JP2002534999A - チャイニーズハムスター卵巣細胞中でのウシコロナウイルスの増殖 - Google Patents
チャイニーズハムスター卵巣細胞中でのウシコロナウイルスの増殖Info
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Abstract
Description
および懸濁培養物の増殖のために、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞
を使用するための方法に関する。
新生仔ウシの下痢の一般的な原因である。主な病原体として、BCVは、一般的
に、軽度の下痢を誘導する。しかし、二次細菌感染と組み合わされる場合、BC
Vは1ヶ月齢以下の仔ウシにおける死亡率に対する主要な寄与因子になり得る。
されており、そしてこれは、糞便中のBCVの存在およびこのような発生の間の
BCV抗体セロコンバージョンによって証拠付けられるように、乳牛における冬
季赤痢の発生に関連している。
させる培養系についての必要性が存在する。
に順応期間を必要とする。多くの樹立された細胞株は、BCVの増殖に適切では
なく、そして首尾よく報告された増殖のうちの多くは、大規模産生には不適切で
ある初代細胞培養物の使用を含む。さらに、ほとんどのコロナウイルスは、顕著
な組織向性を示し、そして天然宿主種の細胞においてのみ増殖する。例えば、F
lemingら、Adv.Exp.Med.Biol.218:333〜342
(1987);Sussmanら、Adv.Exp.Med.Biol.218
:399〜410(1987)を参照のこと。従って、BCVは、一般的に、胎
児ウシ腎臓細胞中で増殖されるが、より簡便な樹立細胞株中で代わりにウイルス
を増殖させることが所望される。
にウイルスを増殖させるために通常使用される細胞培養系の使用に固有な困難性
を考慮すると、培養物においてBCVを増殖させるための改善された方法につい
ての必要性が存在する。
ス(BCV)を増殖させるための方法を提供することによって前述の必要性を満
たす。より詳細には、本発明は、ウイルスの増殖が生じる条件下で、BCVに感
染したCHO細胞を培養することを包含する、BCVを増殖させるための方法を
提供する。
殖したBCVは、アメリカンタイプカルチャーコレクション株ATCC VR−
874である。別の実施形態において、このCHO細胞は、固定依存性培養物に
おいて増殖され、一方、別の実施形態において、それらは、懸濁培養物において
増殖される。
中によって本明細書中に参考として援用される。
させるために比類なく適切であったという驚くべき発見に基づく。このような細
胞は、懸濁培養物においてこのウイルスを増殖させるために特に適切であること
が見出されたが、それらはまた、適切な基材に効果的に付着されて有効に使用さ
れ得る。
培養プレートおよびフラスコ、回転ボトル、およびキャピラリーアセンブリまた
は包装されたベッドバイオリアクタ(この中で、キャピラリーチューブまたは他
の適切な支持マトリクス(例えば、ガラスビーズもしくはポリマーフォーム)の
いずれかに付着されたBCV感染細胞が、適切な培養培地で灌流され、それによ
ってキャピラリーアセンブリまたはバイオリアクタから出現する培地からの、ウ
イルスの連続的な回収を可能にする)を含むがこれらに限定されない)で実施さ
れ得る。このバイオリアクタ系において、BCVに感染した基材依存性CHO細
胞は、ポリマー微粒子に付着され得る。あるいは、CHO細胞は、攪拌によって
懸濁を維持される、任意の基材とは無関係に増殖させるために、標準的な方法に
よって適合され得る。
有用である、当該分野において周知の任意の培地(例えば、ダルベッコ改変イー
グル培地(DMEM)、およびGlasgow改変イーグル培地(GMEM)を
含む)が挙げられる。代表的には、このような培地は、さらなる栄養剤および増
殖(成長)因子の供給源として動物の血清を添加することによって強化される。
本発明における使用のために適切なこのような動物血清の例としては、例えば、
ウシ胎児血清(FCS)および成体ウシ血清(ABS)が挙げられる。
細胞は、任意の動物血清の使用から完全に引き離される。使用され得るこのよう
な規定された培地の1つの例は、ホルモンおよび非血清補充物(アルブミン、イ
ンスリン、トランスフェリンおよびトリプトースを含む)を含むDMEMのよう
な基本培地である。細胞は、徐々に減少したレベルの血清を含む標準培地中での
