CN102762721A - 用于生产Ad26腺病毒载体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供大规模生产重组腺病毒26的方法，其使用灌注系统并在高密度细胞下感染。

Description

用于生产Ad26腺病毒载体的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养和腺病毒生产的领域。更具体而言，它涉及哺乳动物细胞的培养、用腺病毒感染所述细胞和从中生产腺病毒颗粒的改进的方法。
发明背景
近期在使用重组病毒载体的DNA疫苗接种的领域中的发展已经产生对大规模制备临床级材料的需求。需要能够为世界欠发达和不发达地区提供足够量的基于重组腺病毒的疫苗的方法以对抗如结核病和疟疾的世界性问题。一份出生世代的评估显示，世界欠发达和不发达地区在2010-2015年预计有超过1.5亿的新生婴儿。根据该出生世代，对疫苗的预计年需求量可达到大约每年1.5×1019病毒颗粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asp?panel=2)。
几种用于生产腺病毒的方法已有所描述。这些方法使用在转瓶、细胞工厂(NUNC公司的Nunclon，或Corning公司的CellStack)或CellCubes(Corning公司)中的贴壁细胞培养。贴壁细胞培养的生产方法不能满足对基于腺病毒的疫苗的全球需求。因此，用于贴壁方法的细胞改造为适于悬浮培养(例如HEK293和
Figure BDA00002014154900011
细胞系)。使用悬浮培养使得生产方法放大为大规模生物反应器成为可能。用于腺病毒生产的悬浮细胞培养通常可实现介于3至20L的规模，有报道的成功的规模放大高达100L(Kamen等人，2004)和250L(Xie等人，2003)。有实验报道，放大规模至10000L是可预见的(Xie等人，2003)。
但是，放大规模至10000L的一个主要不利条件是高昂的资本投入(CAPEX)，这是设计和建造10000L的生物反应器设施所需要的。此外，建造符合BSL-2条件(二级生物安全)的10000L设施的CAPEX投入，必须在不知道产品成功与否(第四期及以后)之前履行。用于10000L生物反应器制造厂的总的投资费用据报道介于2.25亿和3.2亿欧元之间(Estape等人，2006)。因此，将需要较小规模，例如在1000L或更小的生物反应器中的制备。
使用现有的方法，为了达到1.5×1019VP/年的目标，一年必须在1000L规模生产超过150批次。因此，有需要改进用于腺病毒生产的系统，优选在非过高的费用下，提高腺病毒颗粒的产量，满足腺病毒疫苗的全球需求。
腺病毒生产优化中所遇到的问题之一是所谓的“细胞密度效应”。在成批模式的操作中，多篇文献暗示对于腺病毒生产，在感染时存在最佳的细胞密度。最佳值介于0.5-1×106细胞/mL(Maranga等人，2005；Kamen等人，2004)。已显示对于在批量搅拌罐生物反应器中生产腺病毒(Ad5)，每细胞的病毒生产力保持不变直至大约0.9×106细胞/mL，但在大约1×106细胞/mL时大幅下降(Altaras等人，2005)。超过2×106细胞/mL，没有能够检测到感染性颗粒。涉及比生产率下降的在感染时的细胞密度的断点是培养基依赖的。迄今还没有可获得的培养基显示出支持病毒颗粒的高产量，而在细胞密度超过1×106细胞/mL时使比生产率保持最佳的潜力(Kamen等人，2004)。这一下降的原因还不知道，但可能是由于用于病毒生产的营养的获得性受限，或由于抑制病毒生产的高代谢物浓度。
分批补料操作，像添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸，使得可以在细胞密度高达2×106细胞/mL下感染。然而，在高细胞密度下所获得的生产力低于在1×106细胞/mL的细胞密度下感染所获得的生产力(Kamen等人，2004)。
在灌注方法中，由中空纤维、旋转过滤器或声学分离器将细胞保留在生物反应器中，而培养基灌注穿过生物反应器。在这些方法中，有时可以达到大于100×106细胞/mL的细胞密度(例如Yallop等人，2005)。
在用中空纤维系统灌注的过程中，受感染的灌注细胞表现出过早的细胞损失。这可能涉及到由于病毒感染所致的细胞的较高的剪切敏感性(Cortin等人，2004)。施加在更脆弱的受感染细胞上的在管道、中空纤维或蠕动泵中引起的流体动力压力，最有可能是导这一现象的原因。由于受感染的细胞更加脆弱，如果将在整个感染阶段保持灌注，已特别地建议声学分离器(Henry等人，2004年)是合乎需要的。然而，在灌注模式下进行的感染只能以2vol/天的灌注速率保持最高3×106细胞/mL的细胞密度。在6×106细胞/mL的细胞密度下的感染导致比生产率的五倍的减少(Henry等人，2004年)。
尽管有其他人所报道的细胞密度效应，一份报道(Yuk等人，2004)描述了人肿瘤细胞的成功的灌注培养，其用作溶瘤腺病毒载体的生产平台。此报道描述了使用交替切向流(ATF)技术的高细胞密度灌注方法。在感染时平均活细胞密度为9×106HeLaS3细胞/mL，观察到大约4×1011VP/mL的平均病毒滴度。在此报道中使用的肿瘤细胞不优选作为生产细胞，因为当所生产的腺病毒颗粒要给人类施用时，肿瘤细胞的使用可能会造成安全风险。此报道中的重组腺病毒是基于Ad5。这样的腺病毒具有有限的作为疫苗使用的可能性，因为大多数人口含有预先存在的针对Ad5的中和抗体，因此来自其它血清型的重组腺病毒更适合作为疫苗使用(见如WO 00/70071)。作为疫苗使用的特别有益的重组腺病毒包括Ad26(WO 00/70071)。
对来自除Ad5外其它血清型的重组腺病毒的大规模生产的信息即使有，也非常有限，特别对于所述有益的血清型26。在大规模下Ad35和Ad5生产之间的某些差异，之前在如PCT/EP2009/064265中已有所描述。不同血清型的重组腺病毒的某些不同的物理性质，可能会导致在生产方法中的差异。这些潜在的差异可能在工业规模上尤其重要，其中甚至在小规模上看似微小的差异，可能在用于生产世界年需求的所设想的规模上具有巨大的经济后果。例如，申请人证明所报道的Ad5的细胞密度效应不同于Ad35(PCT/EP2009/064265)。因此，在大规模生产方法中rAd35在生产细胞中的增殖不同于rAd5。显然，来自不同血清型的腺病毒的增殖是非常难以预测的。
为了满足重组腺病毒血清型26(rAd26)疫苗的全球需求，有需要改进用于rAd26生产的系统。
本发明提供用于rAd26的工业化生产的改进方法。
发明概述
在此，我们发现另一种血清型，即Ad26，表现不同于其它血清型Ad5和Ad35。确实，Ad26倾向于表现出轻微的细胞密度效应，不如对Ad5所看到的密度效应那么强烈。并且，用Ad26感染的细胞在感染后倾向于进一步生长，而用Ad35感染的细胞在感染后表现出下降的生长。
这些结果再次暗示对特定血清型腺病毒的方法可能必须对各个血清型细微调整，以获得最佳的结果。本发明提供用于rAd26生产的，对所获得rAd26的产量和质量而言的优化的系统，而且用于下游加工的收获操作简单。
本发明提供用于生产重组腺病毒血清型26(rAd26)的方法，该方法包含：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)在大约10×106活细胞/mL-16×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染所述细胞；c)用灌注系统进一步培养受感染的细胞以增殖所述rAd26；和d)收获所述rAd26。
在某些实施方案中，在大约10×106-14×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染步骤b)中的所述细胞。
在某些优选实施方案中，步骤c)中所述的灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。在其他优选实施方案中，步骤a)中所述的灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。在一个优选实施方案中，步骤a)和c)中所述的灌注系统均为交替切向流(ATF)灌注系统。
在某些实施方案中，本发明的方法还包含：e)纯化所述rAd26。在另外的实施方案中，该方法还包含：f)制备含有所纯化的rAd26的药物组合物。
在某些实施方案中，所述重组腺病毒缺少E1区的至少一部分，并包含异源核酸。
在优选实施方案中，所生产的rAd26的物理颗粒与感染性颗粒的比值(VP/IU)小于30:1，优选小于20:1。
