ES2951678T3

ES2951678T3 - Transfección plasmídica a gran escala mediada por PEI

Info

Publication number: ES2951678T3
Application number: ES17791136T
Authority: ES
Inventors: Hanna Lesch; Anniina Valkama; Joonas Malinen; Eevi Lipponen; Hanna Leinonen
Original assignee: Trizell Ltd
Current assignee: Trizell Ltd
Priority date: 2017-04-03
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: US20190218495A1; CA3021045A1; WO2018007873A1; KR20190039021A; FI3497224T3; US11261416B2; CN109072252A; US20190031998A1; EP3497224A1; SG10202110989QA; WO2018007873A4; SG11201808700QA; EP3497224B1; KR20240025689A; US11242504B2; US20220364036A1; CN116144500A; KR20230022177A

Abstract

Hemos encontrado una manera de hacer posible la transfección de plásmidos a gran escala usando PEI para producir vectores virales de alto título en biorreactores de cultivo celular adherentes o de lecho fijo usando PEI como agente de transfección, evitando al mismo tiempo la formación del precipitado de plásmido PEI que en la técnica anterior se acerca a sustratos de biorreactor adherentes obstruidos. También hemos encontrado una manera de mejorar la transfección basada en PEI modificando cómo se manejan el pH y el CO2 durante la transfección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Transfección plasmídica a gran escala mediada por PEI

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud afirma prioridad a la solicitud del Tratado de Cooperación de Patentes n.° de serie WO2017/180341, presentada el 3 de abril de 2017, que a su vez afirma prioridad a la presentación de patente provisional de Estados Unidos n.° de serie 62/322651, presentada el 14 de abril de 2016.

Antecedentes

El documento WO2016/048556 analiza que la inoculación de un biorreactor de células adherentes con células no adherentes aumenta el límite de densidad de inoculación y reduce el tiempo de expansión requerido. Hanna et al. analizan el desarrollo del proceso de la producción de vector adenovírico en biorreactor de lecho fijo: de escala de poyata de laboratorio a escala comercial. Ansorge et al. analizan el desarrollo de un proceso que se puede cambiar de escala para producción de alto rendimiento de vector lentivírico mediante transfección transitoria de cultivos en suspensión de HEK293.

Muchos vectores usados en genoterapia, tales como vectores lentivíricos y virus adenoasociados (AAV) se producen normalmente cotransfectando células HEK 293T adherentes con varias construcciones plasmídicas diferentes (Follenzi y Naldini, 2002; Tiscomia et al., 2006; Chiorine et al. 1999). El reactivo más normalmente usado en transfección plasmídica es el fosfato de calcio (Tiscomia et al., 2006; Follenzi y Naldini, 2002; Reiser, 2000; Koldej et al., 2005; Naldini et al., 1996a; Sena-Esteves et al., 2004). Como alternativa, se han usado otros reactivos, como SUPERFECT™ basado en dendrímero activado (Coleman et al., 2003) o ácido N,N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES) (Karolewski et al., 2003). La transfección mediada por polietilenimina ("PEI") también ha logrado interés (Kuroda et al., 2009, Segura et al. 2007, Chahal et al. 2014).

Muchas aplicaciones aún se basan en estrategias bidimensionales (2D) de tipo de matraz tales como fábricas de células. El aumento de escala en producción en matraces está limitado por el espacio de producción requerido y las múltiples unidades hace que sea inviable manipularlas y dificulta supervisar/controlar las condiciones de cultivo. También se han intentado microsoportes (Wu et al., 2002), dispersados en suspensión, pero no se ha demostrado que sean suficientemente fáciles de manipular para garantizar crecimiento homogéneo. Una limitación crucial ha sido la expansión de una gran masa de células en un recipiente estático, un proceso con capacidad limitada de cambio de escala. Esta estrategia también necesita operaciones trabajosas para la separación y purificación del vector a partir de las células productoras posteriormente en el proceso. (Dormond et al., 2009).

El uso de biorreactores de lecho compactado ha proporcionado sistemas tridimensionales (3D) controlados, perfundibles con baja tensión de cizallamiento para células adherentes (y en suspensión) (Meuwly et al., 2007). Un biorreactor de lecho fijo novedoso, el iCELLis®, proporciona un desarrollo reciente que proporciona de 66 m2 a 500 m2 de un sustrato de matriz de tereftalato de polietileno (PET) para crecimiento de células adherentes (figura 1). (N.B.: En nuestra patente, se usa el término "sustrato" no en el sentido enzimológico de un compuesto que se cambia mediante una enzima, sino en el sentido de cultivo celular de un material que proporciona una superficie sólida a la que pueden adherirse las células y crecer en modo adherente, por ejemplo, una matriz polimérica u otro macrosoporte). El iCELLis® Nano se ha usado para una serie de aplicaciones de vector, tal como para producción de vacunas de AAV (Lennaertz et al., 2013), retrovirus (Wang et al., 2015), virus de la rabia, virus de la hepatitis-A y virus Chikungunya (Rajendran et al., 2014). Previamente, se evalúo por primera vez el biorreactor de lecho fijo iCELLis® para la fabricación de vectores Ad5 en una línea celular HEK₂93 (Lesch et al. 2015). El desarrollo del proceso se inició en un iCELLis® Nano y por primera vez se consiguió aumento de escala eficaz de la fabricación en el equipo a gran escala iCELLis® 500. A la vez, un hallazgo sorprendente fue usar técnicas de suspensión para expandir la masa de células para biorreactor adherente donde las células se fijaran en los macrosoportes y continuaran el crecimiento en un modo adherente (número de patente GB1417042.7 y documento WO2016/048556). Usando esta estrategia, iCELLis® 500 puede proporcionar hasta 500 m2 de área de cultivo celular en modo adherente para cumplir los requisitos de las buenas prácticas de fabricación (GMP) para la fabricación de producto a escala comercial.