連続的な継代、続いて低血清および漸増した割合の規定された培地を含む規定さ
れた培地の混合物への移動によって、このような規定された培地に適合され得る
。 本発明の方法は、任意のBCV株の増殖に適用可能である。Mebus株と
呼ばれるBCVおよび英国の地の単離物は、以下の実施例において本発明を例証
するために使用され、他の単離物または他の公知の株も同様に、使用され得た。
このような公知の株としては、例えば、株PQ、DB2、DBA、SD、216
XF、CN、BE、AW、OHC、SDC、JAZ、TS、BM、BW、L9、
G110、F15、S1、S2、およびCKが挙げられる。
−CHOK1株、UT−1株、P22株、CHO−1C6株、Lec1株、Le
c2株、Lec8株、Pro−5株、およびDUKXB1株を含むがこれらに限
定されない任意のCHO細胞株が使用され得るが、登録番号ATCC CCL
61の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されたCHO−K1
株が好ましい。同様に、広範な範囲のBCVが、CHO細胞中で増殖され得るが
、アメリカ合衆国のネブラスカにおいて、下痢を患ったウシの糞便からもともと
単離された、BCVのMebus株の増殖は、本発明の例示の目的のために以下
に記載される。
標準的な技術を使用して懸濁培養に適合され、この技術の1つの例は、以下に例
示される。
物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体について以下に示される百分率
は、それぞれ、重量/重量、容量/容量および重量/容量の基準である。滅菌条
件を、一般的に、細胞培養の間維持した。
VR−874の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。簡便さ
のために、このウイルスを、BCV VR−874と以下でいう。BCV MV
Bと命名された英国から得られたBCV地単離物(BCV field iso
late)もまた、使用した。
清(ABS)を補充した培地中で増殖させた。これらの細胞は、アフリカミドリ
ザル腎臓(Vero)細胞、Madin−Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞
、サル胎児性腎臓(MA104)細胞、Madin−Darbyイヌ腎臓(MD
CK)細胞、シリアンハムスター腎臓(BHK−21)細胞、マウス骨髄腫(N
S0)細胞、およびヒト直腸腺癌(HRT−18)細胞を含んだ。懸濁培養細胞
は、懸濁適合CHO−K1細胞、およびハムスター腎臓細胞[BHK(Burg
)と命名された]を含んだ。
細胞、BHK−21細胞、HRT−18細胞、MDBK細胞およびVero細胞
は、最初に、FCSを含む培地中で増殖されるが、次いで、ある血清を他の血清
で徐々に交換することによって、ABSを含む培地中での増殖に適合される。
培地(GMEM)を、ポリミキシンBサルフェート(10,000μg/ml)
、ネオマイシン(10,000μg/ml)、トリプシン−EDTA[(1×)
0.5gトリプシン(1:250)および改変Puck生理食塩水A1リットル
あたり0.2g EDTA]、L−グルタミン(200mM)、L15 Lei
bovitz培地、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水(PBC 10×)、ト
リプシン2.5%およびリン酸トリプトースブロス(TPB)の溶液として、G
ibcoから得た。FCSおよびABSを、Imperial Labsから得
た。L−プロリン 40mg/リットルの最終濃度で使用された1000×スト
ック溶液は、DEAE−Dextran(100×ストック溶液)およびウシア
ルブミン画分Vと同様に、Sigma Chemical Co.からであった
。懸濁培養物中でCHO−K1細胞を増殖させるためのCHO細胞培地は、PA
A Biologicsからであった。Agarose Sea Plaque
を、Flowgen Instruments Ltdから得た。Alseve
r溶液におけるラット血液は、Serotecからであった。
回継代した。固定依存性CHO−K1細胞、MA104細胞、MDBK細胞、N
S0細胞、MDBK細胞およびVero細胞を、DMEM中で増殖するように適
合させ、一方、BHK−21細胞を、GMEM中で増殖させた。生存細胞数およ
