WO2015056986A1 - 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 방법 - Google Patents

연속으로 세포를 배양하는 장치 및 방법 Download PDF

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WO2015056986A1
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cells
culture
space
culturing
scraper
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이희영
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메디칸(주)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles

Definitions

  • the present invention relates to a device and method for culturing cells in a continuous manner, and more particularly, to a device for culturing cells continuously to inject, culture, desorption, and obtain cells and culture medium in a sealed state, and It is about a method.
  • Cell culture includes monolayer culture (attachment culture) in which cells adhere to the incubator, and suspension culture in which cells proliferate in a suspended state.
  • proteolytic enzymes such as trypsin are used to detach the cells cultured in the container.
  • These enzymes are a method of melting the connection surface with the adhesion surface to disrupt the adhesion of the cells, which takes time to process the enzyme and causes various problems such as changes in cell characteristics and death due to the toxicity of the enzyme.
  • the characteristics of the cells are categorized by the number of trypsin treatments, which is evidence that the use of trypsin has a problem of changing cellular characteristics.
  • Trypsin also results in detachment of adherent cells from all sides of the culture vessel, which always requires a process to reattach some cells after this process and the probability of reattachment is less than 10%.
  • Apparatus for culturing cells in a continuous manner of the present invention and a culture method using the same to solve the above problems can be selectively, repeatedly injected, cultured, detached, and obtained cells and culture medium while maintaining the airtightness of the culture vessel
  • cells may be obtained to enable repeated culture of the cells remaining in the culture vessel while preventing contamination and uniformity of the cultured cells.
  • an object of the present invention is to provide a culture medium by supplying the gas necessary for the optimal culture temperature and cell proliferation to the culture vessel through a culture environment means for providing an optimal culture environment for cell proliferation while maintaining the culture vessel, the proliferation of the cell culture To improve it.
  • an object of the present invention is to enable desorption of cultured cells at the bottom of the space of the culture vessel in a sealed state.
  • an object of the present invention is to facilitate the movement, storage and management through a closed culture vessel.
  • Apparatus for culturing cells in a continuous manner of the present invention for achieving the above object is provided with a culture vessel having a space that can selectively determine the closed state, the culture solution injection into the space in the closed state, Cell inoculation, detachment, and harvesting are possible and the culture of cells is allowed with the space open.
  • cells are obtained to enable repeated culture of the cells remaining in the culture vessel.
  • the whole cultured cells are obtained in the process of obtaining the cells, and then the culture vessels can be repeatedly injected with the culture solution, inoculated, cultured, detached, and obtained.
  • the culture vessel is provided with a sealed passage to bring in and out of the fluid, gas and cells into the space from the outside.
  • the culture vessel is provided with a circulation filter capable of circulating the gas required for cell culture in the space.
  • a scraper is installed in the space to scrape the cells by the movement of the scraper and to detach the cells from the bottom of the space.
  • a scraper is installed in the space, and the cell is scraped by the rotation of the scraper and configured to detach the cell from the bottom of the space.
  • the at least one closed passage is installed on the surface of the culture vessel, and the closed passage is made of a soft block to seal the space, and when the needle of the syringe penetrates into and out of the space, it is possible to carry in and out of the fluid, gas and cells. At the same time, when the needle is removed, the space is sealed by the elasticity of the sealed passage.
  • the gas circulated into the space through the circulation filter allows the gas containing at least one of carbon dioxide and oxygen to enter and exit.
  • the circulation filter comprises a pipe installed on the side of the culture vessel, a valve installed at the end of the pipe, and a filter installed inside the valve.
  • the culture vessel is stored in a culture environment means for maintaining the temperature of the culture solution to 0 °C to 42 °C to cultivate the living cells.
  • the present invention by generating a negative pressure in the culture environment means for storing the culture vessel to have a change in the size of the space of the culture vessel so that the gas required for cell culture into the culture environment means through the circulation filter to the space to be supplied to the space. do.
  • one or more culture vessels are provided, and are continuously connected through the circulation filter to enable a plurality of culture vessels to circulate gas integrally.
  • the scraper may be moved by external potential energy.
  • the scraper is rotated or moved while contacting the inner surface of the space through external mechanical forces to scrape the cells.
  • the scraper rotates or moves while contacting the inner surface of the space through magnetic force to scrape the cells.
  • the scraper has a lower surface in contact with the bottom surface of the space to form a plurality of blades.
  • the scraper to form a culture groove on the top to enable the culture medium filling and cell culture.
  • the scraper is polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyamide (PA), polyacetel (POM), polyvinyl chloride (PVC), polyester (PET), polymethylpentene (PMP) , Ionomer (IO), ethylene vinyl alcohol (EVOH), polyvinyl chloride (PVA), polystyrene (PS), methacryl resin (PMMA), polycarbonate (PC), vinyl acetate (PVAc), polyvinyl alcohol ( PVA), phenolic resin (PF), urea resin (UF), melamine resin (MF), epoxy resin (EP), polyurethane (PUR), unsaturated polyester resin (UP) and metals.
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • PA polyamide
  • POM polyacetel
  • PVC polyvinyl chloride
  • PET polyester
  • PMP polymethylpentene
  • Ionomer Ionomer
  • IO ethylene vinyl alcohol
  • PVA polyvinyl chloride
  • PS polystyrene
  • the scraper and the moving member are interlocked by magnetic force.
  • the scraper has a lower surface in contact with the bottom surface of the space to form a plurality of blades, the blade is formed to have a corner angle to detach the cells from the bottom surface by friction with the bottom surface of the space. .
  • the scraper has a lower surface which is in contact with the bottom surface of the space to form a plurality of blades, the blade is formed so that the corner angle is formed continuously so as to contact or non-contact with the bottom surface of the space.
  • the circulating filter is equipped with a clip in the conduit to selectively seal and open the conduit.
  • the method of culturing cells in a continuous manner of the present invention comprises injecting the culture solution into the inner space of the sealed culture vessel and inoculating the cells to incubate the cells; Desorbing the adhered cells when the density of the cells cultured in the culture vessel is greater than or equal to the reference value; Obtaining detached cells from the culture vessel maintained in a closed state.
  • the step of culturing the cells the step of injecting the culture solution in the space, the step of inoculating the cells in the culture medium, and the step of propagating the cells in the culture medium.
  • the culture solution injection, cell inoculation, cell detachment and cell harvesting steps allow the sealed container to proceed in a closed state at all times to enable stable and repeated culture of the cells after the harvesting.
  • the step of detaching the cells allows the scraper installed in the space to move through the mechanical energy or potential energy to scrape the cells to detach from the bottom of the space.
  • the step of detaching the cells allows the scraper installed in the space to detach from the bottom of the space while moving in the space in cooperation with a means having a magnetic force disposed outside the culture vessel.
  • the step of obtaining the cells leaves a part of the detached cells so that the remaining cells can be repeatedly proliferated in the culture vessel.
