JP4475819B2 - チャイニーズハムスター卵巣細胞中でのウシコロナウイルスの増殖 - Google Patents
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- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、コロナウイルス（ウシコロナウイルスを含む）の固定依存性培養物および懸濁培養物の増殖のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）は、２〜４週齢の仔ウシをしばしば苦しめる、新生仔ウシの下痢の一般的な原因である。主な病原体として、ＢＣＶは、一般的に、軽度の下痢を誘導する。しかし、二次細菌感染と組み合わされる場合、ＢＣＶは１ヶ月齢以下の仔ウシにおける死亡率に対する主要な寄与因子になり得る。
【０００３】
より最近、ＢＣＶは、より年をとったウシの潜在的呼吸病原体としてほのめかされており、そしてこれは、糞便中のＢＣＶの存在およびこのような発生の間のＢＣＶ抗体セロコンバージョンによって証拠付けられるように、乳牛における冬季赤痢の発生に関連している。
【０００４】
従って、このようなウシ疾患を予防するワクチン産生のために、ＢＣＶを増殖させる培養系についての必要性が存在する。
【０００５】
伝統的には、ＢＣＶは、細胞培養において増殖することが困難であり、単離後に順応期間を必要とする。多くの樹立された細胞株は、ＢＣＶの増殖に適切ではなく、そして首尾よく報告された増殖のうちの多くは、大規模産生には不適切である初代細胞培養物の使用を含む。さらに、ほとんどのコロナウイルスは、顕著な組織向性を示し、そして天然宿主種の細胞においてのみ増殖する。例えば、Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１８：３３３〜３４２（１９８７）；Ｓｕｓｓｍａｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１８：３９９〜４１０（１９８７）を参照のこと。従って、ＢＣＶは、一般的に、胎児ウシ腎臓細胞中で増殖されるが、より簡便な樹立細胞株中で代わりにウイルスを増殖させることが所望される。
【０００６】
ウシにおけるＢＣＶ感染を予防する経済的重要性、およびワクチン産生のためにウイルスを増殖させるために通常使用される細胞培養系の使用に固有な困難性を考慮すると、培養物においてＢＣＶを増殖させるための改善された方法についての必要性が存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でウシコロナウイルス（ＢＣＶ）を増殖させるための方法を提供することによって前述の必要性を満たす。より詳細には、本発明は、ウイルスの増殖が生じる条件下で、ＢＣＶに感染したＣＨＯ細胞を培養することを包含する、ＢＣＶを増殖させるための方法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である。他方、増殖したＢＣＶは、アメリカンタイプカルチャーコレクション株ＡＴＣＣ ＶＲ−８７４である。別の実施形態において、このＣＨＯ細胞は、固定依存性培養物において増殖され、一方、別の実施形態において、それらは、懸濁培養物において増殖される。
【０００９】
（発明の記述）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、それらの全体において、本明細書中によって本明細書中に参考として援用される。
【００１０】
本発明は、試験された種々の細胞株中で、ＣＨＯ細胞がＢＣＶを効率的に増殖させるために比類なく適切であったという驚くべき発見に基づく。このような細胞は、懸濁培養物においてこのウイルスを増殖させるために特に適切であることが見出されたが、それらはまた、適切な基材に効果的に付着されて有効に使用され得る。
【００１１】
基材に付着したＣＨＯ細胞中でのＢＣＶの増殖は、全ての標準的な容器（組織培養プレートおよびフラスコ、回転ボトル、およびキャピラリーアセンブリまたは包装されたベッドバイオリアクタ（この中で、キャピラリーチューブまたは他の適切な支持マトリクス（例えば、ガラスビーズもしくはポリマーフォーム）のいずれかに付着されたＢＣＶ感染細胞が、適切な培養培地で灌流され、それによってキャピラリーアセンブリまたはバイオリアクタから出現する培地からの、ウイルスの連続的な回収を可能にする）を含むがこれらに限定されない）で実施され得る。このバイオリアクタ系において、ＢＣＶに感染した基材依存性ＣＨＯ細胞は、ポリマー微粒子に付着され得る。あるいは、ＣＨＯ細胞は、攪拌によって懸濁を維持される、任意の基材とは無関係に増殖させるために、標準的な方法によって適合され得る。
【００１２】
本発明において使用され得る培養培地としては、ＣＨＯ細胞を培養するために有用である、当該分野において周知の任意の培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）を含む）が挙げられる。代表的には、このような培地は、さらなる栄養剤および増殖（成長）因子の供給源として動物の血清を添加することによって強化される。本発明における使用のために適切なこのような動物血清の例としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および成体ウシ血清（ＡＢＳ）が挙げられる。
【００１３】
