JP2021518757A - Gmpグレードでの組換えレンチウイルベクターの精製調製物の大規模調製のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 精製の対象となる組換えウイルスベクターを含む体積Vaの供給液である原料を提供する工程;
(b) 前記供給液に対して精密濾過処理を実施し、前記組換えウイルスベクターを含む体積Vbの精密濾過された濾液を得る工程;
(c) 必要に応じて、前記濾液を濃縮して、体積Vcの濃縮濾液を得る工程;
(d) 前工程で得られた濾液をクロマトグラフィにより精製し、組換えウイルスベクターを含む粗純生成物を得る工程;
(e) 前工程で得られた粗純生成物を液体交換し、精巧に精製して精製組換えウイルスベクターを得る工程。
(f) 前記精製組換えウイルスベクターを液体交換することにより、前記精製組換えウイルスベクターを、前記組換えウイルスベクターを含有するウイルス凍結培地に置置換する工程;
(g) 上記液体交換後に、前記ウイルスを濾過および滅菌して、滅菌組換えウイルスベクターを得る工程。
(p1) 前記組換えレンチウイルスベクターの生物学的力価が1.06x109 Tu/mLである;
(p2) BSA残渣<50ng/mL;
(p3) エンドトキシン<1EU/mL。
(S1) 精製される組換えレンチウイルスの原料を保持するための、任意の第1の容器;
(S2) 精製される組換えレンチウイルスの精密濾過処理を行い、精密濾過された濾液を得るために使用される、精密濾過ユニット;
(S3) 濃縮濾液を得るために濾液を濃縮するために使用される、任意の濃縮ユニット;
(S4) 前記精密濾過ユニット又は前記濃縮ユニットからの濾液をクロマトグラフィーにより精製して精製組換えレンチウイルスベクターを得るために使用される、クロマトグラフィー精製ユニット;
(S5) 前記精製された組換えレンチウイルスベクターを収集するために使用される、収集ユニット;
を含む。
(S6) リボザイムを添加するための添加装置を備えるリボザイム処理ユニット。
大規模かつ詳細な研究の後、精製条件の大量スクリーニングおよび探索を通して、本発明者らは、初めて優れた精製効果を有する組換えレンチウイルスのGMPグレード大規模精製のための迅速かつ単純な方法を予想外に開発した。本発明により提供される方法において、特定の精製培地および特定の精製工程および条件を使用することにより、組換えレンチウイルスを含有する製造原料は、非常に効率的、迅速かつ大規模な様式で精製され得、その結果、高い精製、より少ない不純物およびエンドトキシンを有さない組換えレンチウイルス調製物を得る。これにより、本発明が完成する。
本明細書中で使用される場合、用語「複合充填剤樹脂(composite filler resin)」は、Capto Q、Capto ImpRes、又はCapto DEAEをいう。
「Capto Core 700」を「Capto adhere ImpRes」と組み合わせてレンチウイルスを精製することにより、高純度レンチウイルス調製物を迅速に得ることができる。
(1) 飼料液の採取:レンチウイルス飼料液を採取。
a) 0.45〜0.8μM精密濾過中空繊維カラムをAKTA Flux 6システムに接続し、完全性を試験;
b) 接続状態のAKTA Flux 6システムを1M NaOHで滅菌;
c) AKTA Flux 6システムを注射用水で洗浄;
d) AKTA Flux 6システムを滅菌1XPBSで洗浄;
e) 20Lの組換えレンチウイルス供給液を供給液バケットに2バッチで注ぎ、精密濾過を行い、濾液を採取。
a) 300〜800K限外濾過中空繊維カラムとAKTA Flux 6システムを接続し、完全性を試験;
b) 接続したAKTA Flux 6システムを1M NaOHで滅菌;
c) AKTA Flux 6システムを注射用水で洗浄;
d) AKTA Flux 6システムを滅菌1XPBSで洗浄;
e) 精密濾過レンチウイルス供給液の限外濾過濃縮を300〜800K限外濾過カラム及びAKTA Flux 6システムで行い、濾液を廃棄;
f) レンチウイルス飼料液を20Lから1〜2Lに濃縮。
a) レンチウイルス供給液1〜2Lにヌクレアーゼを10〜1000U/mLの割合で添加し、よく混合;
b) 2〜8℃で一晩培養。
a) Capto Core700 500mLとCapto adhere ImpRes 500mLを連続的に接続し、AKTA pure150クロマトグラフィーシステムに設置;
b) 接続状態のAKTA Flux 150システムを1M NaOHで滅菌;
c) AKTA Flux 150システムを注射用水で洗浄;
d) AKTA pure150システムを滅菌レンチウイルス凍結培地で洗浄;
e) 残部;