Aunque están disponibles varias estrategias de suspensión para muchos virus (Kamen et al., 2004, Ferreira et al., 2005, Cortin et al. 2004, Liu et al., 2009), la línea celular adherente HEK₂93 o HEK₂93T a menudo es crucial porque la productividad del vector específico en modo adherente puede ser mucho mayor que en suspensión. El uso de FBS puede no ser una tendencia deseable, pero en alguna ocasión, la adición de FBS fue necesaria para aumentar la productividad y, por tanto, es esencial. Este fenómeno se ha observado previamente con adenovirus (lyer et al., 1999) y otros tipos de virus, especialmente con virus con envuelta. Por ejemplo, se mostró que los lípidos son un componente sérico clave durante la producción de vectores retrovíricos para aumentar el rendimiento y la estabilidad de los vectores (Rodrigues et al. 2009). Comprender el metabolismo celular y la privación de suero o remplazarlo con moléculas sintéticas son áreas de interés en constante aumento (Petiot et al., 2015). Además, hay algunas líneas celulares que no pueden crecer en modo de suspensión, de modo que los sistemas adherentes son la única posibilidad.

Está clara la necesidad de fabricación adherente a gran escala. El biorreactor de lecho fijo iCELLis® con matriz 3D de PET proporciona control homogéneo de los medios y un sistema eficaz de gasificación de la cámara volátil. El sistema proporciona un sistema de un solo uso (Single Use System - "SUS") que comprende un casete fácilmente desechable que aloja el sustrato de PET de cultivo adherente, combinado con capacidad de perfusión del medio y con control automatizado de agitación, temperatura, pH y oxígeno disuelto, que puede minimizar la variación de un lote a otro. Se ensayó el biorreactor de lecho fijo iCELLis® y se optimizó para la producción de adenovirus a pequeña escala y después se aumentó de escala a un biorreactor de 100 m2 a gran escala (Lesch et al. 2015). El iCELLis® 500 proporciona el proceso de una manera desechable con todas las sondas y tubos suministrados estériles y desechables. Es muy deseable para la fabricación de GMP, como con los sistemas desechables, que no haya requisitos reguladores para validar la limpieza y esterilización del equipo específico de producto. La preparación del equipo fue rápida y se minimizó el riesgo de contaminación con las transferencias de sistema cerrado. Fue fácil de configurar y usar.

El método de transfección transitoria a pequeña escala es de realización directa, versátil y evita el desarrollo lento de líneas celulares. También permite un ensayo fácil y rápido de diversos transgenes o pseudotipos (Sena-Esteves et al., 2004). La producción a gran escala adherente con transfección plasmídica se ha conseguido usando fábricas de células de 10 capas (Geraerts et al., 2005; Slepushkin et al., 2003). La capacidad de cambio de escala de cualquier estrategia de tipo de matraz, sin embargo, es limitada. Además, la capacidad de cambio de escala de la propia transfección puede llegar a ser problemática. Se ha averiguado recientemente la manera de usar un biorreactor de tipo iCELLis™ para la fabricación de lentivirus y AAV usando un sistema de producción basado en transfección plasmídica mediada por fosfato de calcio o PEI (figura 1). Se descubrió que un pH constante, proporcionado automáticamente en biorreactores disponibles en el mercado, si se usa durante la transfección, puede disminuir notablemente la eficacia de transfección (documento GB1417042.7 y documento WO2016/048556). Desde entonces, se han descubierto otras maneras contraintuitivas de mejorar la transfección mediada por PEI.

Se ha optimizado la transfección mediada por PEI encontrando varias nuevas estrategias para construir el complejo de ADN plasmídico y PEI. Nuestra investigación ha revelado que varias variables experimentales son cruciales para los resultados. Estas variables cruciales para los resultados incluyen el tiempo de mezcla, el tiempo de incubación, la concentración de ADN y el control del pH. Nuestros hallazgos son sorprendentes porque la técnica no muestra, incluso no insinúa, que alguna de estas variables sea importante en la transfección mediada por PEI a gran escala en volumen limitado.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama de flujo de las etapas del proceso para usar PEI en un biorreactor de lecho fijo novedoso, el biorreactor iCELLis™.

La figura 2 es un diagrama de flujo de las etapas del proceso para intercambiar el medio en un biorreactor de lecho fijo novedoso, el biorreactor iCELLis™.

La figura 3 muestra los resultados de nuestro ensayo inicial de transfección mediada por PEI solamente usando un plásmido y el reactivo de transfección PEIPro™ en matraces siguiendo las instrucciones del fabricante, en un biorreactor iCELLis™.

La figura 4 muestra la concentración de ADN en nuestra mezcla de transfección (es decir, el ADN plasmídico mezclado con PEI, antes de añadir esa mezcla a las células hospedadoras).

