MX2012007936A - Metodo para la produccion de vectores adenovirales del serotipo 26 del adenovirus. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para la producción a gran escala del adenovirus recombinante 26, utilizando sistemas de perfusión y la infección a densidades celulares muy elevadas.

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE VECTORES ADENOVIRALES DEL SEROTIPO 26 DEL ADENOVIRUS Campo de la Invención La invención se refiere al campo de la producción de adenovirus y cultivos celulares. Más particularmente, la misma se refiere a métodos mejorados para el cultivo de células de mamíferos, a la infección de estas células con el adenovirus y a la producción de partículas de adenovirus a partir de las mismas.

Antecedentes de la Invención Los desarrollos recientes en el campo de vacunación de ADN utilizando vectores virales recombinantes han creado la necesidad de una fabricación a gran escala de un material de grado clínico. Son necesarios procesos que sean capaces de proveer a los países del mundo menos y aún menos desarrollado con cantidades suficientes de vacunas a' base de adenovirus, recombinantes, para pelear, por ejemplo, contra el problema de la tuberculosis y la malaria en el mundo. Una evaluación del cohorte de nacimiento muestra que más de 150,000,000 nacimientos son esperados para los países del mundo menos y aún menos desarrollado en 2010-2015. Con base en este cohorte de nacimiento, la demanda anual proyectada para una vacuna podría alcanzar aproximadamente 1.5 x 1019 partículas del virus (VP, por sus siglas en inglés) sobre una base anual REF.232226 (http : //esa . un. org/unpp/index. asp?panel=2 ) .

Varios procesos para la producción de adenovirus han sido descritos. Estos procesos utilizan cultivos celulares adherentes en botellas para máquina centrífuga, fabricas de células ( unclon de Nunc o CellStack de Corning) , o Cubos de Células (Corning) . Los procesos de producción sobre los cultivos de las células adherentes no pueden satisfacer la demanda mundial de las vacunas a base de adenovirus. Por lo tanto, las células utilizadas en el proceso adherente son adaptadas a los cultivos en suspensión (por ejemplo las líneas celulares HEK293 y PER.ce0) . Con el uso de cultivos en suspensión es posible escalar hacia arriba los procesos de producción hasta biorreactores a escala grande. Los cultivos de las células en suspensión para la producción de adenovirus son logrados rutinariamente a una escala de entre 3 hasta 20 1 y un escalamiento hacia arriba exitoso ha sido reportado hasta 100 1 (Kamen et al., 2004) y 250 1 (Xie et al., 2003). Se reportan experimentos en los cuales el escalamiento hacia arriba hasta 10,000 1 es anticipado (Xie et al., 2003).

Sin embargo, un desventaja principal del escalámiento hasta 10,000 1 es la inversión elevada de capital (CAPEX) , que es necesaria para diseñar y construir una instalación de un biorreactor de 10,000 1. Además, él empeño de CAPEX de construir una instalación de 10,000 1, bajo las condiciones de BSL 2, debe ser realizada antes aún de saber si el producto será exitoso (Fase IV y más allá) . El costo total de inversión del capital para una instalación de un biorreactor de 10,000 1 es reportada entre €225,000,000 y €320,000,000 (Estape et al., 2006). Por lo tanto, la preparación a escala inferior, por ejemplo en biorreactores de 1000 1 o más pequeños, podría ser deseable.

Con el uso de los procesos existentes actualmente, más de 150 lotes a una escala de 1000 1 al año deben ser producidos para alcanzar el objetivo de 1.5 x 1019 VP/año. Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar los sistemas para la producción de adenovirus, para mejorar los rendimientos de las partículas de adenovirus para satisfacer la demanda mundial de vacunas de adenovirus, preferentemente a costos no prohibitivos.

Uno de los problemas encontrados en la optimización de la producción de adenovirus es el así llamado "efecto de la densidad celular". En la operación del modo por lotes, varias referencias sugieren la existencia de una densidad celular óptima en la infección para la producción de adenovirus. Lo óptimo radica entre 0.5 - 1 x 106 células/ml (Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004). Se ha mostrado para la producción de adenovirus (Ad5) en un biorreactor de tanque agitado por lotes que la productividad del virus para la célula permanece constante hasta alrededor de 0.9 x 106 células/ml, pero se reduce abruptamente alrededor de 1 x 106 células/ml (Altaras et al., 2005). Más allá de 2 x 106 células/ml, no fueron detectables ningunas partículas infecciosas. El punto de ruptura relacionado con la caída de la producción específica con las densidades celulares en la infección es dependiente del medio. Ningún medio comercial disponible hasta la fecha ha mostrado potencial para soportar rendimientos elevados de las partículas del virus, mientras que se mantiene la producción específica óptima a densidades de la célula más allá de 1 x 106 células/ml (Kamen et al., 2004). Las razones para esta caída no son conocidas todavía pero podría ser debido a una disponibilidad limitada de los nutrientes para la producción del virus, o debido a las concentraciones elevadas de los metabolitos que son inhibidores de la producción' del virus.

Para las operaciones alimentadas por lotes, la adición idéntica de glucosa, glutamina y aminoácidos, permitió infecciones a densidades celulares de hasta 2 x 106 células/ml. Sin embargo, las productividades logradas en las densidades de las células elevadas fueron inferiores que aquellas obtenidas con la infección a densidades celulares de 1 x 106 células/ml (Kamen et al., 2004).

En los procesos de perfusión, las células son retenidas en el biorreactor por las fibras huecas, filtros centrífugos o separadores acústicos mientras que el medio de cultivo es perfusionado a través del biorreactor. En estos procesos, las densidades celulares de >100 x 106 células/ml pueden ser alcanzadas algunas veces (por ejemplo, Yallop et al . , 2005) .

' Las células de la perfusión, infectadas, mostraron una pérdida prematura de las células durante la perfusión con un sistema de fibras huecas. Esto podría estar relacionado con su sensibilidad en el cizallamiento elevado debido a la infección viral (Cortin et al., 2004) . Las tensiones hidrodinámicas inducidas en la tubería, las fibras huecas, o la bomba peristáltica sobre las células infectadas, más frágiles, fue más probablemente la causa para este fenómeno. Puesto que las células infectadas son más frágiles, particularmente el separador acústico (Henry et al., 2004) ha sido sugerido que va a ser deseable si la perfusión va a ser mantenida de principio a fin de la fase de infección. Sin embargo, las infecciones efectuadas en el modo de perfusión podrían solamente ser mantenidas para densidades de la célula de hasta 3 x 106 células/ml, con una tasa de perfusión de 2 volúmenes/día. La infección a una densidad de las células de 6 x 106 células/ml, conduce a una reducción de cinco veces en una productividad específica (Henry et al., 2004).

A pesar del efecto de la densidad celular reportado, un reporte (Yuk et al., 2004) describe cultivos de perfusión exitosos de las células tumorales humanas como una plataforma de producción para los vectores adenovirales oncolíticos. Este reporte describió un proceso de perfusión de alta densidad de las células utilizando una tecnología de flujo tangencial alternativo (ATF, por sus siglas en inglés) . A una densidad de las células, viable, promedio, en la infección de 9 x 106 células HeLaS3/ml, una concentración viral promedio de aproximadamente 4 x 1011 VP/ml fue observada. Las células tumorales utilizadas en este reporte no van a ser preferidas como células de producción, puesto que el uso de las células tumorales puede plantear riesgos de seguridad cuando las partículas de adenovirus producidas sean administradas a los seres humanos. El adenovirus recombinante en este reporte estuvo basado sobre el Ad5. Tales adenovirus han limitado las posibilidades para su uso como vacunas puesto que una mayoría de la población humana contiene anticuerpos neutralizantes pre-existentes contra Ad5 , y los adenovirus recombinantes de otros serotipos por lo tanto son más adecuados para su uso como vacunas (véase, por ejemplo WO 00/70071) . Los adenovirus recombinantes especialmente ventajosos para su uso como vacunas incluyen Ad26 (WO 00/70071) .

Una información limitada, si es que existe alguna, está disponible para la producción a gran escala de los adenovirus recombinantes de otros serotipos que Ad5 , en particular para el serotipo 26 ventajoso. Algunas diferencias entre la producción de Ad35 y Ad5 a gran escala han sido descritas previamente por ejemplo en PCT/EP2009/064265. Las propiedades físicas algo diferentes del adenovirus recombinante de los serotipos diferentes pueden ocasionar diferencias en los procesos de producción. Tales diferencias potenciales pueden ser especialmente importantes a escala industrial, en donde aún las diferencias que parecen pequeñas a una escala pequeña pueden tener consecuencias económicas grandes a la escala contemplada para la producción de la demanda mundial anual . Por ejemplo, se mostró por el solicitante que el efecto de la densidad celular reportado para Ad5 fue diferente para Ad35 (PCT/EP2009/064265) . Por consiguiente, el rAd35 se propaga de manera diferente en las células productoras que rAd5 durante los procesos de producción a gran escala. Aparentemente, la propagación de los adenovirus de diferentes serotipos es muy impredecible .

Para satisfacer la demanda mundial de las vacunas del serotipo 26 (rAd26) del adenovirus recombinante, existe una necesidad de mejorar los sistemas para la producción de rAd26. La presente invención proporciona métodos mejorados para la producción industrial de rAd26.

Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado aquí que todavía otro serotipo, es decir, Ad26 se comporta de manera diferente que otros serotipos Ad5 y Ad35. Realmente, Ad26 tiende a mostrar un efecto de la densidad celular ligero, todavía no tan acentuado como el efecto de la densidad observado para Ad5. Además, las células que son infectadas con Ad26 tienden a crecer adicionalmente después de la infección, mientras que las células infectadas con Ad35 muestran una post-infección con un crecimiento reducido.

Estos resultados nuevamente sugieren que los procesos para los serotipos de adenovirus específicos pueden tener que ser sintonizados finamente para cada serotipo, para obtener resultados óptimos. La presente invención proporciona un sistema optimizado para la producción de rAd26 en términos del rendimiento, la calidad del rAd26 obtenido, y la facilidad de manejo de la recolección para el procesamiento corriente abajo.

La invención proporciona un método para la producción del serotipo 26 (rAd26) del adenovirus recombinante , el método comprende: a) cultivar las células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 células viables/ml y 16 x 106 células viables/ml con rAd26; c) cultivar adicionalmente las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd26; y d) recolectar el rAd26.

En ciertas modalidades las células en la etapa b) son infectadas con rAd26 a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 y 14 x 106 células viables/ml .