しかし、本発明はまた、規定された培地を使用して実施され得、ここでＣＨＯ細胞は、任意の動物血清の使用から完全に引き離される。使用され得るこのような規定された培地の１つの例は、ホルモンおよび非血清補充物（アルブミン、インスリン、トランスフェリンおよびトリプトースを含む）を含むＤＭＥＭのような基本培地である。細胞は、徐々に減少したレベルの血清を含む標準培地中での連続的な継代、続いて低血清および漸増した割合の規定された培地を含む規定された培地の混合物への移動によって、このような規定された培地に適合され得る。本発明の方法は、任意のＢＣＶ株の増殖に適用可能である。Ｍｅｂｕｓ株と呼ばれるＢＣＶおよび英国の地の単離物は、以下の実施例において本発明を例証するために使用され、他の単離物または他の公知の株も同様に、使用され得た。このような公知の株としては、例えば、株ＰＱ、ＤＢ２、ＤＢＡ、ＳＤ、２１６ＸＦ、ＣＮ、ＢＥ、ＡＷ、ＯＨＣ、ＳＤＣ、ＪＡＺ、ＴＳ、ＢＭ、ＢＷ、Ｌ９、Ｇ１１０、Ｆ１５、Ｓ１、Ｓ２、およびＣＫが挙げられる。
【００１４】
Ａ２株、Ａ２Ｈ株、ＸｒＳ６株、ＣＨＯ−Ｋ１株、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ株、ＲＲ−ＣＨＯＫ１株、ＵＴ−１株、Ｐ２２株、ＣＨＯ−１Ｃ６株、Ｌｅｃ１株、Ｌｅｃ２株、Ｌｅｃ８株、Ｐｒｏ−５株、およびＤＵＫＸＢ１株を含むがこれらに限定されない任意のＣＨＯ細胞株が使用され得るが、登録番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されたＣＨＯ−Ｋ１株が好ましい。同様に、広範な範囲のＢＣＶが、ＣＨＯ細胞中で増殖され得るが、アメリカ合衆国のネブラスカにおいて、下痢を患ったウシの糞便からもともと単離された、ＢＣＶのＭｅｂｕｓ株の増殖は、本発明の例示の目的のために以下に記載される。
【００１５】
産生されるウイルスの収率を最大にするために、ＣＨＯ細胞は、好ましくは、標準的な技術を使用して懸濁培養に適合され、この技術の１つの例は、以下に例示される。
【００１６】
（実施例）
本発明は、以下の実施例によって例示され得る。他に示さない限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体について以下に示される百分率は、それぞれ、重量／重量、容量／容量および重量／容量の基準である。滅菌条件を、一般的に、細胞培養の間維持した。
【００１７】
（材料および一般的な方法）
ＢＣＶのＭｅｂｕｓ株（仔ウシ下痢コロナウイルス）を、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８７４の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。簡便さのために、このウイルスを、ＢＣＶ ＶＲ−８７４と以下でいう。ＢＣＶ ＭＶＢと命名された英国から得られたＢＣＶ地単離物（ＢＣＶ ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅ）もまた、使用した。
【００１８】
ＢＣＶ増殖について試験された種々の細胞株を、ＦＣＳの代わりに成体ウシ血清（ＡＢＳ）を補充した培地中で増殖させた。これらの細胞は、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、サル胎児性腎臓（ＭＡ１０４）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、シリアンハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞、およびヒト直腸腺癌（ＨＲＴ−１８）細胞を含んだ。懸濁培養細胞は、懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびハムスター腎臓細胞［ＢＨＫ（Ｂｕｒｇ）と命名された］を含んだ。
【００１９】
ＭＤＣＫ細胞は、伝統的に、ＡＢＳ補充培地中で増殖されるが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＲＴ−１８細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞は、最初に、ＦＣＳを含む培地中で増殖されるが、次いで、ある血清を他の血清で徐々に交換することによって、ＡＢＳを含む培地中での増殖に適合される。
【００２０】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）を、ポリミキシンＢサルフェート（１０，０００μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、トリプシン−ＥＤＴＡ［（１×）０．５ｇトリプシン（１：２５０）および改変Ｐｕｃｋ生理食塩水Ａ１リットルあたり０．２ｇ ＥＤＴＡ］、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）、Ｌ１５ Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＣ １０×）、トリプシン２．５％およびリン酸トリプトースブロス（ＴＰＢ）の溶液として、Ｇｉｂｃｏから得た。ＦＣＳおよびＡＢＳを、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｌａｂｓから得た。Ｌ−プロリン ４０ｍｇ／リットルの最終濃度で使用された１０００×ストック溶液は、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ（１００×ストック溶液）およびウシアルブミン画分Ｖと同様に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からであった。懸濁培養物中でＣＨＯ−Ｋ１細胞を増殖させるためのＣＨＯ細胞培地は、ＰＡＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓからであった。Ａｇａｒｏｓｅ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅを、Ｆｌｏｗｇｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄから得た。Ａｌｓｅｖｅｒ溶液におけるラット血液は、Ｓｅｒｏｔｅｃからであった。
