WO2016208526A1 - 細胞培養方法、細胞培養用治具および細胞培養装置 - Google Patents

細胞培養方法、細胞培養用治具および細胞培養装置 Download PDF

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WO2016208526A1
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culture
flexible
pressing member
flexible culture
container
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PCT/JP2016/068212
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亮 末永
郷史 田中
賢 柏原
貴彦 戸谷
恭平 太田
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure

Definitions

  • the present invention relates to cell culture using a culture vessel having flexibility, and more specifically, a cell culture method and cell capable of stably forming an aggregate of cells on the cell culture surface in the flexible culture vessel
  • the present invention relates to a culture jig and a cell culture apparatus.
  • a culture technique using a well plate suitably used in a laboratory or the like can be mentioned.
  • a cell in which one or a plurality of wells (recesses) are formed is used, and cells and a culture solution are introduced into each well to perform cell culture.
  • the wells are open to the atmosphere, there is a high risk that foreign matter will be mixed in, and there is a problem that the injection and recovery operations for each well are complicated.
  • Patent Document 3 for example, in the culture of regenerative medical stem cells such as neural stem cells, it is disclosed that cells can be efficiently cultured in large quantities by forming aggregates of cells at the initial stage of the culture. Yes.
  • a U-shaped cross-section container having a U-shaped concave section formed on one side where a cell aggregate is easily formed is used.
  • a technique is disclosed in which cell culture is continued in the flat section on the other side by rotating the.
  • Patent No. 5098471 Japanese Patent No. 5344094 Patent No. 4543212
  • the present invention is intended to use a culture vessel having flexibility, a cell culture method and a cell culture capable of culturing various cells at high quality and in large quantities at low cost.
  • An object is to realize a jig and a cell culture apparatus.
  • the cell culture method of the present invention applies pressure to the flexible culture vessel while placing the flexible culture vessel filled with cells and culture medium on the placement surface.
  • the cells in the flexible culture container are cultured in a state in which the outer surface of the flexible culture container in contact with the placement surface is deformed by application of the pressure.
  • the cell culture jig of the present invention has a mounting surface that deforms the outer surface of a flexible culture container filled with cells and a culture solution, and a facing surface.
  • a pressing lid capable of moving between a second position farther than the first position.
  • the cell culture device of the present invention includes a mounting surface that deforms an outer surface of a flexible culture container filled with cells and a culture solution, and a flexible mounting surface. And a control device that controls the deformation of the outer surface of the flexible culture container in contact with the placement surface by applying pressure to the flexible culture container after the culture container is placed.
  • the method for stirring a culture solution of the present invention includes placing a flexible culture vessel filled with cells and culture solution on the placement surface while placing the flexible culture vessel on the placement surface.
  • the pressure member is pressed with the pressing member, and the outer surface of the flexible culture container that is in contact with the placement surface is deformed by the pressing of the pressing member, and stirring is performed between the pressing member and the flexible culture container. It is characterized by inserting a member.
  • the culture medium agitation apparatus of the present invention is mounted on the mounting surface for deforming the outer surface of the flexible culture container filled with cells and the culture solution, and on the mounting surface described above.
  • a pressing member that applies pressure to the placed flexible culture vessel, a stirring member that can be inserted between the pressing member and the flexible culture vessel, and a stirring member driving device that drives the stirring member It is characterized by including these.
  • the method for stirring a culture solution of the present invention includes placing a flexible culture vessel filled with cells and culture solution on the placement surface while placing the flexible culture vessel on the placement surface.
  • the pressing member is further swung to stir the culture medium. It is characterized by performing.
  • mass culture of high-quality cells with reduced contamination risk can be achieved using a flexible culture vessel while allowing cell clumps to be formed as needed.
  • FIG. 1 shows a front view of the cell culture device 1 according to the first embodiment of the present invention
  • FIG. 2 shows a side view of the cell culture device 1.
  • the cell culture apparatus 1 includes a gantry 2 having a placement surface 2a in which one or a plurality of depressions 2b are formed, and the flexible culture vessel FP after the flexible culture vessel FP is placed on the placement surface 2a.
  • the control device 13 includes at least a control device 13 that performs control to apply a pressure to the outer surface FPs to form an uneven portion that follows the depression 2b.
  • the cell culture apparatus 1 is a flexible culture in a frame 11 adjusted to an appropriate temperature (for example, 37 ° C.), carbon dioxide concentration (for example, 5 to 10% CO 2 concentration), and humidity (for example, about 95%).
  • the cells C in the container FP are cultured.