び顕微鏡での観察を使用して、細胞増殖をモニターした。細胞をコンフルエンス
まで増殖させ、そして各継代時に、適切な比率で分割した。一旦、健常な細胞増
殖が樹立されると、ウイルス力価測定を、固定依存性細胞で行った。
た。懸濁細胞を、スピナーフラスコ中で増殖させ、そしてBCVに直接接種した
。
の通りに、コンフルエントな単層の細胞を有する24−ウェルプレートを使用し
て、行った。BCVを、10μg/mlの最終濃度で添加されたトリプシンを有
するかまたは有しないDMEM中で1/10に希釈した。トリプシンの効果を、
その存在がウイルスの複製を増強し、そしてさもなくば非許容性とみなされるい
くつかの細胞株における増殖を促進するということを示唆する報告に基づいて調
査した。例えば、Deaら、J.Clin.Microbiol.10:240
〜244(1980);Storzら、Infect.Immun.31:12
14〜1222(1981);Toht,Am.J.Veterinary R
es.43:967〜972(1982)を参照のこと。
00μlの各ウイルス希釈物を、このウェルに添加した。このウイルスがこのプ
レート全体に均一に広がることを保障するために、穏やかに揺り動かしながら、
このプレートを37℃で1時間インキュベートした。
CSおよび1%アガロースを含むL15培地)を、各ウェルに添加した。トリプ
シン処理ウイルスを含むプレートは、各ウェルに添加された2%FCS、1%ア
ガロースおよびトリプシンならびに50μg/ml DEAE−Dextran
を含むL15培地を有した。このプレートを、37℃で8日間、5%CO2にお
いてインキュベートし、次いで、細胞障害効果(CPE)の存在または非存在に
ついて顕微鏡で試験した。
いで、細胞障害効果(CPE)の存在または非存在について顕微鏡で試験した。
観察されたCPEは、代表的に、細胞顆粒形成、合胞体形成および細胞溶解を含
んだ。
lのL15/2% FCS培地を有した。上記のような37℃で8日間のインキ
ュベーション後に、この培地を取り出し、そして血球凝集反応(Haemagg
lutination)活性についてアッセイした。これを、V字底マイクロタ
イタープレートにわたる、ウイルスの50μlの二重希釈物を力価測定すること
によって達成した。1mlのラット赤血球(Serotec)を、0.5%ウシ
血清アルブミン/リン酸緩衝化生理食塩水(0.5%BSA/PBS)中で2回
洗浄して、次いで遠心分離をして、細胞を沈降させた。得られたパッケージング
された細胞容量を、15mlの0.5%BSA/PBSに希釈して、0.25%
懸濁液を生成した。50マイクロリットルの0.25%ラット赤血球懸濁液を、
各ウェルに添加して、そして血球凝集反応の程度を、室温で1時間後にスコア付
けした。
あるとスコア付けし、そして赤血球が、ウェルの底に移動して小さなボタンを形
成したウェルを、陰性としてスコア付けした。赤血球の完全な凝集反応が観察さ
れた最高の希釈物として、血球凝集反応力価を規定した。
ス力価測定を、30mlの円錐底汎用性容器中に細胞を分割し、そして低速遠心
分離によって細胞を沈降させることによって行った。上清液を廃棄し、そして残
っているペレットを、1個の汎用性容器あたり1mlのGMEM中に再懸濁した
。
。回収物を、3000rpmでの5分間の遠心分離によって清澄化した。次いで
、BCVを、GMEM培地で1/20、1/200および1/10,000に希
釈し、そしてBHK−21(Burg)細胞に、1/20および1/200で感
染させ、CHO−K1細胞に、1/200および1/10,000で感染させた
。細胞に、ウイルスを用いて37℃で1時間インキュベートした。コントロール
細胞をウイルス増殖培地に接種し、感染を刺激した。
含まない、10%TPBおよびネオマイシン/ポリミキシンを含有する、2つの
再懸濁された5mlのGMEMにあった。CHO−K1細胞を、25mlのCH
O培地中に再懸濁した。各汎用物からの内容物を、125mlの円錐フラスコに
移して、そして35℃で振盪インキュベーター中に配置した。培養物を毎日サン
プリングし、そして血球凝集反応活性について試験した。
定依存性CHO−K1細胞、MA104細胞、MDCK細胞、BHK−21細胞
、Vero細胞およびMDBK細胞上で試験した。本質的に上記のように、血球
凝集反応アッセイおよびCPEアッセイによって、ウイルス力価を決定した。こ
こで以下が結果である。