En ciertas modalidades preferidas, el sistema de perfusión en la etapa c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternativo (ATF) . En otras modalidades preferidas, el sistema de perfusión en la etapa a) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternativo (ATF) . En una modalidad preferida, el sistema de perfusión en ambas etapas a) y c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternativo (ATF) .

En ciertas modalidades, el método de la invención incluye además: e) purificar el rAd26. En las modalidades adicionales, el método comprende además: f) preparar una composición farmacéutica que contenga el rAd26 purificado.

En ciertas modalidades, el adenovirus recombinante carece de al menos una porción de la región El, y comprende el ácido nucleico heterólogo.

En las modalidades preferidas, la relación de la partícula física con respecto a la partícula infecciosa (VP/IU) del rAd26 producido es menor que 30:1, preferentemente menor que 20:1.

También es un aspecto de la invención proporcionar un método para la producción de al menos 1 x 1012 partículas del virus de rAd26 (VP)/ml, el método comprende: a) cultivar las células productoras en una suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 células viables/ml, y 16 x 106 células viables/ml con rAd26; c) cultivar adicionalmente las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd26, por lo cual la concentración de las partículas del virus de rAd26 alcanza al menos 10 x 1012 VP/ml; y d) recolectar el rAd26.

La invención también proporciona un biorreactor con un volumen de trabajo de entre 2 1 y 1000 1, que comprende: el medio de cultivo, las células productoras, y al menos 1 x 1012 partículas del virus rAd26 (VP)/ml. En ciertas modalidades, el biorreactor tiene un volumen de trabajo de entre 50 1 y 500 1. En las modalidades preferidas, el biorreactor está conectado a un sistema de perfusión de ATF.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la infección a una densidad celular elevada en los agitadores con rAd5.

La Figura 2 muestra la infección a una densidad celular elevada en los agitadores y el biorreactor de 2 1 con rAd35.TB-S.

La Figura 3 muestra la infección a una densidad celular elevada en los agitadores con rAd26.

La Figura 4 muestra el crecimiento celular post-infección con rAd26.

La Figura 5 muestra el crecimiento celular post-celular con rAd35.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención describe un nuevo proceso para la producción de grandes cantidades del adenovirus recombinante de rAd26. Este proceso optimizado radica en la capacidad para infectar los cultivos a una densidad celular elevada con la conservación de una productividad elevada del virus por célula. Con la misma, se ofrece un método para obtener una solución de un virus recolectado con una concentración del virus elevada en un solo biorreactor. Los rendimientos típicos de los procesos comunes para rAd26 son de aproximadamente 2-3 x 1011 VP/ml. Realmente, se cree que cantidades muy grandes de las partículas de rAd26 pueden ser producidas utilizando los procesos de la presente invención, por ejemplo cantidades de al menos aproximadamente 5 x 1011 VP/ml, preferentemente al menos aproximadamente 6, 7, 8, o 9 x 1011 VP/ml. Preferentemente, al menos 1 x 1012 VP/ml de rAd26 son producidos, más preferentemente al menos 1.5 x 1012 VP/ml, todavía más preferentemente al menos 2 x 1012 VP/ml, por ejemplo entre aproximadamente 1 x 1012 y 5 x 1012 VP/ml. Típicamente, el proceso no producirá más de aproximadamente 1 x 1013 VP/ml de rAd26. Los rendimientos que pueden ser obtenidos con los procesos de acuerdo con la presente invención, son de manera semejante suficiente para preparar la cantidad deseada de ciertas vacunas a base de rAd26 en el mundo, sin que se requieran instalaciones del biorreactor con volúmenes de trabajo más grandes que 1000 1.

La invención proporciona un método para producir el serotipo 26 del adenovirus recombinante (rAd26) , el método comprende: a) cultivar las células productoras en una suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de al menos 10 x 106 células viables/ml con rAd26; c) cultivar adicionalmente las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd26; y d) recolectar el rAd26.

En ciertas modalidades, las células en la etapa b) son infectadas con rAd26 a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 y 50 x 106 células viables/ml. En las modalidades adicionales, las células en la etapa b) son infectadas con rAd26 a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 y 20 x 106 células viables/ml. En todavía unas modalidades ventajosas, adicionales, las células en la etapa b) son infectadas con rAd26 a una densidad de entre aproximadamente 10 x 106 y 16 x 106 células viables/ml, por ejemplo aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14 o 15 x 106 células viables/ml .

Células Productoras y Adenovirus Recombinante Una célula productora (algunas veces también referida en el arte y aquí como "célula de empaque" o "célula de complemento" o "célula hospedera") de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier célula productora en donde un adenovirus deseado puede ser propagado. Por ejemplo, la propagación de los vectores de adenovirus recombinantes se hace en las células productoras que complementan las deficiencias en el adenovirus. Tales células productoras preferentemente tienen en su genoma al menos una secuencia del adenovirus El, y por esto son capaces de complementar los adenovirus recombinantes con una deleción en la región El. Además, los adenovirus pueden tener una deleción en la región E3 , que es desechable del genoma de Ad, y por consiguiente tal deleción no tiene que ser complementada. Cualquier célula productora del complemento de El puede ser utilizada, tal como las células de la retina humana inmortalizadas por las células El, por ejemplo las células 911 o PER.C6 (véase la patente US 5,994,128), los amniocitos transformados con El (véase la patente EP 1230354) , las células A549 transformadas con El (véase por ejemplo WO 98/39411, patente US 5,891,690), GH329 : HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, y semejantes. En ciertas modalidades, las células productoras son por ejemplo las células HEK293,. o las células PER.C6, o las células 911, o las células IT293SF, y semejantes. Preferentemente, las células PER.C6 (como se depositaron el 29 de febrero de 1996 bajo el número de depósito de ECACC 96022940 ante el European Collection of Cell Cultures, CAMR, Salisbury, itshire, UK; véase la patente US 5,994,128), o las células derivadas de las mismas son utilizadas como células productoras.

Se mostró aquí que el serotipo 35 (rAd35) del adenovirus recombinante , tiene hasta ahora propiedades ventajosas, no conocidas, comparado con rAd5 en los procesos que se aplican a la infección de una densidad elevada de las células. Ahora también ya se sabe que todavía otro serotipo (rAd26) nuevamente se comporta de manera diferente en los procesos semejantes que los dos serotipos mencionados previamente, sugiriendo que las condiciones óptimas para la producción a gran escala de los adenovirus recombinantes pueden tener que ser establecidas para diferentes serotipos. El adenovirus de la presente invención es rAd26.

Preferentemente, el vector adenoviral es deficiente en al menos una función genética esencial de la región de El, por ejemplo, la región de Ela y/o la región de Elb, del genoma adenoviral que es requerida para la replicación viral. En ciertas modalidades, el vector es deficiente en al menos una función del gen esencial de la región El y al menos parte de la región E3 no esencial. El vector adenoviral puede ser "deficiente en multipliegues " , significando que el vector adenoviral es deficiente en una o más funciones del gen esencial en cada una de las dos o más regiones del genoma adenoviral. Por ejemplo, los vectores adenovirales deficientes en El o deficientes en El-, E3 , mencionados anteriormente, pueden ser deficientes adicionalmente en al menos un gen esencial de la región E4 y/o al menos un gen esencial de la región E2 (por ejemplo, la región E2A y/o la región E2B) . Los vectores adenovirales delecionados de la región E4 completa pueden producir respuestas inmunológicas inferiores del huésped. Los ejemplos de los vectores adenovirales adecuados incluyen los vectores adenovirales que carecen de (a) la totalidad o una parte de la región El y la totalidad o una parte de la región E2 , (b) la totalidad o una parte de la región El, la totalidad o una parte de la región E2 , y la totalidad o una parte de la región E3, (c) la totalidad o una parte de la región El, la totalidad o una parte de la región E2 , la totalidad o una parte de la región E3, y la totalidad o una parte de la región E4 , (d) al menos una parte de la región Ela, al menos una parte de la región Elb, al menos una parte de la región E2a, y al menos una parte de la región E3, (e) al menos una parte de la región El, al menos una parte de la región E3 , y al menos una parte de la región E4 , y (f) esencialmente la totalidad de los productos del gen adenoviral (por ejemplo, los amplicones adenovirales que comprenden los ITRs y la señal de empaque solamente) . Como ya se sabe por una persona experta, en el caso de las deleciones de las regiones esenciales del genoma del adenovirus, las funciones codificadas por estas regiones tienen que ser provistas en trans, preferentemente por la célula productora, es decir cuando las partes o la totalidad de las regiones de El, E2 y/o E4 son delecionadas del adenovirus, estas tienen que estar presentes en la célula productora, por ejemplo integrada en el genoma, o en la forma del adenovirus así llamado auxiliador o los plásmidos auxiliadores .

En las modalidades adicionales, el adenovirus de la invención carece de al menos una porción de la región El, por ejemplo las regiones de codificación de ElA y/o E1B, y que comprende además el ácido nucleico heterólogo. El ácido nucleico heterólogo adecuado es bien conocido para la persona experta, y por ejemplo puede incluir los marcos de lectura abierta del transgen, por ejemplo los marcos de lectura abierta que codifican para los polipéptidos contra los cuales se desea una respuesta inmunológica cuando el vector de rAd es utilizado para propósitos de vacunación, por ejemplo los transgenes adecuados para generar una respuesta inmunológica contra la malaria (véase por ejemplo WO 2004/055187) , VIH, tuberculosis (véase por ejemplo WO 2006/053871), ciertos virus, etc., la totalidad de los cuales son bien conocidos por la persona experta. En efecto, la naturaleza del ácido nucleico heterólogo no es crítica para la presente invención, puede ser cualquier ácido nucleico heterólogo y por consiguiente no se necesita una elaboración adicional aquí.

La persona experta en el arte estará advertida de las posibilidades de propagar los vectores adenovirales de diferentes serotipos sobre las células hospederas específicas, utilizando los métodos tales como los descritos por ejemplo en la patente US 6,492,169 o WO 03/104467, y las referencias allí. Por ejemplo, para la propagación del rAd26 deficiente en El, las células productoras específicas que expresan E1B-55K de Ad26 pueden ser construidas, por ejemplo basado en las células productoras existentes que expresan ElA y E1B de Ad5 tales como las células PER.C6 o HEK293 (véase, por ejemplo US 6,492,169), como ya se sabe para la persona experta. Alternativamente, y de manera preferente, las líneas celulares complementarias existentes (Ad5-) tales como por ejemplo PER.C6 o HEK293 pueden ser utilizadas sin modificación de las células para la propagación de rAd26 deficiente en El, por la inclusión de la secuencia de codificación de E4-orf6 de Ad5 en el vector de rAd26, como se describe extensamente por ejemplo en WO 03/104467, incorporado en su totalidad para referencia aquí. Por consiguiente, la propagación de los vectores adenovirales de cualquier serotipo se puede hace sobre las células productoras utilizando los métodos y medios bien conocidos por la persona experta en el arte. Los vectores adenovirales, los métodos para la construcción de los mismos y los métodos para la propagación de los mismos, ya son conocidos en el arte y se describen, por ejemplo, en las patentes US Nos. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191, y 6,113,913, y Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication" , M. S. Hor itz, "Adenoviruses " , Capítulos 67 y 68, respectivamente, in Virology, B. N. Fields et al., eds . , 3/a. ed. , Raven Press, Ltd., New York (1996), y otras referencias mencionadas aquí.