f) 供給液1〜2Lを装填し、装填後の溶出には20〜50mM Tris−Cl/1〜1.5M NaClを使用し、溶出ピークを収集。
a) 300−800K限外濾過中空繊維カラムとAKTA Flux 6システムを接続し、試験の完全性を確認;
b) 接続状態のAKTA Flux 6システムを1M NaOHで滅菌;
c) AKTA Flux 6システムを注射用水で洗浄;
d) AKTA pure6システムを無菌レンチウイルス凍結培地で洗浄;
e) 300〜800K限外濾過中空糸カラム及びAKTA Flux 6システムで、精密濾過レンチウイルス供給液の限外濾過及び液交換を行い、濾液を廃棄;
f) 組換えレンチウイルスベクター100〜300mLを採取。
a) 精製レンチウイルス供給液を濾過するために0.2μMフィルターを使用;
b) 完成品を1mL/チューブに包装;
c) レンチウイルス製剤は超低温冷蔵庫(≦−70℃)で保存。
(1) 最終レンチウイルス製品の濃度2〜4×109/mL
(2) BSA <50ng/mL;
(3) HCP <1 ng/mL;
(4) 核酸残基<5pg/mL;
(5) RCL陰性。
0.45〜0.8μM精密濾過中空繊維カラム、300〜800K中空繊維カラムおよび「Capto Core700+Capto adhere Imp Res」複合充填剤を用いて、清澄濾過、濃縮、液体交換および不純物除去を段階的に行うことにより、高純度レンチウイルス調製物を迅速に得ることができた。
Claims (10)
- 組換えウイルスベクター調製物の大規模精製のための方法であって、以下の工程:
(a) 精製の対象となる組換えウイルスベクターを含む体積Vaの供給液である原料を提供する工程;
(b) 前記供給液に対して精密濾過処理を実施し、前記組換えウイルスベクターを含む体積Vbの精密濾過された濾液を得る工程;
(c) 必要に応じて、前記濾液を濃縮して、体積Vcの濃縮濾液を得る工程;
(d) 前工程で得られた濾液をクロマトグラフィにより精製し、組換えウイルスベクターを含む粗純生成物を得る工程;
(e) 前工程で得られた粗純生成物を液体交換し、精巧に精製して精製組換えウイルスベクターを得る工程;
を含み、
ここで、前記クロマトグラフィーは、陰イオンクロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィー、マルチモード複合樹脂クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせから選択される、方法。 - 前記アニオン性樹脂が、Capto Q、Capto ImpRes、およびCapto DEAEから選択される、請求項1に記載の方法。
- クロマトグラフィーによる精製が、陰イオンクロマトグラフィーにより一次精製を行い、次いで、マルチモード複合樹脂クロマトグラフィーの手段による精巧な精製を行うことである、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)において、精製された組換えレンチウイルスベクターが、以下の特徴のうち1つ以上を有する、請求項1に記載の方法:
(p1) 前記組換えレンチウイルスベクターの生物学的力価が1.06x109 Tu/mLである;
(p2) BSA残渣<50ng/mL;
(p3) エンドトキシン<1 EU/mL。 - 前記工程(c)において、濃縮を限外濾過により行う、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって調製された、精製組換えレンチウイルス。
- 請求項5に記載の精製組換えレンチウイルスを含む調製物。
- 請求項1に記載の方法で使用される精製装置であって、
(S1) 精製される組換えレンチウイルスの原料を保持するための、任意の第1の容器;
(S2) 精製される組換えレンチウイルスの精密濾過処理を行い、精密濾過された濾液を得るために使用される、精密濾過ユニット;
(S3) 濃縮濾液を得るために濾液を濃縮するために使用される、任意の濃縮ユニット;
(S4) 前記精密濾過ユニット又は前記濃縮ユニットからの濾液をクロマトグラフィーにより精製して精製組換えレンチウイルスベクターを得るために使用される、クロマトグラフィー精製ユニット;
(S5) 前記精製された組換えレンチウイルスベクターを収集するために使用される、収集ユニット;
を含む、精製装置。 - 前記クロマトグラフィー精製ユニットが、分子排除クロマトグラフィーユニットおよび陰イオンクロマトグラフィーユニットを含む、請求項8に記載の精製装置。
- (S6)リボザイムを添加するための添加装置を備えるリボザイム処理ユニットをさらに含む、請求項8に記載の精製装置。
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