本发明一方面还提供用于生产至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL的方法，该方法包含：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)在大约10×106活细胞/mL-16×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染所述细胞；c)用灌注系统进一步培养受感染的细胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒颗粒的浓度达到至少1×1012VP/mL；和d)收获所述rAd26。
本发明还提供有2L-1000L的工作容积的生物反应器，其包含培养基、生产细胞和至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL。在某些实施方案中，生物反应器具有50L-500L的工作容积。在优选的实施方案中，生物反应器连接至ATF灌注系统。
附图简述
图1.用rAd5在摇瓶中高细胞密度下的感染。
图2.用rAd35.TB-S在摇瓶和2L生物反应器中高细胞密度下的感染。
图3.用rAd26在摇瓶中高细胞密度下的感染。
图4.用rAd26感染后的细胞生长。
图5.用rAd35感染后的细胞生长。
发明详述
本发明描述用于生产大量的重组腺病毒rAd26的新方法。该优化方法依赖于在高细胞密度下感染培养物而且保持高的每细胞的病毒生产力的能力。借此提供在单个生物反应器中获得高病毒浓度的收获的病毒溶液的方法。用于rAd26的本发明的方法的一般产量为大约2-3×1011VP/mL。实际上，据信使用本发明的方法可以生产非常大量的rAd26颗粒，例如至少大约5×1011VP/mL的量，优选地至少大约6、7、8或9×1011VP/mL。优选地生产至少1×1012VP/mL rAd26，更优选地至少1.5×1012VP/mL，更加优选地至少2×1012VP/mL，例如介于1×1012和5×1012VP/mL之间。一般，本方法不会产出大于大约1×1013VP/mL rAd26。用根据本发明的方法能够获得的产量很可能足以制备世界上基于某种rAd26的疫苗的需求量，而无需工作容积大于1000L的生物反应器设施。
本发明提供用于生产重组腺病毒血清型26(rAd26)的方法，该方法包含：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)在至少10×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染所述细胞；c)用灌注系统进一步培养受感染细胞以增殖所述rAd26；和d)收获所述rAd26。
在某些实施方案中，在大约10×106和50×106活细胞/mL之间的密度下用rAd26感染步骤b)中的所述细胞。在另外的实施方案中，在大约10×106和20×106活细胞/mL之间的密度下用rAd26感染步骤b)中的所述细胞。在另外的有益的实施方案中，在大约10×106和16×106活细胞/mL之间，例如大约10、11、12、13、14或15×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染步骤b)中的所述细胞。
生产细胞和重组腺病毒
根据本发明的生产细胞(在本领域和本文，有时也称作“包装细胞”、“互补细胞”或“宿主细胞”)可以是所需要的腺病毒在其中能够增殖的任何生产细胞。例如，在互补腺病毒中的缺陷的生产细胞中完成重组腺病毒载体的增殖。这样的生产细胞在它们的基因组中优选至少具有腺病毒的E1序列，而且由此能够互补具有在E1区的缺失的重组腺病毒。另外，腺病毒可以具有在E3区的缺失，E3区在Ad基因组中是非必要的，因此这缺失不必互补。可以使用任何互补E1的生产细胞，例如被E1永生化的人视网膜细胞(例如911或PER.C6细胞，见美国专利5994128)、E1转化的羊水细胞(见EP专利1230354)、E1转化的A549细胞(见如WO 98/39411、美国专利5891690)、GH329：HeLa细胞(Gao等人,2000,Human Gene Therapy 11:213-219)、293细胞和诸如此类的细胞。在某些实施方案中，生产细胞是例如HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞和诸如此类的细胞。优选使用PER.C6细胞(1996年2月29日保藏欧洲细胞培养物保藏中心(CAMR,Salisbury，Wiltshire,UK)，ECACC保藏号96022940，见美国专利5994128)或由其衍生的细胞作为生产细胞。
本文显示在应用高细胞密度感染的方法中，重组腺病毒血清型35(rAd35)与rAd5相比具有迄今未知的有益特性。我们现在也知道另一种血清型(rAd26)在类似的方法中表现也不同于两种之前提到的血清型，暗示用于重组腺病毒的大规模生产的最佳条件可能必须针对不同的血清型建立。本发明的腺病毒是rAd26。
优选地，所述腺病毒载体缺乏腺病毒基因组的E1区，例如E1a区和/或E1b区的病毒复制所必需的至少一种必要基因功能。在某些实施方案中，载体缺乏在E1区的至少一种必要基因功能和至少部分的非必要的E3区。腺病毒载体可以是“多重缺乏”，意为腺病毒载体缺乏在腺病毒基因组的两个或多个区的每个中的一或多种必要基因功能。例如，上述的E1-缺失或E1-,E3-缺失的腺病毒载体可以另外缺乏在E4区的至少一个必要基因和/或E2区(例如E2A区和/或E2B区)的至少一个必要基因。缺失整个E4区的腺病毒载体可以激发较低的宿主免疫反应。适合的腺病毒载体的实例包括缺少(a)全部或部分E1区和全部或部分E2区，(b)全部或部分E1区、全部或部分E2区和全部或部分E3区，(c)全部或部分E1区、全部或部分E2区、全部或部分E3区和全部或部分E4区，(d)至少部分E1a区、至少部分E1b区、至少部分E2a区和至少部分E3区，(e)至少部分E1区、至少部分E3区和至少部分E4区，和(f)所有必要的腺病毒基因产物(例如只包含ITR和包装信号的腺病毒扩增子)的腺病毒载体。如技术人员所知，在从腺病毒基因组缺失必要区的情况下，由这些区所编码的功能必须以反式提供，优选由生产细胞提供，即当部分或整个E1、E2和/或E4区从腺病毒缺失时，这些区必须在生产细胞中存在，例如整合在基因组中，或者以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒的形式。
在另外的实施方案中，本发明的腺病毒缺少E1区的至少一部分，如E1A和/或E1B编码序列，并还包含异源核酸。适合的异源核酸为技术人员所熟知，例如可以包括转基因开放读框，例如编码多肽的开放读框，当rAd载体用于疫苗预防的目的时，希望针对所述多肽的免疫反应，如适用于产生对疟疾(见如WO 2004/055187)、HIV、肺结核(见如WO 2006/053871)、某些病毒等免疫反应的转基因，所有均为技术人员所熟知。事实上，异源核酸的性质不是本发明的关键，可以是任何异源核酸，因此这里不需要进一步阐述。
本领域技术人员会获知使用如在美国专利6492169或WO 03/104467和其中参考文献中公开的方法，在特定宿主细胞增殖不同血清型的腺病毒载体的可能性。例如，为增殖E1-缺失的rAd26，可以构建表达Ad26的E1B-55K的特定的生产细胞，例如在表达Ad5的E1A和E1B的现有的生产细胞，如PER.C6或HEK293细胞的基础上(例如美国专利6492169)，此方法为技术人员所知。可选地并且优选地，通过在rAd26载体中包括Ad5的E4-orf6编码序列，可以不改造用于增殖E1缺失的rAd26的生产细胞而使用例如像PER.C6或HEK293的现有(Ad5-)互补细胞系，此方法广泛公开于例如WO 03/104467中，此文献通过引用全部并入本文。这样，使用本领域技术人员所熟知的手段和方法，在生产细胞中可以完成任何血清型的腺病毒载体的增殖。腺病毒载体与其构建方法和其增殖方法为本领域所熟知，并且在例如美国专利5559099、5837511、5846782、5851806、5994106、5994128、5965541、5981225、6040174、6020191和6113913，Thomas Shenk的Adenoviridae and their Replication，M.S.Horwitz的Adenoviruses，B.N.Fields等人编著的Virology第三版(Raven Press,Ltd.,New York(1996))的分别第67和68章，和在此提及的其它参考文献中有所描述。