La construcción de los vectores adenovirales es bien entendida en el arte e involucra el uso de las técnicas biológicas moleculares estándares, tales como aquellas descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2/a. ed. , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), atson et al., Recombinant DNA, 2/a. ed., Scientific American Books (1992), y Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology, iley Interscience Publxshers, NY (1995), y otras referencias mencionadas aquí .

Las células productoras de acuerdo con la invención son cultivadas para incrementar los números de las células y virus y/o las concentraciones de los virus. El cultivo de una célula se hace para hacer posible que la misma metabolice, y/o haga crecer y/o divida y/o produzca los virus de interés de acuerdo con la invención. Esto puede ser efectuado por los métodos tales como los que son bien conocidos por la persona experta en el arte, e incluyen pero no están limitados a la provisión de nutrientes para la célula, por ejemplo en el medio de cultivo apropiado. Se pueden utilizar diferentes medios de cultivo, y la selección del medio de cultivo óptimo para las células y las circunstancias utilizadas es parte de las tareas de rutina de la persona experta en este campo. El medio de cultivo adecuado para el propósito de la presente invención es por consiguiente bien conocido por la persona experta en el arte y generalmente puede ser obtenido de las fuentes comerciales en grandes cantidades, o de la manera acostumbrada de acuerdo con los protocolos estándares. El cultivo se puede hacer por ejemplo en placas, botellas para máquina centrífuga o en biorreactores , utilizando sistemas por lotes, de alimentación por lotes, continuos y semejantes. Para lograr la producción a gran escala (continua) de los virus a través del cultivo de las células se prefiere en el arte tener células capaces de crecer en suspensión, y se prefiere tener células capaces de ser cultivadas en la ausencia del suero derivado de un ser humano o animal o los componentes del suero derivados de un ser humano o animal . Las condiciones adecuadas para el cultivo de las células ya son conocidos (véase por ejemplo Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R. I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edición (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

Sistema de cultivo de las células y sistema de perfusión Los biorreactores han sido utilizados ampliamente para la producción a gran escala de productos biológicos a partir de los cultivos de las células de animales dependientes de la suspensión. De acuerdo con la invención, los biorreactores utilizados para la propagación del adenovirus pueden ser por ejemplo tanques agitados, biorreactores desechables, reactores suspendidos en el aire y semejantes. De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, el biorreactor es un tanque agitado.

De acuerdo con las modalidades de la invención, el biorreactor tiene un volumen de trabajo entre aproximadamente 2 1 y 2000 1, lo que significa aquí que incluye los valores límites superior e inferior descritos, es decir 2 1 que es el volumen de trabajo más pequeño y 2000 1 que es volumen de trabajo más grande. Los biorreactores que tienen un volumen de trabajo de cualquier valor individual entre estos valores se entiende que van a estar incluidos en la invención. El término "aproximadamente" para los valores numéricos como se utilizaron en la presente descripción significa el valor de + 10. En ciertas modalidades preferidas, el volumen de trabajo está entre 10 1 y 1000 1, preferentemente entre 20 1 y 800 1, por ejemplo entre 30 1 y 600 1, por ejemplo entre 50 1 y 500 1, por ejemplo aproximadamente 250 1 o aproximadamente 500 1. Una ventaja del uso de los biorreactores con un volumen de trabajo de acuerdo con la invención es que el uso de biorreactores de volumen muy grande, es decir aquellos con un volumen de trabajo «mucho mayor que 2000 1, preferentemente 1000 1, es evitado, y por consiguiente la enorme inversión de tiempo y capital en la construcción de tal biorreactor muy grande no es requerida. Además, el producto, es decir el rAd, es mucho más concentrado cuando se hace uso de los métodos de la presente invención, lo cual ahorra' tiempo y costos en la recolección y/o en el procesamiento de la corriente, corriente abajo, adicionales, de rAd desde los biorreactores. El volumen de trabajo es el volumen de cultivo efectivo en el biorreactor. Los tanques agitados generalmente tienen una relación de la altura con respecto al diámetro de 1:1 hasta 3:1. El cultivo es mezclado usualmente con uno o más agitadores, basado en los discos con álabes o configuraciones propulsoras marinas. Los sistemas agitadores . que ofrecen menores fuerzas de cizallamiento que los álabes ya han sido descritos. La agitación puede ser accionada ya sea directa o indirectamente por motores acoplados magnéticamente. Los medios de accionamiento indirectos reducen el riesgo de contaminación microbiana a través de los sellos sobre los ejes del agitador. La instrumentación y los controles de los biorreactores incluyen (sin limitación) : la agitación, la temperatura, el oxígeno disuelto, los controles del pH y de la biomasa. La agitación, el pH, la temperatura, la concentración del oxígeno disuelto del medio de cultivo celular en un principio no son críticos y dependen del tipo de celda elegida. Preferentemente, la agitación, el pH, la temperatura, la concentración del oxígeno disuelto son elegidos de tal modo que sean óptimos para el crecimiento de las células. La persona experta en el arte sabe cómo encontrar la agitación, el pH, la temperatura, la concentración del oxígeno disuelto, óptimos, para el cultivo. Usualmente, la agitación óptima está entre 50 y 300 rpm, por ejemplo 100-250 rpm, el pH óptimo está entre 6.7 y 7.7, la temperatura óptima entre 30 y 39 °C, por ejemplo 34, 35, 36, 37 o 38 °C.

La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala son operados como procesos por lotes o alimentados por lotes a causa de que los mismos son la mayoría dirigidos para la operación y el escalamiento hacia arriba. Sin embargo, los procesos continuos basados en los principios de perfusión están llegando a ser más comunes. De acuerdo con la presente invención, las células productoras son cultivadas en un sistema de perfusión. El cultivo por perfusión de las células tiene su significado convencional en el arte, es decir el mismo significa que durante el cultivo las células son detenidas por un dispositivo de separación en el cual existe un flujo de salida del líquido que tiene una densidad inferior de las células que previo a la separación y en el cual existe un flujo de entrada del medio de cultivo de las células. El uso del cultivo perfusionado es en respuesta al desafío de las células que crecen a densidades más elevadas (por ejemplo 10-50 x 106 células viables/ml) . Para incrementar las densidades más allá de 2-4 x 106 células viables/ml, el medio es reemplazado de manera constante, o intermitente, con un suministro fresco para establecer las deficiencias nutritivas y para remover los productos tóxicos. La perfusión también permite un mejor control del medio ambiente del cultivo (pH, d02, los niveles de los nutrientes, etc.). La perfusión del medio fresco a través del cultivo puede ser lograda reteniendo las células con una variedad de dispositivos de separación (por ejemplo un filtro centrífugo de malla fina, filtros de fibra hueca o de una membrana de placa plana, tubos de asentamiento) . En las modalidades preferidas del proceso de la presente invención, el dispositivo de separación es un módulo de filtración que comprende fibras huecas.

Con el término "fibra hueca" se entiende una membrana tubular. El diámetro interno del tubo. está preferentemente entre 0.3 y 6.0 mm, más preferentemente entre 0.5 y 3.0 mm, aún más preferentemente entre 0.5 y 2.0 mm. En ciertas modalidades, el tamaño de malla (tamaño de poro) en la membrana es elegido de tal modo que el tamaño de los poros en la malla esté cercano al diámetro de las células, asegurando una retención elevada de las células mientras que los desechos celulares pueden pasar el filtro. En otras modalidades, el tamaño de la malla es significativamente más pequeño que el diámetro de las células. Preferentemente, el tamaño de la malla está entre 0.1-30 pm, por ejemplo entre 0.1 y 3 µp?, por ejemplo aproximadamente 0.2 µp?. Los módulos de filtración que comprenden fibras huecas están disponibles comercialmente por ejemplo de la General Electric (antiguamente Amersham) . No se observaron cantidades significativas de las partículas de adenovirus en el medio de cultivo que fluye hace afuera durante el proceso de la presente invención, a pesar de que las partículas del virus son más pequeñas que el tamaño de malla aplicado.

La perfusión es utilizada para mantener los niveles deseados de ciertos metabolitos y para remover y por esto reducir las impurezas en el medio de cultivo. Las velocidades de perfusión pueden ser medidas de varias maneras, tal como en términos de los volúmenes de reemplazo/unidad de tiempo o en términos de los niveles de ciertos metabolitos, los cuales deben ser mantenidos, durante los periodos de perfusión. Este es típicamente el caso de que la perfusión no se lleve a cabo todas las veces durante el cultivo y generalmente se lleva a cabo solamente de tiempo en tiempo durante el cultivo cuando sea deseable. Por ejemplo, la perfusión no es iniciada típicamente sino hasta después de que ciertos componentes del medio tales como la glucosa empiecen a llegar a ser agotados y necesiten ser reemplazados.

Varios sistemas de perfusión ya son conocidos en el arte y en un principio son adecuados para los métodos de la presente invención. Con el término "sistema de perfusión" se entiende la combinación de un biorreactor conectado a un dispositivo de separación. El dispositivo de separación puede ser incorporado ya sea en el biorreactor (por ejemplo el filtro centrífugo de malla fina) o puede permanecer fuera del biorreactor (por ejemplo de fibra hueca) . En ambos casos, como se explicó anteriormente, el dispositivo de separación previene el retiro por lavado de la masa celular del reactor y hace posible el refresco del medio.