【００２１】
種々の細胞株の増殖に使用された培地の処方を、以下の表に示す：
【００２２】
【表１】
全ての細胞株を、液体窒素中での保存から回復させ、そして適切な培地中で数回継代した。固定依存性ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞を、ＤＭＥＭ中で増殖するように適合させ、一方、ＢＨＫ−２１細胞を、ＧＭＥＭ中で増殖させた。生存細胞数および顕微鏡での観察を使用して、細胞増殖をモニターした。細胞をコンフルエンスまで増殖させ、そして各継代時に、適切な比率で分割した。一旦、健常な細胞増殖が樹立されると、ウイルス力価測定を、固定依存性細胞で行った。
【００２３】
ＣＨＯ−Ｋ１懸濁細胞を、任意のさらなる添加なしにＣＨＯ培地中で増殖させた。懸濁細胞を、スピナーフラスコ中で増殖させ、そしてＢＣＶに直接接種した。
【００２４】
種々の固定依存性細胞株の培養物におけるウイルス力価測定を、本質的に以下の通りに、コンフルエントな単層の細胞を有する２４−ウェルプレートを使用して、行った。ＢＣＶを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加されたトリプシンを有するかまたは有しないＤＭＥＭ中で１／１０に希釈した。トリプシンの効果を、その存在がウイルスの複製を増強し、そしてさもなくば非許容性とみなされるいくつかの細胞株における増殖を促進するということを示唆する報告に基づいて調査した。例えば、Ｄｅａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：２４０〜２４４（１９８０）；Ｓｔｏｒｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１２１４〜１２２２（１９８１）；Ｔｏｈｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．４３：９６７〜９７２（１９８２）を参照のこと。
【００２５】
３７℃での１時間のインキュベーション後に、このウイルスを、１０-2、１０-3、および１０-4に希釈した。増殖培地を、このプレートから除去し、そして１００μｌの各ウイルス希釈物を、このウェルに添加した。このウイルスがこのプレート全体に均一に広がることを保障するために、穏やかに揺り動かしながら、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００２６】
インキュベーション後に、接種物を除去し、そして１ｍｌの重層培地（２％ＦＣＳおよび１％アガロースを含むＬ１５培地）を、各ウェルに添加した。トリプシン処理ウイルスを含むプレートは、各ウェルに添加された２％ＦＣＳ、１％アガロースおよびトリプシンならびに５０μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎを含むＬ１５培地を有した。このプレートを、３７℃で８日間、５％ＣＯ2においてインキュベートし、次いで、細胞障害効果（ＣＰＥ）の存在または非存在について顕微鏡で試験した。
【００２７】
このプレートを、３７℃で８日間、５％ＣＯ2においてインキュベートし、次いで、細胞障害効果（ＣＰＥ）の存在または非存在について顕微鏡で試験した。観察されたＣＰＥは、代表的に、細胞顆粒形成、合胞体形成および細胞溶解を含んだ。
【００２８】
二連のセットのプレートは、ウェルに添加されたアガロースを含まない、１ｍｌのＬ１５／２％ ＦＣＳ培地を有した。上記のような３７℃で８日間のインキュベーション後に、この培地を取り出し、そして血球凝集反応（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）活性についてアッセイした。これを、Ｖ字底マイクロタイタープレートにわたる、ウイルスの５０μｌの二重希釈物を力価測定することによって達成した。１ｍｌのラット赤血球（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、０．５％ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝化生理食塩水（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で２回洗浄して、次いで遠心分離をして、細胞を沈降させた。得られたパッケージングされた細胞容量を、１５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈して、０．２５％懸濁液を生成した。５０マイクロリットルの０．２５％ラット赤血球懸濁液を、各ウェルに添加して、そして血球凝集反応の程度を、室温で１時間後にスコア付けした。
【００２９】
底に形成された赤血球のマットを含むウェルを、血球凝集反応に対して陽性であるとスコア付けし、そして赤血球が、ウェルの底に移動して小さなボタンを形成したウェルを、陰性としてスコア付けした。赤血球の完全な凝集反応が観察された最高の希釈物として、血球凝集反応力価を規定した。
【００３０】
ＢＨＫ（Ｂｕｒｇ）細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁培養物におけるウイルス力価測定を、３０ｍｌの円錐底汎用性容器中に細胞を分割し、そして低速遠心分離によって細胞を沈降させることによって行った。上清液を廃棄し、そして残っているペレットを、１個の汎用性容器あたり１ｍｌのＧＭＥＭ中に再懸濁した。