  • the step of propagating the cells in the culture medium is cultured by storing the culture vessel in the culture environment means after inoculating the cells in the culture medium, the culture environment means has a culture temperature of 0 °C to -42 °C, It is possible to supply the gas necessary for cell culture to the culture vessel to have an optimal culture environment.
  • the step of propagating the cells in the culture medium is to switch to open in a closed state of the space of the sealed container to store the sealed container in the culture environment means, the sealed container is supplied to the culture environment means Gas is repeatedly introduced into and out of the culture vessel by the gas and negative pressure.
  • the sealed container is to be opened and closed selectively with the outside, when the culture vessel is taken out from the culture environment means to be carried out and transported after the space of the sealed container is sealed with the outside.
  • Apparatus for culturing cells in a continuous manner of the present invention and a culture method using the same to solve the above problems can be selectively, repeatedly injected, cultured, detached, and obtained cells and culture medium while maintaining the airtightness of the culture vessel
  • cells may be obtained to enable repeated culture of the cells remaining in the culture vessel while preventing contamination and uniformity of the cultured cells.
  • the apparatus for culturing cells in a continuous manner and the method of culturing using the same culture the gas necessary for the optimal culture temperature and cell growth through a culture environment means for providing an optimal culture environment of cell proliferation while keeping the culture vessel
  • the present invention is to improve the proliferation of the cell culture by allowing the container to be supplied to the container.
  • the apparatus for culturing cells and the culturing method using the same of the present invention has the effect of making it easy to move, store and manage through a closed culture vessel.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a device for culturing cells in a row of the present invention.
  • Figure 2 is a longitudinal sectional view showing a device for culturing cells in a row of the present invention.
  • Figure 3 is a cross-sectional view showing a device for culturing cells in a row of the present invention.
  • 4 to 9 is a flow chart showing the step of culturing the cells using the apparatus for culturing cells in a continuous of the present invention.
  • Figure 10 is a perspective view showing another embodiment of the scraper in the apparatus for culturing cells in a row of the present invention.
  • Figure 11 is a perspective view showing various embodiments of the scraper in the apparatus for culturing cells in a row of the present invention.
  • Figure 12 is a perspective view showing a culture environment means for storing the apparatus for culturing cells in a row of the present invention.
  • Figure 13 is a perspective view showing another embodiment of the apparatus for culturing cells in a row of the present invention.
  • culture medium 100 culture vessel
  • valve 123 filter
  • FIG. 1 is a perspective view showing a device for culturing cells in a continuous manner of the present invention
  • Figure 2 is a longitudinal sectional view showing a device for culturing cells in a continuous manner of the present invention
  • Figure 3 is a device for culturing cells in a continuous of the present invention
  • 4 to 9 is a flow chart showing the step of culturing cells using the apparatus for culturing cells in a continuous manner of the present invention
  • Figure 10 is a scraper of the apparatus for culturing cells in a continuous of the present invention 11 is a perspective view showing another embodiment
  • Figure 11 is a perspective view showing a variety of embodiments of the scraper of the apparatus for culturing cells in a continuous of the present invention
  • Figure 12 is a culture environment for storing the apparatus for culturing cells in a continuous of the present invention
  • Figure 13 is a perspective view showing the means
  • Figure 13 is a perspective view showing another embodiment of the apparatus for culturing cells in a continuous manner
  • the apparatus for culturing cells in a continuous manner of the present invention is provided with a culture vessel 100 formed in a polygonal or circular shape.
  • the culture vessel 100 has a space 101 is sealed inside.
  • the culture vessel 100 is made of a soft plastic material, the size of the space 101 may be varied by the external pressure or force.
  • the culture vessel 100 is to provide a culture vessel 100 having a space for selectively determining the closed state, the culture solution injection, cell inoculation, desorption, and obtainment into the space 101 in the space 101 is closed It is possible to culture the cells in the open state of the space.
  • culture medium 100 can be repeatedly injected with culture solution, cell inoculation, culture, detachment, and harvesting.
  • the culture vessel 100 is equipped with a closed passage 110 and a circulation filter 120 to enable continuous culture of the cells 11 as described above.
  • the closed passage 110 is installed in the culture vessel 100 to allow the injection of the culture medium 12 into the space 101, the inoculation of the cells 11 in the culture medium 12, the process of obtaining the cells 11, even in the progress of the above process the sealed container is sealed The state is maintained.
  • the closed passage 110 is installed on the side of the culture vessel 100 to allow the fluid, gas and cells 11 to be carried in and out of the space 101 from the outside.
  • the closed passage 110 is installed on the culture vessel 100 surface, and the closed passage 110 is formed in a space 101 consisting of a soft block.
  • the sealed passage 110 may be sealed by the elasticity of the sealed passage 110 to maintain the tightness of the space 101.
  • the circulation filter 120 is installed to inject a gas necessary for culturing the cells 11 into the space 101 of the culture vessel 100.
  • the culture vessel 100 is stored in the culture environment means 200 at the time of culturing the cell 11 is provided with a gas required for culturing the cell 11 at the same time to provide the appropriate temperature.
  • the culture vessel 100 allows gas to enter and exit the space 101 through the circulation filter 120.
  • the entry of gas into the space 101 of the culture vessel 100 generates a negative pressure in the culture environment means 200 to have a change in the size of the space 101 of the culture vessel 100 culture environment through the circulation filter 120
  • the gas necessary for culturing the cells 11 is allowed to enter the space 101 within the means 200.
  • the gas contains at least one of carbon dioxide and oxygen.
  • a detailed configuration of the circulation filter 120 is as follows.
  • the circulation filter 120 includes a conduit 121 installed at a side of the culture vessel 100, a valve 122 installed at an end of the conduit 121, and a filter 123 installed inside the valve 122.
  • the pipe 121 is provided with a clip 124 to selectively seal and open the pipe 121.
  • the clip 124 allows the gas to enter and exit the space 101 by opening the pipe 121 when the culture vessel 100 is stored in the culture environment means 200, and using the clip 124 to remove the culture vessel 100 from the culture environment means 200.
  • the pipeline 121 is interrupted to seal the space 101 of the sealed container.
  • a scraper 130 which is a separate tool for detachment of the cells 11 is installed in the space 101.
  • the scraper 130 scrapes the cell 11 while rotating or moving inside the space 101 through a mechanical external force or magnetic force or potential energy to detach the cell 11 from the bottom surface of the space 101.
  • the scraper 130 constitutes a rectangular culture vessel, but as long as the scraper 130 has a surface to which cells can be attached, the shape of the culture vessel such as a circle or a polygon such as a triangle is not limited.
  • the scraper 130 is a cell 11 detachment method through a mechanical external force is as follows.
  • the bottom of the space 101 is rotatably installed by the central axis 133, and the central axis 133 is exposed to the outside of the culture vessel 100 to interlock the scraper 130 by the rotation of the central axis 133.
  • Rotating scraper 130 at the bottom of 101 scrapes off cell 11 while rubbing.