を示す;ウイルス増殖は、他の細胞中では検出できなかった。同様の結果が、表
3から観察され得るように、BCV VR−874を使用して得られた。この場
合におけるウイルスは、感染前にトリプシで処理されなかった。ウイルス増殖を
、DMEMベースの重層培地を含む力価測定プレートと、L15重層培地を含む
プレートとの間で比較して、そしてウイルス増殖を、血球凝集反応活性として表
した。
Vero細胞およびCHO−K1細胞の両方において増殖することが見い出され
た。しかし、そのウイルスの特徴は、このウイルスをワクチンにおける使用につ
いて不適切にする。
されたが、CHO−K1細胞中でのBCV VR−874の増殖はまた、同様に
成体ウシ血清を使用して、そして血清補充物を含まない化学的に規定された培地
さえも使用して実証された。例えば、BCV MVBの増殖を、DMEMベース
の無血清培地中で増殖した懸濁適合CHO−K1細胞において得た。
CV MVBの増殖を、上記のような血球凝集反応およびプラークアッセイを使
用する感染性によってウイルス力価を決定することによって実証した。ウイルス
サンプルを、10%リン酸トリプトースブロスおよび40μg/ml L−プロ
リンを含むDMEMで、10倍の希釈物シリーズにおいて力価測定した。105
の固定依存性CHO−K1細胞を24時間前に播種した24ウェル細胞培養プレ
ートの別々のウェルに、25マイクロリットルの各希釈物を添加した。37℃で
の1時間のインキュベーション後に、ウェルに、2%FCS、10%リン酸トリ
プトースブロス、40μg/ml L−プロリンおよび1%シープラーク(se
a plaque)アガロースを含むDMEMを重層した。このプレートを、3
7℃で7時間インキュベートして、次いで、PBS中10%ホルマリンで1時間
固定した。そしてプラークを、1ウェルあたり0.5mlの1%ラット赤血球を
添加した後に、血球吸着によって可視化した。感染の7日後の回収後の結果は、
表4に示される通りであった。
−K1細胞にBCV VR−874を感染させた後に得た。
の増殖を支持したよりもかなり良好にBCV VR−874の増殖を支持した。
の増殖に有効な宿主細胞である。
その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される
特定の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請
求の範囲によってのみ制限されるべきではない。
Claims (10)
- 【請求項1】 コロナウイルスを増殖させるための方法であって、コロナウ
イルスが増殖する条件下で、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で該ウイルスを
培養する工程を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記ウイルスがウシコロナウイルスである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項3】 前記チャイニーズハムスター卵巣細胞が、固定依存性培養物
および懸濁培養物である、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記チャイニーズハムスター卵巣細胞がCHO−K1細胞で
ある、請求項2に記載の方法。 - 【請求項5】 前記ウシコロナウイルスがVR−874である、請求項2に
記載の方法。 - 【請求項6】 前記細胞が無血清培地において培養される、請求項2に記載
の方法。 - 【請求項7】 ウシコロナウイルスを増殖させるための方法であって、ウシ
コロナウイルスVR−874が増殖する条件下で、CHO−K1細胞中で該ウイ
ルスを培養する工程を包含する、方法。 - 【請求項8】 コロナウイルスが増殖する条件下で、チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞中で該ウイルスを培養する工程を包含する方法により産生される、コ
ロナウイルス。 - 【請求項9】 前記ウイルスがウシコロナウイルスである、請求項8に記載
のコロナウイルス。 - 【請求項10】 前記ウイルスがウシコロナウイルスVR−874である、
請求項9に記載のコロナウイルス。
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