Los presentes inventores efectuaron experimentos piloto, con varios sistemas de perfusión de los cuales el sistema de perfusión de Flujo Tangencial Alternativo (ATF) proporcionó los mejores resultados. Por lo tanto, en una modalidad preferida, los biorreactores son operados con (conectados a) un sistema de perfusión de ATF (por ejemplo, un sistema ATF, Refine Technology, Co . , East Hanover, NJ) . El sistema consiste de una bomba de diafragma montada a un extremo de un alojamiento de la fibra hueca. El otro extremo del alojamiento está fijado a un ensamblaje de la junta, el cual, a su vez, está conectado a un biorreactor por medio de una abertura disponible. El sistema de control y de la bomba de diafragma sirve para generar un Flujo Tangencial Alternativo a través de las fibras huecas. Esto significa que existe un flujo en la misma dirección que (es decir es tangencial a) las superficies de la membrana de las fibras huecas, tal flujo se está realizando de atrás hacia delante, y porque existe otro flujo en una dirección substancialmente perpendicular a la superficie del filtro. El flujo tangencial puede ser logrado de acuerdo con los métodos conocidos por la persona experta en el arte y como se describe en, por ejemplo, US 6,544,424.

La operación del sistema de perfusión de ATF ya ha sido descrita (Furey, 2002) . Los sistemas de ATF permiten que las células sean cultivas durante un periodo de tiempo más prolongado y que alcancen densidades elevadas de las células sin tener un filtro bloqueado. Realmente, las densidades de las células extremadamente elevadas de arriba de 100 x 106 células viables/ml pueden ser obtenidas con el uso de un sistema de perfusión de ATF, por ejemplo con las células PER.C6 (véase por ejemplo Yallop et al) . Sin embargo, en los reportes previos se utilizaron las células PER.C6 en los sistemas de perfusión para un propósito completamente diferente y no se infectaron con los adenovirus .

Una ventaja adicional del sistema ATF es que el sistema genera una tensión de cizallamiento baja. La energía es agregada a la superficie del líquido, generando un flujo laminar de cizallamiento bajo. Esto puede ser una ventaja especialmente para la presente invención, en donde las células son infectadas con el adenovirus. Durante los procesos de perfusión, la post-infección, con el sistema ATF ninguna pérdida en la densidad celular fue encontrada y no se observó ninguna pérdida celular prematura, más bien en lugar de esto se observó un crecimiento celular. Puesto que las células permanecen intactas, son creadas las condiciones óptimas para la propagación del virus.

La perfusión con el sistema ATF por lo tanto es ventajosa durante la fase de precultivo (etapa "a" de acuerdo con la presente invención) , puesto que la misma permite obtener densidades muy elevadas de las células, y las células están en una buena condición para la infección subsiguiente con el adenovirus, contribuyendo posiblemente a los altos rendimientos obtenidos. Para alcanzar las densidades celulares elevadas, el medio de cultivo es perfusionado al menos parcialmente en ciertas modalidades durante una porción del tiempo durante el crecimiento celular de las células productoras (etapa a). En ciertas modalidades, la perfusión es iniciada una vez que una densidad celular entre aproximadamente 2 x 106 células viables/ml y 8 x 106 células viables/ml es alcanzada.

Además, la perfusión con el sistema ATF es ventajosa después de la etapa de infección (etapa c de acuerdo con la presente invención) , puesto que permite la obtención de rendimientos de adenovirus muy elevados desde las células infectadas. Por lo tanto en las modalidades preferidas, tanto la etapa del precultivo como la etapa de post-infección de los procesos de la invención emplean un sistema de perfusión de ATF. El volumen del medio de cultivo utilizado durante la ATF se puede hacer variar de acuerdo con las necesidades de las células que pueden ser establecidas y ajustadas fácilmente por la persona experta, y típicamente varía entre 0.5-5 volúmenes del recipiente/día (vol/d), por ejemplo entre 1-3 vol/d, por ejemplo aproximadamente 2 vol/d. En ciertas modalidades ventajosas, la velocidad de refresco o renovación está entre aproximadamente 1 y 2 vol/d, porque los inventores han mostrado aquí que esto proporciona resultados muy buenos en términos de los rendimientos y la calidad del rAd26 obtenido, mientras que al mismo tiempo el consumo del medio y por lo tanto los costos asociados con el mismo todavía son razonables.

Finalmente, el sistema de perfusión ATF es un sistema escalable. Las unidades de ATF de diferente tamaño están disponibles. Puesto que un flujo de aire es utilizado para impulsar el cultivo a través de la membrana de fibra hueca, se pueden generar velocidades de flujo tangenciales de cizallamiento bajo, muy rápidas, haciendo posible que la tecnología sea utilizada de R&D para escalar hacia arriba la producción hasta 1000 1 (Furey, 2002). Posiblemente, los desarrollos adicionales permitirán un escalamiento hacia arriba aún adicional del sistema de perfusión de ATF.

En Yuk et al, rAd5 es producido utilizando una línea de las células tumorales, y en la misma el proceso completo es efectuado en un solo biorreactor, lo cual toma aproximadamente 8-10 días en un biorreactor de producción. En ciertas modalidades de la presente invención, se utilizan dos biorreactores diferentes, uno para el precultivo (etapa a; biorreactor del precultivo) , y uno para la infección (etapa b) y un. cultivo post- infección (etapa c; biorreactor de producción) de las células. Una ventaja del uso de los dos biorreactores separados para estas etapas es que solo aproximadamente 1.5-6, típicamente de manera aproximada 4-5 días de cultivo en el biorreactor de producción son requeridos, y por lo tanto muchas más corridas pueden ser efectuadas por año. La adición de una gran cantidad del medio de cultivo fresco durante la infección es ventajosa además para la reducción del volumen del medio de cultivo requerido durante la perfusión en el biorreactor de producción. En las modalidades alternativas también es posible efectuar todas las etapas a-c de la invención en un solo biorreactor.

Infección En los métodos de la invención, las células productoras son infectadas con el adenovirus recombinante . Típicamente, el virus será expuesto a las células productoras apropiadas bajo las condiciones óptimas, permitiendo la absorción del virus. Las condiciones óptimas dependen del tipo de la célula y del tipo de adenovirus elegido. La persona experta en el arte sabe cómo encontrar las condiciones óptimas, es decir para la agitación, el pH, la temperatura, el oxígeno disuelto (d02 o DO) , la multiplicidad de infecciones (MOI) . Usualmente, la agitación óptima está entre aproximadamente 50 y 300 rpm, típicamente de manera aproximada 100-200, por ejemplo aproximadamente 150, el DO típico es de 20-60 %, por ejemplo 40 %, el pH óptimo está entre 6.7 y 7.7, la temperatura óptima entre 30 y 39 °C, por ejemplo 34-37 °C, y el MOI óptimo entre 5 y 1000, por ejemplo aproximadamente 50-300. Típicamente, el adenovirus infecta las células productoras espontáneamente y lleva a las células productoras en contacto con las partículas de rAd durante un periodo suficiente para la infección de las células. En general, una materia prima de una semilla de adenovirus es agregada al cultivo para iniciar la infección, y subsiguientemente el adenovirus se propaga en las células productoras. Esto es totalmente rutinario para la persona experta en el arte.

En una cierta modalidad de la presente invención, la perfusión es detenida previo a la infección y es reasumida después de entre 1 y 20 horas, por ejemplo 3-15 horas, por ejemplo 5 horas post- infección . Este retardo debe permitir que las partículas del virus se introduzcan a las células y previene que las partículas del virus sean retiradas por lavado del sistema. Las velocidades de perfusión, postinfección, son definidas en términos del nivel de glucosa que es mantenido por medio de la perfusión. Por ejemplo, en la presente invención la concentración de glucosa en el medio usualmente es mantenida a una concentración de entre aproximadamente 2 mmol/1 y 20 mmol/1, típicamente entre aproximadamente 5 y 10 mmol/1.

Ventajosamente, es posible infectar un biorreactor con rAd26 a densidades elevadas de las células, es decir más elevadas entonces que 10 x 106 células viables/ml, con la conservación de una productividad elevada del virus por células. En ciertas modalidades, la productividad específica permanece entre aproximadamente ,0.5 x 105 y 1.5 x 105 VP/célula.

Además, en la presente invención, la viabilidad del cultivo celular previo a la infección permanece más elevada que el 75 %. Lo cual significa que al menos 75 % de la cantidad total de las células en el cultivo está viable en el momento de la infección. En ciertas modalidades, la viabilidad del cultivo celular en la infección es de al menos 80 %, en las modalidades adicionales de al menos 85 %. La viabilidad puede ser medida utilizando los métodos de rutina disponibles para 'la persona experta, por ejemplo la exclusión del azul de tripano, el conteo de las células de Casy, y semejantes.

En una cierta modalidad, la densidad celular en la infección está entre aproximadamente 10 x 106 células y 50 x 106 células viables/ml, por ejemplo entre aproximadamente 10 x 10s y 20 x 106 células viables/ml, por ejemplo entre aproximadamente 10 x 10s y 15 x 106 células viables/ml, por ejemplo entre aproximadamente 10 x 106 y 14 x 106 células viables/ml. Estas densidades celulares permiten una productividad elevada del virus con una acumulación limitada de desechos celulares y el ADN de la célula hospedera, lo cual proporciona una ventaja de estas modalidades en el procesamiento corriente abajo de la recolección del adenovirus. Por consiguiente, la presente invención proporciona un proceso optimizado para la producción de rAd26, produciendo números elevados de las partículas de rAd26 de buena calidad, mientras que al mismo tiempo proporciona un material de recolección que todavía es manejable para los propósitos de procesamiento corriente abaj o .

Las infecciones en estas densidades celulares pueden producir concentraciones aún más elevadas del adeno'virus recombinante , en particular el rAd26, y sobrepasan los rendimientos para rAd26 descritos por consiguiente después. Como se muestra por primera vez en la presente descripción, en contraste con la infección de rAd5 a densidades celulares elevadas (arriba de 10 x 106 células viables/ml) , la infección con rAd26 a densidades arriba de 10 x 106 células viables/ml todavía incrementó la productividad volumétrica de rAd26 con densidades celulares crecientes hasta al menos 16 x 106 células viables/ml en la infección, utilizando las células productoras en la suspensión con un sistema de perfusión. En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método para la producción de al menos 1 x 1012 partículas del virus de rAd26 (VP)/ml.

Los procesos de la presente invención permiten la recuperación de rAd26. con una proporción de la partícula física con respecto a la partícula infecciosa de menos de 30:1, lo cual es un parámetro importante para el adenovirus que va a ser administrado a los seres humanos. Esto puede ser medido como una relación de la partícula del virus (VP) /unidad infecciosa (IU, por sus siglas en inglés), por ejemplo empleando un ensayo de QPA (Wang et al., 2005). Una proporción inferior es ventajosa puesto que menos partículas del virus necesitan ser administradas para infectar el mismo número de células en tal caso. Las regulaciones actuales de la FDA requieren una relación de VP/IU de menos de 30:1, y por consiguiente los procesos de la invención descritos aquí son adecuados para preparar números grandes de rAd26 que satisfagan este requerimiento particular. Los autores de Yuk et al (2004) reportaron números absolutos inferiores de las partículas del virus que los números descritos aquí, y además la relación de VP/IU de las muestras descritas en Yuk et al (2004) están redondeadas en 100 (Figuras 2A-2B en . Yuk et al, 2004) . En contraste, los presentes inventores reportan rendimientos más elevados absolutos y además significativamente mejores relaciones de VP/IU de abajo de 20:1. Por lo tanto, en ciertas modalidades preferidas, los procesos de la invención proporcionan lotes de rAd26 que tienen una proporción de VP/IU de menos de 20:1, por ejemplo entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 5:1.