  • the culture vessel 100 is formed in a cylindrical shape, and the scraper 130 is rotated about the central axis 133 at the inner circumference of the space 101 to detach the cell 11.
  • cell 11 detachment by magnetic force is as follows.
  • the scraper 130 and the moving member 140 may be provided with a metal body 134 or a magnetic body 141, respectively, to be integrated with each other by magnetic force.
  • the culture vessel 100 is inclined to scrape and detach the cell 11 while the scraper 130 having its own weight slides on the bottom surface of the space 101.
  • the scraper 130 configured as described above forms a culture groove 132 in the upper portion thereof to enable filling of the culture solution 12 and culturing the cells 11.
  • the culture medium 12 is injected into the space 101, or the culture medium 12 is injected into the culture groove 132 of the space 101 and the scraper 130 to inoculate the cell 11 into the culture solution 12.
  • the scraper 130 has a lower surface in contact with the bottom surface of the space 101 forming a plurality of blades 131.
  • the scraper 130 has a lower surface in contact with the bottom surface of the space 101 to form a plurality of blades 131, the blade 131 is formed to have a corner angle to detach the cell 11 from the bottom surface by friction with the bottom surface of the space 101 Let's do it.
  • the scraper 130 has a lower surface which is in contact with the bottom surface of the space 101 to form a plurality of blades 131, the blade 131 is formed so that the corner angle is formed to be in continuous or non-contact with the bottom surface of the space 101.
  • the scraper is polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyamide (PA), polyacetel (POM), polyvinyl chloride (PVC), polyester (PET), polymethylpentene (PMP), ionomer (IO), ethylene vinyl alcohol (EVOH), polyvinyl chloride (PVA), polystyrene (PS), methacryl resin (PMMA), polycarbonate (PC), vinyl acetate (PVAc), polyvinyl alcohol (PVA), The material selected from phenol resin (PF), urea resin (UF), melamine resin (MF), epoxy resin (EP), polyurethane (PUR), unsaturated polyester resin (UP) and metal is applied.
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • PA polyamide
  • POM polyacetel
  • PVC polyvinyl chloride
  • PET polyester
  • PMP polymethylpentene
  • IO ionomer
  • EVOH ethylene vinyl alcohol
  • PVA polyvinyl chloride
  • PS polystyrene
  • the culture vessel 100 configured as described above is provided with one or more, and is continuously connected in parallel through the circulation filter 120.
  • the plurality of culture vessels 100 are sequentially arranged and based on the culture vessels 100 located on one side, the culture vessel 100 for one side by sequentially connecting the circulating filter 120 between the culture vessels 100 adjacently listed Through the circulation filter 120 of the plurality of culture vessels 100 to enable the gas inlet integrally.
  • the method of culturing cells continuously through the culture apparatus configured as described above is as follows.
  • the step of culturing the cell 11 comprises a step of injecting the culture medium 12 in the space 101, inoculating the cell 11 in the culture medium 12, and propagating the cell 11 in the culture medium 12 .
  • the cells 11 are inoculated in the culture medium 12 and the culture vessel is stored in the culture environment means 200 to culture the cells.
  • the culture environment means 200 has a culture temperature of 0 °C to -42 °C, it is possible to supply the gas necessary for culturing the cell 11 to the culture vessel.
  • the culture environment means 200 supplies the gas necessary for culturing the cells 11 therein and at the same time generates a negative pressure repeatedly so that the gas repeatedly enters the culture vessel 100.
  • the culture vessel 100 is made of soft and the size of the space 101 is variable while being compressed by an external pressure such as negative pressure.
  • the gas existing in the culture environment means 200 is sucked into the space 101 to enter and exit the gas.
  • the gas is introduced into and out of the space 101 through the circulation filter 120 installed in the culture vessel 100.
  • the clip 124 may selectively open or close the circulation filter 120 to determine whether the circulation filter 120 is opened or closed.
  • the circulation filter 120 is sealed through the clip 124 to obtain the cells 11 so that the culture vessel 100 is converted into a sealed state.
  • the culture vessel 100 is taken out from the culture environment means 200, and then the scraper 130 and the movable member 140 having magnetic force are brought into close contact with the culture vessel 100 and then moved into the space 101.
  • the scraper 130 is interlocked to scrape off the cells 11 attached to the bottom surface of the space 101.
  • the scraper 130 installed in the space 101 rotates and moves through mechanical energy to scrape the cell 11 and detach it from the bottom of the space 101.
  • the scraper 130 is rotatably coupled to the inside of the space 101 through the central axis 133, and the central axis 133 is exposed to the outside of the space 101 to rotate the central axis 133 to interlock the scraper 130 to scrape the cells 11 to space the space 101. Desorption from the bottom surface.
  • the scraper 130 moves through the potential energy to scrape the cells 11 and detach them from the bottom of the space 101.
  • the culture vessel 100 is inclined so that the scraper 130 having its own weight slides off the bottom surface of the space 101 while scraping off the cells 11.
  • the syringe needle penetrates into the sealed passage 110 at the other place except the sealed passage 110 into which the culture solution 12 is injected, and sucks the cultured cell 11 through the needle through the negative pressure of the syringe to obtain the syringe.
  • the obtaining of the cell 11 leaves a part of the detached cell 11 so that the remaining cell 11 can be repeatedly proliferated.
  • the method of culturing cells 11 in a continuous manner of the present invention is obtained by injecting the culture solution 12, inoculating the cells 11, incubating the cells 11, releasing the cells 11 and obtaining the cells 11 so that the airtight container is always kept closed. This allows for stable and repeated culturing of cells 11.

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Abstract

본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 방법은 밀폐된 배양용기의 내부 공간에 배양액을 주입 후 세포를 접종하여 세포를 배양하는 단계; 상기 배양용기의 공간에 배양된 세포의 밀도가 기준치 이상이 되면 상기 부착된 세포를 탈리시키는 단계; 밀폐된 상태를 유지하는 배양용기에서 탈리된 세포를 수득하는 단계를 포함한다.

Description

연속으로 세포를 배양하는 장치 및 방법
본 발명은 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 밀폐성을 유지한 상태로 세포 및 배양액을 주입, 배양, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 방법에 관한 것이다.
세포배양에는 세포가 배양기에 부착하여 증식하는 단층배양(부착배양)과 세포가 부유 상태로 증식하는 현탁배양이 있다.
대부분의 동물세포는 표면에 부착하여 생장하며 생장속도가 미생물에 비하여 매우 느리기 때문에 생산성이 낮고 배양 도중 미생물에 의해 오염되기 쉽다.
그러나, 세포 평면 부착 배양에서 기존의 방법들은 밀폐성 유지가 힘들고 따라서 일정기간의 세포 수득 과정 후에는 오염되기가 쉬운 문제점을 가지고 있다.
또한 배양 세포를 실험실 외부로 이동시에는 별개의 밀폐 수단을 구비해야 하나, 아직 완전 밀폐가 성공적인 경우가 없고 대부분 용기를 옮겨서 이동하는 방법을 사용한다.
