CN105339488A - 细胞剥离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞剥离方法，可以将使用包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞不造成损伤地从培养容器选择性剥离。本发明是将附着于包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的细胞剥离方法，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，而将粘附培养系细胞从培养容器剥离。
Description
技术领域
本发明涉及一种将使用培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的方法，特别涉及将使用包含具有挠曲性的膜的密闭体系的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的方法。
背景技术
近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等，使用具有透气性的培养袋，在封闭体系中自动地进行细胞的大量培养。
然而，最近特别是使用具有万能分化性的iPS细胞、或具有变为属于间充质的细胞的分化能力的间充质干细胞等的再生医疗等研究开发迅速地开展，而此种研究开发中使用的细胞的大部分是粘附培养系细胞。
粘附培养系细胞是附着于培养容器增殖的细胞，因此与在培养液内以浮游状态增殖的浮游培养系细胞不同，在培养后需要从培养容器剥离。由此，以往为了使粘附培养系细胞能够进行剥离操作，多在Petri培养皿等开放体系的培养容器中培养。
然而，在Petri培养皿中进行大量培养繁琐且花费工夫，因此今后为了更高效地大量培养，希望使用封闭体系的培养袋进行培养。
另外，在粘附培养系细胞的培养中，需要仅培养状态良好的细胞等选择出的细胞，因此还要求从培养容器仅剥离所需的部分。
作为以往的细胞剥离方法，首先可以举出借助胰蛋白酶处理的方法。该方法中，通过利用作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶，将粘附培养系细胞与培养容器的粘附因子分解，而将细胞剥离。
即，如图8所示，向加入了培养液2的Petri培养皿10中接种粘附培养系细胞3而使之增殖后，从Petri培养皿10中除去培养液2(1)。然后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS溶液)清洗培养液成分(2)，注入胰蛋白酶溶液(3)。通过在培养箱内保持数分钟，而将粘附因子分解，粘附培养系细胞3从Petri培养皿10纷纷剥落(4)。最后，向Petri培养皿10中注入培养液2，使胰蛋白酶失活，将粘附培养系细胞3与培养液2一起回收。
根据此种胰蛋白酶处理，可以将接触性培养细胞3从培养容器剥离。
另外，作为以往的细胞剥离方法，还有使用细胞刮棒物理地刮取细胞的方法(参照专利文献1)。根据该方法，与胰蛋白酶处理相比操作简单，如果是一定程度内，则也可以剥离目标范围的细胞。
此外，在专利文献2中，公开有如下的方法，即，利用具有探针的扫描型探针显微镜，对特定的细胞以预先确定的力按压探针而施加物理的刺激，将细胞从基板上剥离。根据该方法，可以选择性剥离细胞。
现有技术文献
专利文献1：日本实用新型第2531969号
专利文献2：日本专利第4831543号
发明内容
发明所要解决的问题
然而，在胰蛋白酶处理中，如果培养箱内的保持时间过长，则会分解至细胞膜，会有损伤细胞的情况。另外，操作繁琐，很难应用于培养袋。此外，很难仅将一部分细胞群剥离，不能满足希望仅剥离所需的部分的要求。
另外，专利文献1中记载的使用细胞刮棒的方法适合于开口部大的开放形的培养容器，存在有难以适用于开口部小的培养袋的问题。
另外，专利文献2中记载的利用具有探针的扫描型探针显微镜的方法由于使用探针，因此难以适用于培养袋，另外由于是将细胞一个个选择性剥离，因此无法将培养袋中大量培养的粘附培养系细胞高效地剥离。