【００３１】
ＢＣＶを、８日間のＣＨＯ−Ｋ１固定依存性細胞中での増殖によって調製した。回収物を、３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって清澄化した。次いで、ＢＣＶを、ＧＭＥＭ培地で１／２０、１／２００および１／１０，０００に希釈し、そしてＢＨＫ−２１（Ｂｕｒｇ）細胞に、１／２０および１/２００で感染させ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、１／２００および１／１０，０００で感染させた。細胞に、ウイルスを用いて３７℃で１時間インキュベートした。コントロール細胞をウイルス増殖培地に接種し、感染を刺激した。
【００３２】
ＢＨＫ−２１（Ｂｕｒｇ）細胞の二連の汎用物は、２％ＦＣＳを含むかまたは含まない、１０％ＴＰＢおよびネオマイシン／ポリミキシンを含有する、２つの再懸濁された５ｍｌのＧＭＥＭにあった。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２５ｍｌのＣＨＯ培地中に再懸濁した。各汎用物からの内容物を、１２５ｍｌの円錐フラスコに移して、そして３５℃で振盪インキュベーター中に配置した。培養物を毎日サンプリングし、そして血球凝集反応活性について試験した。
【００３３】
（ＢＣＶ増殖は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞により支持される）
英国の地の単離物であるＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、コンフルエントな単層の固定依存性ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＭＤＢＫ細胞上で試験した。本質的に上記のように、血球凝集反応アッセイおよびＣＰＥアッセイによって、ウイルス力価を決定した。ここで以下が結果である。
【００３４】
【表２】
表２における結果は、ＢＣＶがＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのみ十分に増殖したことを示す；ウイルス増殖は、他の細胞中では検出できなかった。同様の結果が、表３から観察され得るように、ＢＣＶ ＶＲ−８７４を使用して得られた。この場合におけるウイルスは、感染前にトリプシで処理されなかった。ウイルス増殖を、ＤＭＥＭベースの重層培地を含む力価測定プレートと、Ｌ１５重層培地を含むプレートとの間で比較して、そしてウイルス増殖を、血球凝集反応活性として表した。
【００３５】
【表３】
ＢＣＶ ＭＶＢに由来するＢＣＶ ＷＶＢと命名された１つの他の単離物は、Ｖｅｒｏ細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方において増殖することが見い出された。しかし、そのウイルスの特徴は、このウイルスをワクチンにおける使用について不適切にする。
【００３６】
前述の表におけるデータは、ウシ胎児血清を補充した培養培地を使用して作成されたが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのＢＣＶ ＶＲ−８７４の増殖はまた、同様に成体ウシ血清を使用して、そして血清補充物を含まない化学的に規定された培地さえも使用して実証された。例えば、ＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、ＤＭＥＭベースの無血清培地中で増殖した懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞において得た。
【００３７】
（懸濁培養物におけるＢＣＶ増殖）
ＤＭＥＭベースの無血清培地中で増殖した懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、上記のような血球凝集反応およびプラークアッセイを使用する感染性によってウイルス力価を決定することによって実証した。ウイルスサンプルを、１０％リン酸トリプトースブロスおよび４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリンを含むＤＭＥＭで、１０倍の希釈物シリーズにおいて力価測定した。１０5の固定依存性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２４時間前に播種した２４ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに、２５マイクロリットルの各希釈物を添加した。３７℃での１時間のインキュベーション後に、ウェルに、２％ＦＣＳ、１０％リン酸トリプトースブロス、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリンおよび１％シープラーク（ｓｅａ ｐｌａｑｕｅ）アガロースを含むＤＭＥＭを重層した。このプレートを、３７℃で７時間インキュベートして、次いで、ＰＢＳ中１０％ホルマリンで１時間固定した。そしてプラークを、１ウェルあたり０．５ｍｌの１％ラット赤血球を添加した後に、血球吸着によって可視化した。感染の７日後の回収後の結果は、表４に示される通りであった。
【００３８】
【表４】
同様の結果を、以下の表において観察され得るように、懸濁培養物適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＢＣＶ ＶＲ−８７４を感染させた後に得た。
【００３９】
【表５】
