyThrMetLeuAsnCys GluCysLysArgGlyPheArgArgIleLysSerGlySerLeu TyrMetLeuCysThrGlyAsnSerSerHisSerSerTrpAsp AsnGlnCysGlnCysThrSerSerAlaThrArgAsnThrThr LysGlnValThrProGlnProGluGluGlnLysGluArgLys ThrThrGluMetGlnSerProMetGlnProValAspGlnAla SerLeuProGlyHisCysArgGluProProProTrpGluAsn GluAlaThrGluArgIleTyrHisPheValValGlyGlnMet ValTyrTyrGlnCysValGlnGlyTyrArgAlaLeuHisArg GlyProAlaGluSerValCysLysMetThrHisGlyLysThr ArgTrpThrGlnProGlnLeuIleCysThrGlyGluMetGlu ThrSerGlnPheProGlyGluGluLysProGlnAlaSerPro GluGlyArgProGluSerGluThrSerCysLeuValThrThr ThrAspPheGlnIleGlnThrGluMetAlaAlaThrMetGlu ThrSerIlePheThrThrGluTyrGlnValAlaValAlaGly CysValPheLeuLeuIleSerValLeuLeuLeuSerGlyLeu ThrTrpGlnArgArgGlnArgLysSerArgArgThrIle（配列番
   号：１） で表されるアミノ酸配列を含有するインターロイキン−
   ２受容体活性を有するポリペプチドをコードする組み換
   えＤＮＡを有する動物細胞を培養し、培養物中にインタ
   ーロイキン−２受容体を生成、蓄積せしめることを特徴
   とする該受容体の製造法。