由此，希望有能够将使用培养袋培养的粘附培养系细胞从培养袋选择性并且高效地剥离的技术。
因而，本发明人等对可以适用于培养袋的细胞剥离方法进行了深入研究。由此发现，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养袋的膜的面相面对的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，就可以将粘附培养系细胞从培养袋的内面剥离，从而完成了本发明。
即，本发明的目的在于，提供一种细胞剥离方法，其可以将使用包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞不造成损伤地从培养容器选择性并且高效地剥离。
用于解决问题的方法
为了达成上述目的，本发明的细胞剥离方法是将附着在包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的细胞剥离方法，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，而将粘附培养系细胞从培养容器剥离。
发明效果
根据本发明，可以提供一种细胞剥离方法，其可以将使用包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞不造成损伤地容易地从培养容器选择性并且高效地剥离。
附图说明
图1是表示本发明的第一实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
图2是表示本发明的第一实施方式的细胞剥离方法中的推压构件的例子的图。
图3是表示本发明的第二实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
图4是表示本发明的第三实施方式的细胞剥离方法的工序的图。
图5是表示实施例1的结果的显微镜照片的图。
图6是表示实施例2的实施的样子及结果的显微镜照片等的图。
图7是表示将利用以往的方法剥离并进行继代培养的粘附培养系细胞与实施例2的结果所得的粘附培养系细胞以相同密度接种而分别培养的结果的显微镜照片的图。
图8是表示以往的借助胰蛋白酶处理的细胞剥离方法的图。
具体实施方式
本发明的细胞剥离方法是将附着于包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从培养容器剥离的细胞剥离方法，通过使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力，而将粘附培养系细胞从培养容器剥离，只要是此种方法即可，并不受其他的构成特别限定。
即，作为对粘附培养系细胞施加压力的途径，只要是可以使与粘附培养系细胞所附着的培养容器的膜的面相面对的培养容器的膜的面接触粘附培养系细胞、并对粘附培养系细胞施加压力即可，既可以通过从培养容器的外部施加压力而对细胞施加压力，也可以通过将培养容器内的空气设为负压而对细胞施加压力。
另外，作为从培养容器的外部施加压力的方法，也可以利用推压构件等推压培养容器、或利用空气压等推压培养容器。
以下，对本发明的实施方式进行具体说明。
[第一实施方式]
首先，参照图1及图2对本发明的第一实施方式的细胞剥离方法进行详细说明。
在图1的(1)中，示意性地表示出向包含具有挠曲性的膜的培养容器1(培养袋)中封入培养液2和粘附培养系细胞3并载放在装载台4上、将推压构件5配置于培养容器1的上方的样子。粘附培养系细胞3附着在培养容器1内的膜的底面而被培养。
然后，如图1的(2)所示，利用推压构件5，从上方推压培养容器1。此时，使培养容器1内的膜的上表面接触粘附培养系细胞3，对粘附培养系细胞3施加不会损伤粘附培养系细胞3的程度的压力。
此后，如图1的(3)所示，当使推压构件5离开培养容器1时，粘附培养系细胞3就从培养容器1内的膜的底面剥落。