表５から明らかであるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＢＨＫ（Ｂｕｒｇ）細胞の増殖を支持したよりもかなり良好にＢＣＶ ＶＲ−８７４の増殖を支持した。
【００４０】
従って、固定依存性または懸濁の培養物にかかわらず、ＣＨＯ細胞は、ＢＣＶの増殖に有効な宿主細胞である。
【００４１】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきではない。
（技術分野）
本発明は、コロナウイルス（ウシコロナウイルスを含む）の固定依存性培養物および懸濁培養物の増殖のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）は、２〜４週齢の仔ウシをしばしば苦しめる、新生仔ウシの下痢の一般的な原因である。主な病原体として、ＢＣＶは、一般的に、軽度の下痢を誘導する。しかし、二次細菌感染と組み合わされる場合、ＢＣＶは１ヶ月齢以下の仔ウシにおける死亡率に対する主要な寄与因子になり得る。
【０００３】
より最近、ＢＣＶは、より年をとったウシの潜在的呼吸病原体としてほのめかされており、そしてこれは、糞便中のＢＣＶの存在およびこのような発生の間のＢＣＶ抗体セロコンバージョンによって証拠付けられるように、乳牛における冬季赤痢の発生に関連している。
【０００４】
従って、このようなウシ疾患を予防するワクチン産生のために、ＢＣＶを増殖させる培養系についての必要性が存在する。
【０００５】
伝統的には、ＢＣＶは、細胞培養において増殖することが困難であり、単離後に順応期間を必要とする。多くの樹立された細胞株は、ＢＣＶの増殖に適切ではなく、そして首尾よく報告された増殖のうちの多くは、大規模産生には不適切である初代細胞培養物の使用を含む。さらに、ほとんどのコロナウイルスは、顕著な組織向性を示し、そして天然宿主種の細胞においてのみ増殖する。例えば、Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１８：３３３〜３４２（１９８７）；Ｓｕｓｓｍａｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１８：３９９〜４１０（１９８７）を参照のこと。従って、ＢＣＶは、一般的に、胎児ウシ腎臓細胞中で増殖されるが、より簡便な樹立細胞株中で代わりにウイルスを増殖させることが所望される。
【０００６】
ウシにおけるＢＣＶ感染を予防する経済的重要性、およびワクチン産生のためにウイルスを増殖させるために通常使用される細胞培養系の使用に固有な困難性を考慮すると、培養物においてＢＣＶを増殖させるための改善された方法についての必要性が存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でウシコロナウイルス（ＢＣＶ）を増殖させるための方法を提供することによって前述の必要性を満たす。より詳細には、本発明は、ウイルスの増殖が生じる条件下で、ＢＣＶに感染したＣＨＯ細胞を培養することを包含する、ＢＣＶを増殖させるための方法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である。他方、増殖したＢＣＶは、アメリカンタイプカルチャーコレクション株ＡＴＣＣ ＶＲ−８７４である。別の実施形態において、このＣＨＯ細胞は、固定依存性培養物において増殖され、一方、別の実施形態において、それらは、懸濁培養物において増殖される。
【０００９】
（発明の記述）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、それらの全体において、本明細書中によって本明細書中に参考として援用される。
【００１０】
本発明は、試験された種々の細胞株中で、ＣＨＯ細胞がＢＣＶを効率的に増殖させるために比類なく適切であったという驚くべき発見に基づく。このような細胞は、懸濁培養物においてこのウイルスを増殖させるために特に適切であることが見出されたが、それらはまた、適切な基材に効果的に付着されて有効に使用され得る。
【００１１】
基材に付着したＣＨＯ細胞中でのＢＣＶの増殖は、全ての標準的な容器（組織培養プレートおよびフラスコ、回転ボトル、およびキャピラリーアセンブリまたは包装されたベッドバイオリアクタ（この中で、キャピラリーチューブまたは他の適切な支持マトリクス（例えば、ガラスビーズもしくはポリマーフォーム）のいずれかに付着されたＢＣＶ感染細胞が、適切な培養培地で灌流され、それによってキャピラリーアセンブリまたはバイオリアクタから出現する培地からの、ウイルスの連続的な回収を可能にする）を含むがこれらに限定されない）で実施され得る。このバイオリアクタ系において、ＢＣＶに感染した基材依存性ＣＨＯ細胞は、ポリマー微粒子に付着され得る。あるいは、ＣＨＯ細胞は、攪拌によって懸濁を維持される、任意の基材とは無関係に増殖させるために、標準的な方法によって適合され得る。
【００１２】
本発明において使用され得る培養培地としては、ＣＨＯ細胞を培養するために有用である、当該分野において周知の任意の培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）を含む）が挙げられる。代表的には、このような培地は、さらなる栄養剤および増殖（成長）因子の供給源として動物の血清を添加することによって強化される。本発明における使用のために適切なこのような動物血清の例としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および成体ウシ血清（ＡＢＳ）が挙げられる。
【００１３】