하지만 용기를 옮길 경우 또 한번의 계대(passage)가 되므로 배양세포의 균일성을 유지하기 어렵다.
한편, 용기내에 부착 배양된 세포를 탈리하기 위해서는 트립신과 같은 단백질 분해 효소를 사용한다.
이들 효소는 부착면과의 연결면을 녹여 세포의 부착을 와해시키는 방법으로서 효소처리에 시간이 소요되고 효소의 독성으로 인한 세포 특성의 변화, 사멸 등 다양한 문제를 일으키고 있다.
세포의 특성은 트립신 처리 횟수로 그 특성의 변화 정도를 분류하는데, 이는 트립신의 사용이 세포 특성을 변화시키는 문제가 있다는 증거가 된다.
또한 트립신을 사용하면 배양용기의 모든 면에서 부착세포를 떼어내는 결과를 초래하여 항시 이 과정 후에는 일부 세포를 다시 부착시키기 위한 공정을 필요로 하고 재부착 확률은 10% 이하로 낮다.
트립신을 사용하지 않기 위한 방법으로는 강한 물의 전단력을 이용하는 방법, 평판이나 완만한 곡면에 적용가능한 스크레이퍼로 긁어내는 방법, 온도 반응 액화/경화 형 고체-액체, 액체-고체 소재를 부착 소재로 이용하는 법, 트립신이 아닌 콜라겐 용해효소(collagenase)를 사용하는 방법 등 다양하게 활용되고 있으나 세포의 회수율이 낮거나 불균일한 단점이 있거나 세포 부착면적의 제한이 문제가 되고 있다.
예를 들어, 세포 부착 비드(bead)에서 물의 전단력만을 이용하여 탈리시키는 경우 강한 와류를 이용하여야 하므로 물의 방향이 균일하지 않아 회수율이 일정치 않고 비드끼리 충돌하면서 사이에 끼는 세포가 손상을 입는 문제가 있다.
또한, 콜라겐 부착소재와 콜라겐 용해효소를 이용할 경우는 세포가 두겹 이상 적층되었을때 안쪽에서는 효소의 영향을 받지 않아 아예 용해되지 않는 세포가 있거나 콜라겐이 모두 녹을 때까지 소요되는 시간 동안 콜라겐 용해 효소가 가진 트립신 유사 기능으로 인해 세포를 녹일 수도 있는 위험성이 있으므로 활용이 쉽지 않다.
상기의 문제점을 해소하기 위한 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 이를 이용한 배양 방법은 배양용기의 밀폐성을 유지하면서 세포 및 배양액을 선택적이고 반복적으로 주입, 배양, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하여 수득 과정에서 전체 배양 세포 중 일부분을 제외하고 세포를 수득하여 배양용기 내부에 잔존되어 있는 세포의 반복 배양을 가능하도록 하면서 배양세포의 오염방지 및 균일성을 확보할 수 있다.
아울러, 본 발명의 목적은 배양용기를 보관하면서 세포 증식의 최적의 배양환경을 부여하는 배양환경수단을 통해 최적의 배양온도 및 세포 증식에 필요한 기체를 배양용기에 공급할 수 있도록 하여 세포 배양의 증식성을 향상시키도록 하는 데 있다.
그리고, 본 발명의 목적은 밀폐된 상태에서 배양용기의 공간 바닥에 배양된 세포의 탈리를 시킬 수 있도록 하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 밀폐형의 배양용기를 통해 이동과 보관 및 관리가 손쉽도록 하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치는 선택적으로 밀폐상태를 결정할 수 있는 공간을 갖는 배양용기를 마련하되, 상기 공간이 밀폐된 상태에서 상기 공간 내부로 배양액 주입, 세포 접종, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하고, 상기 공간이 개방된 상태에서 세포의 배양을 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 세포의 수득 과정에서 전체 배양 세포 중 일부분을 제외하고 세포를 수득하여 배양용기 내부에 잔존되어 있는 세포의 반복 배양을 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 세포의 수득 과정에서 전체 배양 세포를 수득한 다음 배양용기에 배양액 주입, 세포 접종, 배양, 탈리, 및 수득의 반복적으로 행할 수 있도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기에는 밀폐통로를 설치하여 외부에서 유체, 기체 및 세포를 공간 내부로 반입 및 반출한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기는 공간에 세포 배양에 필요한 기체를 순환시킬 수 있는 순환필터를 설치한다.
본 발명에 따르면, 상기 공간에는 스크레퍼가 설치되어 상기 스크레퍼의 이동에 의해 세포를 긁어 공간 바닥면에서 세포를 탈리시키도록 구성한다.
본 발명에 따르면, 상기 공간에는 스크레퍼가 설치되되, 상기 스크레퍼의 회전에 의해 세포를 긁어 공간 바닥면에서 세포를 탈리시키도록 구성한다.
본 발명에 따르면, 상기 밀폐통로는 배양용기 표면에 하나 이상 설치하고, 상기 밀폐통로는 연질로 이루어진 블록으로 이루어져 공간을 밀폐시키며, 주사기의 바늘을 침투시 공간에 유체, 기체 및 세포의 반출입을 가능하게 하는 동시에 바늘이 제거되면 밀폐통로의 탄성에 의해 공간이 밀폐된다.
본 발명에 따르면, 상기 순환필터를 통해 공간 내부로 순환되는 기체는 이산화탄소, 산소 중 어느 하나 이상을 포함하는 기체를 출입시킨다.
본 발명에 따르면, 상기 순환필터는 배양용기의 측면에 설치되는 관로와, 상기 관로의 끝단에 설치되는 밸브와, 상기 밸브 내부에 설치되는 필터로 구성한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기는 배양액의 온도를 0℃ 내지 42℃로 유지하는 배양환경수단에 보관되어 생체 세포를 배양시키도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기를 보관하는 배양환경수단내부에 음압을 발생시켜 상기 배양용기의 공간 크기 변화를 갖도록 하여 순환필터를 통해 배양환경수단내부로 세포 배양에 필요한 기체를 공간으로 공급 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기는 하나 이상 구비되고, 상기 순환필터를 통해 연속으로 이음되어 복수의 배양용기가 일체로 기체 순환을 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 외부의 위치에너지에 의해 이동이 가능하다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 외부의 기계적 힘을 통해 공간의 내부 표면을 접촉하면서 회전 또는 이동하여 세포를 긁어낸다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 자력을 통해 공간의 내부 표면을 접촉하면서 회전 또는 이동하여 세포를 긁어낸다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성한다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 상부에 배양홈을 형성시켜 배양액 충진 및 세포 배양을 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레이퍼는 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리아미드(PA), 폴리아세텔(POM), 폴리염화비닐(PVC), 폴리에스테르(PET), 폴리메틸펜텐(PMP), 아이오노머(IO), 에틸렌비닐알코올(EVOH), 폴리염화비닐(PVA), 폴리스틸렌(PS), 메타크릴수지(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 초산비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 페놀수지(PF), 우레아수지(UF), 멜라민수지(MF), 에폭시수지(EP), 폴리우레탄(PUR), 불포화폴리에스테르수지(UP) 및 금속에서 선택된 재질로 적용된다.