此处，附着于培养容器1内的膜的底面的粘附培养系细胞3即使从培养容器1下方摩擦也无法剥离。即，即使从培养容器1的外部对粘附培养系细胞所附着的培养容器1的膜的面施加力，也只会对膜造成损伤，或将其拉长，无法剥离粘附培养系细胞3。
与此相对，根据上述的本实施方式的细胞剥离方法，可以不使附着于培养袋内的粘附培养系细胞3损伤，在一定程度上选择性并且高效地剥离目标范围的细胞。
虽然其理由还不明确，然而可以推测，通过像本实施方式那样使培养容器1的膜接触粘附培养系细胞3并施加压力，就会对粘附培养系细胞作用大于粘附培养系细胞3与培养容器1的粘附力的应力，从培养容器1分离粘附培养系细胞3。
培养容器1是以软包装材料作为材料制成袋状的、包含具有挠曲性的膜的培养袋。培养容器1由于是用于粘附培养系细胞3的培养，因此优选具有透气性，并且为了可以确认内容物，优选一部分或全部具有透明性。作为满足此种条件的膜的材料，例如可以举出聚烯烃、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅橡胶等。
另外，为了可以使粘附培养系细胞3附着于培养容器1内，需要使培养容器1内为亲水性，或涂布足够量的粘附因子，例如纤连蛋白等。作为使培养容器1内为亲水性的方法，例如可以举出使用进行了UV臭氧处理或电晕处理的膜来制成培养容器1。作为涂布粘附因子的方法，例如可以举出用粘附因子的溶液浸渍培养容器1内，并保持给定时间，由此使粘附因子吸附在培养容器1内面的方法。
此外，在培养容器1中，具备一个或两个以上的用于进行培养液2及粘附培养系细胞3的取放的口(ポート)。
培养液2只要是可以培养粘附培养系细胞3的培养液即可，可以使用现有的培养液。例如可以合适地使用在DMEM(杜尔伯科/沃格特改良伊格尔最低必需培养基)中加入了FBS(胎牛血清)10％的培养液等。
粘附培养系细胞3只要是附着于培养容器1内增殖的细胞，就没有特别限定，例如可以使用iPS细胞或间充质干细胞等。
装载台4是在其上表面载放培养容器1的平面的台。在装载台4中，例如可以设置用于将培养容器1固定在装载台4的固定件等、用于安置培养容器1的各种构成。
推压构件5是通过从培养容器1的外部推压培养容器1，而使与粘附培养系细胞3所附着的培养容器1的膜的面相面对的培养容器1的膜的面接触粘附培养系细胞3、并对粘附培养系细胞3施加压力的构件。
作为该推压构件5，例如如图2的(A)所示，可以使用其底面为平面的立体形状的构件。如果使用此种底面为平面的推压构件5-1，则可以将附着于由平面推压的培养容器1内的一定区域中的膜的粘附培养系细胞3选择性并且高效地剥离。作为此种立体形状，例如可以举出长方体、立方体、圆柱、圆锥、多棱柱等形状。
另外，作为推压构件5，例如也可以如图2的(B)所示，使用其底面为曲面(向下方伸出的凸面)的立体形状的构件。如果使用此种底面为曲面的推压构件5-2，则可以将附着于培养容器1内的更小的一定区域中的膜的粘附培养系细胞3选择性剥离。
此外，作为推压构件5，例如也可以如图2的(C)所示，使用辊5-3。即，从上方用辊推压培养容器1，使与粘附培养系细胞3所附着的培养容器1的膜的面相面对的培养容器1的膜的面接触粘附培养系细胞3、并对粘附培养系细胞3施加压力，同时使辊5-3与装载台4平行地移动，由此就可以将附着于培养容器1内的更大的一定区域中的膜的粘附培养系细胞3选择性并且高效地剥离。特别是，为了将培养容器1内的全部粘附培养系细胞3高效地剥离，作为推压构件5，适合使用辊5-3。
[第二实施方式]
下面，参照图3，对本发明的第二实施方式的细胞剥离方法进行说明。本实施方式作为装载台4使用具备孔4-1的构件，由此更容易选择作为剥离对象的粘附培养系细胞3。对于其他的方面，与第一实施方式相同，对于培养容器1、培养液2、粘附培养系细胞3、及推压构件5，可以使用与第一实施方式相同的材料。
即，本实施方式的细胞剥离方法中，如图3所示，作为装载台4，使用在其一定区域形成有孔4-1的构件，将附着于培养容器1的内面培养的粘附培养系细胞3中的、不想剥离的粘附培养系细胞3所附着的培养容器1内的一定区域配置于孔4-1上。此后，从培养容器1的外部用推压构件5推压包括该区域的范围，就可以不将附着于该区域的粘附培养系细胞3剥离，而仅将附着于该区域以外的推压了的范围的粘附培养系细胞3选择性剥离。
