CN104371982A

CN104371982A - 一种慢病毒的纯化方法

Info

Publication number: CN104371982A
Application number: CN201410561875.9A
Authority: CN
Inventors: 黄�俊
Original assignee: WUHAN VIRALTHERAPY TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: WUHAN VIRALTHERAPY TECHNOLOGIES Co Ltd
Priority date: 2014-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明涉及一种慢病毒的纯化方法，包括以下步骤：S10，提供含慢病毒的细胞培养物；S20，离心浓缩上述细胞培养物，并进行过滤，得到病毒悬液；S30，阴离子交换层析纯化病毒悬液；S40，凝胶过滤层析纯化病毒悬液。本发明的慢病毒纯化工艺易于放大，可大规模处理细胞工厂或生物反应器生产的大量病毒液，能满足慢病毒液的生产需求，工艺稳定，重复性好；且本发明制备的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留低，安全性好、纯度和滴度高，完全达到临床基因治疗的要求。

Description

一种慢病毒的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种慢病毒的纯化方法。

背景技术

随着生物技术的发展，病毒学的基因转移方法，被越来越多的应用于基因治疗。它可以将外源基因导入包括鼠类、灵长类及人在内的体细胞中，并整合到细胞基因组中，达到长期稳定表达的目的，因而在包括遗传病治疗、移植、干细胞转导等许多领域的应用中有非常好的前景。

病毒学的基因转移载体以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。常见的逆转录病毒载体由小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，因此只能用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导。

近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明，以HIV-1为基础构建的慢病毒载体不仅能将目的基因整合至靶细胞基因组，实现长期稳定表达，同时具有可感染非分裂细胞、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。

HIV-1慢病毒载体由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

通常，制备出的慢病毒颗粒在进一步应用之前，需要进行纯化。在大多数小规模的实验应用中，可采用离心技术等相对简单的方法来进行病毒的浓缩和纯化。但将纯化方法进行放大以便临床使用，使其纯度和滴度达到临床基因转移治疗的标准，同时确保其安全性和功效，这是一个重大挑战。因此需要摸索一种更有效的病毒纯化方法以满足要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从细胞培养物中纯化慢病毒，最终获得低残留、高纯度、高滴度的病毒纯化的方法。

本发明提出一种慢病毒的纯化方法，包括以下步骤：

S10，提供含慢病毒的细胞培养物；

S20，离心浓缩细胞培养物，并进行过滤，得到病毒悬液；

S30，阴离子交换层析纯化病毒悬液；

S40，凝胶过滤层析纯化病毒悬液。

优选地，还包括步骤S50，将步骤S20得到的病毒悬液经过核酸酶处理之后，再进行步骤S30的操作。

优选地，步骤S10中所述的细胞培养物由细胞工厂或生物反应器产生。

优选地，所述细胞培养物其细胞株为293T细胞。

优选地，步骤S20中所述的离心浓缩采用5000-10000g离心力在2-8℃离心10-30分钟；所述的过滤采用2.5μM和0.45μM孔径的过滤器进行两次过滤。

优选地，步骤S30中阴离子交换层析介质为Hi Trap Q-XL。

优选地，步骤S40中凝胶过滤层析介质为HiPrep S-500。

本发明的慢病毒纯化工艺易于放大，可大规模处理细胞工厂或生物反应器生产的大量病毒液，能满足病毒液的生产需求，工艺稳定，重复性好；且本发明制备的病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留低，安全性好、纯度和滴度高，完全达到临床基因治疗的要求。

附图说明

图1为纯化后的病毒液经SDS-PAGE结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种慢病毒纯化方法，其是从细胞培养物中收集病毒液，随后进行核酸酶处理，再使用阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化病毒。

