CN117025684A - 包含阳离子层析的慢病毒载体纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含阳离子层析的慢病毒载体纯化方法，对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理，基于该阳离子交换层析建立的慢病毒载体纯化方法，其对载体收获液进行纯化的结果表明，加入该步骤的纯化方法病毒滴度回收率高，宿主蛋白和核酸去除率高，并有利于其他工艺杂质的进一步去除。该纯化技术不仅适用于实验室研发，同时可进行线性放大，适用于大规模生产的工艺处理。

Description

包含阳离子层析的慢病毒载体纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种慢病毒载体纯化方法。
背景技术
慢病毒载体是用于传递外源基因以在细胞内稳定表达的重要工具，在基因治疗及细胞治疗等领域具有非常广泛的应用，是一种重要的外源基因递送载体。基因治疗及细胞治疗对慢病毒载体的纯度和滴度有极高的要求。实验室一般通过超速离心进行制备高浓度病毒载体，该方法虽然简单但是无法进行工业化放大，而且制备得到的病毒载体可能存在宿主蛋白、宿主核酸、工艺相关杂质等残留，无法直接用于人体，或对下游工艺有较大影响。
现有的用于工业化生产慢病毒载体的纯化方法，通常综合使用各种澄清、超高速离心、层析、超滤、过滤等方式进行(非专利文献1、2)，其中在层析方法的使用上，原有的纯化方法主要采用阴离子交换层析(非专利文献3)，专利文献1披露了一种阴离子交换层析综合其他各种纯化方式进行慢病毒载体的纯化方法，专利文献2披露了另外一种慢病毒制备方法，也包含阴离子交换层析步骤，两种方法均采用的是结合洗脱模式，而在缓冲液pH条件下病毒载体外壳带负电，可与带正电荷的阴离子填料配基相结合。但此种方法通常采用含0.5-1.0mol/L浓度的较高盐浓度的氯化钠缓冲液进行洗脱。而在此种缓冲溶液条件下，慢病毒载体并不稳定，容易丧失活性，导致总体的回收率降低(非专利文献4、5)。由于阴离子交换层析技术在各种病毒载体纯化过程中普遍存在收率低和杂质残留高、步骤繁琐等缺点(非专利文献6)。
现有技术文献：
<专利文献>
专利文献1：CN114181970A
专利文献2：US9169491B2
<非专利文献>
非专利文献1：Molecular Therapy-Methods&Clinical Development(2016)3,16017；DOI：10.1038/mtm.2016.17
非专利文献2：Current Gene Therapy，November 2010；DOI：10.2174/156652310793797748
非专利文献3：Gene Therapy，20January 2011；DOI：10.1038/gt.2010.162
非专利文献4：HUMAN GENE THERAPY METHODS23:255-263(August 2012)
非专利文献5：Journal of Chromatography B,837(2006)59-68；DOI：10.1016/j.jchromb.2006.03.061
非专利文献6：Gene Therapy，February 2007；DOI：10.1038/sj.gt.3302851
发明内容
本发明鉴于以上技术问题研发而成，目的在于提供一种不依赖阴离子交换层析技术的慢病毒载体纯化方法。
为实现本发明目的，本发明提供的慢病毒载体纯化方法包括：对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理，其中，所述慢病毒载体溶液包含带正电杂质。
进一步地，所述阳离子交换层析处理使用的层析柱内填充有表面配基为pH值在3～11范围内任一pH值点、带负电的配基的填料。
进一步地，所述阳离子交换层析处理采用流穿模式。
进一步地，所述填料的孔径为10～600nm。
进一步地，阳离子交换层析处理以10～300cm/h上样流速进行上样。
进一步地，上样前使用流量系数3～10CV、pH值6～8、含浓度为20～200mmol/LNaCl的缓冲液平衡所述层析柱。
其中，带正电杂质包含阳离子有机大分子和/或包含阳离子有机大分子的复合物。
还包括配置在所述阳离子交换层析处理之前和/或之后的其他纯化方法，该其他纯化方法为从澄清、核酸酶消化、超滤、其他柱层析、过滤中任选的一个或多个的组合。
所述纯化方法包括：1)对慢病毒载体溶液进行澄清和/或核酸酶消化处理；2)对1)处理后的溶液进行所述阳离子交换层析处理。