La figura 5 muestra el efecto de incubación prolongada (por mezcla) sobre el tamaño de partícula de ADN-plásmido.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para fabricar un vector lentivírico recombinante, comprendiendo el método:

(a) mezcla PEI y plásmido que codifica un vector lentivírico recombinante para formar una solución de transfección, en donde la solución de transfección se incuba durante significativamente más de 20 minutos, de modo que la solución de transfección no forme un precipitado de complejo de ADN-PEI; y después

(b) añadir líneas celulares a la solución de transfección en un biorreactor antes de que se complete la transfección y hacer recircular la solución de transfección hasta que la transfección esté sustancialmente completa, por lo que el plásmido transfecta las células de la línea para generar células productoras que producen el vector lentivírico recombinante; y después

(c) cultivar las células productoras en modo adherente en el biorreactor, en donde el biorreactor tiene un volumen de lecho fijo de al menos 5 litros y por el que las células productoras producen el vector lentivírico recombinante; y después

(d) recoger el vector lentivírico recombinante.

En algunas realizaciones, el plásmido está presente en una cantidad adecuada para producir una relación de PEI:ADN plasmídico de 1:1,5. En algunas realizaciones, la solución de transfección es de al menos 20 litros de volumen. En algunas realizaciones, la concentración de ADN plasmídico en la solución de transfección es de al menos 300 nanogramos de ADN por cm2. En algunas realizaciones, la concentración de ADN plasmídico en la solución de transfección es de no más de 400 nanogramos de ADN por cm2. En algunas realizaciones, la etapa (b) se caracteriza por cesar sustancialmente la adición de CO²a la solución de transfección, por lo que la PEI no reacciona sustancialmente con el CO². En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza en un biorreactor que tiene un mecanismo automático de control del pH, y en donde la etapa (b) se caracteriza por permitir que el pH del medio de cultivo baje de forma natural durante o justo después de la transfección, produciendo un medio de cultivo ligeramente ácido que evita la formación de precipitado de complejo de PEI-ADN. En algunas realizaciones, la solución de transfección se agita durante el tiempo de incubación para evitar la agregación.

Descripción

El fabricante de PEIPRO™ (Polyplus transfection) recomienda el uso de PEI a 1-6 μl de PEIPRO™ por 1 μg de ADN para células HEK₂93. Para células adherentes, la cantidad recomendada de ADN es 0,1-0,58 μg/cm2, dependiendo del tipo de matraz cuando la concentración total es hasta 0,029 μg/μl (Polyplus, protocolo de reactivo de transfección de ADN in vitro PEipro).

En primer lugar, lo hicimos "como indica" la técnica a pequeña escala. Surgió un problema cuando se intentó aumentar de escala, sin embargo, porque averiguamos que la estrategia recomendada por la técnica no funciona a gran escala cuando el volumen de trabajo es limitado. Inicialmente ensayamos la transfección mediada por PEI solamente usando un plásmido y reactivo de transfección PEIPRO™ en matraces siguiendo las instrucciones del fabricante (figura 3). Usamos una cantidad de ADN de 100 a 400 ng/cm2 evaluada usando una relación de ADN:PEI de 1:1. Los resultados mostraron que 300-400 ng/cm2 de concentración de ADN total conseguía la eficacia de transfección más alta (hasta un 98 % de células positivas) en nuestras células. La concentración de ADN en nuestra mezcla de transfección (es decir, el ADN plasmídico mezclado con PEI, antes de añadir esa mezcla a las células hospedadoras) que evaluamos fue de hasta 15 μg/ml. Además, usamos diferentes relaciones de PEI, y descubrimos que la relación de PEI tiene un efecto sobre la eficacia de transfección (figura 4). Descubrimos que la mejor eficacia de transfección se conseguía usando una relación de PEI:ADN de aproximadamente 1:1,5.

En nuestros siguientes experimentos, las concentraciones de ADN total por cm2 fueron las mismas, pero usamos ADN que contenía cuatro plásmidos diferentes, como se usa típicamente para la producción de vectores retrovíricos. La producción de virus mediante células productoras que se han transfectado con varios plásmidos es complicada porque las células productoras requieren un volumen mayor de ADN plasmídico (es decir, varias construcciones plasmídicas diferentes) que una producción típica de proteínas recombinantes donde se usa solamente un plásmido para expresar el polipéptido de interés. Descubrimos que los valores cuantitativos más altos se conseguían usando las mejores condiciones mostradas en un experimento previo.

La primera transfección plasmídica mediada por PEI en un biorreactor iCELLis™ se hizo por Lennaertz et al. cuando produjeron AAV en un biorreactor de lecho fijo de 0,53 m2. Sus resultados mostraron que la transfección plasmídica es factible en el biorreactor iCELLis® Nano a escala de laboratorio de baja altura de lecho (Lennaertz et al., 2013).