본 발명에 따르면, 상기 배양용기 외부 하부면에 이동부재를 근접시켜 이동시키면 스크레퍼와 이동부재가 자력에 의해 연동한다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성하되, 상기 블레이드는 모서리각을 갖도록 형성되어 공간의 바닥면과 마찰에 의해 세포를 바닥면에서 탈리시키도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성하되, 상기 블레이드는 모서리각이 연속으로 형성되도록 형성되어 공간의 바닥면과 접촉 또는 비접촉되도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 순환필터는 관로에 클립을 장착하여 관로를 밀폐 및 개방을 선택적으로 행할 수 있도록 한다.
본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 방법은 밀폐된 배양용기의 내부 공간에 배양액을 주입 후 세포를 접종하여 세포를 배양하는 단계; 상기 배양용기의 공간에 배양된 세포의 밀도가 기준치 이상이 되면 상기 부착된 세포를 탈리시키는 단계; 밀폐된 상태를 유지하는 배양용기에서 탈리된 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 세포를 배양하는 단계는, 상기 공간에 배양액 주입단계와, 상기 배양액에 세포를 접종하는 단계와, 상기 세포를 배양액에 증식시키는 단계로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 상기 배양액 주입, 세포 접종, 세포 탈리 및 세포 수득 단계는 밀폐용기가 항상 밀폐된 상태에서 진행되도록 하여 수득 후 세포의 안정적이고 반복적 배양을 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 세포를 탈리시키는 단계는 공간 내부에 설치된 스크레퍼가 기계적 에너지 또는 위치에너지를 통해 이동하여 세포를 긁어내어 공간 바닥에서 탈리시키도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 세포를 탈리시키는 단계는 공간 내부에 설치된 스크레퍼가 배양용기 외부에 배치된 자력을 갖는 수단과 연동하여 공간 내부에서 이동하면서 세포를 공간 바닥에서 탈리시키도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 세포를 수득하는 단계는 탈리된 세포 중 일부분을 남겨 잔존한 세포가 배양용기에서 반복 증식이 가능하도록 한다.
본 발명에 따르면, 세포를 배양액에 증식시키는 단계는 세포를 배양액에 접종 후 배양환경수단에 배양용기를 보관하여 세포를 배양하되, 상기 배양환경수단은 0℃ 내지 -42℃의 배양온도를 갖고, 세포 배양에 필요한 기체를 배양용기로 공급시킬 수 있도록 하여 최적의 배양환경을 갖도록 한다.
본 발명에 따르면, 상기 세포를 배양액에 증식시키는 단계는 상기 밀폐용기의 공간이 밀폐된 상태에서 개방되도록 전환하여 상기 배양환경수단에 밀폐용기를 보관하되, 상기 밀폐용기가 배양환경수단 내부에 공급되는 기체와 음압에 의해 배양용기 내부로 기체가 반복 출입된다.
본 발명에 따르면, 상기 밀폐용기는 외부와 선택적으로 개폐되도록 하되, 상기 배양환경수단에서 배양용기를 반출시 밀폐용기의 공간이 외부와 밀폐된 후 반출 및 운반되도록 한다.
상기의 문제점을 해소하기 위한 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 이를 이용한 배양 방법은 배양용기의 밀폐성을 유지하면서 세포 및 배양액을 선택적이고 반복적으로 주입, 배양, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하여 수득 과정에서 전체 배양 세포 중 일부분을 제외하고 세포를 수득하여 배양용기 내부에 잔존되어 있는 세포의 반복 배양을 가능하도록 하면서 배양세포의 오염방지 및 균일성을 확보할 수 있다.
아울러, 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 이를 이용한 배양 방법은 배양용기를 보관하면서 세포 증식의 최적의 배양환경을 부여하는 배양환경수단을 통해 최적의 배양온도 및 세포 증식에 필요한 기체를 배양용기에 공급할 수 있도록 하여 세포 배양의 증식성을 향상시키도록 하는 데 있다.
또한, 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 및 이를 이용한 배양 방법은 밀폐형의 배양용기를 통해 이동과 보관 및 관리가 손쉽도록 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 사시도.
도 2는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 종단면도.
도 3은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 횡단면도.
도 4 내지 도 9는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 이용하여 세포를 배양하는 단계를 나타낸 순서도.
도 10은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 중 스크레퍼의 다른 실시예를 나타낸 사시도.
도 11은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 중 스크레퍼의 다양한 실시예를 나타낸 사시도.
도 12는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 보관하는 배양환경수단을 나타낸 사시도.
도 13은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치의 다른 실시예를 나타낸 사시도.
[부호의 설명]
10 : 배양장치 11 : 세포
12 : 배양액 100 : 배양용기
101 : 공간 110 : 밀폐통로
120 : 순환필터 121 : 관로
122 : 밸브 123 : 필터
124 : 클립 130 : 스크레퍼
131 : 블레이드 132 : 배양홈
133 : 중심축 134 : 금속체
140 : 이동부재 141 : 자성체
200 : 배양환경수단
이하, 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일실시예를 상세히 설명하기로 한다.
우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호로 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않기 위하여 생략한다.
도 1은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 사시도이고, 도 2는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 종단면도이며, 도 3은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 나타낸 횡단면도이고, 도 4 내지 도 9는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 이용하여 세포를 배양하는 단계를 나타낸 순서도이며, 도 10은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 중 스크레퍼의 다른 실시예를 나타낸 사시도이고, 도 11은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치 중 스크레퍼의 다양한 실시예를 나타낸 사시도이며, 도 12는 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치를 보관하는 배양환경수단을 나타낸 사시도이고, 도 13은 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치의 다른 실시예를 나타낸 사시도이다.
먼저, 도 1 내지 도 9에서 도시한 바와 같이, 본 발명의 연속으로 세포를 배양하는 장치는 다각형 또는 원형으로 형성된 배양용기 100가 마련된다.
상기 배양용기 100는 내부가 밀폐된 공간 101이 형성된다.
상기 배양용기 100는 연질의 플라스틱 재질로 이루어져, 외부의 압력 또는 힘에에 의해 공간 101의 크기가 가변 될 수 있다.
상기 배양용기 100는 선택적으로 밀폐상태를 결정할 수 있는 공간을 갖는 배양용기 100를 마련하되, 상기 공간 101이 밀폐된 상태에서 상기 공간 101 내부로 배양액 주입, 세포 접종, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하고, 상기 공간이 개방된 상태에서 세포의 배양을 가능하도록 한다.
또한, 세포 11의 수득 과정에서 전체 배양 세포 11 중 일부분을 제외하고 세포 11를 수득하여 배양용기 100 내부에 잔존되어 있는 세포 11의 반복 배양을 가능하도록 한다.