所述纯化方法包括：1)对慢病毒载体溶液进行澄清和/或核酸酶消化处理；2)对1)处理后的溶液进行所述阳离子交换层析处理；3)对2)处理后的溶液进行缓冲体系置换并浓缩。
所述纯化方法包括：1)对慢病毒载体溶液进行澄清和/或核酸酶消化处理；2)对1)处理后的溶液进行所述阳离子交换层析处理；3)对2)处理后的溶液进行缓冲体系置换并浓缩；4)对3)处理后的溶液进行复合模式层析处理。
本发明基于上述包含阳离子交换层析步骤建立的慢病毒载体纯化方法对载体收获液进行纯化的结果表明，加入该步骤的纯化方法病毒滴度回收率高，宿主蛋白和核酸去除率高，并有利于其他工艺杂质的进一步去除。该纯化技术不仅适用于实验室研发，同时可进行线性放大，适用于大规模生产的工艺处理。。
为获得高效率高质量的慢病毒载体的纯化方法，本发明披露了一种新型的慢病毒载体纯化的工艺，首次将阳离子交换层析技术用于慢病毒载体的纯化工艺中，使用阳离子填料对病毒载体进行离子交换层析来对相关杂质进行去除。
质粒转染细胞包装病毒的工艺中常用各种带正电的阳离子转染试剂，如聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)等，均是具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子。转染完成后残留的转染试剂不利于后续的杂质去除。本发明中选择经过一步阳离子层析，通过阳离子填料对带正电荷PEI复合物的捕获，便于后续杂质的去除保证。经证实，加入阳离子层析步骤后的病毒纯化的方法能够有效的提高病毒载体纯化过程的回收率，并降低杂质的残留。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明所提供一实施方式的慢病毒载体纯化方法包括：对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理，其中慢病毒载体溶液包含带正电杂质。所述慢病毒载体溶液的制备包括：由质粒系统转染/共转染包装细胞生产包装慢病毒。所述带正电杂质为生产包装慢病毒的余物。
包装细胞是可以表达外源基因，具有产生慢病毒载体的能力的细胞株或细胞系，作为一实施例可以采用293T(例如HEK293T)。293细胞是人肾上皮细胞系，来源于人胚胎肾细胞，极少表达细胞外配体所需的内生受体，且较容易转染。293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系。
质粒系统包含用于转染包装细胞的质粒，例如包括但不限于2质粒、3质粒或4质粒，当采用不同的质粒系统时，采用相应的培养方法。其中培养基可以是无血清或有血清培养基，培养方式可以是悬浮或贴壁培养，培养容器根据需要可采用培养瓶、细胞工厂或生物反应器。
作为一实施例质粒系统可以包含：含有编码形成慢病毒粒子所需蛋白的基因的多个质粒、及含有转录整合到慢病毒粒子中的RNA的基因和要表达的目的导入基因的质粒。例如慢病毒载体基于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)开发的情况，将HIV-1前病毒基因组分开并含有在多个质粒中，并将各质粒共转染入细胞，这种情况下无需将病毒基因组的全部分开并含有在多个质粒，含有除去辅助基因等基因之外的病毒基因组一部分即可。例如可以使用如下3质粒：(1)至少含有LTR(5’LTR和3’LTR)、包装信号(Ψ)和目的导入基因(转基因)的慢病毒载体质粒(含有包装信号(Ψ)且插入目的基因的质粒)、(2)含有包装所必需的gag和pol且任选含有调控基因rev和tat的包装质粒、以及(3)含有env基因的env表达质粒，所述env基因编码VSV-G等包膜(env)(包膜质粒)。例如也可以使用如下4质粒系统：(A)至少含有LTR(5’LTR和3’LTR)、包装信号(Ψ)和目的导入基因(转基因)的慢病毒载体质粒、(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒、(C)含有env基因的env表达质粒，所述env基因编码VSV-G等包膜(env)(包膜质粒)、以及(D)含有rev的rev表达质粒。例如也可以使用如下3质粒系统：(A)至少含有LTR(5’LTR和3’LTR)、包装信号(Ψ)和目的导入基因(转基因)的慢病毒载体质粒、(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒、以及(C)含有env表达单元和rev表达单元质粒，所述env表达单元含有env基因，所述env基因编码VSV-G等包膜(env)，所述rev表达单元质粒含有rev。