Nuestro siguiente objetivo fue ensayar la producción de virus usando el biorreactor de lecho fijo iCELLis™ con las mismas condiciones que en matraces (instrucciones del fabricante), pero esta vez usando el biorreactor iCELLis™ Nano más grande de 4 m2 (lecho fijo comparable para 500 m2 en iCELLis™ 500) (figura 1). Se observó sorprendentemente que realmente las condiciones de transfección recomendadas no se pueden cambiar de escala y no son aplicables para biorreactores iCELLis™, especialmente en biorreactores de mayor altura de lecho (>2 cm) debido a su limitado volumen de trabajo para un número de células totales alto si la cantidad de ADN tuviera que mantenerse igual por célula o por cm2. En otras palabras, si se hubiera usado la misma mezcla de transfección plasmídica, no habría cabido en el biorreactor o habría requerido un intercambio de medio completo durante la transfección. El iCELLis™ Nano es un equipo a pequeña escala donde el intercambio del medio completo puede hacerse rápido y no es una etapa limitante en un proceso. Por el contrario, en el iCELLis™ 500 a escala, el intercambio de medio completo no es una etapa práctica del proceso porque es lenta y puede influir en la viabilidad celular debido al hecho de que, durante el drenaje, la agitación es cerrada y las células en los soportes superiores están sin medio. Por tanto, había una necesidad de disminuir el volumen en la mezcla de transfección que diera lugar a mayor concentración de ADN (plasmídico) en una mezcla, pero se disminuyó la eficacia de transfección (serie 1, tabla 1). Fuimos capaces de evitar la formación de agregación por mezcla continua de la mezcla de ADN-PEI antes de añadirla a las células o con un tiempo de incubación más corto (tabla 1). Si hubiéramos mantenido la concentración de ADN igual en un iCELLis Nano que en los matraces, el total de 800 ml de mezcla de transfección hubiera necesitado que fuera el volumen de trabajo máximo en la escala del iCELLis Nano. Como alternativa, se requiere recirculación en el biorreactor de lecho fijo iCELLis cuando se usa una altura de lecho >4 cm. En un lecho fijo de 2 cm, una menor cantidad de células no requiere tantos plásmidos (mezcla de transfección) y, por tanto, el volumen del biorreactor no es un factor limitante. Por tanto, Lennaertzt et al. no afrontaron ningún problema en su transfección (Lennaertz et al. 2013). Ensayamos la transfección preparando la mezcla de plásmido-PEI en un gran volumen (menor concentración), y añadiéndola al biorreactor, pero como el volumen de trabajo del biorreactor estaba excedido, usamos un circuito de recirculación (figura 2) (serie 7, tabla 1).

Se observó otra sorpresa durante la transfección a gran escala. Después de añadir la mezcla de transfección al biorreactor, todo parecía normal, pero cuando se tomaban muestras del biorreactor, se observaba reacción química cuando el tubo de plásmido de forma normal "se hundía" o "fundía" debido a la muestra de medio con mezcla de transfección. Se descubrió que la PEI podía reacciona con el CO². En función de lo que sucedía y lo que se observaba, se concluyó que el flujo de CO²(control del pH) debe desactivarse para poder evitar cualquier reacción química en un biorreactor. Esto puede ser un importante aspecto de seguridad también.

Hemos descubierto varias maneras de optimizar la transfección plasmídica a gran escala para producir vectores víricos (o cualquier otro producto biológico) con alto valor cuantitativo en biorreactores (tales como, aunque sin limitación, el biorreactor de lecho fijo iCELLis®). También hemos descubierto una manera de mejorar la seguridad de la producción basada en PEI al controlar el flujo de CO²durante la transfección, y mediante corta incubación de la mezcla de transfección (ADN-PEI). Cuando el ADN (plasmídico) se mezcla con el reactivo de transfección, hemos descubierto que hay varios factores, que previamente no se sabía que influyen, que influyen en la eficacia de transfección, de hecho, tienen un efecto crucial para los resultados cuando la transfección se intenta a escala. Estos factores son:

1. Concentración de ADN plasmídico

2. Relación de PEI a ADN plasmídico

3. Tiempo de incubación

4. Mezcla durante la precipitación

5. Temperatura

6. Medio

7. pH

Las condiciones más óptimas pueden no ser prácticas de realizar a gran escala para transducir células en un biorreactor donde una densidad celular alta está en un volumen limitado relativo. Si hay necesidad de disminuir el volumen de la mezcla de transfección, una concentración aumentada de ADN plasmídico puede no conseguir la precipitación óptima de ADN-PEI, y puede dar lugar incluso o a agregación de ADN, convirtiendo el ADN en un agregado físico demasiado grande físicamente para transfectar apropiadamente una célula hospedadora. Para evitar la agregación, sorprendentemente hemos descubierto que es preferible un tiempo de incubación más corto de la mezcla de transfección antes de añadir la mezcla a las células. Este hallazgo fue sorprendente y contraintuitivo porque la técnica indica que, para aumentar la transfección, se debe aumentar el tiempo durante el que el plásmido se incuba con el reactivo de transfección hasta 20 min.

Mezcla continua de la mezcla de transfección (ADN-PEI) antes de la adición a las células

Asimismo, la práctica convencional en la técnica es combinar el ADN plasmídico y el reactivo de transfección, y permitir que la combinación repose, permitiendo la precipitación, porque se cree que la agitación interfiere con la precipitación formando, quizás moviendo físicamente el ADN plasmídico lejos de un reactivo de transfección. Descubrimos que, cuando se realiza a escala, permitir que la mezcla se asiente en clama es, de hecho, desfavorable, y la combinación debe agitarse o mezclarse durante el tiempo de incubación, preferiblemente agitarse o mezclarse durante sustancialmente todo el tiempo de incubación de transfección.