腺病毒载体的构建为本领域所充分了解并且涉及标准的分子生物学技术的使用，例如那些在如Sambrook等人的Molecular Cloning,a LaboratoryManual第二版(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，Watson等人的Recombinant DNA第二版(Scientific American Books(1992))，Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology(Wiley IntersciencePublishers,NY(1995))，和在此提及的其它参考文献中有所描述的。
培养本发明的生产细胞以增加细胞、病毒的数量和/或病毒滴度。培养细胞以使其能够代谢，和/或生长，和/或分裂，和/或生产本发明的感兴趣的病毒。这可以通过为本领域技术人员所熟知的方法实现，包括但不限于为细胞提供营养，例如在合适的培养基中。可以使用不同的培养基，选择对所用的细胞最佳的培养基和使用环境是本领域技术人员的常规工作之一。因此，适合于本发明的目的的培养基为技术人员所熟知，通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方法自行制备。培养可以在例如培养皿、转瓶或生物反应器中，使用分批、分批补料、连续系统等完成。为了通过细胞培养实现大规模(连续)的病毒生产，在本领域优选能够悬浮生长的细胞，优选能够在缺乏源于动物或源于人类的血清，或源于动物或人类的血清成分下培养的细胞。适合的培养细胞的条件是已知的(见如TissueCulture(Academic Press,Kruse and Paterson,editors(1973))和R.I.Freshney的Culture of animal cells:A manual of basic technique第四版(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9)。
细胞培养系统和灌注系统
生物反应器被广泛使用于从依赖悬浮的动物细胞培养物中大规模生产生物产品。根据本发明，用于腺病毒增殖的生物反应器可以是例如搅拌罐、一次性生物反应器、气升式反应器等。根据本发明的某些实施方案，生物反应器是搅拌罐。
根据本发明的某些实施方案，生物反应器具有大约2L-2000L的工作容积，本文术语“之间”是指包括所公开的上限值和下限值，即2L是最小的工作容积，而2000L是最大的工作容积。具有介于这些值之间的任何个别值的工作容积的生物反应器，都意为包括在本发明中。在此公开内容中使用的对于数字数值的术语“大约”是指数值±10％。在某些优选的实施方案中，工作容积介于10L和1000L之间，优选介于20L和800L之间，例如介于30L和600L之间，例如介于50L和500L之间，例如大约250L或大约500L。使用有根据本发明的工作容积的生物反应器的一个优点是避免非常大容积的生物反应器的使用，即工作容积远大于2000L的生物反应器，优选1000L，并且由此也不需要在建造如此非常大型的生物反应器中的巨大的资金和时间投入。另外，当使用本发明的方法，产品即rAd更为浓缩，从而在收获和/或进一步下游加工来自生物反应器的rAd中节省时间和费用。工作容积是在生物反应器中的有效培养容积。搅拌罐通常具有1:1到3:1的高度直径比。培养物通常使用基于叶盘或船舶螺旋桨样式的一个或多个搅拌器混合。搅拌器系统给出的剪切力小于已有描述的桨叶。搅拌可以直接或间接的由磁耦合驱动器驱动。间接驱动减少穿过搅拌轴上密封物的微生物污染的风险。所述生物反应器的使用和控制包括(不限于)：搅拌、温度、溶解氧、pH值和生物量控制。细胞培养基的搅拌、pH值、温度、溶解氧浓度在原则上不是关键而且取决于所选细胞的种类。优选地，选择搅拌、pH值、温度和溶解氧浓度以使其对细胞的生长是最佳的。本领域技术人员知道如何找出对培养最佳的搅拌、pH值、温度和溶解氧浓度。通常，最佳搅拌介于50和300rpm之间，例如100-250rpm，最佳pH值介于6.7和7.7之间，最佳温度介于30和39°C之间，例如34、35、36、37或38°C。
多数的大规模悬浮培养以分批或分批补料的方行操作，因为它们的操作和规模放大最为直接。然而，基于灌注原理的连续方法正变得更为普遍。根据本发明，在灌注系统中培养生产细胞。细胞的灌注培养在本领域具有它的传统含义，即意为在培养中由分离装置保留细胞，其中有细胞密度低于分离前的液体流出，并且在其中有细胞培养基的流入。灌注培养的使用是为了应对在高密度(例如10-50×106活细胞/mL)培养细胞的挑战。为了增加密度超过2-4×106活细胞/mL，使用新鲜的供给物连续或间断地替换培养基，以弥补营养的不足并且除去有毒的产物。灌注也使得可以对培养环境(pH值、dO2、营养水平、等等)有好得多的控制。穿过培养物的新鲜培养基的灌注可以通过用多种分离装置(例如细网孔旋转过滤器、中空纤维或平板膜过滤器、沉降管)保留细胞来实现。在本发明方法的优选实施方案中，分离装置是包含中空纤维的过滤模块。
术语“中空纤维”是指管状膜。管的内径优选介于0.3和6.0毫米之间，更优选介于0.5和3.0毫米之间，最优选介于0.5和2.0毫米之间。在某些实施方案中，选择膜中网孔尺寸(孔尺寸)以使网中孔的尺寸接近细胞的直径，确保细胞的高度保留而细胞碎片可以通过过滤器。在其他实施方案中，网孔尺寸显著小于细胞的直径。优选地，网孔尺寸介于0.1-30微米之间，例如介于0.1和3微米之间，例如大约0.2微米。包含中空纤维的过滤模块可从例如通用电气公司(原Amersham公司)购买获得。在本发明的方法过程中，在流出的培养基中未观察到显著量的腺病毒颗粒，尽管病毒颗粒小于所应用的网孔尺寸。
使用灌注是为了保持某些代谢产物的所要求的水平并清除从而减少培养基中的杂质。灌注速率可以通过各种方式测量，例如单位时间的置换容积或者某些代谢物的水平，其在灌注期间必须保持。一般情况是在培养过程中并不是所有时间进行灌注，通常只在培养中不时按要求进行。例如，一般直到某些培养基成分，如葡萄糖，开始变得耗尽需要更换才开始灌注。
本领域已知若干灌注系统，基本上适用于本发明的方法。术语“灌注系统”是指连接至分离装置的生物反应器的组合。分离装置可以并入生物反应器中(如细网孔旋转过滤器)或在生物反应器外(如中空纤维)。在这两种情况中，如上所解释的，分离装置防止细胞团从反应器洗出，并且使培养基的更新成为可能。
本发明人对几种灌注系统进行预实验，其中交替切向流(ATF)灌注系统给出最好的结果。因此，在本发明的优选实施方案中，生物反应器同ATF灌注系统(例如ATF系统，Refine Technology，Co.,East Hanover,NJ)一起运行(连接于ATF灌注系统)。该系统由安装在中空纤维外壳一端的隔膜泵组成。外壳的另一端连接于组合接头，所述组合接头反过来通过可用端口连接到生物反应器。隔膜泵和控制系统用于通过中空纤维产生交替切向流。这意味有一与中空纤维的膜表面的相同方向(即切向)的流动，其流动是来回流动，并且有另一基本垂直于所述过滤器表面方向的流动。通过本领域技术人员所知的方法可以实现切向流动，并在例如美国专利6544424中有所描述。
ATF灌注系统的操作已有所描述(Furey，2002)。ATF系统使得可以更长时间地培养细胞并达到高细胞密度而不堵塞过滤器。事实上，使用ATF灌注系统可以获得超过100×106活细胞/mL的极高的细胞密度，例如用PER.C6细胞(见如Yallop等人)。然而在更早的报道中，灌注系统中的PER.C6细胞被用于完全不同的目的，并没有用腺病毒感染。
ATF系统额外的优点是该系统产生低剪切压力。能量加在液体的表面，产生低剪切层流。特别对其中细胞用腺病毒感染的本发明而言，这可能是一个优点。用ATF系统的灌注过程中，在感染后没有发现细胞密度的损失，没有观察到过早的细胞损失，反而观察到稳定的细胞生长。由于细胞保持完整，为病毒的增殖创造最佳条件。
因此在预培养阶段(根据本发明的步骤a)中用ATF系统的灌注是有益的，因为它使得可以获得非常高的细胞密度，并且对随后的使用腺病毒的感染而言细胞条件良好，有可能对所获得的高产量有所贡献。为了达到所述的高细胞密度，某些实施方案中，在生产细胞的细胞生长过程(步骤a)的一部分时间中至少部分灌注培养基。在某些实施方案中，一旦达到大约2×106活细胞/mL和8x106活细胞/mL之间的细胞密度就开始灌注。