具体而言，在图3的(1)中，示意性地表示出向包含具有挠曲性的膜的密闭体系的培养容器1(培养袋)中封入培养液2和粘附培养系细胞3并载放在具备孔4-1的装载台4上、将推压构件5配置于培养容器1的上方的样子。粘附培养系细胞3附着在培养容器1内的膜的底面而被培养。
然后，如图3的(2)所示，利用推压构件5，从包含孔4-1的范围的上方推压培养容器1。此时，培养容器1内的膜的上表面接触粘附培养系细胞3，对于附着于孔4-1的上方以外的区域的粘附培养系细胞3，施加不会损伤粘附培养系细胞3的程度的压力。另一方面，附着于孔4-1的上方的区域的粘附培养系细胞3当被从上方推压时，就会沉入孔4-1中，从而不会对粘附培养系细胞3施加剥离所必需的压力。
其结果是，如图3的(3)所示，当使推压构件5离开培养容器1时，仅使附着于孔4-1的上方以外的区域的粘附培养系细胞3从培养容器1内的膜的底面剥落，而附着于孔4-1的上方的区域的粘附培养系细胞3不会从培养容器1内的膜的底面剥落。
如此所述，根据本实施方式的细胞剥离方法，通过以使不想要剥离的粘附培养系细胞3位于装载台4的孔4-1的上方的方式，将培养容器1配置于装载台4，就可以更加细致地选择要剥离的粘附培养系细胞3。
而且，虽然孔4-1在图3中作为贯穿装载台4而形成的孔表示，然而并不限定于此，也可以作为装载台4中的凹陷形成。另外，装载台4的水平面中的孔的形状也可以是任意的形状，可以设为圆形、长方形、多边形等以及其他由曲线等构成的自由的形状。此外，其个数也不限定为一个，也可以在装载台4中设置两个以上的孔4-1。
另外，本实施方式中也可以不使用推压构件5，而是例如利用空气压、液压等来推压包括配置于孔4-1上的区域的范围。
[第三实施方式]
下面，参照图4对本发明的第三实施方式的细胞剥离方法进行说明。本实施方式的细胞剥离方法通过将培养容器1内设为负压，而使与粘附培养系细胞3所附着的培养容器1的膜的面相面对的培养容器1的膜的面接触粘附培养系细胞3、并对粘附培养系细胞3施加压力。对于培养容器1、培养液2、粘附培养系细胞3、及装载台4，可以使用与第一实施方式相同的材料。
即，本实施方式的细胞剥离方法中，通过从培养容器1内排出培养液2，然后抽吸培养容器1的空气而将培养容器1内设为负压，来使与粘附培养系细胞3所附着的培养容器1的膜的面相面对的培养容器1的膜的面接触粘附培养系细胞3、并对粘附培养系细胞3施加压力。然后，向培养容器1内注入培养液2，将粘附培养系细胞3从培养容器1的内面剥离。
具体而言，在图4的(1)中，示意性地表示出向包含具有挠曲性的膜的密闭体系的培养容器1(培养袋)中封入培养液2和粘附培养系细胞3、并载放在装载台4上的样子。粘附培养系细胞3附着于培养容器1内的膜的底面而被培养。
然后，如图4的(2)所示，从培养容器1中排出培养液2，再利用泵等抽吸培养容器1内的空气，将培养容器1内设为负压。由此，就使与粘附培养系细胞3所附着的培养容器1的膜的面相面对的培养容器1的膜的面接触粘附培养系细胞3、并对粘附培养系细胞3施加压力。
继而，如图4的(3)所示，通过向培养容器1内注入培养液2，而将粘附培养系细胞3从培养容器1的内面剥离。
根据本实施方式的细胞剥离方法，可以不损伤培养容器1内的粘附培养系细胞3地容易并且高效地进行剥离。
[实施例]
(实施例1)
进行了利用上述第一实施方式的细胞剥离方法从培养袋1剥离粘附培养系细胞3的实验。
作为培养袋1，使用了聚乙烯(PE)制且尺寸为100mm×225mm、膜厚为0.1mm的培养袋。在该培养袋1内涂覆了纤连蛋白。
具体而言，将用PBS(磷酸缓冲生理盐水)稀释为5μg/ml的纤连蛋白溶液100ml以浸渍培养袋1的整个内面的状态在37℃的CO2培养箱内保持约2小时。
然后，将纤连蛋白溶液全部排出后，用PBS清洗培养容器1的内面1次(使100ml的PBS浸渍培养袋的整个内面后立即排出)。液体的取放通过在设于培养袋1的口处连接注射器而进行。