Mezcla continua e incubación prolongada de la mezcla de transfección (ADN-PEI) antes de la adición a las células

Asimismo, la técnica indica que la precipitación se completa sustancialmente en aproximadamente 20 minutos, de modo que se debe añadir la mezcla a las células a los 20 minutos. Como alternativa, descubrimos que, cuando se realiza a escala, la formación de complejo de ADN-PEI depende de la concentración relativa de cada uno, y la concentración de ambos en el medio. Por tanto, descubrimos sorprendentemente que, cuando se realiza a escala, la formación de complejo de ADN-PEI puede continuar durante más de veinte minutos, de modo que la transfección a escala puede requerir una incubación significativamente más larga que el periodo de 20 minutos recomendado por la técnica anterior. Para evitar la agregación, se prefiere agitar o mezclar la mezcla de transfección durante el tiempo de incubación. También se observó que prolongar el tiempo de incubación tiene un efecto sobre la formación del tamaño de partícula de ADN/PEI. Se observó que la incubación prolongada (mediante mezcla) está aumentando el tamaño de partícula hasta 35 min, pero disminuyendo el tamaño después de eso (figura 5).

Aumentar el volumen de transfección puede superarse añadiendo la mezcla de transfección al circuito de recirculación.

Como se menciona anteriormente, la técnica sugiere que la concentración aumentada de ADN puede dar lugar a agregación del ADN, haciendo que el ADN no esté disponible para transfección. La técnica indica reducir la concentración de ADN por perfusión, de hecho, eliminando por lavado el ADN del recipiente de transfección completamente. Esto funciona, pero desperdicia una tremenda cantidad de plásmido. Descubrimos sorprendentemente una manera en que se puede transfectar a escala y superar la cuestión el volumen limitado de la concentración excesiva de ADN por recirculación de la mezcla de transfección y el medio de cultivo durante la transfección (figura 2). Este hallazgo era contraintuitivo, porque la técnica sugería que la recirculación del medio de cultivo haría recircular una cantidad en exceso de ADN en el recipiente de transfección. De esta manera, el volumen de ADN-PEI puede aumentarse, reduciendo la concentración real de ADN-PEI durante el tiempo de mezcla/incubación y también después de añadir la mezcla al biorreactor.

Ensayamos la transfección usando el volumen de 200 ml cuando no se requería todo el medio potenciado. De esta manera, la concentración de ADN en una mezcla aumentaba de 0,015 μg/μl a 0,05 μg/μl. Cuando la PEI se mezcló con el plásmido, y se incubó 15-20 min a temperatura ambiente de acuerdo con el fabricante, se observó notable agregación de ADN visible. Típicamente los plásmidos y la PEI deben formar precipitación homogénea de color ópalo o "turbia" que pueda transfectar de forma eficaz las células. En nuestro caso, se formó agregación plasmídica grande visual durante la incubación. Además, la eficacia de transfección fue sorprendentemente baja (40 %, medida al muestrear soportes superiores desde el lecho fijo), y la productividad disminuyó. Aunque la mezcla debe incubarse para permitir que el ADN y la PEI formen una precipitación turbia, nuestro siguiente experimento se hizo limitando el tiempo de incubación (≤10 min) cuando se formó agregación "demasiado grande" menos problemática. Esto mejoró la eficacia de transfección. También se ensayó el aumento del volumen duplicando el volumen de mezcla de transfección en 480 ml cuando la concentración del ADN se disminuyó.

El reactivo de transfección puede ser PEIPro™ (PolyPlus), JetPEI™, PEI lineal o cualquier derivado de polietilenimina. También puede ser cualquier otro reactivo de transfección funcionalmente equivalente.

Ejemplos

Transfección plasmídica

Ensayamos la transfección usando el volumen de 200 ml cuando no se requería todo el medio potenciado. De esta manera, la concentración de ADN en una mezcla aumentaba de 0,015 μg/μl a 0,05 μg/μl. Cuando la PEI se mezcló con el plásmido, y se incubó 15-20 min a temperatura ambiente de acuerdo con el fabricante, se observó notable agregación de ADN visible (tabla 1). Típicamente, los plásmidos y la PEI deben formar precipitación homogénea de color ópalo o "turbia" que pueda transfectar de forma eficaz las células. En nuestro caso, se formó agregación plasmídica grande visual durante la incubación. Además, la eficacia de transfección fue sorprendentemente baja (40 %, medida al muestrear soportes superiores desde el lecho fijo), y la productividad disminuyó. Aunque la mezcla debe incubarse para permitir que el ADN y la PEI formen una precipitación turbia, nuestro siguiente experimento se hizo limitando el tiempo de incubación (≤10 min) cuando se formó agregación "demasiado grande" menos problemática. Esto mejoró la eficacia de transfección. También se ensayó el aumento del volumen duplicando el volumen de mezcla de transfección en 480 ml cuando la concentración del ADN se disminuyó. La mejor eficacia de transfección se consiguió cuando la concentración de ADN se aumentaba más y la mezcla de ADN-PEI se incubaba durante 7,5 minutos con mezcla, antes de la adición al biorreactor (tabla 1).