另外，在感染阶段后的(根据本发明的步骤c)用ATF系统灌注是有益的，因为它使得可以从受感染的细胞获得非常高的腺病毒的产量。因此在优选实施方案中，本发明方法的预培养阶段和感染后阶段均使用ATF灌注系统。ATF灌注过程中所用的培养基的体积可以根据细胞的需要改变，此体积可以由技术人员容易地设定和调整，一般为0.5-5容器容积/天(vol/d)，例如1-3vol/d，例如大约2vol/d。在某些有益的实施方案中，更新速率为1-2vol/d，如发明人在本文所示，从所获得的rAd26的产量和质量而言其给出非常好的结果，而培养基的消耗和由此而来的费用仍然合理。
最后，ATF灌注系统是可放大的系统。可获得不同尺寸的ATF单元。由于使用空气流来推动培养物穿过中空纤维膜，它可以产生非常快速的低剪切的切向流速率，使得从研发到规模高达1000L的生产中使用该技术成为可能(Furey，2002)。有可能进一步的发展将使得ATF灌注系统可以更进一步放大规模。
在Yuk等人的文献中，使用肿瘤细胞系生产rAd5，其中完整的方法是在单一的生物反应器中进行的，它在生产生物反应器中将用大约8-10天。在本发明的某些实施方案中，使用两个不同的生物反应器，一个用于预培养(步骤a，预培养生物反应器)，一个用于细胞的感染(步骤b)和感染后培养(步骤c，生产生物反应器)。为这些步骤使用两个单独的生物反应器的优点是仅仅需要在生产生物反应器中培养大约1.5-6，一般大约4-5天，因此每年可以进行多得多的运行。在感染期间中添加大量的新鲜培养基，对减少在生产生物反应器灌注期间中所需培养基的体积也是有益的。在可选的实施方案中，也可能在单一生物反应器中进行本发明的步骤a-c。
感染
在本发明的方法中，用重组腺病毒感染生产细胞。一般地，在最佳条件下将病毒暴露于适合的生产细胞，使得摄入病毒。此最佳条件取决于所选细胞的类型和腺病毒的类型。本领域技术人员知道如何寻找此最佳条件，即对于搅拌、pH值、温度、溶解氧(dO2或DO)、感染复数(MOI)的最佳条件。通常，最佳搅拌介于大约50和300rpm之间，一般大约100-200rpm，例如大约150rpm；一般DO是20-60％，例如40％；最佳pH值介于6.7和7.7之间；最佳温度介于30和39°C之间，例如34-37°C；而最佳MOI介于5和1000之间，例如大约50-300。一般地，腺病毒自发地感染生产细胞，让生产细胞与rAd颗粒接触足以感染细胞。通常，向培养物添加腺病毒种子储备来开始感染，随后腺病毒在生产细胞中增殖。这对本领域技术人员而言都是常规工作。
在本发明的某个实施方案中，在感染前停止灌注而在感染后的1-20小时后，例如3-15小时后，例如5小时后恢复灌注。这一延时应该使得病毒颗粒可以进入细胞并防止病毒颗粒被冲刷出系统之外。在感染后，灌注速率的定义为通过灌注手段所保持的葡萄糖的水平。例如，在本发明中培养基中的葡萄糖浓度通常保持在大约2mmol/L-20mmol/L的浓度，一般大约5-10mmol/L。
有利地，可能在高细胞密度下(即高于10×106活细胞/mL)用rAd26感染生物反应器而保持高的每细胞的病毒生产力。在某些实施方案中，比生产率保持在大约0.5×106-1.5×106VP/细胞。
此外，在本发明中，感染前细胞培养物的活力保持高于75％。意味着感染时培养物中细胞总量的至少75％是活的。在某些实施方案中，感染时细胞培养物的活力为至少80％，在另外的实施方案中至少85％。使用技术人员可获得的常规方法可以测量活力，例如台盼蓝排除、凯西(Casy)细胞计数等。
在某个实施方案中，感染时的细胞密度为大约10×106和50×106活细胞/mL之间，如大约10×106和20×106活细胞/mL之间，如大约10×106和15×106活细胞/mL之间，如大约10×106和14×106活细胞/mL之间。这些细胞密度允许高病毒生产力且细胞碎片和宿主细胞DNA积累有限，这给这些实施方案在腺病毒收获物的下游加工带来优势。因此，本发明提供用于rAd26生产的优化的方法，产出高质量的高数量rAd26颗粒，同时为下游加工目的提供仍可管理的收获材料。
在这些细胞密度感染可以生产更高浓度的重组腺病毒，特别是rAd26，而且超过迄今所公开的rAd26的产量。如在本公开内容中首次显示，与在高细胞密度(10×106活细胞/mL以上)的rAd5感染相反，使用悬浮液中的生产细胞，使用灌注系统，在10×106活细胞/mL以上的密度下用rAd26感染仍增加了rAd26的容积生产力，感染时的细胞密度增长高达至少16×106活细胞/mL。在本发明的一个优选实施方案中，提供生产至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL的方法。
本发明的方法允许回收物理颗粒对感染性颗粒的比值小于30:1的rAd26，这对将给人类施用的腺病毒是一个重要的参数。可以以病毒颗粒(VP)/感染性单位(IU)的比值测量，例如采用QPA分析(Wang等人，2005)。较低的比值是有益的，因为在这种情况下需要施用较少的病毒颗粒来感染同样数目的细胞。目前的FDA法规要求小于30:1的VP/IU比值，因此本文描述的本发明的方法适于制备满足这一具体要求的大量的rAd26。Yuk等人(2004)的作者报道了低于本文公开的数量的病毒颗粒绝对数量，另外在Yuk等人(2004)所公开的样品的VP/IU比值为大约100(Yuk等人，2004中的图2A/2B)。相反，我们报道更高的绝对产量并且显著更好的低于20:1的VP/IU比值。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法提供的rAd26批次具有小于20:1的VP/IU比值，例如大约20∶1-大约5∶1。
细胞收获和裂解的方法
在腺病毒的感染后，病毒在细胞内复制从而被扩增。腺病毒的感染最后导致受感染的细胞的裂解。因此，腺病毒的裂解特性准许两种不同的病毒生产模式。第一种模式是在细胞裂解前收获病毒，采用外部因子来裂解细胞。第二种模式是在由生产的病毒(几乎)完全裂解细胞后收获病毒的上清(见例如美国专利6485958，描述不使用由外部因子来裂解宿主细胞的腺病毒的收获)。对后者的模式，要求较长的孵育时间以实现完全的细胞裂解，和由此的病毒高产量。另外，宿主细胞内容物逐步溢出进入培养基可能对所获得的病毒的完整性和产量是有害的。因此，根据本发明，优选采用外部因子主动地裂解细胞以收获腺病毒。
可用于主动的细胞裂解的方法为本领域技术人员所知，例如在WO98/22588的28-35页中有所讨论。在这一方面有用的方法例如冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声处理、高压挤压、去污剂裂解、上述的组合等。在本发明的一个实施方案中，至少使用一种去污剂裂解细胞。使用去污剂裂解具有方法简单和易于放大的优势。
可使用的去污剂和使用的方式，通常为本领域技术人员所知。例如，在WO 98/22588的29-33页中讨论了几个实例。本文所用的去污剂可以包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子型去污剂。本领域技术人员清楚的知道去污剂的浓度可能有所不同，例如在大约0.1％-5％(W/W)的范围内。在一个实施方案中，所用的去污剂是Triton X-100。
可以采用核酸酶来清除污染，即主要是生产细胞、核酸。适用于本发明的典型的核酸酶包括或任何在本领域经常使用的其他DNase和/或RNase。在优选的实施方案中，核酸酶是
Figure BDA00002014154900142
它通过水解特定核苷酸之间的磷酸二酯键来迅速地水解核酸，从而减少细胞裂解液的粘度。
Figure BDA00002014154900143
能够从Merck KGaA商购获得(代码W214950)。所采用的核酸酶的浓度优选地在1-100单位/ml的范围内。
从生产细胞的培养物中收获腺病毒的方法已在WO 2005/080556中彻底公开。
根据本发明，收获的时间为感染后大约24-120小时，例如感染后大约48-96小时，例如感染后72小时。
纯化方法
在某些实施方案中，收获的腺病毒被进一步纯化。腺病毒的纯化可以以几个步骤进行，包含澄清、超滤、渗滤或使用层析分离，如WO 05/080556所描述，其通过引用并入本文。澄清可以通过过滤步骤完成，从细胞裂解物中清除细胞碎片和其他杂质。使用超滤浓缩病毒溶液。使用超滤器的渗滤或缓冲液交换是清除或交换盐、糖等的方法。本领域技术人员知道如何找到每个纯化步骤的最佳条件。WO 98/22588(通过引用并入本文)也描述用于生产和纯化腺病毒载体的方法。该方法包含使宿主细胞生长、使用腺病毒感染所述宿主细胞、收获和裂解所述宿主细胞、浓缩所述粗裂解物、交换所述粗裂解物的缓冲液、使用核酸酶处理所述裂解物和进一步使用层析纯化病毒。
纯化可以通过例如密度梯度离心实现，如在WO 98/22588的59-61页所讨论的。