Métodos de recolección de las células y lisis Después de la infección de un adenovirus, el virus se replica dentro de la célula y por esto es amplificado. La infección por el adenovirus conduce finalmente a la lisis de las células que son infectadas. Las características líticas del adenovirus permiten por lo tanto dos diferentes modos de producción del virus. El primer modo es la recolección del virus previo a la lisis de las células, empleando factores externos para lisar las células. El segundo modo es la recolección del sobrenadante del virus después (casi) de la lisis celular completa por el virus producido (véase por ejemplo la patente US 6,485,958, que describe la recolección del adenovirus sin la lisis de las células hospederas por un factor externo) . Para este último modo, los tiempos de incubación más prolongados son requeridos para lograr la lisis celular completa y por consiguiente rendimientos elevados del virus. Además, el derrame gradual de los contenidos de la célula hospedera en el medio puede ser perjudicial para la integridad y el rendimiento de los virus obtenidos. Por consiguiente, se prefieren emplear factores externos para lisar activamente las células para la recolección del adenovirus, de acuerdo con la invención.

Los métodos que pueden ser utilizados para activar la lisis celular ya son conocidos por la persona experta en el arte, y se han descrito por ejemplo en WO 98/22588, p. 28-35. Los métodos útiles a este respecto son .por ejemplo, congelamiento-congelamiento, cizallamiento en fase sólida, lisis hipertónica y/o hipotónica, cizallamiento en fase líquida, sonicación, extrusión a alta presión, la lisis del detergente, las combinaciones de los anteriores, y semejantes. En una modalidad de la invención, las células son lisadas utilizando al menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis tiene la ventaja de que es un método fácil, y que se puede escalar fácilmente.

Los detergentes que pueden ser utilizados, y la manera en que los mismos son empleados, ya son conocidos generalmente por la persona experta en el arte. Varios ejemplos se describen por ejemplo en WO 98/22588, p. 29-33. Los detergentes, como son utilizados aquí pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos , y no iónicos. Es evidente para la persona experta en el arte que la concentración del detergente se puede hacer variar, por ejemplo dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 %-5 % (p/p) . En una modalidad, el detergente utilizado es Tritón X-100.

La nucleasa puede ser empleada para remover los materiales contaminantes, es decir en su mayoría las células productoras, los ácidos nucleicos. Las nucleasas ejemplares para su uso en la presente invención incluyen Benzonase®, Pulmoxyme®, o cualquier otra DNasa y/o R asa utilizada comúnmente dentro del arte. En las modalidades preferidas, la nucleasa es Benzonase®, la cual hidroliza rápidamente los ácidos nucleicos por la hidrólisis de los enlaces de fosfodiéster internos entre los nucleótidos específicos, por lo cual se reduce la viscosidad del lisado celular. Benzonase® puede ser obtenido comercialmente de Merck KGaA (código W214950) . La concentración en la cual la nucleasa es empleada está preferentemente dentro del intervalo de 1-100 unidades/ml .

Los métodos para la recolección del adenovirus de los cultivos de las células productoras ya se han descrito extensamente en WO 2005/080556.

De acuerdo con la presente invención, el tiempo de recolección está entre aproximadamente 24 y 120 horas post-infección, por ejemplo entre aproximadamente 48 y 96 horas post-infección, por ejemplo 72 horas post-infección.

Métodos de purificación En ciertas modalidades, el adenovirus recolectado es purificado adicionalmente . La purificación del adenovirus puede ser efectuada en varias etapas que comprenden la aclaración, ultrafiltración, diafiltración o separación con cromatografía como se describe por ejemplo en WO 05/080556, incorporada aquí para referencia. La aclaración se puede hacer por una etapa de filtración, la remoción de los desechos celulares y otras impurezas del lisado celular. La ultrafiltración es utilizada para concentrar la solución del virus. La diafiltración, o el intercambio del amortiguador, utilizando ultrafiltros , es una manera para remover e intercambiar las sales, azúcares y semejantes. La persona experta en el arte sabe cómo encontrar las condiciones óptimas para cada etapa de purificación. También WO 98/22588, incorporada en su totalidad aquí para referencia, describe métodos para la producción y purificación de los vectores adenovirales . Los métodos comprenden hacer crecer las células hospederas, infectar las células hospederas con el adenovirus, recolectar y lisar las células hospederas, concentrar el lisado sin refinar, intercambiar el amortiguador del lisado sin refinar, tratar el lisado con la nucleasa y además purificar el virus utilizando cromatografía.

La purificación puede ser lograda por ejemplo por centrifugación con un gradiente de la densidad, como se describe por ejemplo en O 98/22588, p. 59-61.

Sin embargo, preferentemente, la purificación emplea al menos una etapa de cromatografía, como se describe por ejemplo en WO 98/22588, p. 61-70. Muchos procesos han sido descritos para la purificación adicional de los adenovirus, en donde las etapas de cromatografía están incluidas en el proceso. La persona experta en el arte estará conciente de estos procesos y puede hacer variar la manera exacta de emplear las etapas cromatográficas para optimizar el proceso.

Es posible por ejemplo purificar los adenovirus por las etapas de cromatografía de intercambio aniónico, véase por ejemplo WO 05/080556. Para la purificación del adenovirus, se prefiere utilizar al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Después de la etapa de cromatografía por intercambio aniónico, el virus puede ser suficientemente puro. Sin embargo, en ciertas modalidades, una etapa de cromatografía por exclusión de tamaño es efectuada adicionalmente para incrementar la robustez del proceso. Esta etapa puede ser previo a, o después de, la etapa de cromatografía por intercambio aniónico. Obviamente, otras etapas de purificación también pueden ser combinadas adecuadamente con una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

El uso de la cromatografía de intercambio aniónico para la purificación del adenovirus ha sido descrita extensamente, y por lo tanto este aspecto está muy adentro del alcance de la persona experta en el arte. Muchas matrices de cromatografía diferentes han sido empleadas para la purificación de los adenovirus y son adecuadas, y la persona experta en el arte puede encontrar fácilmente el material de intercambio aniónico óptimo para purificar el virus, guiado por ejemplo por el siguiente arte.

La patente US 5,837,520 (véase también Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) describe un método de purificación del adenovirus en donde el lisado de las células hospederas es tratado con una nucleasa, seguido por intercambio aniónico y cromatografía„de afinidad de iones metálicos.

La patente US 6,485,958 describe el uso de una cromatografía de intercambio aniónico fuerte para la purificación del adenovirus recombinante .

La cromatografía de intercambio aniónico ha sido empleada con columnas de lecho fluidizado para la purificación de las partículas del adenovirus, véase WO 00/50573. Además, la cromatografía por intercambio aniónico de lecho expandido, y ciertas resinas cromatográficas para la cromatografía por intercambio aniónico para la purificación de las partículas del adenovirus han sido descritas en la patente US 6,586,226.

Además de las columnas de intercambio aniónico, los productos de la cromatografía de membrana de intercambio aniónico tales como aquellos producidos por Pall (por ejemplo las series Mustang™) y Sartorius (por ejemplo las series Sartobind) son adecuadas. Para el uso de estos filtros y sus ventajas en la purificación del adenovirus véase por ejemplo WO 03/078592 y WO 2005/080556.

La patente US 6,537,793 describe la purificación de las partículas adenovirales a partir de las células hospederas utilizando cromatografía de intercambio iónico, en particular se enseña una preferencia por los tipos de Q Sepharose XL del soporte cromatográfico para este propósito. En una modalidad de la presente invención, un adenovirus es purificado adicionalmente utilizando una columna Q Sepharose XL .

El proceso de purificación también puede emplear adecuadamente una etapa de cromatografía por exclusión de tamaño .

La solicitud internacional O 97/08298 describe la purificación de los adenovirus utilizando ciertas matrices cromatográficas para prevenir el daño a los virus, incluyendo las etapas de intercambio aniónico y de exclusión de tamaño. La patente US 6,261,823 describe un método para purificar los adenovirus en donde la preparación de los adenovirus es sometida a cromatografía por intercambio aniónico seguida por cromatografía por exclusión de tamaño. En la etapa de exclusión de tamaño, una separación del grupo de las partículas virales de la impurezas de peso molecular bajo es lograda.

También es posible emplear un medio de hidroxiapatita para la purificación del adenovirus, véase WO 02/44348.

También podría ser utilizada una etapa de adsorción de fase inversa, como se describe por ejemplo en WO 03/097797, p. 26.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus utilizando ciertas matrices cromatográficas para prevenir el daño a los virus, incluyendo las etapas de intercambio aniónico y de exclusión de tamaño.

Ciertos métodos de ultrafiltración también son muy adecuados para la purificación del adenovirus, como se describe en WO 2006/108707. Tales etapas pueden ser efectuadas además de, o en lugar de, ciertas etapas de purificación cromatográfica .

Los métodos de purificación ventajosos adicionales para los adenovirus de los cultivos de densidad celular elevada han sido descritos por el solicitante en las solicitudes EP 09173090.3 y EP 09173119.0 como se presentaron el 15 de octubre de 2009, ambas incorporadas en su totalidad para referencia aquí.

Preparación de una preparación farmacéutica En ciertas modalidades, el adenovirus purificado es formulado en una composición farmacéutica. Esta se puede hacer de acuerdo con una variedad de métodos y utilizando una variedad de amor iguadores todo de acuerdo con los métodos de rutina bien conocidos por la persona experta en el arte. En general, el mismo abarca llevar a las partículas del adenovirus en una composición farmacéuticamente aceptable, que comprende el adenovirus y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede ser preparada bajo las condiciones conocidas por la persona experta, y en ciertas modalidades es adecuada para la administración a los seres humanos.

Por ejemplo, los adenovirus pueden ser intercambiados con el amortiguador durante la separación del grupo hasta - y finalmente almacenados en - el amortiguador que también es utilizado para los estándares mundiales de los adenovirus (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing marzo 2002, p. 43-48): 20 mM Tris pH 8, 25 m NaCl , 2.5 % glicerol.