En primer lugar, ensayamos la transfección mediada por PEI solamente usando un plásmido y reactivo de transfección PEIPro™ en matraces siguiendo las instrucciones del fabricante (figura 3). Usamos una cantidad de ADN de 100 a 400 ng/cm2, evaluada usando una relación de ADN:PEI de 1:1. Los resultados mostraron que 300-400 ng/cm2 de concentración de ADN total conseguía la eficacia de transfección más alta (hasta un 98 % de células positivas) en nuestras células. La concentración de ADN en nuestra mezcla de transfección (es decir, el ADN plasmídico mezclado con PEI, antes de añadir esa mezcla a las células hospedadoras) que evaluamos fue de hasta 15 μg/ml. Además, usamos diferentes relaciones de PEI, y descubrimos que la relación de PEI tiene un efecto sobre la eficacia de transfección (figura 4). Descubrimos que la mejor eficacia de transfección se conseguía usando una relación de PEI:ADN de aproximadamente 1:1,5.

En nuestros siguientes experimentos, las concentraciones de ADN total por cm2 fueron las mismas, pero usamos ADN que contenía cuatro plásmidos diferentes, como se usa típicamente para la producción de vectores retrovíricos. La producción de virus mediante células productoras que se han transfectado con varios plásmidos es complicada porque las células productoras requieren un volumen mayor de ADN plasmídico (es decir, varias construcciones plasmídicas diferentes) que una producción típica de proteínas recombinantes donde se usa solamente un plásmido para expresar el polipéptido de interés. Descubrimos que los valores cuantitativos más altos se conseguían usando las mejores condiciones mostradas en un experimento previo (datos no mostrados).

El siguiente objetivo fue ensayar la producción de virus usando biorreactor de lecho fijo iCELLis™ con las mismas condiciones, pero esta vez usando el biorreactor iCELLis™ Nano más grande de 4 m2 (lecho fijo comparable para 500 m2 en iCELLis 500). Se observó que realmente las condiciones de transfección recomendadas no se pueden cambiar de escala y no son aplicables para biorreactores iCELLis™, especialmente en biorreactores de mayor altura de lecho (>2 cm) debido a su limitado volumen de trabajo para un número de células totales alto si la cantidad de ADN tuviera que mantenerse igual por célula o por cm2. En otras palabras, si se hubiera usado la misma mezcla de transfección plasmídica, no habría cabido en el biorreactor o habría requerido un intercambio de medio a completo durante la transfección. El iCELLis™ Nano es un equipo a pequeña escala donde el intercambio del medio completo puede hacerse rápido y no es una etapa limitante en un proceso. Por el contrario, a la escala de un iCELLis™ 500, el intercambio de medio completo no es una etapa práctica del proceso porque es lenta y puede influir en la viabilidad celular debido al hecho de que, durante el drenaje, la agitación es cerrada y las células en los soportes superiores están sin medio. Por tanto, había una necesidad de disminuir el volumen en la transfección que diera lugar a mayor concentración de ADN (plasmídico) en una mezcla. Si hubiéramos mantenido la concentración de ADN igual, el total de 800 ml de mezcla de transfección hubiera necesitado que fuera el volumen de trabajo máximo. Por tanto, ensayamos la transfección usando el volumen de 200 ml cuando no se requería todo el medio potenciado. De esta manera, la concentración de ADN en una mezcla aumentaba de 0,015 gg/gl a 0,05 gg/gl. Cuando la PEI se mezcló con el plásmido, y se incubó 15-20 minutos a temperatura ambiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se observó notable agregación de ADN visible. Típicamente los plásmidos y la PEI deben formar precipitación homogénea opalescente o "turbia" que pueda transfectar de forma eficaz las células. En nuestro caso, sin embargo, se formó agregación plasmídica grande visual durante la incubación. Además, la eficacia de transfección fue sorprendentemente baja (40 %, medida al muestrear soportes superiores desde el lecho fijo), y la productividad disminuyó. Aunque la mezcla debe incubarse para permitir que el ADN y la PEI formen una precipitación turbia, nuestro siguiente experimento se hizo limitando el tiempo de incubación (≤10 min) cuando se formó agregación "demasiado grande" menos problemática. Esto mejoró la eficacia de transfección. También se ensayó el aumento del volumen duplicando el volumen de mezcla de transfección en 480 ml cuando la concentración del ADN se disminuyó.

Se obtuvo mejora para las situaciones cuando la mezcla de transfección se agitó también durante la incubación. Concluimos que la agitación durante la incubación realmente está impidiendo la agregación grande cuando las moléculas precipitadas aún están en pequeño tamaño razonable y no puede formarse agregación grande. La formación de la precipitación estuvo seguida de Nanosight™ cuando la variación del tamaño y el número de partículas no puede supervisarse en función del movimiento del color pardo. Nuestra invención es contra el conocimiento común de que, cuando se hace transfección grande, se requiere mezcla continua o la incubación en reposo adicional tiene que ser más corta que lo recomendado (≤20 min).