然而，优选地，纯化采用至少一个层析步骤，如在WO 98/22588的61-70页所讨论的。已描述许多对腺病毒进一步纯化的方法，其中层析步骤包括在所述方法中。本领域技术人员会获悉这些方法，并且能够改变应用层析步骤的确切方式以优化此方法。
例如，通过阴离子交换层析步骤纯化腺病毒是可能的，见如WO05/080556。对腺病毒纯化，优选使用至少一个阴离子交换层析步骤。阴离子交换层析步骤后，病毒可以足够纯。然而，在某些实施方案中，进一步进行尺寸排阻层析步骤以提高此方法的稳健性。此步骤可以在阴离子交换层析步骤之前或之后。明显地，其他的纯化步骤也可以适合地与阴离子交换层析步骤组合。
用于腺病毒纯化的阴离子交换层析的使用已被广泛描述，因此这方面是在本领域技术人员熟识的范围内。许多不同的层析基质已被应用于腺病毒的纯化并且是适合的，而本领域技术人员能够容易地找到用于纯化病毒的最佳的阴离子交换材料，例如由以下技术所指导的。
美国专利5837520(又见于Huyghe等人，1995，Human Gene Therapy 6:1403-1416)描述一种纯化腺病毒的方法，其中宿主细胞裂解物用核酸酶处理，然后是阴离子交换和金属离子亲和层析。
美国专利6485958描述使用强阴离子交换层析来纯化重组腺病毒。
阴离子交换层析与流化床柱已应用于腺病毒颗粒的纯化，见WO00/50573。
另外，用于腺病毒颗粒的纯化的扩张床阴离子交换层析和某些用于阴离子交换层析的层析树脂已在美国专利6586226中有所描述。
除了阴离子交换柱，例如由Pall公司(如MustangTM系列)和Sartorius公司(如Sartobind系列)所生产的阴离子交换膜层析产品是适合的。对于在腺病毒纯化中使用这些过滤器和它们的优势，见WO 03/078592和WO2005/080556。
美国专利6537793描述使用离子交换层析从宿主细胞纯化腺病毒颗粒，具体教导出于此目的优选使用Q Sepharose XL型层析支持物。在本发明的一个实施方案中，使用Q Sepharose XL柱进一步纯化腺病毒。
该纯化方法也可以适当地采用尺寸排阻层析步骤。
国际申请WO 97/08298描述使用某些层析基质的腺病毒的纯化以防止对病毒的损害，包括阴离子交换和尺寸排阻步骤。美国专利6261823描述用于纯化腺病毒的方法，其中腺病毒制备物经历阴离子交换层析和接着的尺寸排阻层析。在此尺寸排阻步骤中，实现从低分子量的杂质中对病毒颗粒的一组分离。
采用羟基磷灰石介质来净化腺病毒也是可能的，见WO 02/44348。
也可以使用反相吸附步骤，例如在WO 03/097797的26页描述的。
国际申请WO 97/08298描述使用某些层析基质纯化腺病毒以防止对病毒的损害，包括阴离子交换和尺寸排阻步骤。
某些超滤方法也非常适合用作腺病毒的纯化，正如在WO 2006/108707中所公开的。这些步骤可以在除某些层析纯化步骤之外额外进行或代替所述层析纯化步骤进行。
从高细胞密度培养物中对腺病毒的进一步的有益的纯化方法已在由申请人于2009年10月15日提交的EP 09173090.3和EP 09173119.0申请(通过引用全部并入本文)中有所描述。
制备药物制备物
在某些实施方案中，将纯化的腺病毒配制成药物组合物。这可以通过多种方法和使用多种缓冲液完成，其全部依据本领域技术人员所熟知的常规方法。在一般情况下，必需使腺病毒颗粒处于药学可接受的组合物中，所述组合物包含该腺病毒和至少一种药学可接受的赋形剂。可以在技术人员所知的条件下制备这样的组合物，并在某些实施方案中此组合物适合于给人类施用。
例如，在组分离过程中腺病毒可以通过缓冲液交换至也为腺病毒世界标准所用的缓冲液中并最终储存在该缓冲液中(Hoganson等人，Development of a stable adenoviral vector formulation,Bioprocessing March2002，43-48页)：20mM的pH 8的Tris，25mM氯化钠，2.5％甘油。
显然，可以使用许多其他的缓冲液，例如适用于纯化的(腺)病毒制备物的储存和药物学施用的几种配方的实例可以在欧洲专利号0853660和国际专利申请WO 99/41416、WO 99/12568、WO 00/29024、WO 01/66137、WO03/049763中找到。
在某些实施方案中，腺病毒载体用作疫苗，而这些一般包含在药学可接受的载体或赋形剂以及(或)稀释剂中。药学可接受的载体或赋形剂和稀释剂在本领域是众所周知的，并广泛应用于范围广泛的治疗产品。优选地，使用在疫苗中工作良好的载体。更优选地，疫苗还包含佐剂。如本领域所知的，佐剂进一步提高对所应用的抗原决定簇的免疫反应，例如在WO2007/110409中所公开的包含腺病毒和磷酸铝佐剂的药物组合物。
为了给人类施用，本发明可以采用包含rAd和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在此上下文中，“药学可接受的”一词是指所述载体或赋形剂，在所采用的剂量和浓度下，不会对施用的对象造成任何不想要的或有害的效果。这样的药学可接受的载体和赋形剂是本领域所熟知的(见Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishing Company[1990];Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides and Proteins,S.Frokjaer and L.Hovgaard,Eds.,Taylor & Francis[2000];and Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press[2000])。纯化的rAd优选以无菌溶液来配制和施用，不过利用冻干制备物是在本发明的范围内。通过无菌过滤或在本领域中本身已知的其他方法制备无菌溶液。然后将该溶液冻干或填充入药物剂量容器。该溶液的pH通常在pH 3.0至9.5的范围内，例如pH 5.0至7.5。rAd一般在具有适合的药物可接受的缓冲剂的溶液中，而且rAd的溶液可能也含有盐。任选地，可以存在稳定剂，如白蛋白。在某些实施方案中，添加去污剂。在某些实施方案中，rAd可以配制成可注射的制备物。这些制剂含有有效量的rAd，是无菌液体溶液、液体悬浮液或者是冻干版本并且任选地含有稳定剂或赋形剂。
本发明公开生产腺病毒载体特别是rAd26的方法，，此方法的产量非常高，并且就我们所知在此所获得的和公开的产量尚未有所报道。在本发明的方法中使用了生物反应器，而具有每容积非常高数量的腺病毒颗粒的生物反应器是本发明的直接(中间)产品。本发明因此还提供有介于2L和2000L之间的工作容积的生物反应器，优选介于10L和1000L之间，其包含培养基、生产细胞和至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL。如上所描述的，所述培养基可以是任何适合于所述细胞的增殖和腺病毒感染的培养基。生物反应器的容积、生产细胞和rAd26颗粒的数量和VP/IU比值的方面在上面的本发明方法中有所描述。在优选的实施方案中，生物反应器连接至ATF灌注系统。
在另一方面，本发明提供生产至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL的方法，该方法包含：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)在大约10×106活细胞/mL和16×106活细胞/mL之间的细胞密度下用rAd26感染所述细胞；c)用灌注系统进一步培养受感染的细胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒颗粒的浓度达到至少1×1012VP/mL；和d)收获所述rAd26。在本公开内容之前，如此高产量的rAd26是否可行是完全未知的，更别说如何达到如此高的产量。根据在此公开的方法，本发明公开这些产量是可能的。优选地，所收获的rAd26的物理颗粒对感染性颗粒的比值小于30:1。有益的另外的实施方案在前述的根据本发明的方法中有所描述。
在下面的实施例中进一步解释本发明。该实施例不以任何方式限制本发明。它们只用于澄清本发明。
实施例
实施例1：在高细胞密度下使用Ad5载体的感染
从
Figure BDA00002014154900181