しかし、本発明はまた、規定された培地を使用して実施され得、ここでＣＨＯ細胞は、任意の動物血清の使用から完全に引き離される。使用され得るこのような規定された培地の１つの例は、ホルモンおよび非血清補充物（アルブミン、インスリン、トランスフェリンおよびトリプトースを含む）を含むＤＭＥＭのような基本培地である。細胞は、徐々に減少したレベルの血清を含む標準培地中での連続的な継代、続いて低血清および漸増した割合の規定された培地を含む規定された培地の混合物への移動によって、このような規定された培地に適合され得る。本発明の方法は、任意のＢＣＶ株の増殖に適用可能である。Ｍｅｂｕｓ株と呼ばれるＢＣＶおよび英国の地の単離物は、以下の実施例において本発明を例証するために使用され、他の単離物または他の公知の株も同様に、使用され得た。このような公知の株としては、例えば、株ＰＱ、ＤＢ２、ＤＢＡ、ＳＤ、２１６ＸＦ、ＣＮ、ＢＥ、ＡＷ、ＯＨＣ、ＳＤＣ、ＪＡＺ、ＴＳ、ＢＭ、ＢＷ、Ｌ９、Ｇ１１０、Ｆ１５、Ｓ１、Ｓ２、およびＣＫが挙げられる。
【００１４】
Ａ２株、Ａ２Ｈ株、ＸｒＳ６株、ＣＨＯ−Ｋ１株、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ株、ＲＲ−ＣＨＯＫ１株、ＵＴ−１株、Ｐ２２株、ＣＨＯ−１Ｃ６株、Ｌｅｃ１株、Ｌｅｃ２株、Ｌｅｃ８株、Ｐｒｏ−５株、およびＤＵＫＸＢ１株を含むがこれらに限定されない任意のＣＨＯ細胞株が使用され得るが、登録番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されたＣＨＯ−Ｋ１株が好ましい。同様に、広範な範囲のＢＣＶが、ＣＨＯ細胞中で増殖され得るが、アメリカ合衆国のネブラスカにおいて、下痢を患ったウシの糞便からもともと単離された、ＢＣＶのＭｅｂｕｓ株の増殖は、本発明の例示の目的のために以下に記載される。
【００１５】
産生されるウイルスの収率を最大にするために、ＣＨＯ細胞は、好ましくは、標準的な技術を使用して懸濁培養に適合され、この技術の１つの例は、以下に例示される。
【００１６】
（実施例）
本発明は、以下の実施例によって例示され得る。他に示さない限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体について以下に示される百分率は、それぞれ、重量／重量、容量／容量および重量／容量の基準である。滅菌条件を、一般的に、細胞培養の間維持した。
【００１７】
（材料および一般的な方法）
ＢＣＶのＭｅｂｕｓ株（仔ウシ下痢コロナウイルス）を、登録番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８７４の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。簡便さのために、このウイルスを、ＢＣＶ ＶＲ−８７４と以下でいう。ＢＣＶ ＭＶＢと命名された英国から得られたＢＣＶ地単離物（ＢＣＶ ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅ）もまた、使用した。
【００１８】
ＢＣＶ増殖について試験された種々の細胞株を、ＦＣＳの代わりに成体ウシ血清（ＡＢＳ）を補充した培地中で増殖させた。これらの細胞は、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、サル胎児性腎臓（ＭＡ１０４）細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、シリアンハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞、およびヒト直腸腺癌（ＨＲＴ−１８）細胞を含んだ。懸濁培養細胞は、懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびハムスター腎臓細胞［ＢＨＫ（Ｂｕｒｇ）と命名された］を含んだ。
【００１９】
ＭＤＣＫ細胞は、伝統的に、ＡＢＳ補充培地中で増殖されるが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＲＴ−１８細胞、ＭＤＢＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞は、最初に、ＦＣＳを含む培地中で増殖されるが、次いで、ある血清を他の血清で徐々に交換することによって、ＡＢＳを含む培地中での増殖に適合される。
【００２０】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）を、ポリミキシンＢサルフェート（１０，０００μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、トリプシン−ＥＤＴＡ［（１×）０．５ｇトリプシン（１：２５０）および改変Ｐｕｃｋ生理食塩水Ａ１リットルあたり０．２ｇ ＥＤＴＡ］、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）、Ｌ１５ Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＣ １０×）、トリプシン２．５％およびリン酸トリプトースブロス（ＴＰＢ）の溶液として、Ｇｉｂｃｏから得た。ＦＣＳおよびＡＢＳを、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｌａｂｓから得た。Ｌ−プロリン ４０ｍｇ／リットルの最終濃度で使用された１０００×ストック溶液は、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ（１００×ストック溶液）およびウシアルブミン画分Ｖと同様に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からであった。懸濁培養物中でＣＨＯ−Ｋ１細胞を増殖させるためのＣＨＯ細胞培地は、ＰＡＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓからであった。Ａｇａｒｏｓｅ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅを、Ｆｌｏｗｇｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄから得た。Ａｌｓｅｖｅｒ溶液におけるラット血液は、Ｓｅｒｏｔｅｃからであった。