带正电杂质尤其包括阳离子有机大分子和/或包含阳离子有机大分子的复合物。其中阳离子有机大分子尤其为包装慢病毒工艺中使用的阳离子转染试剂提供的阳离子有机大分子成分，更适应性地，为具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子成分。作为一实施例，尤其包含利用基因导入试剂转染细胞时使用的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)及其复合物。
利用质粒的293T细胞转染可以通过已知的方法来进行。例如：使用基因导入试剂的方法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、微注射法。作为基因导入试剂，例如聚乙烯亚胺(PEI，直链型或者支链型)和市售的基因导入试剂。作为市售的基因导入试剂，例如：Lipofectamine(注册商标)、Lipofectamine plus(注册商标)、jet PEI(注册商标)、TransIT(注册商标)、Xfect(注册商标)、Transfectin-Lipid(注册商标)、Oligofectamine(注册商标)、siLentFect(注册商标)、DMRIE-C(注册商标)、Effectene(注册商标)、FuGENE(注册商标)。在聚乙烯亚胺(PEI)中，直链PEI和含有伯胺、仲胺、叔胺的支链PEI均可以使用。此外，PEI的分子量也没有限定。进一步还可以使用经脱酰基化等化学修饰的PEI。
染入293T细胞后，在培养数天后回收培养上清，从培养上清中回收慢病毒粒子。293T细胞的培养中使用的培养基和培养条件是通常的动物细胞的培养中使用的培养基和培养条件。用于产生慢病毒的培养期间例如为12～72小时，优选为24～48小时。
关于慢病毒载体的包装和培养过程在此还可以引用《Production of cGMP-GradeLentiviral Vectors》、《Optimization of lentiviral vector production for scale-up in fixed-bed bioreactor》的全部内容。
所述阳离子交换层析处理包括：(1)层析柱内填充有表面配基为pH值在3～11范围内任一pH值点、带负电的配基的填料；(2)使用流量系数3～10CV、pH值6～8、含浓度为20～200mmol/L NaCl的缓冲液平衡层析柱；(3)平衡后进行上样，上样流速为10～300cm/h；(4)观察紫外吸收的同时，收集阳离子交换层析操作后的透过液。
所述(1)中，填料表面配基的pH值可以选自3、4、5、6、7、8、9、10、11，也可以是3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11，优选6～7、7～8、8～9，尤其优选7～8。调料的表面配基种类包含且不限：磺丙基基团(SP)、羧甲基基团(CM)、磺甲基基团(S)等，填料可以采用常见市售填料：Cytiva公司的S/SP系列阳离子交换填料、纳微科技Nano系列和Uni系列阳离子交换填料、伯格隆CM/S/SP强阳离子交换填料、天地人和公司的CM/SP系列阳离子交换填料、ThermoFisher公司生产的的POROS XS/POROS 50HS系列阳离子交换填料、日本东曹株式会社生产的SP/GigaCap S/CM/GigaCap CM系列阳离子交换层析填料等。
在所述(1)中，阳离子交换填料表面带负电荷，可以与慢病毒载体溶液中的阳离子物质进行交换，病毒载体表面带有负电，不与阳离子交换填料发生交换。进一步地，阳离子交换层析采用流穿模式。
所述(2)中，NaCl缓冲液的流量系数可以选自3CV、4CV、5CV、6CV、7CV、8CV、9CV、10CV，也可以选自范围3～4CV、4～5CV、5～6CV、6～7CV、7～8CV、8～9CV、9～10CV，优选4～6CV，进一步优选4.5～5.5CV，更优选5CV。NaCl缓冲液的pH值可以选自6、7、8，也可以是6～7、7～8，优选7～8，尤其优选7.0、7.2、7.5，作为一优选实施例，可以采用7.0～7.5，进一步可以采用7.0～7.2、7～7.5。NaCl缓冲液浓度可以选自20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、130mmol/L、150mmol/L、170mmol/L、200mmol/L，也可以是20～50mmol/L、50～100mmol/L、100～130mmol/L、130～150mmol/L、150～170mmol/L、170～200mmol/L，优选100～200mmol/L，尤其优选130～170mmol/L，进一步优选140～160mmol/L，更优选150mmol/L。