아울러, 세포 11의 수득 과정에서 전체 배양 세포를 수득한 다음 배양용기 100에 배양액 주입, 세포 접종, 배양, 탈리, 및 수득의 반복적으로 행할 수 있도록 한다.
상기 배양용기 100에는 상기와 같은 세포 11의 연속적인 배양을 가능하도록 밀폐통로 110와 순환필터 120가 각각 장착된다.
먼저, 밀폐통로 110는 배양용기 100에 설치되어 공간 101으로 배양액 12의 주입, 배양액 12에 세포 11 접종, 세포 11의 수득 과정을 가능하도록 하고, 상기와 같은 과정의 진행 상황에서도 밀폐용기는 밀폐된 상태가 유지된다.
즉, 상기 밀폐통로 110는 상기 배양용기 100의 측면에 설치하여 외부에서 유체, 기체 및 세포 11를 공간 101 내부로 반입 및 반출할 수 있도록 한다.
이를 가능하도록 상기 밀폐통로 110는 배양용기 100 표면에 설치하고, 상기 밀폐통로 110는 연질로 이루어진 블록으로 이루어져 공간 101에 설치된다.
이때, 상기 밀폐통로 110를 통한 배양액 12과 세포 11의 주입 및 외부로 세포 11의 수득과정은 통상적으로 주사기를 이용한다.
다시 말해, 주사기의 바늘을 통해 밀폐통로 110를 관통되게 침투시킨 다음 주사기 내부 충진된 배양액 12을 공간 101으로 주입하거나, 상기 배양용기 100 내부에 배양 후 탈리 된 세포 11를 주사기 음압을 이용하여 주사기로 빨아들여 외부로 수득 가능하게 한다.
그리고, 배양액 12의 주입 또는 세포 11의 수득 후 밀폐통로 110에서 바늘을 빼내면 밀폐통로 110의 탄성에 의해 밀폐통로 110 자체가 밀폐되어 공간 101의 밀폐성을 유지시킬 수 있다.
또한, 상기 순환필터 120는 배양용기 100의 공간 101 내부로 세포 11 배양에 필요한 기체를 주입하기 위해 설치된다.
즉, 상기 배양용기 100는 세포 11 배양시 배양환경수단 200에 보관되어 적정 온도를 제공받는 동시에 세포 11 배양에 필요한 기체를 제공받는다.
이때, 상기 배양용기 100는 순환필터 120를 통해 기체를 공간 101 내외부로 출입되도록 한다.
즉, 도 13에서 보는 바와 같이, 상기 배양용기 100의 공간 101으로 기체의 출입은 배양환경수단 200내부에 음압을 발생시켜 상기 배양용기 100의 공간 101 크기 변화를 갖도록 하여 순환필터 120를 통해 배양환경수단 200내부로 세포 11 배양에 필요한 기체를 공간 101으로 출입 가능하도록 한다.
여기서, 기체는 이산화탄소, 산소 중 어느 하나 이상을 포함한다.
상기 순환필터 120의 구체적인 구성은 아래와 같다.
상기 순환필터 120는 배양용기 100의 측면에 설치되는 관로 121 와, 상기 관로 121 의 끝단에 설치되는 밸브 122와, 상기 밸브 122 내부에 설치되는 필터 123로 구성한다.
그리고, 관로 121 에는 클립 124을 장착하여 관로 121 를 밀폐 및 개방을 선택적으로 행할 수 있도록 한다.
상기 클립 124은 배양용기 100를 배양환경수단 200에 보관시 관로 121 를 개방시켜 공간 101으로 기체의 출입을 가능하도록 하고, 상기 배양환경수단 200에서 배양용기 100를 반출하고자 할 때에는 클립 124을 이용하여 관로 121를 단속시켜 밀폐용기의 공간 101을 밀폐시킨다.
그리고, 상기 배양용기 100의 공간 101의 바닥면에 배양된 세포 11는 부착력에 의해 쉽게 탈리되지 않기 때문에 세포 11의 탈리를 위한 별도의 도구인 스크레퍼 130를 공간 101 내부에 설치한다.
즉, 상기 스크레퍼 130는 기계적인 외력 또는 자력 또는 위치에너지 등을 통해 공간 101 내부에서 회전 또는 이동하면서 세포 11를 긁어 공간 101 바닥면에서 세포 11를 탈리시키도록 한다.
특히, 도 11에서 도시한 바와 같이, 상기 스크레퍼 130는 사각형의 배양용기를 구성하였으나, 세포가 부착할 수 있는 면을 갖는 한 원형, 삼각형 등의 다각형 등 배양용기의 형상에는 제한이 없다.
먼저, 상기 스크레퍼 130는 기계적 외력을 통한 세포 11 탈리 방법은 아래와 같다.
도 10에서 도시한 바와 같이, 상기 공간 101 바닥면에 중심축 133에 의해 회전 가능하게 설치되고, 상기 중심축 133은 배양용기 100 외부로 노출되어 중심축 133의 회전에 의해 스크레퍼 130를 연동시켜 공간 101의 바닥면에서 회전하는 스크레퍼 130가 마찰되면서 세포 11를 긁어내어 탈리시킨다.
여기서, 상기 스크레퍼 130의 회전에 의해 세포 11를 탈리시키고자 할 경우 상기 배양용기 100는 원통형으로 형성되고, 공간 101의 내주연에서 스크레퍼 130가 중심축 133을 기준으로 회전시켜 세포 11를 탈리시킨다.
또한, 자력을 통한 세포 11 탈리 방법은 아래와 같다.
별도로 마련된 이동부재 140를 상기 배양용기 100 외부 하부면에 근접시키되, 상기 스크레퍼 130와 자력으로 연결되도록 하여 이동부재 140의 이동에 의해 스크레퍼 130를 공간 101 내부에서 연동시켜 스크레퍼 130가 마찰되면서 세포 11를 긁어내어 탈리시킨다.
즉, 스크레퍼 130와 이동부재 140에는 각각 금속체 134 또는 자성체 141를 설치하여 자력에 의해 상호 일체로 연동될 수 있다.
그리고, 위치 에너지를 이용한 세포 11 탈리 방법은 배양용기 100를 경사지게 위치시켜 자중을 갖는 스크레퍼 130가 공간 101 바닥면에서 미끄러지면서 세포 11를 긁어내어 탈리시킨다.
이와 같이 구성된 스크레퍼 130는 상부에 배양홈 132을 형성시켜 배양액 12 충진 및 세포 11 배양을 가능하도록 한다.
즉, 본 발명의 연속으로 세포 11를 배양하는 장치는 공간 101에 배양액 12을 주입하거나, 공간 101 및 스크레퍼 130의 배양홈 132에 주입하여 배양액 12에 세포 11의 접종을 진행한다.
그리고, 상기 스크레퍼 130는 공간 101의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드 131를 형성한다.