【００２１】
種々の細胞株の増殖に使用された培地の処方を、以下の表に示す：
【００２２】
【表１】
【００２３】
ＣＨＯ−Ｋ１懸濁細胞を、任意のさらなる添加なしにＣＨＯ培地中で増殖させた。懸濁細胞を、スピナーフラスコ中で増殖させ、そしてＢＣＶに直接接種した。
【００２４】
種々の固定依存性細胞株の培養物におけるウイルス力価測定を、本質的に以下の通りに、コンフルエントな単層の細胞を有する２４−ウェルプレートを使用して、行った。ＢＣＶを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加されたトリプシンを有するかまたは有しないＤＭＥＭ中で１／１０に希釈した。トリプシンの効果を、その存在がウイルスの複製を増強し、そしてさもなくば非許容性とみなされるいくつかの細胞株における増殖を促進するということを示唆する報告に基づいて調査した。例えば、Ｄｅａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：２４０〜２４４（１９８０）；Ｓｔｏｒｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１２１４〜１２２２（１９８１）；Ｔｏｈｔ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．４３：９６７〜９７２（１９８２）を参照のこと。
【００２５】
３７℃での１時間のインキュベーション後に、このウイルスを、１０-2、１０-3、および１０-4に希釈した。増殖培地を、このプレートから除去し、そして１００μｌの各ウイルス希釈物を、このウェルに添加した。このウイルスがこのプレート全体に均一に広がることを保障するために、穏やかに揺り動かしながら、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００２６】
インキュベーション後に、接種物を除去し、そして１ｍｌの重層培地（２％ＦＣＳおよび１％アガロースを含むＬ１５培地）を、各ウェルに添加した。トリプシン処理ウイルスを含むプレートは、各ウェルに添加された２％ＦＣＳ、１％アガロースおよびトリプシンならびに５０μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎを含むＬ１５培地を有した。このプレートを、３７℃で８日間、５％ＣＯ2においてインキュベートし、次いで、細胞障害効果（ＣＰＥ）の存在または非存在について顕微鏡で試験した。
【００２７】
このプレートを、３７℃で８日間、５％ＣＯ2においてインキュベートし、次いで、細胞障害効果（ＣＰＥ）の存在または非存在について顕微鏡で試験した。観察されたＣＰＥは、代表的に、細胞顆粒形成、合胞体形成および細胞溶解を含んだ。
【００２８】
二連のセットのプレートは、ウェルに添加されたアガロースを含まない、１ｍｌのＬ１５／２％ ＦＣＳ培地を有した。上記のような３７℃で８日間のインキュベーション後に、この培地を取り出し、そして血球凝集反応（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）活性についてアッセイした。これを、Ｖ字底マイクロタイタープレートにわたる、ウイルスの５０μｌの二重希釈物を力価測定することによって達成した。１ｍｌのラット赤血球（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、０．５％ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝化生理食塩水（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で２回洗浄して、次いで遠心分離をして、細胞を沈降させた。得られたパッケージングされた細胞容量を、１５ｍｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈して、０．２５％懸濁液を生成した。５０マイクロリットルの０．２５％ラット赤血球懸濁液を、各ウェルに添加して、そして血球凝集反応の程度を、室温で１時間後にスコア付けした。
【００２９】
底に形成された赤血球のマットを含むウェルを、血球凝集反応に対して陽性であるとスコア付けし、そして赤血球が、ウェルの底に移動して小さなボタンを形成したウェルを、陰性としてスコア付けした。赤血球の完全な凝集反応が観察された最高の希釈物として、血球凝集反応力価を規定した。
【００３０】
ＢＨＫ（Ｂｕｒｇ）細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁培養物におけるウイルス力価測定を、３０ｍｌの円錐底汎用性容器中に細胞を分割し、そして低速遠心分離によって細胞を沈降させることによって行った。上清液を廃棄し、そして残っているペレットを、１個の汎用性容器あたり１ｍｌのＧＭＥＭ中に再懸濁した。
【００３１】