具体步骤如下：

S10，提供含慢病毒的细胞培养物。

此步骤中，产生细胞培养物的细胞株为适应于慢病毒培养的任何细胞，优选为293T细胞；培养方式包括细胞工厂或生物反应器；细胞培养物为细胞培养上清液。

S20，离心浓缩步骤S10中所述细胞培养物，并进行过滤，得到病毒悬液。

根据细胞培养物的体积选择合适的离心机和转子，优选以5000-10000g离心力在2-8℃离心10-30分钟，收取上清，即为病毒澄清液；过滤澄清，优选的方法是先通过2.5μM孔径的表面过滤器进行预过滤；然后通过具有0.45μM孔径的过滤器进行再次过滤。滤过液即为澄清的病毒悬液。

S30，阴离子交换层析纯化病毒悬液。

优选地，此步骤之前，使用核酸酶除去包装细胞的核酸。本发明的优选实施方案中，所述核酸酶是Benzonase，其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键使核酸快速水解，从而降低细胞宿主蛋白、宿主DNA残留。应用的核酸酶的浓度优选为200-280U/mL。

阴离子交换层析采用的介质优选为Hi Trap Q-XL或SOURCE 30Q；平衡缓冲液优选pHpH7.5-8.0的50mM Tris-HCl；洗脱缓冲液优选pH7.5-8.0的50mM Tris-HCl，含400mM NaCl。

S40，凝胶过滤层析纯化病毒悬液。

阴离子交换层析纯化的病毒液继续用凝胶过滤层析纯化，采用的介质优选为HiPrep S-500，平衡缓冲液优选pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)。

进一步地，S10具体包括顺次进行的以下几步：

S11，包装细胞的培养。

优选地，包装细胞为293T细胞，且处于对数生长期。

S12，质粒转染上述包装细胞，并在上述包装细胞内进行慢病毒包装，产生病毒颗粒。

S13，收集经步骤S12的细胞上清液，得到含慢病毒的细胞培养物。

实施例1：病毒液的制备

(1)大规模培养包装细胞。

首先，从液氮罐中取出冻存的293T细胞，立即放入37℃水浴箱中使其复苏。待其完全融化后加入5mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)充分混匀，1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用5mL DMEM完全培养基充分混匀，转移到T-25cm²的细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜；接着，待上述细胞生长到80％融合度时，弃去培养基，加入5mL PBS，轻微摇匀，弃去PBS，加入1mL 0.25％EDTA-胰酶，室温放置2-3min，待其细胞完全从瓶壁上脱落下来，加入10mL DMEM完全培养基，充分混匀，1000rpm离心5min，弃去上清，细胞沉淀用5mL DMEM完全培养基充分混匀，转移到T-75cm²的细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。以此类推，传代到T-175cm²和T-225cm²的细胞培养瓶中；最后，准备10层细胞培养工厂，37℃，5％CO2培养箱培养过夜，待用。

(2)质粒转染。

准备1支50ml的洁净离心管，依次加入900ul(1.0ug/ul)的pCCL、600ul(1.0ug/ul)的pMDLg/pRRE、200ul(1.0ug/ul)的pRSV-REV、300ul(1.0ug/ul)的pMD2.G、34ml ddH₂O、4ml 2.5mol/L的CaCl₂(pH7.2)共40ml，用移液器轻微混匀。另取1支50ml的洁净离心管，加入40ml HEPES缓冲盐溶液(即2×HEBS Buffer，pH 7.2)。用移液器吸入前者的溶液加入到后者的溶液中，用10ml移液器反复吹打混匀。室温孵育30min后将混合液一滴一滴添加到步骤(1)中所述的10层细胞培养工厂中，轻轻摇晃混匀后放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中过夜培养。转染后12-14h更换2L新鲜的不含双抗(P/S)的高糖DMEM+5％FBS的培养液。

(3)病毒液收集。

转染后24h，收集培养上清液约2L，放入2～8℃环境中保存；同时步骤(2)中转染后的细胞再次更换2L新鲜的不含双抗(P/S)的高糖DMEM+5％FBS的培养液；继续培养24h后，再次收集培养上清液约2L。将两次收集的细胞培养上清液共4L，混合在一起。