여기서, 상기 스크레퍼 130는 공간 101의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드 131를 형성하되, 상기 블레이드 131는 모서리각을 갖도록 형성되어 공간 101의 바닥면과 마찰에 의해 세포 11를 바닥면에서 탈리시키도록 한다.
또는, 상기 스크레퍼 130는 공간 101의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드 131를 형성하되, 상기 블레이드 131는 모서리각이 연속으로 형성되도록 형성되어 공간 101의 바닥면과 접촉 또는 비접촉되도록 한다.
또한, 상기 스크레이퍼는 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리아미드(PA), 폴리아세텔(POM), 폴리염화비닐(PVC), 폴리에스테르(PET), 폴리메틸펜텐(PMP), 아이오노머(IO), 에틸렌비닐알코올(EVOH), 폴리염화비닐(PVA), 폴리스틸렌(PS), 메타크릴수지(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 초산비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 페놀수지(PF), 우레아수지(UF), 멜라민수지(MF), 에폭시수지(EP), 폴리우레탄(PUR), 불포화폴리에스테르수지(UP) 및 금속에서 선택된 재질을 적용한다.
상기와 같이 구성되는 배양용기 100는 하나 이상 구비되고, 상기 순환필터 120를 통해 연속으로 병렬 이음시킨다.
즉, 도 13에서 도시한 바와 같이, 복수의 배양용기 100는 순차적으로 나열하고 일측에 위치한 배양용기 100를 기준으로 인접하게 나열된 배양용기 100끼리 순환필터 120를 순차적으로 연결하여 일측에 위한 배양용기 100의 순환필터 120를 통해 복수의 배양용기 100가 일체로 기체 출입을 가능하도록 한다.
상기와 같이 구성된 배양장치를 통한 연속으로 세포를 배양하는 방법은 아래와 같다.
밀폐된 배양용기 100의 내부 공간 101에 배양액 12을 주입 후 세포 11를 접종하여 세포 11를 배양하는 단계와, 상기 배양용기 100의 공간 101에 배양된 세포 11의 밀도가 기준치 이상이 되면 상기 부착된 세포 11를 탈리시키는 단계와, 밀폐된 상태를 유지하는 배양용기 100에서 탈리된 세포 11를 수득하는 단계로 이루어진다.
먼저, 도 4와 같이, 세포 11를 배양하는 단계는 세부적으로 상기 공간 101에 배양액 12 주입단계와, 상기 배양액 12에 세포 11를 접종하는 단계와, 상기 세포 11를 배양액 12에 증식시키는 단계로 이루어진다.
세포 11를 배양액 12에 증식시키는 단계는 세포 11를 배양액 12에 접종 후 배양환경수단 200에 배양용기를 보관하여 세포를 배양시킨다.
이때, 상기 배양환경수단 200은 0℃ 내지 -42℃의 배양온도를 갖고, 세포 11 배양에 필요한 기체를 배양용기로 공급시킬 수 있도록 한다.
동시에, 상기 순환필터에서 클립의 압박을 해제하여 관로를 개방시킨다.
상기 배양환경수단 200은 내부에 세포 11 배양에 필요한 기체를 공급하는 동시에 반복적으로 음압을 발생시켜 배양용기 100 내부로 기체가 반복적 출입되도록 한다.
즉, 도 6에서 보는 바와 같이, 상기 배양용기 100는 연질로 이루어져 음압 등의 외부 압력에 의해 압착되면서 공간 101의 크기가 가변된다.
이후, 공간 101의 크기가 탄력적으로 원상태로 복원되면서 배양환경수단 200 내부에 존재하는 기체를 공간 101 내부로 빨아들여 기체를 출입시킨다.
여기서, 기체의 출입은 배양용기 100에 설치된 순환필터 120를 거쳐 공간 101으로 기체를 출입시킨다.
특히, 상기 순환필터 120에는 클립 124을 장착하되, 상기 클립 124은 순환필터 120를 선택적으로 압박하거나 압박을 해제시켜 순환필터 120의 개폐상태를 결정할 수 있다.
이후, 상기 배양환경수단 200내에서 배양용기 100에 세포 11의 증식이 이루어지고 난 후 상기 세포 11를 수득하기 위해 클립 124을 통해 순환필터 120를 밀폐시켜 상기 배양용기 100가 밀폐상태로 전환되도록 한다.
다음으로 도 8에서 도시한 바와 같이, 상기 배양환경수단 200에서 배양용기 100를 반출한 다음 스크레퍼 130와 자력 작용을 갖는 이동부재 140를 배양용기 100 하부면에 밀착시킨 다음 이동시키면 공간 101 내부에 위치된 스크레퍼 130가 연동하여 공간 101의 바닥면에 부착된 세포 11를 긁어 탈리시킨다.
또는, 상기 세포 11를 탈리시키는 단계는 공간 101 내부에 설치된 스크레퍼 130가 기계적 에너지를 통해 회전 및 이동하여 세포 11를 긁어내어 공간 101 바닥에서 탈리시키도록 한다.
즉, 상기 공간 101 내부에 스크레퍼 130가 중심축 133을 통해 회전 가능하게 결합되고, 상기 중심축 133은 공간 101 외부로 노출되어 상기 중심축 133을 회전시켜 스크레퍼 130를 연동시켜 세포 11를 긁어 공간 101의 바닥면에서 탈리시킨다.
또는, 상기 스크레퍼 130가 위치에너지를 통해 이동하여 세포 11를 긁어내어 공간 101 바닥에서 탈리시킨다.
즉, 배양용기 100를 경사지게 위치시켜 자중을 갖는 스크레퍼 130가 공간 101 바닥면에서 미끄러지면서 세포 11를 긁어내어 탈리시킨다.
이후, 배양액 12을 주입한 밀폐통로 110를 제외한 다른 개소의 밀폐통로 110에 주사기 바늘을 침투시켜 주사기의 음압을 통해 바늘을 거쳐 배양된 세포 11를 주사기로 빨아들여 수득한다.
여기서, 도 9에서 도시한 바와 같이, 상기 세포 11를 수득하는 단계는 탈리된 세포 11 중 일부분을 남겨 잔존한 세포 11가 반복 증식이 가능하도록 한다.
상기와 같이, 본 발명의 연속으로 세포 11를 배양하는 방법은 상기 배양액 12 주입, 세포 11 접종, 세포 11 배양, 세포 11 탈리 및 세포 11 수득 단계는 밀폐용기가 항상 밀폐된 상태에서 진행되도록 하여 수득 후 세포 11의 안정적이고 반복적 배양을 가능하도록 한다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 명백할 것이다.