所述(3)中，上样流速可以选自10cm/h、50cm/h、100cm/h、130cm/h、150cm/h、170cm/h、200cm/h、250cm/h、300cm/h，也可以选自范围10～50cm/h、50～100cm/h、100～130cm/h、130～150cm/h、150～170cm/h、170～200cm/h、200～250cm/h、250～300cm/h，其中优选100～200cm/h，进一步优选130～170cm/h，更进一步优选140～150cm/h，作为一优选实施例例如为150cm/h。
进一步地，所述填料的孔径为10～600nm。该孔径可以具体选自10nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm、260nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm，也可以选自范围10～20nm、20～40nm、40～60nm、60～80nm、80～100nm、100～120nm、120～140nm、140～160nm、160～180nm、180～200nm、
200～220nm、220～240nm、240～260nm、260～280nm、280～300nm、
300～320nm、320～340nm、340～360nm、360～380nm、380～400nm、
400～420nm、420～440nm、440～460nm、460～480nm、480～500nm、500～520nm、520～540nm、540～560nm、560～580nm、580～600nm。
所述纯化方法还可以包括阳离子层析与其他纯化方式的组合，例如：阳离子层析与澄清、核酸酶消化、超滤、其他柱层析、过滤等其他纯化方式中的一种或多种的组合，其中其他柱层析例如为复合模式层析，其中每种纯化方式可以是1次也可以是多次，对各纯化方式的位置在此也不做限制。
作为一个优选的纯化方法实施例，包括：
1)获得慢病毒载体溶液液；
2)对慢病毒载体溶液进行澄清和核酸酶消化处理；
3)对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理。
作为另一优选的纯化方法实施例，包括：
1)获得慢病毒载体溶液液；
2)对慢病毒载体溶液进行澄清和核酸酶消化处理；
3)对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理；
4)对慢病毒载体溶液进行缓冲体系置换并浓缩。
作为又一优选的纯化方法实施例，包括：
1)获得慢病毒载体溶液液；
2)对慢病毒载体溶液进行澄清和核酸酶消化处理；
3)对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理；
4)对慢病毒载体溶液进行缓冲体系置换并浓缩；
5)对慢病毒载体溶液进行复合模式层析处理。
通过对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析操作，通过阳离子填料对带正电荷PEI复合物的捕获，便于后续杂质的去除保证。经证实，加入阳离子层析步骤后的病毒纯化的方法能够有效的提高病毒载体纯化过程的回收率，并降低杂质的残留。
滤膜的平均孔径在本领域被称作膜孔径。膜孔径通常表示为kDa，指的是该膜可能保留的最小颗粒或超分子的平均分子量。或者膜孔径可表示为μm，指的是该膜可能保留的最小颗粒的直径。该直径与相似形状分子(如球状分子)的分子量成比例。
在一实施例中，采用中空纤维柱对所述病毒液进行澄清。所述中空纤维柱的膜孔径为0.22～1.2μm，实施人员可根据需求选择中空纤维柱膜的孔径，选择的孔径可选自0.22μm，0.45μm、0.5μm、0.65μm、0.8μm、1μm和1.2μm，也可以是0.22～0.45μm，0.45～0.50μm、0.50～0.65μm、0.65～0.80μm、0.80～1.00μm、1.00～1.20μm。
在一实施例中，采用中空纤维柱对所述病毒液进行浓缩和对所述慢病毒载体样本的缓冲体系置换。所述的中空纤维柱的膜孔径为100～750kDa，实施人员可根据需求选择所述中空纤维膜柱的孔径，选择的孔径可以是100kDa、300kDa、500kDa、750kDa，也可以是100～300kDa、300～500kDa、500～750kDa，优选500～750kDa，尤其优选700～750kDa，作为一更优选实施例，孔径是750kDa，能够获得更好的去除杂质效果。