ＢＣＶを、８日間のＣＨＯ−Ｋ１固定依存性細胞中での増殖によって調製した。回収物を、３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって清澄化した。次いで、ＢＣＶを、ＧＭＥＭ培地で１／２０、１／２００および１／１０，０００に希釈し、そしてＢＨＫ−２１（Ｂｕｒｇ）細胞に、１／２０および１/２００で感染させ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、１／２００および１／１０，０００で感染させた。細胞に、ウイルスを用いて３７℃で１時間インキュベートした。コントロール細胞をウイルス増殖培地に接種し、感染を刺激した。
【００３２】
ＢＨＫ−２１（Ｂｕｒｇ）細胞の二連の汎用物は、２％ＦＣＳを含むかまたは含まない、１０％ＴＰＢおよびネオマイシン／ポリミキシンを含有する、２つの再懸濁された５ｍｌのＧＭＥＭにあった。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２５ｍｌのＣＨＯ培地中に再懸濁した。各汎用物からの内容物を、１２５ｍｌの円錐フラスコに移して、そして３５℃で振盪インキュベーター中に配置した。培養物を毎日サンプリングし、そして血球凝集反応活性について試験した。
【００３３】
（ＢＣＶ増殖は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞により支持される）
英国の地の単離物であるＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、コンフルエントな単層の固定依存性ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＭＤＢＫ細胞上で試験した。本質的に上記のように、血球凝集反応アッセイおよびＣＰＥアッセイによって、ウイルス力価を決定した。ここで以下が結果である。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
前述の表におけるデータは、ウシ胎児血清を補充した培養培地を使用して作成されたが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのＢＣＶ ＶＲ−８７４の増殖はまた、同様に成体ウシ血清を使用して、そして血清補充物を含まない化学的に規定された培地さえも使用して実証された。例えば、ＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、ＤＭＥＭベースの無血清培地中で増殖した懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞において得た。
【００３７】
（懸濁培養物におけるＢＣＶ増殖）
ＤＭＥＭベースの無血清培地中で増殖した懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのＢＣＶ ＭＶＢの増殖を、上記のような血球凝集反応およびプラークアッセイを使用する感染性によってウイルス力価を決定することによって実証した。ウイルスサンプルを、１０％リン酸トリプトースブロスおよび４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリンを含むＤＭＥＭで、１０倍の希釈物シリーズにおいて力価測定した。１０5の固定依存性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２４時間前に播種した２４ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに、２５マイクロリットルの各希釈物を添加した。３７℃での１時間のインキュベーション後に、ウェルに、２％ＦＣＳ、１０％リン酸トリプトースブロス、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリンおよび１％シープラーク（ｓｅａ ｐｌａｑｕｅ）アガロースを含むＤＭＥＭを重層した。このプレートを、３７℃で７時間インキュベートして、次いで、ＰＢＳ中１０％ホルマリンで１時間固定した。そしてプラークを、１ウェルあたり０．５ｍｌの１％ラット赤血球を添加した後に、血球吸着によって可視化した。感染の７日後の回収後の結果は、表４に示される通りであった。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
従って、固定依存性または懸濁の培養物にかかわらず、ＣＨＯ細胞は、ＢＣＶの増殖に有効な宿主細胞である。
【００４１】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきではない。
Claims (6)
- ウシコロナウイルスを増殖させるための方法であって、コロナウイルスが増殖する条件下で、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で該ウイルスを培養する工程を包含する、方法。
- 前記チャイニーズハムスター卵巣細胞が、固定依存性培養または懸濁培養される、請求項１に記載の方法。
- 前記チャイニーズハムスター卵巣細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記ウシコロナウイルスがＶＲ−８７４である、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞が無血清培地において培養される、請求項１に記載の方法。
- ウシコロナウイルスを増殖させるための方法であって、ウシコロナウイルスＶＲ−８７４が増殖する条件下で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で該ウシコロナウイルスＶＲ−８７４を培養する工程を包含する、方法。
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