Claims (32)

  1. 선택적으로 밀폐상태를 결정할 수 있는 공간을 갖는 배양용기를 마련하되,
    상기 공간이 밀폐된 상태에서 상기 공간 내부로 배양액 주입, 세포 접종, 탈리, 및 수득이 가능하도록 하고,
    상기 공간이 개방된 상태에서 세포의 배양을 가능하도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    세포의 수득 과정에서 전체 배양 세포 중 일부분을 제외하고 세포를 수득하여 배양용기 내부에 잔존되어 있는 세포의 반복 배양을 가능하도록 하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    세포의 수득 과정에서 전체 배양 세포를 수득한 다음 배양용기에 배양액 주입, 세포 접종, 배양, 탈리, 및 수득의 반복적으로 행할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양용기에는 밀폐통로를 설치하여 외부에서 유체, 기체 및 세포를 공간 내부로 반입 및 반출하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양용기는 공간에 세포 배양에 필요한 기체를 순환시킬 수 있는 순환필터를 설치하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 공간에는 스크레퍼가 설치되어 상기 스크레퍼의 이동에 의해 세포를 긁어 공간 바닥면에서 세포를 탈리시키도록 구성한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공간에는 스크레퍼가 설치되되, 상기 스크레퍼의 회전에 의해 세포를 긁어 공간 바닥면에서 세포를 탈리시키도록 구성한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 밀폐통로는 배양용기 표면에 하나 이상 설치하고,
    상기 밀폐통로는 연질로 이루어진 블록으로 이루어져 공간을 밀폐시키며,
    주사기의 바늘을 침투시 공간에 유체, 기체 및 세포의 반출입을 가능하게 하는 동시에 바늘이 제거되면 밀폐통로의 탄성에 의해 공간이 밀폐되는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 순환필터를 통해 공간 내부로 순환되는 기체는 이산화탄소, 산소 중 어느 하나 이상을 포함하는 기체를 출입시키는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 순환필터는 배양용기의 측면에 설치되는 관로와,
    상기 관로의 끝단에 설치되는 밸브와,
    상기 밸브 내부에 설치되는 필터로 구성한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 배양용기는 배양액의 온도를 0℃ 내지 42℃로 유지하는 배양환경수단에 보관되어 생체 세포를 배양시키도록 하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 배양용기를 보관하는 배양환경수단내부에 음압을 발생시켜 상기 배양용기의 공간 크기 변화를 갖도록 하여 순환필터를 통해 배양환경수단내부로 세포 배양에 필요한 기체를 공간으로 공급 가능하도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 배양용기는 하나 이상 구비되고, 상기 순환필터를 통해 연속으로 이음되어 복수의 배양용기가 일체로 기체 순환을 가능하도록 하는 것을 특징으로 하는 속으로 세포를 배양하는 장치.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 외부의 위치에너지에 의해 이동이 가능한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  15. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 외부의 기계적 힘을 통해 공간의 내부 표면을 접촉하면서 회전 또는 이동하여 세포를 긁어내는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  16. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 자력을 통해 공간의 내부 표면을 접촉하면서 회전 또는 이동하여 세포를 긁어내는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  17. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  18. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 상부에 배양홈을 형성시켜 배양액 충진 및 세포 배양을 가능하도록 한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  19. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레이퍼는 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리아미드(PA), 폴리아세텔(POM), 폴리염화비닐(PVC), 폴리에스테르(PET), 폴리메틸펜텐(PMP), 아이오노머(IO), 에틸렌비닐알코올(EVOH), 폴리염화비닐(PVA), 폴리스틸렌(PS), 메타크릴수지(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 초산비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 페놀수지(PF), 우레아수지(UF), 멜라민수지(MF), 에폭시수지(EP), 폴리우레탄(PUR), 불포화폴리에스테르수지(UP) 및 금속에서 선택된 재질인 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  20. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 배양용기 외부 하부면에 이동부재를 근접시켜 이동시키면 스크레퍼와 이동부재가 자력에 의해 연동하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  21. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성하되,
    상기 블레이드는 모서리각을 갖도록 형성되어 공간의 바닥면과 마찰에 의해 세포를 바닥면에서 탈리시키도록 한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  22. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 스크레퍼는 공간의 바닥면과 접촉되는 하부면이 복수의 블레이드를 형성하되,
    상기 블레이드는 모서리각이 연속으로 형성되도록 형성되어 공간의 바닥면과 접촉 또는 비접촉되도록 한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  23. 제10항에 있어서,
    상기 순환필터는 관로에 클립을 장착하여 관로를 밀폐 및 개방을 선택적으로 행할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 장치.
  24. 밀폐된 배양용기의 내부 공간에 배양액을 주입 후 세포를 접종하여 세포를 배양하는 단계;
    상기 배양용기의 공간에 배양된 세포의 밀도가 기준치 이상이 되면 상기 부착된 세포를 탈리시키는 단계;
    밀폐된 상태를 유지하는 배양용기에서 탈리된 세포를 수득하는 단계를 포함하는 것을 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 세포를 배양하는 단계는,
    상기 공간에 배양액 주입단계와,
    상기 배양액에 세포를 접종하는 단계와,
    상기 세포를 배양액에 증식시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 배양액 주입, 세포 접종, 세포 탈리 및 세포 수득 단계는 밀폐용기가 항상 밀폐된 상태에서 진행되도록 하여 수득 후 세포의 안정적이고 반복적 배양을 가능하도록 하는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  27. 제 24항에 있어서
    상기 세포를 탈리시키는 단계는 공간 내부에 설치된 스크레퍼가 기계적 에너지 또는 위치에너지를 통해 이동하여 세포를 긁어내어 공간 바닥에서 탈리시키도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  28. 제 24항에 있어서
    상기 세포를 탈리시키는 단계는 공간 내부에 설치된 스크레퍼가 배양용기 외부에 배치된 자력을 갖는 수단과 연동하여 공간 내부에서 이동하면서 세포를 공간 바닥에서 탈리시키도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  29. 제 24항에 있어서,
    상기 세포를 수득하는 단계는 탈리된 세포 중 일부분을 남겨 잔존한 세포가 배양용기에서 반복 증식이 가능하도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  30. 제 25항에 있어서,
    세포를 배양액에 증식시키는 단계는 세포를 배양액에 접종 후 배양환경수단에 배양용기를 보관하여 세포를 배양하되,
    상기 배양환경수단은 0℃ 내지 -42℃의 배양온도를 갖고,
    세포 배양에 필요한 기체를 배양용기로 공급시킬 수 있도록 하여 최적의 배양환경을 갖도록 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  31. 제 25항에 있어서,
    상기 세포를 배양액에 증식시키는 단계는
    상기 밀폐용기의 공간이 밀폐된 상태에서 개방되도록 전환하여
    상기 배양환경수단에 밀폐용기를 보관하되,
    상기 밀폐용기가 배양환경수단 내부에 공급되는 기체와 음압에 의해 배양용기 내부로 기체가 반복 출입되는 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
  32. 제 24항에 있어서,
    상기 밀폐용기는 외부와 선택적으로 개폐되도록 하되,
    상기 배양환경수단에서 배양용기를 반출시 밀폐용기의 공간이 외부와 밀폐된 후 반출 및 운반되도록 한 것을 특징으로 하는 연속으로 세포를 배양하는 방법.
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