工作细胞库中解冻细胞，并湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度以在1.5L的容积和0.2至0.5×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH下，在生物反应器中增殖细胞。在4.7×106总细胞/mL的细胞密度下，开始ATF灌注方法。该ATF来自Refine Technology有限公司(East Hanover，NJ)。89小时后细胞密度达到12.4×106总细胞/mL。在此刻收获部分细胞并在300g下离心细胞5分钟。在新鲜的不含血清的培养基中重新悬浮细胞沉淀至以下浓度：
-1.3×106活细胞/mL，30mL/摇瓶(shaker)，两个250mL的摇瓶
-10×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
-20×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
-30×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
在90VP/细胞的MOI下，用Ad5.CS(rAd5载体；Shott等人，2008)感染这些摇瓶，在36°C、10％的CO2和100rpm下孵育。感染后第1天和第2天，对在10、20和30×106活细胞/mL下被感染的摇瓶进行培养基更新。通过在300g下5分钟的离心步骤和在每摇瓶30mL新鲜培养基中重新悬浮细胞沉淀进行培养基的更新。感染后第3天收获摇瓶并取样用于AEX-HPLC分析。通过将每个摇瓶的1mL样品体积与100μL的10％Triton X-100混合并在37°C孵育30分钟进行收获物的细胞裂解。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C下保存样品，直到进行AEX-HPLC分析来测定所生产的病毒颗粒数量(VP/mL)。结果如图1中所示。
在10×106活细胞/mL的细胞密度下感染的容积产量是在1×106活细胞/mL下的10倍。这有些出人意料，因为在之前报道中所报道的细胞密度效应是在低得多的密度下(即在大约0.5-3×106细胞/mL，例如Maranga等人，2005；Kamen等人，2004；Altaras等人，2005)。然而，超过10×106细胞/mL就观察到细胞密度效应，并且容积产量下降。因此，在灌注系统中观察到对重组Ad5的细胞密度效应。
实施例2：在低细胞密度下(1-1.6×106活细胞/mL)使用rAd35的感染
在实施例1中，使用了rAd5。然而，已知有不同的腺病毒血清型并且为不同的目的有所描述。这些血清型可能具有不同的属性，因此对一种血清型有用的方法不一定总是适合于另一种血清型。这可能在工业规模方法中尤其相关，其中看似微小的差别可能从经济上来说非常重要。用于例如疫苗的一个具体的有益的血清型是Ad35，在下面的实施例中我们测试改善rAd35的产量以获得大量rAd35的可行性。这一实施例显示在低细胞密度下用rAd35载体的感染，作为与下面的在较高的细胞密度下感染细胞的实施例的比较。
从
Figure BDA00002014154900191
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度以在5L的容积和0.2至0.35×106活细胞/mL的细胞密度下接种10L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH下，在生物反应器中增殖细胞。接种后四天(当细胞密度达到介于2至3.5×106活细胞/mL之间)用5L新鲜培养基稀释细胞悬浮液，之后用rAd35.TB-S(rAd35载体；Radosevic等人，2007)在70VP/cell的MOI下感染。在36℃、7.3的pH和40％的DO下进行病毒增殖。感染后三天，对生物反应器取样用于细胞计数和病毒生产的测定。为了释放病毒，每个生物反应器的1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟。最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC分析。根据以上所述方法，总共进行和分析了10次生物反应器运行，这些运行给出一致的结果(未显示)。平均病毒颗粒生产为2.3×1011VP/mL。
对于大约1.5×1019VP的年需求，以这样的产量必须进行大约65000L。这会需要大型的设施和因此而来的在疫苗开发过程中大量的前期投资。
实施例3：使用rAd35在高细胞密度(>10×106活细胞/mL)下的感染方法的可行性研究。
从
Figure BDA00002014154900201
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在1.5L的容积和0.2至0.5×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH下，在生物反应器中增殖细胞。在6.8×106总细胞/mL的细胞密度下，使用ATF灌注系统开始培养基的灌注。70个小时后细胞密度达到36.8×106总细胞/mL。在此刻进行以下感染：
·在以下细胞密度下的摇瓶中的感染：
ο1.3×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
ο10×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
ο20×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
ο30×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
·在8.7×106总细胞/mL(84%的活性)下在2L生物反应器的规模下感染
ο感染生物反应器后一个小时，从生物反应器取出样品并转移到两个250mL的摇瓶，30mL/摇瓶。
对于在250mL摇瓶的感染方法，从2L生物反应器收获一部分的细胞悬浮液并且将此悬浮液在300g离心5分钟。在新鲜的不含血清的培养基中重新悬浮细胞沉淀至上述浓度。在70VP/细胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染摇瓶，并在36°C、10％的CO2和100rpm下孵育。感染后第1天和第2天，对在10、20和30×106活细胞/mL下被感染的摇瓶进行培养基的更新。通过在300g下5分钟的离心步骤和在每摇瓶30mL新鲜培养基中重新悬浮细胞沉淀进行培养基的更新。感染后第3天收获摇瓶并取样用于AEX-HPLC分析。通过将每个摇瓶的1mL样品体积与100μL的10％Triton X-100混合并在37°C孵育30分钟进行所获物的细胞裂解。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C下保存样品直到进行AEX-HPLC分析。
在2L生物反应器中剩余的细胞用新鲜的不含血清的培养基稀释到8.7×106总细胞/mL(84％活性)。在70VP/细胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染生物反应器，并在36°C、7.3的pH和40％的DO下孵育。感染后15小时启动ATF系统，培养基更新速率为每天1生物反应器容积。感染后第1、2、3和4天对生物反应器取样用于细胞计数(CASY细胞计数)和病毒生产的的AEX-HPLC测定。如上所述进行样品的制备。在低于-65°C下保存样品直到进行AEX-HPLC分析。
感染生物反应器后大约一小时，从2L生物反应器取出一份至少60mL的样品并以每摇瓶30mL的容积开始两个感染(250mL摇瓶)。感染后第1天和第2天，进行培养基更新以模仿灌注系统。通过在300g下5分钟的离心步骤和在每摇瓶30mL新鲜培养基中重新悬浮细胞沉淀进行培养基的更新。感染后第3天收获摇瓶并取样用于AEX-HPLC分析。如上所述进行样品的制备。在低于-65°C下保存样品直到进行AEX-HPLC分析。
结果如图2所示。结果显示在介于1.3×106活细胞/mL和30×106活细胞/mL之间的感染是可能的。与rAd5的结果相反，rAd35的总产量随着感染时细胞密度的增加(甚至在10×106活细胞/mL样品以上)而增加。在30×106活细胞/mL达到1.4×1012VP/mL的容积得率。该结果清楚地表明在高细胞密度下，即10×106活细胞/mL或更高，用Ad35.TB-S感染是可能的。即使在30×106活细胞/mL，感染也给出高的容积产量。
需要注意的是看到从1.3×106活细胞/mL的120.000VP/细胞到30×106活细胞/mL的47.000VP/细胞的单位生产力的下降。从在生物反应器中感染的细胞悬浮液开始的摇瓶显示8.0×1011VP/mL的收获产量和92.000VP/细胞的单位生产力。在2L生物反应器中的结果有些低：获得5×1011VP/mL的收获产量，其单位生产力为57.000VP/细胞。
