CN112175996A - 一种基因治疗载体的制备方法和用途 - Google Patents

一种基因治疗载体的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因治疗载体的制备方法，包括细胞培养及搅拌、病毒接种、细胞收集、超滤、离心、HiTrop Q HP脱盐、检测等步骤：所述细胞培养及搅拌为：将细胞培养于细胞培养基中；所述病毒接种为：将治疗病毒进行接种；所述细胞收集为：待细胞数达到需求，并经过检测后，对细胞进行收集；所述超滤为：将收集的细胞放入超滤管进行过滤；所述离心为：通过离心设备进行离心；所述HiTrop Q HP为：利用阴离子交换层析的方法重组病毒载体；所述脱盐为：利用层析柱脱盐。本发明通过阴离子交换层析的方法重组病毒载体可显著提高制备效率，且具有工艺简单、流程短、成本低的特点，对人类的遗传性疾病和后天获得性疾病进行基因治疗，治愈人类的各种难治性疾病。

Description

一种基因治疗载体的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因治疗载体制备技术领域，具体为一种基因治疗载体的制备方法和用途。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术；
遗传病的基因治疗(Gene Therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正缺陷基因而根治疾病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括:遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同:一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式:一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。基因治疗的靶细胞主要分为两大类:体细胞和生殖细胞，如今开展的基因治疗只限于体细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，如今更多地是采用体细胞基因治疗。体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥"治疗"作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以如今的观点看，骨髓胞是唯一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此，不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA 缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。
为了更好的制备基因治疗载体，我们提出一种基因治疗载体的制备方法。
发明内容
本发明提供一种基因治疗载体的制备方法可以有效解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基因治疗载体的制备方法，包括细胞培养及搅拌、病毒接种、细胞收集、超滤、离心、HiTrop Q HP 脱盐、检测等步骤：
A.所述细胞培养及搅拌为：将细胞培养于细胞培养基中；
B.所述病毒接种为：将治疗病毒进行接种。
C.所述细胞收集为：待细胞数达到需求，并经过检测后，对细胞进行收集；
D.所述超滤为：将收集的细胞放入超滤管进行过滤；
E.所述离心为：通过离心设备进行离心；
F.所述HiTrop Q HP为：利用阴离子交换层析的方法重组病毒载体；
G.所述脱盐为：利用层析柱脱盐；
H.所述检测为：将基因治疗载体对病毒细胞的作用进行实时检测。
进一步，所述步骤A中细胞培养基包括细胞培养的罐体和对罐体内的液体进行混合的混合机构，将细胞培养基放入无菌环境中。
进一步，所述混合机构设置为搅拌叶轮，搅拌叶轮的切片应光滑平整，不能有锋尖的叶面，避免搅拌时损伤培养细胞，搅拌的目的是保持细胞均匀呈悬浮状态生长，细胞的培养过程中的氧气、二氧化碳、pH值、葡萄糖浓度等参数的变化，随时调整和补充介质，每天观察细胞生长状态及检测生长密度。
进一步，所述步骤B中病毒可设置为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
进一步，所述病毒接种是种毒量按最后所需加入维持液体积的10％；如果用小塑料瓶种毒，一般该培养瓶加8-9ml培养液，加入0.8ml病毒即可，病毒加入后，盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让病毒液在细胞面上来回10几次；在对照细胞中，加入相同的0.8ml维持液。
进一步，所述步骤D中超滤采用截留分子量为50000～60000的超滤管进行过滤。
进一步，所述步骤E中离心设备的离心速率为5000～10000rpm，离心时间为1～30min。
进一步，所述步骤E中离心密度设置为1.1-1.4g/m3。
进一步，一种基因治疗载体的用途，所述基因治疗是指正常或野生的基因矫正或置换致病基因的治疗，利用载体将起治疗作用的基因导入靶细胞，使其与染色体整合为一体或在细胞中表达，从而起到治疗作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明通过阴离子交换层析的方法重组病毒载体可显著提高制备效率，且具有工艺简单、流程短、成本低的特点，对人类的遗传性疾病和后天获得性疾病进行基因治疗，彻底治愈人类的各种难治性疾病。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种基因治疗载体的制备方法，包括细胞培养及搅拌、病毒接种、细胞收集、超滤、离心、HiTrop Q HP脱盐、检测等步骤：