在一实施例中，所述的其他层析方式为复合模式层析，所述复合模式层析使用Diamond Layer700或Diamond Layer400填料。Diamond Layer700及Diamond Layer400其微粒具有核心辛胺配基和惰性壳层，其惰性壳层可以排阻大分子进入微粒内部，而较小的杂质可以通过壳层上的小孔(排阻分子量为700KD或400KD)进入核心与配基结合，因此在慢病毒载体纯化中采用流穿模式。
以下实施例中采用的试剂、耗材和仪器设备如非特别说明，均为本领域常规选择；未注明具体条件的实验方法，均为本领域的常规方法。常规选择和方法包括但不限于相关文献、书籍中报道或厂家推荐的条件和方法。
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件实施，或按材料供应商推荐的条件实施。尤其是为了保证实施例的可靠性，本发明在充分注意了一下操作的基础上完成：HEK-293T细胞在状态良好时使用；由于HEK-293T细胞贴壁性差，保证了操作过程轻柔、所用培养基进行预热；包装好的慢病毒收集后立即分装、低温保存，在4℃保存未超过一周；慢病毒使用期间，病毒液一直保持在冰盒上；操作中始终避免试剂污染。
以下的实施例中所用阳离子交换填料均为市面所售的阳离子交换填料，层析管柱为XK50/20，层析系统为AKTA pure 150层析系统。
实施例1
考察阳离子层析用于慢病毒载体纯化的表现，本实施例包括以下步骤：
1)制备慢病毒收获液：使用液氮罐中冻存的293T细胞，进行复苏后依次传代扩大培养，采用贴壁培养方式最终传代至4个十层细胞工厂中。将四种质粒按一定比例与转染试剂混合后转染细胞。转染后培养48h收获上清液约5L。
2)慢病毒收获液进行澄清和核酸酶消化：使用中空纤维柱对收获液进行澄清。澄清完成后加入全能核酸酶至终浓度为20U/ml，镁离子终浓度为1mM，放置于37℃孵育2小时。
3)对所述慢病毒载体澄清收获液采用阳离子层析：使用Cytiva公司生产的CaptoS填料装填层析柱，层析柱直径为5cm，装柱高度为5.1cm，装柱体积均为100ml。使用5CV的pH值7.5、含浓度为150mmol/L NaCl的缓冲液平衡层析柱；然后进行上样，上样流速为150cm/h，观察紫外吸收，收集透过液。当UV280吸光值开始升高时收集透过液。上样完成后，使用平衡缓冲溶液冲洗层析柱至UV280值回落至基线，结束收集透过液。收集液体积约5L。
4)取步骤(3)中层析前后慢病毒载体溶液进行慢病毒滴度(TU)、HCP、dsDNA检测。检测结果见下表1。
表1
滴度回收率 HCP去除率 dsDNA去除率
阳离子层析前后 90.8％ 31.53％ 84.21％
从上表可以看出，阳离子层析过程中，慢病毒载体不与阳离子填料结合，因此其活性滴度几乎没有损失。反而是HCP与dsDNA等杂质得到了去除。
实施例2
考察阳离子层析与超滤换液组合方式在慢病毒纯化中的表现，本实施例包括以下步骤：
1)制备慢病毒收获液：使用液氮罐中冻存的293T细胞，进行复苏后依次传代扩大培养，采用贴壁培养方式最终传代至4个十层细胞工厂中。将四种质粒按一定比例与转染试剂混合后转染细胞。转染后培养48h收获上清液约5L。
2)慢病毒收获液进行澄清和核酸酶消化：使用中空纤维柱对收获液进行澄清。澄清完成后加入全能核酸酶至终浓度为30U/ml，镁离子终浓度为2mM，放置于37℃孵育2h。
3)对所述慢病毒载体澄清收获液采用阳离子层析：使用Cytiva公司生产的CaptoS填料装填层析柱，层析柱直径为5cm，装柱高度为5.1cm，装柱体积均为100ml。使用5CV的pH值7.2、含浓度为150mmol/L NaCl的缓冲液平衡层析柱；然后进行上样，上样流速为150cm/h，观察紫外吸收，收集透过液。当UV280吸光值开始升高时收集透过液。上样完成后，使用平衡缓冲溶液冲洗层析柱至UV280值回落至基线，结束收集透过液。收集体积约5L。
4)慢病毒载体层析收集液进行缓冲体系置换并浓缩：使用膜孔径为750KD的中空纤维柱进行超滤换液，使用含浓度为150mmol/L NaCl的缓冲液进行换液，连续换液5倍体积，完成后进行浓缩，得到体积为200ml的慢病毒载体。
5)取步骤(4)中的慢病毒载体进行HCP、BSA、dsDNA检测。检测结果见下表2。
表2
HCP去除率 BSA去除率 dsDNA去除率
超滤前后 98.18％ 91.7％ 76.5％
从上表可以看出，即使含有高浓度血清的慢病毒液，在经过阳离子层析后，在超滤换液过程中杂质能够被更大程度的去除。
实施例3