实施例4：使用rAd35载体在高细胞密度下感染的生物反应器实验。
1)从工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在0.59×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在2L生物反应器中增殖细胞。当达到大约2.9×106总细胞/mL的细胞密度(接种后4天)启动ATF系统。经过118小时的灌注后达到29×106总细胞/mL的细胞密度。此刻收获一部分的细胞悬浮液而剩余的细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释到16.4×106总细胞/mL的细胞密度(82％活性，13.4×106活细胞/mL)。随后在70VP/细胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染2L生物反应器，并在36°C、7.3的pH值和40％的DO下孵育。感染后15小时启动ATF系统，培养基更新速率为每天2容器容积。感染后第1、2和3天对生物反应器取样用于细胞计数(CASY细胞计数)和病毒生产的AEX-HPLC测定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC分析。结果如表2中所示。
此结果证明在10×106活细胞/mL以上的细胞密度下的感染在连接到灌注系统的生物反应器中是可行的，并且与批量方法(实施例2)相比它可能增加容积产量几乎10倍。没有观察到受感染培养物的过早的细胞损失，表明ATF方法对培养受感染细胞是一种合适的系统。
表2:实施例4(1)的结果
FDA对rAd批次的要求是VP/IU比值<30。QPA(基于Q-PCR的效价测定；Wang等人，2005)显示所有样品符合此要求。相比之下，公开于Yuk等人(2004)的样品具有大约100的VP/IU比值(其中的图2A/2B)。物理颗粒对感染性颗粒的比值是腺病毒的一个相关参数，而对rAd批次而言优选较低的比值。在这一实施例中制备的批次一致地具有这样小于10:1的低比值。
对于大约1.5×1019VP的年需求和具有大约2×1012VP/ml的产率，需要加工少于7500L的收获物。这些容积可以在1000L或更少的设施中进行加工，因此会降低在疫苗开发过程中前期费用投入。
2)在2L生物反应器的进一步实验
从
Figure BDA00002014154900232
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在0.44×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在2L生物反应器中增殖细胞。感染后4天，在大约2.72×106总细胞/mL的细胞密度下启动ATF系统。经过144小时的灌注后达到30.5×106总细胞/mL的细胞密度。此刻收获一部分的细胞悬浮液而剩余的细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释到16.2×106总细胞/mL的细胞密度(81％活性，因此是13.1×106活细胞/mL)。随后在70VP/细胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染2L生物反应器，并在36°C、7.3的pH值和40％的DO下孵育。感染后5小时启动ATF系统，培养基更新速率为每天2容器容积。感染后第2、3和4天对生物反应器取样用于细胞计数和病毒生产的AEX-HPLC测定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC分析。结果如表3中所示。
表3:实施例4(2)的结果
Figure BDA00002014154900241
此结果再次证明了在10×106活细胞/mL以上的细胞密度下的感染在连接到灌注系统的生物反应器中是可行的，并且与批量方法(实施例2)相比可能增加容积产量几乎10倍。此外，这一实施例证明感染后的灌注速率可以被限制为每天2容器容积而不危害病毒生产。
对于大约1.5×1019VP的年需求和具有大约2×1012VP/ml的产率，需要加工少于7500L的收获物。这些容积可以在1000L或更少的设施中进行加工，因此会降低在疫苗开发过程中前期费用投入。
3)在50L生物反应器中的进一步实验
从
Figure BDA00002014154900242
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在0.52×106总细胞/mL的细胞密度下接种10L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在10L生物反应器中增殖细胞。当达到大约5.3×106总细胞/mL的细胞密度(接种后4天)启动ATF系统。经过118小时的灌注后达到77×106总细胞/mL的细胞密度。此刻将10L细胞悬浮液用新鲜培养基在50L生物反应器中稀释到15.5×106总细胞/mL的细胞密度(81％活性，因此是12.6×106活细胞/mL)。随后在70VP/细胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染50L生物反应器，并在36°C、7.3的pH值和40％的DO下孵育。感染后5小时启动ATF系统，培养基更新速率为每天2容器容积。感染后第2和3天对50L生物反应器取样用于细胞计数和病毒生产的AEX-HPLC测定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC分析。结果如表4中所示。
表4:实施例4(3)的结果
Figure BDA00002014154900251
此结果证明了在10×106活细胞/mL以上的细胞密度下的感染在连接到灌注系统的50L生物反应器中是可行的，并且与批量方法(实施例2)相比50L的规模可能增加容积产量几乎10倍。由此显示所开发的方法可以放大规模。为了满足病毒的年需求所必须每年进行加工的收获物容积可以用此方法生产。对于大约1.5×1019VP的年需求和大约2×1012VP/ml的产率，需要加工少于7500L的收获物。这些容积可以在1000L或更少的设施中进行加工，因此会降低在疫苗开发过程中前期费用投入。
实施例5：用rAd26在低细胞密度(1-1.6×106活细胞/mL)下的感染。
这一实施例显示在低细胞密度下用包含CS疟疾转基因的rAd26载体(rAd26.CS)的感染，作为与后面的在较高的细胞密度下感染的实施例的比较。
从
Figure BDA00002014154900252
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度在5L的容积和0.25至0.35×106活细胞/mL的细胞密度下接种10L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在生物反应器中增殖细胞。接种后三天(当细胞密度达到介于1至2.1×106活细胞/mL之间)用5L新鲜培养基稀释细胞悬浮液，之后用rAd26.CS在70VP/cell的MOI下感染。在36℃、7.3的pH值和40％的DO下进行病毒增殖。感染后三天，对生物反应器取样用于细胞计数和病毒生产的测定。为了释放病毒，每个生物反应器的1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟。最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC分析。根据上述方法，总共进行和分析了5次生物反应器运行，这些运行给出一致的结果(未显示)。平均病毒颗粒的生产为7.6×1010VP/mL。
对于大约1.5×1019VP的年需求，以这样的产量必须每年进行大约197000L。这会需要大型的设施和由此而来的在疫苗开发过程中大量的前期投资。
实施例6：用rAd26载体在高细胞密度下感染的可行性。
之前评估了用Ad35在高细胞密度下的感染的可行性，显示Ad35的生产可以放大规模。由于腺病毒血清型之间存在显著的差异，在此测试通过感染高密度培养物来生产Ad26是否可行。
从
Figure BDA00002014154900261