A.所述细胞培养及搅拌为：将细胞培养于细胞培养基中；
B.所述病毒接种为：将治疗病毒进行接种；种毒量按最后所需加入维持液体积的10％；如果用小塑料瓶种毒，一般该培养瓶加8-9ml培养液，加入 0.8ml病毒即可。病毒加入后，盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让病毒液在细胞面上来回10几次；在对照细胞中，加入相同的0.8ml维持液；
C.所述细胞收集为：待细胞数达到需求，并经过检测后，对细胞进行收集；
D.所述超滤为：将收集的细胞放入超滤管进行过滤；
E.所述离心为：通过离心设备进行离心；
F.所述HiTrop Q HP为：利用阴离子交换层析的方法重组病毒载体；
G.所述脱盐为：利用层析柱脱盐；
H.所述检测为：将基因治疗载体对病毒细胞的作用进行实时检测。
进一步，所述步骤A中细胞培养基包括细胞培养的罐体和对罐体内的液体进行混合的混合机构，将细胞培养基放入无菌环境中。
进一步，所述混合机构设置为搅拌叶轮，搅拌叶轮的切片应光滑平整，不能有锋尖的叶面，避免搅拌时损伤培养细胞，搅拌的目的是保持细胞均匀呈悬浮状态生长，细胞的培养过程中的氧气、二氧化碳、pH值、葡萄糖浓度等参数的变化，随时调整和补充介质，每天观察细胞生长状态及检测生长密度，细胞生长过程中的各种参数能自动由计算机程控连续监控显示。
进一步，所述步骤B中病毒可设置为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
进一步，所述步骤D中超滤采用截留分子量为50000～60000的超滤管进行过滤。
进一步，所述步骤E中离心设备的离心速率为5000～10000rpm，离心时间为1～30min。
进一步，所述步骤E中离心密度设置为1.1-1.4g/m3。
进一步，一种基因治疗载体的用途，所述基因治疗是指正常或野生的基因矫正或置换致病基因的治疗，利用载体将起治疗作用的基因导入靶细胞，使其与染色体整合为一体或在细胞中表达，从而起到治疗作用。
本申请通过阴离子交换层析的方法重组病毒载体可显著提高制备效率，且具有工艺简单、流程短、成本低的特点，对人类的遗传性疾病和后天获得性疾病进行基因治疗，彻底治愈人类的各种难治性疾病。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于，包括细胞培养及搅拌、病毒接种、细胞收集、超滤、离心、HiTrop Q HP脱盐、检测步骤：
A.所述细胞培养及搅拌为：将细胞培养于细胞培养基中；
B.所述病毒接种为：将治疗病毒进行接种；
C.所述细胞收集为：待细胞数达到需求，并经过检测后，对细胞进行收集；
D.所述超滤为：将收集的细胞放入超滤管进行过滤；
E.所述离心为：通过离心设备进行离心；
F.所述HiTrop Q HP为：利用阴离子交换层析的方法重组病毒载体；
G.所述脱盐为：利用层析柱脱盐；
H.所述检测为：将基因治疗载体对病毒细胞的作用进行实时检测。
2.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述步骤A中细胞培养基包括细胞培养的罐体和对罐体内的液体进行混合的混合机构，将细胞培养基放入无菌环境中。
3.根据权利要求2所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述混合机构设置为搅拌叶轮，搅拌叶轮的切片应光滑平整，不能有锋尖的叶面，避免搅拌时损伤培养细胞，搅拌的目的是保持细胞均匀呈悬浮状态生长，细胞的培养过程中的氧气、二氧化碳、pH值、葡萄糖浓度等参数的变化，随时调整和补充介质，每天观察细胞生长状态及检测生长密度。
4.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述步骤B中病毒可设置为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
5.根据权利要求4所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述病毒接种是种毒量按最后所需加入维持液体积的10％；如果用小塑料瓶种毒，一般该培养瓶加8-9ml培养液，加入0.8ml病毒即可，病毒加入后，盖上瓶塞，轻轻将摇晃瓶子，让病毒液在细胞面上来回10几次；在对照细胞中，加入相同的0.8ml维持液。
6.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述步骤D中超滤采用截留分子量为50000～60000的超滤管进行过滤。
7.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述步骤E中离心设备的离心速率为5000～10000rpm，离心时间为1～30min。
8.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的制备方法，其特征在于：所述步骤E中离心密度设置为1.1-1.4g/m3。
9.根据权利要求1所述的一种基因治疗载体的用途，其特征在于：所述基因治疗是指正常或野生的基因矫正或置换致病基因的治疗，利用载体将起治疗作用的基因导入靶细胞，使其与染色体整合为一体或在细胞中表达，从而起到治疗作用。
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