作为粘附培养系细胞3，使用了CHO细胞(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠的卵巣)。另外，作为培养液2，使用了加入FBS(胎牛血清)10％的DMEM培养基。将该CHO细胞200万个与培养液150ml一起接种在培养袋1内，静置培养72小时，使用所得的材料，进行了剥离实验。
培养是利用CO2培养箱在37℃、CO2浓度5％、湿度97％的条件下进行。
剥离实验中，作为推压构件5，使用头端为圆形的、粗1mm的针(头端SR1)，作为装载台4使用了玻璃板。此后，用手指捏住该针向培养袋轻轻地推压。此时的压力为数十gf，将针按下至感觉到来自玻璃板的应力为止。此后，使针离开培养袋1。将其结果表示于图5中。
图5的(1)中，表示出用针推压培养袋1的状态的显微镜照片，图5的(2)中，表示出使针离开培养袋1的状态的显微镜照片。根据图5的(2)可知，仅在培养袋1的用针推压了的区域中，粘附培养系细胞3发生了剥离。
因而可以清楚，根据第一实施方式的细胞剥离方法，可以选择性并且高效地剥离附着于培养袋内的粘附培养系细胞。
(实施例2)
进行了利用上述第二实施方式的细胞剥离方法从培养袋1剥离粘附培养系细胞3的实验。培养容器1、培养液2、及粘附培养系细胞3使用了与实施例1相同的材料。本实施例中，在具备孔4-1的装载台4’上载放培养袋1，在利用辊5-3’推压培养袋1的同时，使辊5-3’与装载台4’平行地旋转移动。作为该辊5-3’，如下所示，使用了可以每隔一定间隔将培养袋1按下的辊。
具体而言，如图6的(1)所示，作为推压构件5，使用了带有海绵的辊5-3’。在带有海绵的辊5-3’，在辊的整个长度方向上，与辊筒的圆周面上的一部分相面对地贴附有2个细长的板状的海绵。这些海绵是硬度为AskerC15的硅海绵，使用了宽为6.5mm、厚为3mm、长与辊的长度方向的长度相同的海绵。
在此种带有海绵的辊5-3’在培养袋1上旋转移动的期间，在海绵位于下方时可以推压培养袋1，在海绵位于上方或横向时，不推压培养袋1。当使用此种带有海绵的辊5-3’，在培养袋1上一边推压一边旋转移动时，在培养袋1中，就会产生被带有海绵的辊5-3’推压了的部分和没有被推压的部分。
另外，作为装载台4’，使用了不锈钢制的冲孔金属板(孔径2、开孔率40.2)。在该装载台4’中具备多个孔。本实施例中，仅附着于载放在装载台4’上的培养容器1中的被带有海绵的辊5-3’推压了的、且并非装载台4’的孔的上方的区域的粘附培养系细胞3被选择性剥离。在图6的(2)～(4)中表示出其结果。
即，在图6的(2)中，表示出在培养袋1中仅海绵所接触的区域看起来为黑色、在其他的区域附着有细胞而看起来为白色的样子。图6的(3)是将图6的(2)中的白色的包围部分放大了的照片，可知在对应于装载台4’的孔的区域中为白色，附着有细胞。图6的(4)是包括对应于装载台4’的孔的区域的周边的显微镜照片，可知附着在对应于孔的区域的粘附培养系细胞3没有被剥离，仅附着于周边的粘附培养系细胞3被剥离。
因而可以清楚，根据第二实施方式的细胞剥离方法，可以更加细致地选择性剥离附着于培养袋1内的粘附培养系细胞3。
(培养试验)
为了确认对于利用本实施方式的细胞剥离方法剥离的粘附培养系细胞可以没有损伤地培养，进行了用于对以往的用细胞刮棒剥离后培养的细胞和利用本实施方式的细胞剥离方法剥离后培养的细胞的培养状态进行比较确认的培养试验。
(1)使用细胞刮棒剥离的粘附培养系细胞的培养试验
作为培养容器，使用了Falcon组织培养用培养皿(φ6cm)，作为培养液，使用了加入FBS(胎牛血清)10％的DMEM培养基4ml。另外，作为粘附培养系细胞，使用CHO细胞，将接种密度设为1×105细胞/ml，使用CO2培养箱，在37℃、CO2浓度5％、湿度97％的条件下进行了培养。继代间隔设为72小时，利用以下的方法进行继代。