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在1.5L的容积和0.5×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在生物反应器中增殖细胞。在3.6×106总细胞/mL的细胞密度下，开始ATF灌注方法。120个小时后细胞密度达到21.6×106总细胞/mL。此刻收获一部分细胞。在300g下离心细胞5分钟并在新鲜的不含血清的培养基中重新悬浮细胞沉淀至以下浓度：
·1.3×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
·10×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
·20×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
·30×106活细胞/mL，30mL/摇瓶，两个250mL的摇瓶
在70VP/细胞的MOI下，用Ad26.CS感染摇瓶，并在36°C、10％的CO2和100rpm下孵育。感染后第1天和第2天，为在10、20和30×106活细胞/mL下被感染的摇瓶进行培养基的更新。通过在300g下5分钟的离心步骤和在每摇瓶30mL新鲜培养基中重新悬浮细胞沉淀进行培养基的更新。感染后第3天收获摇瓶并取样用于AEX-HPLC分析。通过将每个摇瓶的1mL样品体积与100μL的10％Triton X-100混合并在37°C孵育30分钟进行收获物的细胞裂解。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C下保存样品直到进行AEX-HPLC分析。结果如图3所示，而且显示在高达30×106活细胞/mL的细胞密度下用Ad26感染细胞是可行的。rAd26的容积产量高于例如用Ad5所获得的产量。
与rAd35的结果相反，在高于10×106活细胞/mL的细胞密度时观察到细胞密度效应。事实上，在增加感染时的细胞密度到10×106活细胞/mL以上时rAd26的产量增加，而在20×106-30×106活细胞/mL的范围内产量减少。
基于所观察的细胞密度效应，对Ad26可以确定感染时的最佳细胞密度。所述最佳细胞密度位于10-16×106活细胞/mL的范围内。在所述范围内感染细胞所获得的rAd26的容积产量，显著高于在低细胞密度(例如在批次方法中)感染细胞所获得的容积产量。事实上，实施例5中在低细胞密度下所获得的产量等于7.6×1010VP/mL，而在高细胞密度下感染时，产量高达1-2×1012VP/mL(见实施例7)。在所述范围内的感染允许可用于大生产规模的有高生产性的方法。
实施例7：在生物反应器中用rAd26在高细胞密度下的感染。
从
Figure BDA00002014154900271
工作细胞库中解冻细胞，并在湿润培养箱中在37°C和10％的CO2下在不含血清的培养基中增殖细胞。每3至4天进行继代培养，直到达到足够的细胞密度可以在0.6×106活细胞/mL的细胞密度下接种2L的生物反应器。在37°C、40％的DO和7.3的pH值下，在2L生物反应器中增殖细胞。感染后2天，在大约2×106总细胞/mL的细胞密度下启动ATF系统。经过7天的灌注后达到19.1×106总细胞/mL的细胞密度。此刻收获一部分的细胞悬浮液而剩余的细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释到16.5×106总细胞/mL的细胞密度(80％活性，因此是13.1×106活细胞/mL)。随后在70VP/细胞的MOI下，用Ad26.CS感染2L生物反应器，并在36°C、7.3的pH值和40％的DO下孵育。感染后15小时启动ATF系统，培养基更新速率为每天2容器容积。感染后第3、4、5和6天对2L生物反应器取样用于细胞计数和病毒生产的AEX-HPLC和QPA测定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL的10％Triton X-100混合，并在37°C孵育30分钟。孵育后将样品与2.42μL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，随后在37°C孵育30分钟，最后向样品添加100μL的50％蔗糖。2500g下5分钟的离心步骤后，在低于-65°C的温度下保存样品直到AEX-HPLC和QPA分析。结果如表5中所示。
表5:实施例7的结果
这些结果首次证明在介于10×106以上和16×106活细胞/mL的细胞密度下的rAd26的感染在连接到灌注系统的生物反应器中是可行的，并且与批量方法(如实施例5中所示)相比可能增加容积产量20倍。
对于大约1.5×1019VP的年需求和具有大约2×1012VP/ml的产率，需要加工少于7500L的收获物。这些容积可以在1000L或更少的设施中进行加工，因此会降低在疫苗开发过程中前期费用投入。
当比较感染后的细胞生长，观察到在Ad26感染后，细胞倾向于进一步生长，而在Ad35感染后，细胞停止生长。事实上，显示(图4)在12×106vc/ml的密度下用Ad26感染的细胞在3天后进一步生长至22×106vc/ml的最大值。用Ad35感染后，在12×106vc/ml的密度下感染的细胞在2天时进一步生长至最大值，而在3天后下降到14×106vc/ml的密度。因此，Ad26增殖不同于Ad35。连同之前所描述的细胞密度效应，这显示不同血清型的重组腺病毒(Ad5、Ad35和Ad26)在细胞中的增殖之间有清楚的差异，这些差异对从这些血清型中生成药物材料的工业规模方法具有影响。
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Claims (12)

1.用于生产重组腺病毒血清型26(rAd26)的方法，所述方法包括：
a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；
b)在10×106活细胞/mL-16×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染所述细胞；
c)用灌注系统进一步培养受感染的细胞以增殖所述rAd26；和
d)收获所述rAd26。
2.权利要求1的方法，其中在大约10×106-14×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染步骤b)中的所述细胞。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)中的所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。
4.前述权利要求中任一项的方法，还包括：
e)纯化所述rAd26，和任选地
f)制备含有所纯化的rAd26的药物组合物。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组腺病毒缺少E1区的至少一部分，并包含异源核酸。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)中的所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)在第一生物反应器中进行，步骤b)和c)在第二生物反应器进行。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所生产的rAd35的物理颗粒与感染性颗粒的比值(VP/IU)小于30:1，优选小于20:1。
9.包含培养基、生产细胞和病毒颗粒的生物反应器，其中所述生物反应器具有2升-1000升，优选50升-500升的工作容积，并且特征在于所述生物反应器包含至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL。
10.权利要求9的生物反应器，其连接至ATF灌注系统。
11.权利要求9或10的生物反应器，其中所述rAd26病毒颗粒具有小于30:1，优选小于20:1的VP/IU比值。
12.用于生产至少1×1012rAd26病毒颗粒(VP)/mL的方法，所述方法包括：
a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；
b)在10×106活细胞/mL-16×106活细胞/mL的密度下用rAd26感染所述细胞；
c)用灌注系统进一步培养受感染的细胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒颗粒的浓度达到至少1×1012VP/mL；和
d)收获所述rAd26。
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