Control del pH

Típicamente se proporcionan biorreactores con un control automático del pH para mantener el medio de cultivo a un pH constante, que añade automáticamente una solución básica (por ejemplo, una solución de bicarbonato de sodio) si el pH del medio de cultivo baja. Hemos mostrado previamente (número de patente GB 14/17042.7) que, durante la transfección, si el control automático del pH en el biorreactor iCELLis™ se deja operativo, entonces el biorreactor añadirá solución de base en el biorreactor, lo que provocará la formación de un precipitado en el biorreactor. Con la transfección por fosfato de calcio, el precipitado, que creemos que es un precipitado de ADN-sal, es indeseable porque obstruye el biorreactor e impide la productividad. Descubrimos que al deshabilitar el control automático del pH durante (antes o justo después) de la transfección y permitir que el pH del medio de cultivo baje de manera natural, el medio de cultivo ligeramente ácido evita la formación de precipitado y, por tanto, aumenta el rendimiento. Aquí hicimos la misma observación también con transfección basada en PEI de que hay una inactivación del control del pH porque, durante la transfección, el sistema añade automáticamente base al biorreactor y localmente esto puede provocar un cambio de pH alto y dar lugar a agregación o desprendimiento del ADN o PEI del complejo.

Modo de recirculación

Para encontrar las condiciones óptimas para transfección a gran escala, también ensayamos el método de recirculación cuando el biorreactor estaba equipado con recirculación en lugar de perfusion durante la transfección. Con el circuito de recirculación, la mitad de la mezcla de transfección se añadió al biorreactor y la otra mitad al medio de recirculación hasta que el volumen total fue de 1000 ml, y la mezcla se añadió al biorreactor al hacer recircular la mezcla de transfección a través del biorreactor. El circuito de recirculación se remplazó con perfusion 24 h postransfección ("PT"). Fue crucial apagar el control del pH. La eficacia de transfección fue comparable, pero podría no ser práctica de realizar y requiere cantidades aumentadas de medio (tabla 1, serie 7).

Mejora de la seguridad inactivando el CO²

Se observó otra sorpresa durante la transfección a gran escala. Se hizo mezcla de transfección que contenía ADN, PEI y medio sin FBS. Los controles de base y DO, así como la perfusión estaban INACTIVOS durante la transfección, pero el control de CO²estaba ACTIVO. Todo parecía funcionar, y los valores en la pantalla del iCELLis™ era como se suponía que tenían que ser. Nada más inusual se apreció en ese punto. Se tomó una muestra de 5 ml del biorreactor a las 14:00 en un tubo Falcon de 15 ml para las mediciones de glucosa y lactato. Antes de tomar la muestra, el tubo era de forma normal. Después de tomar la muestra, el operario que tomó la muestra estaba sujetando el tubo, mientras vaciaba el frasco de muestra de nuevo en el biorreactor. Después de 2-3 min, el operario observó el tubo que contenía la muestra y descubrió sorprendentemente que el tubo había cambiado su forma. Estaba hundido/aplanado, pero no eran visibles arañazos. Posteriormente, también un matraz Erlenmeyer de plástico que contenía la muestra del biorreactor parecía "fundirse" como por exceso de calor. La aparente "fusión", sin embargo, no estaba provocada por el calor. Se descubrió que la PEI puede reaccionar con el CO²provocando una reacción química. En función de lo que sucedía y lo que se observaba, se concluyó que el flujo de CO²debe desactivarse para poder evitar cualquier reacción química en un biorreactor. Esto puede ser un importante aspecto de seguridad también.

T l I imiz i n l r n f i n l infl n i n l fi i r n f i n l r n imi n l

Referencias:

Chahal PS, Schulze E, Tran R, Montes J, Kamen AA. (2014) Production of adeno-associated virus (AAV) serotypes by transient transfection of HEK₂93 cell suspension cultures for gene delivery.

Chiorini JA, Kim F, Yang L, Kotin RM. (1999) Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5.

Coleman, J.E., Huentelman, M.J., Kasparov, S., Metcalfe, B.L., Paton, J.F., Katovich, M.J., Semple-Rowland,S.L., y Raizada,M.K. (2003). Efficient large-scale production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors for use in vivo. Physiol Genomics 12, 221-228.

Cortin V, Thibault J, Jacob D, Garnier (2004) A. High-titer adenovirus vector production in 293S cell perfusion culture. Biotechnol Prog. 20(3):858-63.

Dormond E, Perrier M, Kamen A. (2009) From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield? Biotechnol Adv. 27(2):133-44.

Ferreira TB, Ferreira AL, Carrondo MJ, Alves PM. (2005) Effect of re-feed strategies and non-ammoniagenic medium on adenovirus production at high cell densities. J Biotechnol. 119(3):272-80.

Follenzi, A. y Naldini, L. (2002). Generation of HIV-1 derived lentiviral vectors. Methods Enzymol. 346, 454-465.

Geraerts, M., Michiels, M., Baekelandt, V., Debyser, Z., y Gijsbers, R. (2005). Upscaling of lentiviral vector production by tangential flow filtration. J. Gene Med. 7, 1299-1310.

Iyer P, Ostrove JM, Vacante D. (1999) Comparison of manufacturing techniques for adenovirus production. Cytotechnology. 30(1-3):169-72.

Karolewski, B.A., Watson, D.J., Parente, M.K., y Wolfe, J.H. (2003). Comparison of transfection conditions for a lentivirus vector produced in large volumes. Hum. Gene Ther. 14, 1287-1296.

Kamen A, Henry O. (2004) Development and optimization of an adenovirus production process. J Gene Med. 6 Suμl. 1: S184-S192.