(4)病毒液的浓缩与过滤。

步骤(3)中的上清液经5000r/min低速离心10min，收集上清，先用2.5μM孔径的表面过滤器进行预过滤，再用0.45um PVDF滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片。

实施例2：病毒液的纯化：

(5)核酸酶处理病毒液。

实施例1中的病毒液经步骤(4)的浓缩与过滤后，加入250U/mLBenzonase，37℃水浴反应6h。

(6)使用阴离子交换层析纯化病毒液并离心浓缩。

具体地，有如下步骤：①先用1L ddH2O冲洗500mL HiTrap Q-XL强阴离心柱，流速设为50mL/min。②再用1L上样缓冲液Buffer A(50mMTris-HCl,pH 8.0)平衡500mL HiTrap Q-XL强阴离心柱，流速设为50mL/min。③将0.45um过滤后的病毒上清液上样，流速设为50mL/min。④用1.5L上样缓冲液Buffer A(50mM Tris-HCl,pH8.0)冲洗500mL HiTrapQ-XL强阴离心柱，直至基线平稳，以去除非特异性结合的蛋白，流速设为50mL/min。⑤用3L洗脱液Buffer B(50mM Tris-HCl,400mM NaCl,pH8.0)冲洗500mL HiTrap Q-XL强阴离心柱，直至液色去除，以去除非特异性结合的蛋白，流速设为50mL/min。⑥用1.5L洗脱液Buffer C(50mMTris-HCl,1M NaCl,pH8.0)冲洗500mL HiTrap Q-XL强阴离心柱，收集目的病毒，流速设为50mL/min。⑦用1L ddH2O冲洗500mL HiTrap Q-XL强阴离心柱，流速设为50mL/min。⑧最后用1L 20％的无水乙醇冲洗500mLHiTrap Q-XL强阴离心柱，流速设为50mL/min。⑨对于收集的目的病毒液用50,000g离心3h，弃去上清，病毒沉淀用10-20mL PBS充分溶解。

(7)凝胶过滤层析纯化病毒悬液，并经0.22μm滤器过滤除菌。

本步骤通过S-500凝胶过滤纯化柱进行纯化，且病毒液与纯化柱体积比为1:15。其具体操作如下：①先用120mL PBS Buffer平衡120mLHiPrep S-500凝胶过滤柱，流速设为1mL/min。②上样，再用PBS Buffer冲洗，流速设为1mL/min。③收集最先检测到的病毒样品约20～25mL。④再用180ml ddH2O冲洗120mL HiPrep S-500凝胶过滤柱，流速设为1mL/min。⑤最后用120ml 20％的无水乙醇冲洗120mL HiPrep S-500凝胶过滤柱，流速设为1mL/min。⑥用0.22um PVDF针头滤器过滤除菌。

纯化后的病毒液经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，纯度可达99％，结果如图1所示。

纯化后的病毒液进行以下指标的检定，结果见表一。

表一

结果表明，本发明的病毒纯化方法在杂蛋白去除率及各种残留物质的去除上具有一定的优势，通过本发明所制备的病毒液残留低、滴度能达10⁹Tu/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10，提供含慢病毒的细胞培养物；

S20，离心浓缩细胞培养物，并进行过滤，得到病毒悬液；

S30，阴离子交换层析纯化病毒悬液；

S40，凝胶过滤层析纯化病毒悬液。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，还包括步骤S50，将步骤S20得到的病毒悬液经过核酸酶处理之后，再进行步骤S30的操作。

3.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，步骤S10中所述的细胞培养物由细胞工厂或生物反应器产生。

4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述细胞培养物其细胞株为293T细胞。

5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤S20中，所述的离心浓缩采用5000-10000g离心力在2-8℃离心10-30分钟；所述的过滤采用2.5μM和0.45μM孔径的过滤器进行两次过滤。

6.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，步骤S30中阴离子交换层析介质为Hi Trap Q-XL。

7.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，步骤S40中凝胶过滤层析介质为HiPrep S-500。