考察阳离子层析、超滤换液和复合层析组合方式在慢病毒载体纯化中的表现，本实施例包括以下步骤：
1)制备慢病毒收获液：使用液氮罐中冻存的293T细胞，进行复苏后依次传代扩大培养，采用贴壁培养方式最终传代至4个十层细胞工厂中。将四种质粒按一定比例与转染试剂混合后转染细胞。转染后培养48h收获上清液约5L。
2)慢病毒收获液进行澄清和核酸酶消化：使用中空纤维柱对收获液进行澄清。澄清完成后加入全能核酸酶至终浓度为10U/ml，镁离子终浓度为2mM，放置于37℃孵育4h。
3)对所述慢病毒载体澄清收获液采用阳离子层析:使用Cytiva公司生产的CaptoS填料装填层析柱，层析柱直径为5cm，装柱高度为5.1cm，装柱体积均为100ml。使用5CV的pH值7.0、含浓度为150mmol/L NaCl的缓冲液平衡层析柱；然后进行上样，上样流速为150cm/h，观察紫外吸收，收集透过液。当UV280吸光值开始升高时收集透过液。上样完成后，使用平衡缓冲溶液冲洗层析柱至UV280值回落至基线，结束收集透过液。收集体积约5L。
4)慢病毒载体层析收集液进行缓冲体系置换并浓缩：使用膜孔径为300KD的中空纤维柱进行超滤换液，使用含浓度为150mmol/LNaCl的缓冲液进行换液，连续换液5倍体积，完成后进行浓缩，得到体积为100ml的慢病毒载体样品。
5)对步骤(4)所得到初纯慢病毒载体样品采用复合模式层析：使用DiamondLayer700层析填料对慢病毒载体样品进一步精纯。装载层析柱直径为2.6cm，柱高7.5cm，填料体积40ml，层析过程流速为113cm/h。首先使用pH值为7.0、150mmol/L NaCl缓冲液平衡层析柱，共平衡5CV。平衡完成后使用步骤(4)样品进行上样。上样完成后继续使用平衡液pH值为7.0、150mmol/L NaCl缓冲液冲洗层析柱直至紫外吸收下降至接近基线。在上样和冲洗过程中观察紫外吸收，收集流穿峰。
6)取步骤(5)中的慢病毒载体进行慢病毒滴度(TU)、HCP、BSA、dsDNA检测。检测结果见下表3。
表3
从上表可以看到，经阳离子层析、超滤换液与复合层析的组合模式纯化后的慢病毒载体，杂质含量降到了极低的水平，均优于市场上相关公司的水平，获得的慢病毒载体的纯度更高，更利于后续临床应用。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种慢病毒载体纯化方法，其特征在于，
对慢病毒载体溶液进行阳离子交换层析处理，
其中，所述慢病毒载体溶液包含带正电杂质。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其中，
所述阳离子交换层析处理使用的层析柱内填充有表面配基为pH值在3～11范围内任一pH值点、带负电的配基的填料。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其中，
所述阳离子交换层析处理采用流穿模式，
所述填料的孔径为10～600nm。
4.如权利要求2或3所述的纯化方法，其中，
所述阳离子交换层析处理以10～300cm/h上样流速进行上样。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其中，
所述上样前使用流量系数3～10CV、pH值6～8、含浓度为20～200mmol/L NaCl的缓冲液平衡所述层析柱。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其中，
所述带正电杂质包含阳离子有机大分子和/或包含阳离子有机大分子的复合物。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其中，
还包括配置在所述阳离子交换层析处理之前和/或之后的其他纯化方法，该其他纯化方法为从澄清、核酸酶消化、超滤、其他柱层析、过滤中任选的一个或多个的组合。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其中，
包括：
1)对慢病毒载体溶液进行澄清和/或核酸酶消化处理；
2)对1)处理后的溶液进行所述阳离子交换层析处理。
9.如权利要求8所述的纯化方法，其中，
还包括：
3)对2)处理后的溶液进行缓冲体系置换并浓缩。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其中，
还包括：
4)对3)处理后的溶液进行复合模式层析处理。
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