Obviamente, muchos otros amortiguadores se pueden utilizar, y varios ejemplos de las formulaciones adecuadas para el almacenamiento y la administración farmacéuticas de las preparaciones de los (adeno) virus purificados se pueden encontrar por ejemplo en la patente Europea No. 0853660, las solicitudes de patente internacionales WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763.

En ciertas modalidades, los vectores del adenovirus son utilizados como vacunas, y estas son mantenidas típicamente en portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, y/o diluyentes. Los portadores o excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en el arte y utilizados extensamente en una amplia gama de productos terapéuticos. Preferentemente, los portadores que son aplicados son los que trabajan bien en las vacunas. Más preferentemente, las vacunas comprenden además un adyuvante. Los adyuvantes ya se sabe en el arte que incrementan adicionalmente la respuesta inmunológica a un determinante antigénico aplicado, y las composiciones farmacéuticas que comprenden el adenovirus y un adyuvante de fosfato de aluminio, se describen por ejemplo en WO 2007/110409.

Para la administración en los seres humanos la invención puede emplear las composiciones farmacéuticas que comprenden el rAd y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En el presente contexto, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador o excipiente, a las dosificaciones y concentraciones empleadas, no provocará ningún efecto indeseable o perjudicial a los sujetos a los cuales son administradas las mismas. Tales portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en el arte (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18/a. edición, A. R. Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company

[1990] ; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds . , Taylor & Francis

[2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3/a. edición, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press

[2000] ) . El rAd purificado preferentemente es formulado y administrado como una solución estéril aunque está dentro del alcance de esta invención utilizar las preparaciones liofilizadas . Las soluciones estériles son preparadas por filtración en condiciones estériles o por otros métodos conocidos per se en el arte. Las soluciones son liofilizadas o llenadas entonces en recipientes de dosificación farmacéutica. El pH de la solución generalmente está en el intervalo de pH 3.0 hasta 9.5, por ejemplo pH 5.0 a 7.5. El rAd típicamente está en una solución que tiene un amortiguador farmacéuticamente aceptable, adecuado, y la solución de rAd también puede contener una sal. Opcionalmente, el agente estabilizante puede estar presente, tal como la albúmina. En ciertas modalidades, se agrega un detergente. En ciertas modalidades, el rAd puede ser formulado en una preparación inyectable. Estas formulaciones contienen cantidades efectivas de rAd, que son ya sea soluciones líquidas estériles, suspensiones líquidas o versiones liofilizadas y contienen opcionalmente estabilizadores o excipientes.

La presente invención describe métodos para producir vectores adenovirales , en particular rAd26, con rendimientos muy elevados y siempre que estén concientes dé los rendimientos obtenidos y que se han descrito aquí no hayan sido reportados previamente. En los procesos de la invención, se utilizan biorreactores , y el biorreactor con un número muy elevado de partículas del adenovirus por volumen es un producto directo (intermedio) de la invención. Por lo tanto, la invención también proporciona un biorreactor con un volumen de trabajo de entre 2 1 y 2000 1, preferentemente entre 10 1 y 1000 1, que comprende: el medio de cultivo, las células productoras, y al menos 1 x 1012 partículas del virus rAd26 (VP)/ml. El medio de cultivo puede ser cualquier medio de cultivo adecuado para la propagación de las células y la infección para el adenovirus, como se describió anteriormente. Los aspectos del volumen del biorreactor, las células productoras y el número de partículas de rAd26 y la relación de VP/IU son como se describieron anteriormente para los métodos de la invención. En las modalidades preferidas, el biorreactor está conectado a un sistema de perfusión de ATF.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para la producción de al menos 1 x 1012 partículas del virus de adenovirus recombinante (VP)/ml, el método comprende: a) cultivar las células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre 10 x 106 células viables/ml y 15 x 106 células viables/ml con rAd26; c) cultivar adicionalmente las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd26, por lo cual la concentración de las partículas del virus de rAd26 alcanza al menos 1 x 1012 VP/ml; y d) cultivar el rAd26. Previo a la presente descripción, se desconoce si tales rendimientos elevados de rAd26 fueran factibles en su totalidad, mucho menos cómo se logran tales rendimientos elevados. La presente descripción de la invención menciona que estos rendimientos son posibles con los métodos descritos aquí. Preferentemente, la proporción de la partícula física con respecto a la partícula infecciosa del rAd26 es menor que 30:1. Las modalidades adicionales ventajosas son como se describen para los métodos de acuerdo con la invención como se mencionaron anteriormente.

La invención es explicada adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención de ninguna manera. Las mismas sirven solamente para aclarar la invención .

Ejemplos Ejemplo 1: Infección a densidades celulares elevadas con un vector Ad5.

A partir de las células de un banco de células de trabajo PER.C6®, las células fueron descongeladas y propagadas hacia un medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a un volumen de 1.5 1 y una densidad celular de 0.2 a 0.5 x 106 células viables/ml . Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. El proceso por perfusión de ATF fue iniciado a una densidad celular de 4.7 x 10s células totales/ml. El ATF fue de. Refine Technology, Co., East Hanover, NJ. Después de 89 horas se alcanza una densidad celular de 12.4 x 106 células totales/ml. En este momento, una parte de las células fueron recolectadas y las células fueron centrifugadas durante 5 minutos a 300 g. Las pelotillas de las células fueron resuspendidas a las siguientes concentraciones en el medio libre del suero fresco: - 1.3 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 10 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 20 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 30 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi Los agitadores fueron infectados con Ad5.CS (un vector rAd5; Shott et al., 2008) a un MOI de 90 VP/celda y se incuba a 36 °C, 10 % de C02 y 100 rpm. El refresco del medio el día 1 y 2 post-infección se efectuó para los agitadores infectados a 10, 20, y 30 x 106 células viables/ml. Este refresco del medio se efectuó por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y la re-suspensión de las pelotillas de las células en un medio fresco en una cantidad de 30 mi por agitador. El día 3 post-infección los agitadores fueron recolectados y muestreados para llevar a cabo el análisis de AEX-HPLC. La lisis celular del material recolectado se efectuó mezclando 1 mi del volumen de la muestra de cada agitador con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % e incubación a 37 °C · durante 30 minutos. Después de la incubación las muestran fueron mezcladas con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de ' incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se agregan 100 µ? de sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas abajo de -65 °C hasta que el análisis por AEX-HPLC fue efectuado para determinar el número de partículas producidas (VP)/ml. Los resultados son presentados en la Figura 1.

El rendimiento volumétrico de una infección a una densidad celular de 10 x 106 células viables/ml fue 10 veces más elevada entonces a 1 x 106 células viables/ml. Esto fue algo inesperado dado que el efecto de la densidad celular reportado en los reportes previos a densidades mucho más bajas (es decir, a aproximadamente 0.5-3 x 106 células viables/ml, por ejemplo aranga et al., 2005; Kamen et al., 2004; Ataras et al., 2005) . Sin embargo, pasadas las 10 x 106 células viables/ml un efecto de la densidad celular fue observado y los rendimientos volumétricos se redujeron. Por consiguiente, con el Ad5 recombinante un efecto de la densidad celular es observado en el sistema de perfusión.

Ejemplo 2: Infección con rAd35 a densidades celulares bajas (1-1.6 x 106 células viables/ml) .

En el ejemplo 1, se utilizó la rAd5. Sin embargo, ya se conocen los diferentes serotipos del adenovirus y han sido descritos para diferentes propósitos. Estos serotipos pueden tener diferentes propiedades, y por consiguiente los procesos útiles para un serotipo no necesariamente siempre son adecuados para otro serotipo. Esto puede ser especialmente relevante en los procesos a escala industrial, en donde parece que las diferencias pequeñas pueden ser económicamente de gran importancia. Un serotipo particularmente ventajoso para su uso en, por ejemplo, las vacunas es Ad35, y en los siguientes ejemplos se prueba la factibilidad de mejorar los rendimientos de rAd35 para obtener grandes cantidades del mismo. Este ejemplo muestra la infección con un vector rAd35 a densidades celulares bajas, como una comparación con los siguientes ejemplos en donde las células están infectadas a densidades celulares más elevadas.

Desde un banco de células de las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular los biorreactores de 10 1 a un volumen de 5 1 y a una densidad celular de 0.2 hasta 0.35 x 106 células viables/ml . Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. Cuatro días después de la inoculación (cuando una densidad celular se alcanza entre 2 hasta 3.5 x 106 células viables/ml) la suspensión celular se diluye con 5 1 del medio fresco y subsiguientemente se infecta con rAd35.TB-S (un vector rAd35; Radosevic et al, 2007) a una MOI de 70 VP/celda. La propagación del virus fue efectuada a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. Tres días después de la infección los biorreactores fueron muestreados para la determinación del conteo de las células y la producción del virus. Para la liberación del virus, 1 mi de la muestra de cada biorreactor fue mezclado con 100 µ? de Tritón X-1000 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, las muestras se mezclan con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se agregan 100 µ? de sucrosa al 50 % de las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura de abajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPL. Un total de diez corridas del biorreactor fueron efectuadas y analizadas de acuerdo con el proceso descrito anteriormente, y estas corridas proporcionaron resultados consistentes (no mostrados) . La producción de las partículas del virus, promedio, fue de 2.3 x 1011 VP/ml .

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP, con tal rendimiento, aproximadamente 65000 1 podrían haber sido procesados. Esto podría requerir grandes instalaciones y por lo tanto una inversión inicial grande durante el desarrollo de la vacuna.

Ejemplo 3: Estudio de factibilidad de un proceso de infección con rAd35 a densidades celulares elevadas (> 10 x 106 células viables/ml) .