首先，将培养容器从CO2培养箱中取出，用移液管吸出上清液从而将其全部排出。然后，用细胞刮棒刮擦培养容器内的整个表面，剥离细胞。此后，向培养容器中注入新鲜的培养液2ml，进行吹吸(pipetting)而拆分细胞。先回收到另外的容器(锥形管)中，再从其中采集极少量，用血细胞计数板计数出细胞数。基于计数出的值，以使细胞密度为1×105细胞/ml的方式注入培养液。此后，将所得的细胞悬浮液在新的培养容器中接种4ml，再在培养箱内保存72小时。反复进行该继代方法，持续培养半年以上。
(2)实施例2中被剥离的粘附培养系细胞的培养试验
将实施例2中被剥离的粘附培养系细胞回收到锥形管中并采集极少量，用血细胞计数板计数出细胞数。基于计数出的值，以使细胞密度为1×105细胞/ml的方式注入培养液(加入FBS10％的DMEM培养基)。此后，将所得的细胞悬浮液在新的培养容器中接种4ml，在培养箱内保存72小时。
图7的(A)是使用细胞刮棒剥离、并进行了半年以上继代培养的粘附培养系细胞的显微镜照片。另外，图7的(B)是将实施例2中剥离的粘附培养系细胞在与使用细胞刮棒剥离的粘附培养系细胞相同的接种密度及培养条件进行了72小时培养的样品的显微镜照片。
比较它们则可知，可以获得大致同等的细胞增殖率、大致同等的粘附率(粘附了细长细胞的比率)。
因而可以清楚，利用本发明的细胞剥离方法剥离的粘附培养系细胞可以不损伤细胞地进行剥离。
本发明当然并不限定为以上的实施方式或实施例，可以在本发明的范围内中进行各种变更实施。
例如，可以适当地变更为如下方式等，即，通过取代推压构件的使用，而从培养容器的外部对粘附培养系细胞施加与使用推压构件时相同程度的空气压或液压，而从培养容器剥离粘附培养系细胞。
产业上的可利用性
本发明能够适用于大量培养粘附培养系细胞的情况。
符号说明
1培养容器，
2培养液，
3粘附培养系细胞，
4装载台，
4’装载台(冲孔金属板)，
4-1孔，
5推压构件，
5-1底面为平面的推压构件，
5-2底面为曲面的推压构件，
5-3辊，
5-3’带海绵的辊，
10Petri培养皿。
Claims (7)
1.一种细胞剥离方法，是将附着于包含具有挠曲性的膜的培养容器培养的粘附培养系细胞从所述培养容器剥离的细胞剥离方法，其特征在于，
通过使与所述粘附培养系细胞所附着的所述培养容器的膜的面相面对的所述培养容器的膜的面接触所述粘附培养系细胞、并对所述粘附培养系细胞施加压力，而将所述粘附培养系细胞从所述培养容器剥离。
2.根据权利要求1所述的细胞剥离方法，其特征在于，
通过对附着于所述培养容器培养的所述粘附培养系细胞，从所述培养容器的外部用推压构件施加压力，而将所述粘附培养系细胞从所述培养容器剥离。
3.根据权利要求2所述的细胞剥离方法，其特征在于，
作为所述推压构件，使用底面为平面的构件，对所述培养容器的一定区域或全部区域施加压力。
4.根据权利要求2所述的细胞剥离方法，其特征在于，
作为所述推压构件，使用底面为曲面的构件，对所述培养容器的一定区域施加压力。
5.根据权利要求2所述的细胞剥离方法，其特征在于，
作为所述推压构件，使用辊，对所述培养容器的一定区域或全部区域施加压力。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞剥离方法，其特征在于，
作为装载所述培养容器的装载台，使用形成有一个或两个以上的孔的装载台，
将附着于所述培养容器培养的所述粘附培养系细胞中的、不想要剥离的粘附培养系细胞所附着的所述培养容器的区域配置于所述孔上，推压包括配置于所述孔上的所述区域的范围，不使附着于所述区域的粘附培养系细胞剥离，而仅选择性剥离附着于所述区域以外的实施了推压的范围的粘附培养系细胞。
7.根据权利要求1所述的细胞剥离方法，其特征在于，
通过从所述培养容器内排出培养液，然后抽吸所述培养容器的空气而将所述培养容器内设为负压，由此使与所述粘附培养系细胞所附着的所述培养容器的膜的面相面对的所述培养容器的膜的面接触所述粘附培养系细胞、从而对所述粘附培养系细胞施加压力，
向所述培养容器内注入培养液，将所述粘附培养系细胞从所述培养容器剥离。
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