Koldej, R., Cmielewski,P., Stocker, A., Parsons, D.W., y Anson, D.S. (2005). Optimisation of a multipartite human immunodeficiency virus based vector system; control of virus infectivity and large-scale production. J. Gene Med. 7, 1390-1399.

Kuroda, H., Kutner, R.H., Bazan, N.G., y Reiser, J. (2008). Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection. J. Virol. Methods.

Lennaertz, A., Knowles, S., Drugmand, JC., y Castillo, J. (2013) Viral vector production in the integrity® iCELLis® single-use fixed-bed bioreactor, from bench-scale to industrial scale. 7 (Suμl. 6), 59-60. 1 -1 -2013. BMC Proceedings. Lesch HP, Heikkila KM, Lipponen EM, Valonen P, Müller A, Rasanen E, Tuunanen T, Hassinen MM, Parker N, Karhinen M, Shaw R, Yla-Herttuala S. Process Development of Adenoviral Vector Production in Fixed Bed Bioreactor: From Bench to Commercial Scale. Hum Gene Ther. 2015 agosto; 26(8):560-71. doi: 10.1089/hum.2015.081.

Liu H, Liu XM, Li SC et al. (2009) A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J Biosci Bioeng. 107(5):524-9.

Meuwly F, Ruffieux PA, Kadouri A, von SU. (2007) Packed-bed bioreactors for mammalian cell culture: bioprocess and biomedical applications. Biotechnol Adv. 25(1):45-56.

Naldini, L., Blomer, U., Gage, F.H., Trono, D., y Verma, I.M. (1996a). Efficient transfer, integration, and sustained longterm expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93, 11382-11388.

Petiot E, Cuperlovic-Culf M, Shen CF, Kamen A. (2015) Influence of HEK₂93 metabolism on the production of viral vectors and vaccine. Vaccine. Nov 4; 33(44):5974-81.

Rajendran R, Lingala R, Vuppu SK et al. (2014) Assessment of packed bed bioreactor systems in the production of viral vaccines. AMB Express. 4:25.

Reiser, J. (2000). Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Ther. 7, 910 913.

Rodrigues AF, Carmo M, Alves PM, Coroadinha AS. (2009) Retroviral vector production under serum deprivation: The role of lipids. Biotechnol Bioeng. 104(6):1171 -81.

Segura, M.M., Garnier, A., Durocher, Y., Coelho,H., y Kamen, A. (2007). Production of lentiviral vectors by large-scale transient transfection of suspension cultures and affinity chromatography purification. Biotechnol. Bioeng. 98, 789-799. Sena-Esteves, M., Tebbets, J.C., Steffens, S., Crombleholme, T., y Flake, A.W. (2004). Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J. Virol. Methods 122, 131 -139.

Slepushkin, V., Chang,N., Cohen, R., Gan, Y., Jiang, B., Deausen, D., Berlinger, D., Binder, G., Andre, K., Humeau, L., y Dropulic, B. (2003). Large-scale Purification of a Lentiviral Vector by Size Exclusion Chromatography or Mustang Q Ion Exchange Capsule. BioProcessing Journal 2, 89-95.

Tiscornia, G., Singer,O., y Verma, I.M. (2006). Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1,241-245. Wu SC, Huang GY, Liu JH. (2002) Production of retrovirus and adenovirus vectors for gene therapy: a comparative study using microcarrier and stationary cell culture. Biotechnol Prog. 18(3) :617-22.

Wang, X., Olszewska, M., Qu, J., Wasielewska, T., Bartido, S., Hermetet, G., Sadelain, M., y Riviere, I (2015) Largescale Clinical-grade Retroviral Vector Production in a Fixed-Bed Bioreactor. 38[3], 127-135. 3-4-2015. J Immunother.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar un vector lentivírico recombinante, comprendiendo el método:

(a) mezcla PEI y plásmido que codifica un vector lentivírico recombinante para formar una solución de transfección, en donde la solución de transfección se incuba durante significativamente más de 20 minutos, de modo que la solución de transfección no forme un precipitado de complejo de ADN-PEI; y después (b) añadir líneas celulares a la solución de transfección en un biorreactor antes de que se complete la transfección y hacer recircular la solución de transfección hasta que la transfección esté sustancialmente completa, por lo que el plásmido transfecta las células de la línea para generar células productoras que producen el vector lentivírico recombinante; y después

(d) recoger el vector lentivírico recombinante.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el plásmido está presente en una cantidad adecuada para producir una relación de PEI:ADN plasmídico de 1:1,5.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la solución de transfección es de al menos 20 litros de volumen.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de ADN plasmídico en la solución de transfección es de al menos 300 nanogramos de ADN por cm2.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la concentración de ADN plasmídico en la solución de transfección no es de más de 400 nanogramos de ADN por cm2.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) se caracteriza por cesar sustancialmente la adición de CO²a la solución de transfección, por lo que la PEI no reacciona sustancialmente con el CO².

7. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) se realiza en un biorreactor que tiene un mecanismo automático de control del pH, y en donde la etapa (b) se caracteriza por permitir que el pH del medio de cultivo baje de forma natural durante o justo después de la transfección, produciendo un medio de cultivo ligeramente ácido que evita la formación de precipitado de complejo de PEI-ADN.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la solución de transfección se agita durante el tiempo de incubación para evitar la agregación.