Desde las células de un banco de trabajo, las células PER.C6e fueron descongeladas y propagadas en un medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a un volumen de 1.5 1 y una densidad celular de 0.2 hasta 0.5 x 106 células viables/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. La perfusión del medio fue empezada a una densidad celular de 6.8 x 106 células totales/ml, utilizando un sistema de ATF . Después de 70 horas se alcanza una densidad celular de 36.8 x 106 células totales/ml. En este momento, se efectúan las siguientes infecciones: Infección en los agitadores a densidades de la célula de: - 1.3 x 106 células viables/ml, 30 mi/agitador, dos agitadores de 250 mi - 10 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 20 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 30 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi • Infección a una escala del biorreactor de 2 1 a 8.7 x 106 células totales/ml (viabilidad del 84 %) - Una hora después de la infección del biorreactor, una muestra fue extraída del biorreactor y transferida a dos agitadores de 250 mi, 30 ml/agitador Para el proceso de infección en los agitadores de 250 mi, una parte de la suspensión celular del biorreactor de 2 1 fue recolectada y esta suspensión se centrifuga durante 5 minutos a 300 g. La pelotilla de células fue resuspendida a las concentraciones mencionadas anteriormente en el medio libre del suero, fresco. Los agitadores fueron infectados con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, 10 % de C02 y 100 rpm. Los días 1 y 2 post-infección se llevó a cabo el refresco del medio para los agitadores infectados a 10, 20, y 30 x 106 células viables/ml. Este refresco del medio fue efectuado por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y la re-suspensión de las pelotillas de las células en 30 mi del medio de refresco por agitador. El. día 3 post-infección, los agitadores fueron recolectados y muestreados para el análisis de AEX-HPLC. Las lisis de las células del material recolectado se efectuaron mezclando 1 mi del volumen de la muestra de cada agitador con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y la incubación a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, las muestras fueron mezcladas con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se agregan a las muestras 100 µ? de sucrosa al 50 %. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas abajo de -65 °C hasta que se efectuó el análisis por AEX-HPLC.

Las células restantes en el biorreactor de 2 1 se diluyen con el medio libre del suero, fresco, a una concentración celular de 8.7 x 106 células totales/ml (84 % de viabilidad) . El biorreactor fue infectado con Ad35.TB-S en un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. El sistema de ATF fue iniciado 15 horas después de la infección a una velocidad de refrescamiento del medio de un volumen del biorreactor por día. Los días 1, 2, 3, y 4 post-infección, el biorreactor fue · muestreado para la determinación del conteo de las células (contador de las células CASY) y la producción del virus por AEX-HPLC. La preparación de la muestra fue efectuada como se describió anteriormente. Las muestras fueron almacenadas abajo de -65 °C hasta que se efectuó el análisis por AEX-HPLC.

Aproximadamente una hora después de la infección del biorreactor, se tomó una muestra de al menos 60 mi del biorreactor de 2 1 y dos infecciones (en los agitadores de 250 mi) fueron iniciadas a un volumen de 30 mi por agitador. Los días 1 y 2 post-infección, el refresco del medio fue efectuado para imitar el sistema de perfusión. Este refresco del medio fue efectuado por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y la re-suspensión de las pelotillas de las células en 30 mi del medio de refresco por agitador. El día 3 post- infección, los agitadores fueron recolectados y muestreados para un análisis de AEX-HPLC. La preparación de la muestra fue efectuada como se describió anteriormente. Las muestras fueron almacenadas abajo de -65 °C hasta que se efectuó el análisis por AEX-HPLC.

Los resultados son presentados en la Figura 2. Los resultados muestran que la infección entre 1.3 x 106 células viables/ml y 30 x 106 células viables/ml es posible. En contraste con los resultados con rAd5 , los rendimientos totales de rAd35 se incrementaron con la densidad celular creciente en la infección aún arriba de 10 x 106 células viables/ml de las muestras. A 30 x 106 células viables/ml se alcanza un rendimiento volumétrico de 1.4 x 1012 VP/ml . Los resultados indican claramente que las infecciones con Ad35.TB-S a densidades celulares elevadas, es decir 10 x 106 células viables/ml o más elevadas, son posibles. Aún a 30 x 106 células viables/ml, las infecciones proporcionaron rendimientos volumétricos elevados . Se señala que una reducción es observada en la productividad unitaria desde 120,000 VP/celda a 1.3 x 106 células a 47,000 VP/celda a 30 x 106 células viables/ml. Los agitadores iniciaron a partir de una suspensión celular, la cual fue infectada en el biorreactor, muestran un rendimiento de la recolección de 8.0 x 1011 VP/ml y una productividad unitaria de 92,000 VP/celda. Los resultados en el biorreactor de 2 1 son algo inferiores : un rendimiento de la recolección de 5 x 1011 VP/ml fue obtenido, el cual es una productividad unitaria de 57,000 VP/celda.

Ejemplo 4: Experimentos del biorreactor de la infección a densidades celulares elevadas con un vector rAd35 1) A partir de un banco de células de trabajo PER.C6 , las células fueron descongeladas y propagadas en un medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 0.59 x 106 células viables/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2 1 a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. Cuando una densidad celular de aproximadamente 2.9 x 106 células totales/ml fue alcanzada (día 4 post-inoculación) un sistema de ATF fue iniciado. Después de 118 horas de perfusión, una densidad celular de 29 x 106 células totales/ml fue alcanzada. En este momento, una parte de la suspensión celular fue colectada y las células restantes fueron diluidas con el medio fresco en el biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 16.4 x 10s células totales/ml (82 % de viabilidad, por consiguiente 13.4 x 106 células viables/ml) . Subsiguientemente, el biorreactor de 2 ' 1 fue infectado con Ad35.TB-S a un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. El sistema de ATF fue iniciado 15 horas post-infección a una velocidad de refresco del medio de 2 volúmenes del recipiente por día. Los días 1, 2, y 3 post-infección, el biorreactor de 2 1 fue muestreado para realizar el conteo de las células y verificar la producción del virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus, 1 mi de la muestra fue mezclado con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, la muestra fue mezclada con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se agregan 100 µ? de sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura abajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados son presentados en la Tabla 2.

Los resultados demostraron que las infecciones a las densidades celulares arriba de 10 x 106 células viables/ml son factibles en los biorreactores acoplados a un sistema -de perfusión y que es posible incrementar el rendimiento volumétrico casi 10 veces comparado con un proceso por lotes (ejemplo 2) . Ninguna pérdida de células prematuras del cultivo infectado fue observada, indicando que el proceso de ATF es un sistema apropiado para el cultivo de las células infectadas .

Tabla 2: Resultados del ejemplo 4 (1) .

Un requerimiento de FDA para los lotes de rAd es una relación de VP/IU < 30. El análisis de QPA (ensayo de potencia a base de Q-.PCR; Wang et al, 2005) mostró que todas la muestras satisfacen este requerimiento. En contraste, las muestras descritas en Yuk et al (2004) tienen una relación de VP/IU de alrededor de 100 (figuras 2A/2B en la misma) . La relación de las partículas físicas con respecto a las partículas infecciosas es un parámetro relevante para los adenovirus, y una relación más baja es preferida para los lotes de Ad. Los lotes preparados en este ejemplo tienen consistentemente tal relación baja de menos de 10:1.

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP/ml y un rendimiento de aproximadamente 2 x 1012 VP/ml, menos de 7500 1 del material de recolección tienen que ser procesados. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1000 1 o menores, y podrían reducir por consiguiente el costo inicial comprometido durante el desarrollo de la vacuna. 2) Experimentos adicionales en un biorreactor de 2 1 A partir de un banco de células de trabajo de PER.C6®, las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 0.44 x 106 células totales/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2 1 a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. El sistema de ATF fue empezado 4 días post-inoculación a una densidad celular de aproximadamente 2.72 x 106 células totales/ml. Después de 144 horas de perfusión una densidad celular de 30.5 x 106 células totales/ml fue alcanzada. En este momento una parte de la suspensión celular fue recolectada y las células restantes fueron diluidas con el medio de refresco en el biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 16.2 x 106 células totales/ml (viabilidad del 81 %, por consiguiente 13.1 x 106 células viables/ml) . Subsiguientemente, el biorreactor de 2 1 fue infectado con Ad35.TB-S en un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. El sistema de ATF fue iniciado 5 horas post-infección a una velocidad de refresco del medio de 2 volúmenes del recipiente por día. Los días 2, 3, y 4 post-infección, el biorreactor de 2 1 fue muestreado para realizar el conteo de las células y para verificar la producción del virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus, 1 mi de la muestra se mezclan con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcla con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se agregan 100 µ? de* la sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura abajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados son presentados en la Tabla 3.

Tabla 3: Resultados del ejemplo 4(2).

Tabla 3 : (Cont . ) Día post- Conteo de las AEX-HPLC QPA AEX/QPA infección células (x 106 (VP(ml) (IU/ml) (VP/IU) células totales/ml) 3 24.60 2 20 x 1012 1.82 x 1011 12.1 4 16.26 1 90 x 1012 1.51 x 1011 12.5 veces comparado con un proceso por lotes (e emplo 2) .

Adicionalmente , este ejemplo demuestra que la velocidad de perfusión después de la infección puede ser limitada a 2 volúmenes del recipiente por día sin comprometer la producción del virus.

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP y con un rendimiento de aproximadamente 2 x 1012 VP/ml, menos de 7500 1 de la recolección tienen que ser procesados. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1000 1 o menores, y podrían reducir por consiguiente el costo inicial comprometido durante el desarrollo de la vacuna. 3) Experimentos adicionales en un biorreactor de 50 1 A partir de una banco de células de trabajo de PER.06®, las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 10 1 a una densidad celular de 0.52 x 106 células totales/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 10 1 a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. El sistema de ATF fue empezado cuando una densidad celular de aproximadamente 5.3 x 106 células totales/ml fue alcanzado (4 días postinoculación) . Después de 169 horas de perfusión a una densidad celular de 77 x 106 células totales/ml fue alcanzada. En este momento la suspensión celular, en una cantidad de 10 1 fue diluida con el medio de refresco en un biorreactor de 50 1 a una densidad celular de 15.5 x 106 células totales/ml (81 % de viabilidad, por consiguiente 12.6 x 106 células viables/ml) . Subsiguientemente, el biorreactor de 50 1 fue infectado con Ad35.TB-S a un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. El sistema de ATF fue iniciado 5 horas post- infección a una velocidad de refresco del medio de 2 volúmenes del recipiente por día. Los días 2 y 3 post-infección, el biorreactor de 50 1 fue muestreado para efectuar el conteo de las células y verificar la producción del virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus, 1 mi de la muestra se mezcló con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcla con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se agregan 100 µ? de la sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura abajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados son presentados en la Tabla 4.

Tabla 4: Resultados del ejemplo 4(3).

Los resultados demostraron que las infecciones a las densidades celulares arriba de 10 x 106 células viables/ml fueron factibles en los biorreactores de 50 1 acoplados a un sistema de perfusión y que fue posible a una escala de 50 1 incrementar el rendimiento volumétrico casi 10 veces comparado con un proceso por lotes (ejemplo 2). Se mostró con el presente que el proceso desarrollado podría ser escalado hacia arriba. Los volúmenes de recolección que pueden ser procesados por año para satisfacer la demanda anual del virus, pueden ser producidos con el proceso común. Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP y con un rendimiento de aproximadamente 2 x 1012 VP/ml, menos de 7500 1 del material de recolección tienen que ser procesados. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1000 1 o menores, y por consiguiente podrían reducir el costo inicial comprometido durante el desarrollo de la vacuna.

Ejemplo 5: Infección con rAd26 a densidades celulares (1-1.6 x 106 células viables/ml) .

Este ejemplo muestra la infección con un vector rAd26 que comprende un transgen de la malaria CS (rAd26.CS) a densidades celulares bajas, como una comparación con los ejemplos posteriores en donde las células son infectadas a densidades celulares más elevadas.

A partir de un banco de células de trabajo de PER.C6®, las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 10 1 a una densidad celular de 0.25 hasta 0.35 x 106 células viables/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2 1 a 37 °C, DO del 40 % y un pH de 7.3. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37 °C, DO del 40 %, un pH de 7.3. Tres días después de la inoculación (cuando una densidad celular fue alcanzada entre 1 a 2.1 x 106 células viables/ml) la suspensión celular fue diluida con 5 1 del medio fresco y subsiguientemente se infecta con un vector rAd26.CS a un MOI de 70 VP/celda. La propagación el virus se efectuó a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. Tres días después de la infección los biorreactores fueron muestreados para el conteo celular y la determinación de la producción del virus. Para liberar el virus, 1 mi de la muestra se mezcló con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación las muestras se mezclan con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se agregan 100 µ? de la sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura abajo de -65 "C hasta el análisis por AEX-HPLC. Un total de 5 corridas del biorreactor fueron efectuadas y analizadas de acuerdo con el proceso descrito anteriormente, y estas corridas proporcionaron resultados consistentes (no mostrados) . La producción de partículas del virus, promedio, fue de 7.6 x 1010 VP/ml.

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP, con tal rendimiento aproximadamente 197,000 1 podrían haber sido procesados anualmente. Eso podría requerir grandes instalaciones y por lo tanto una inversión inicial grande durante el desarrollo de la vacuna.

Ejemplo 6: Factibilidad de infección a densidades celulares elevadas con el vector rAd26 La factibilidad de la infección a las densidades celulares elevadas con Ad35 fue evaluada previamente y se mostró que la producción de Ad35 podría ser escalada hacia arriba. Puesto que existen diferencias substanciales entre los serotipos del adenovirus, se probó aquí si la producción de Ad26 por la infección de los cultivos con densidades celulares elevadas fue factible.

De un banco de células de trabajo de PER.C6 , las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador humidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a un volumen de 1.5 1 y a una densidad celular de 0.5 x 106 células viables/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37 °C, DO del 40 %, y un pH de 7.3. El proceso de perfusión por ATF fue iniciado a una densidad de 3.6 x 106 células totales/ml . Después de 120 horas se alcanza una densidad celular de 21.6 x 106 células totales/ml. En este momento, una parte de las células fue recolectada. Las células fueron centrifugadas durante 5 minutos a 300 g y las pelotillas de las células se vuelven a suspender a las siguientes concentraciones en el medio libre del suero fresco: - 1.3 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 10 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 20 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi - 30 x 106 células viables/ml, 30 ml/agitador, dos agitadores de 250 mi Los agitadores fueron infectados con rAd26.CS a un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, 10 % de C02 y 100 rpm. Los días 1 y 2 post-infección el refresco del medio fue efectuado para los agitadores infectados a 10, 20, y 30 x 10s células viables/ml. Este refresco del medio fue efectuado por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y la resuspensión de las pelotillas de las células en 30 mi del medio fresco por agitador. El día 3 post- infección, los agitadores fueron recolectados y muestreados para el análisis por AEX-HPLC. La lisis celular del material recolectado se efectuó por el mezclado de 1 mi del volumen de la muestra de cada agitador con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % de incubación a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación las muestras fueron mezcladas con 2.42 µ? de benzonasa/MgCl2 seguido por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se agregan 100 µ? de sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas abajo de -65 °C hasta que el análisis por AEX-HPLC fue efectuado. Los resultados son presentados en la Figura 3 y muestran que las células de infección con Ad26 a una densidad celular de hasta 30 x 106 células viables/ml fue factible. Los rendimientos volumétricos de rAd26 fueron más elevados que los rendimientos obtenidos con por ejemplo Ad5.

En contraste con los resultados con rAd35, un efecto sobre la densidad celular fue observado a las densidades celulares más elevadas que 10 x 106 células viables/ml. Realmente, el rAd26 tiene rendimientos incrementados cuando se aumentan las densidades celulares en la infección arriba de 10 x 106 células viables/ml, y los rendimientos se reducen en el intervalo de 20 x 106 - 30 x 106 células viables/ml.

Basado en el efecto de la densidad celular observada, una densidad celular óptima en la infección podría ser determinada para Ad26. El punto óptimo radica dentro del intervalo de 10-16 x 106 células viables/ml. Los rendimientos volumétricos de rAd26 obtenidos por la infección de las células en el intervalo fueron substancialmente más elevados cuando se compara con los rendimientos volumétricos obtenidos infectando las células a densidades celulares bajas (por ejemplo en un. proceso por lotes) . Realmente, el rendimiento obtenido a una densidad celular baja en el ejemplo 5 fue igual a 7.6 x 1010 VP/ml, mientras que a las densidades celulares elevadas en la infección, los rendimientos alcanzaron hasta 1-2 x 1012 VP/ml (véase el ejemplo 7) . La infección en el intervalo permite tener un proceso altamente productivo que puede ser utilizado a escalas de producción grandes.

Ejemplo 7: Infección a densidades celulares elevadas de las células con un vector rAd26 en un biorreactor De un banco de células de trabajo de PER. C6®, las células fueron descongeladas y propagadas en el medio de cultivo libre del suero en un incubador hutnidificado a 37 °C y 10 % de C02. El subcultivo fue efectuado cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente fue alcanzada para inocular un biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 0.6 x 106 células totales/ml. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2 1 a 37 °C DO del 40 %, y un pH de 7.3. El sistema ATF fue iniciado a los 2 días post-inoculación a una densidad celular de aproximadamente 2 x 106 células totales/ml. Después de 7 días de perfusión una densidad celular de 19.1 x 106 células totales/ml fue alcanzada. En este momento una parte de la suspensión celular fue recolectada y las células restantes se diluyen con el medio fresco en el biorreactor de 2 1 a una densidad celular de 16.5 x 106 células totales/ml (80 % de viabilidad, por consiguiente 13.1 x 106 células viables/ml) . Subsiguientemente, el biorreactor de 2 1 se infecta con rAd26.CS a un MOI de 70 VP/celda y se incuba a 36 °C, pH 7.3 y DO del 40 %. El sistema de ATF fue iniciado 5 horas post-infección a una velocidad de refresco del medio de 2 volúmenes del recipiente por día. En los días 3, 4, 5 y 6 pos-infección, el biorreactor de 2 1 fue muestreado para realizar el conteo de las células y verificar la producción del virus por AEX-HPLC y QPA. Para liberar el virus 1 mi de la muestra se mezcla con 100 µ? de Tritón X-100 al 10 % y se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, la muestra se mezcla con 2.42 µ? de benzonase/MgCl2 por una etapa de incubación subsiguiente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se agregan 100 µ? de sucrosa al 50 % a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura abajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPLC y QPA. Los resultados son presentados en la Tabla 5.

Tabla 5: Resultados del ejemplo 7.

Estos resultados por primera vez demostraron que las infecciones de rAd26 a las densidades celulares de entre arriba de 10 x 106 y 16 x 10s células viables/ml son factibles en los biorreactores acoplados a un sistema de perfusión y que es posible incrementar el rendimiento volumétrico en más de 20 veces comparado con un proceso por lotes (como se muestra en el ejemplo 5) .

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5 x 1019 VP y con un rendimiento de aproximadamente 2 x 1012 VP/ml, menos de 7500 1 del material recolectado tienen que ser procesados. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1000 1 o menor, y podrían reducir así el costo inicial comprometido durante el desarrollo de la vacuna .

Cuando se compara el crecimiento celular post-infección, se observa que después de la infección con Ad26, las células tienden a crecer adicionalmente, mientras que después de la infección con Ad35, las células detuvieron su crecimiento. Realmente, se ha mostrado (Figura 4) que las células que fueron infectadas con Ad26 a una densidad de 12 x 106 vc/ml crecieron adicionalmente hasta un máximo de 22 x 10s vc/ml después de 3 días. Después de la infección con Ad35, las células que fueron infectadas a una densidad de 12 x 105 vc/ml crecieron adicionalmente hasta un máximo en el día 2 y se redujo hasta una densidad de 14 x 106 vc/ml después de 3 días (Figura 5). Así, el Ad26 se propaga de manera diferente que el Ad35. Junto con el efecto de la densidad celular descrito anteriormente, esto muestra que existen diferencias claras entre la propagación de los adenovirus recombinantes de diferentes serotipos (Ad5, Ad35 y Ad26) en las células, tales diferencias tienen impacto sobre un proceso a escala industrial para generar materiales farmacéuticos de estos serotipos .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la producción del serotipo 26 (rAd26) del adenovirus recombinante , caracterizado porque comprende: a) cultivar las células PER.C6 en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre 10 x 106 células viables/ml y 16 x 106 células viables/ml con rAd26; c) adicionalmente , cultivar las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd26; y d) recolectar el rAd26.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células en la etapa b) son infectadas con rAd26 a una densidad de aproximadamente de 10 x 106 y 14 x 106 células viables/ml.

3. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sistema de perfusión en la etapa c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternativo (ATF) .

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende : e) purificar el rAd26, y opcionalmente f) preparar una composición farmacéutica que contiene el rAd26 purificado.

5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el adenovirus recombinante carece de al menos una porción de la región El, y comprende el ácido nucleico heterólogo.

6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sistema de perfusión en la etapa a) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternativo (ATF) .

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa a) es efectuada en un primer biorreactor, y las etapas b) y c) son efectuadas en un segundo biorreactor.

8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la relación de la partícula física con respecto a la partícula infecciosa (VP/IU) del rAd26 producido es menor que 30:1, preferentemente menor que 20:1.

9. El uso de un biorreactor en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el biorreactor tiene un volumen de trabajo de entre 2 1 y 1000 1, preferentemente entre 50 1 y 500 1, y comprende el medio de cultivo, las células PER.C6, y al menos 1 x 1012 partículas del virus de rAd26 (VP)/ml.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde el biorreactor está conectado, a un sistema de perfusión de ATF.

11. El uso de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, en donde las partículas del virus de rAd26 tienen una relación de VP/IU de menos de 30:1, preferentemente de menos de 20:1.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos 1 x 1012 partículas del virus de rAd26 (VP) /mi son producidas.