  • the flexible culture container FP is a flexible culture container formed into a bag shape using a film-based soft packaging material as a material.
  • This flexible culture vessel FP preferably has gas permeability suitable for culturing cells C, and part or all of it is transparent so that the contents can be confirmed.
  • the flexible culture vessel FP is composed of a multilayer film having a three-layer structure of a base layer f 1 , an inner layer f 2 and an outer layer f 3 as exemplified in FIGS. 3 (a) to 3 (c), for example.
  • One or more ports FP 1 for taking in and out the culture solution and the cells C are provided.
  • Base f 1 and the inner layer f 2 is high gas permeability, and using a material having heat sealing properties, and transparency.
  • the inner layer 2 is made of a material having low cytotoxicity in addition to the above characteristics.
  • materials include linear low density polyethylene (LLDPE), very low density polyethylene (VLDPE, Very Low Density Polyethylene / ULDPE, Ultra Low Density Polyethylene), and low density polyethylene (LDPE, Low Density Polyethylene) or a polyethylene resin such as a blend thereof can be used.
  • LLDPE linear low density polyethylene
  • VLDPE very low density polyethylene
  • LDPE Very Low Density Polyethylene / ULDPE
  • LDPE Low Density Polyethylene
  • LDPE Low Density Polyethylene
  • the outer layer f 3 polyethylene resin density of 0.886g / cm 3 ⁇ 0.93g / cm 3 are preferred.
  • the outer layer f 3 may be omitted as appropriate.
  • Japanese Patent No. 5344094 may be referred to.
  • the cells C cultured in the flexible culture vessel FP there is no particular limitation on the cells C cultured in the flexible culture vessel FP, but cells that are effective in forming cell aggregates (artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells)) Neural stem cells, hepatocytes, corneal stem cells, islet cells, etc.) are particularly suitable.
  • the culture solution as a medium supplied to the flexible culture vessel FP is also appropriately selected according to the cells C to be cultured.
  • the details of each of the components attached to the cell culture apparatus 1 that performs cell culture using the flexible culture container FP filled with such cells C and culture medium will be described.
  • the gantry 2 is a plate material on which a flexible culture vessel FP, which will be described later, is placed, and is made of, for example, metal or hard resin.
  • the gantry 2 is shown in cross section for easy understanding of the structure, but actually has a plate-like outer shape.
  • the gantry 2 has a mounting surface 2a on which the flexible culture vessel FP is mounted, and a recess 2b formed in the mounting surface 2a by only one or more. ing.
  • a fixture for fixing the flexible culture vessel FP to the gantry 2 may be provided on the gantry 2.
  • a temperature control device such as a coil wire, a thermocouple, or a Peltier element may be provided on the gantry 2, and the temperature of the flexible culture vessel FP may be controlled by the temperature control device mounted on the gantry 2.
  • a vibration motor or a vibrator may be attached to the gantry 2 as a mechanism for promoting the collection of the cells C in the depression 2b and stirring the culture solution. Examples of such a vibrator include an ultrasonic vibrator, a piezo drive vibrator, and a crystal vibrator.
  • the installation location of the vibrator is not particularly limited, and examples thereof include the placement surface 2a, the recess 2b, and the back surface of the gantry 2 opposite to the placement surface 2a.
  • the mounting surface 2a has a function of deforming the outer surface of the flexible culture vessel FP.
  • the mounting surface 2a is a flat surface on the pedestal 2 on which the flexible culture vessel FP is mounted.
  • One or a plurality of depressions 2b are formed in the first and second recesses 2b.
  • the recess 2b refers to a portion that is recessed from the mounting surface 2a.
  • the recess 2b has a through-hole shape penetrating from the mounting surface 2a of the gantry 2 to the back surface on the opposite side.
  • one or a plurality of depressions 2b on the mounting surface 2a by providing one or a plurality of depressions 2b on the mounting surface 2a, one or a plurality of irregularities are formed on the mounting surface 2a.
  • the “dent” in the present invention may be any shape that has an uneven shape when an outer surface FPs (described later) of the flexible culture vessel FP protrudes from the placement surface 2 a toward the recess 2 b, and is not necessarily penetrated. Instead, it may be a recess.
  • the gantry support column 3 is a metal or a resin material that supports the gantry 2, and can accommodate the observation device 7, the stage device 12, and the like in a space inside thereof. In the present embodiment, a total of four gantry support pillars 3 support the four corners of the gantry 2.
  • the pressing member 4 is a three-dimensional member that is disposed to face the flexible culture vessel FP and has a flat bottom surface that presses the flexible culture vessel FP, for example.
  • a transparent resin such as acrylic is used in the present embodiment. It is desirable that the planar shape of the pressing member 4 is at least larger than the flexible culture vessel FP.
  • the size of the pressing member 4 is increased if a desired pressure is applied to the flexible culture vessel FP.
  • the material of the press member 4 may not be transparent resin, for example, may be comprised with the metal.
  • the above-described bottom surface of the pressing member 4 does not necessarily have to be flat.
  • a three-dimensional shape having a curved bottom surface (a convex surface protruding in the ⁇ Z direction (downward)) can be used.
  • one or a plurality of holes or the like may be provided on the bottom surface (the surface on the side facing the mounting surface 2a) of the pressing member 4.
  • the pressurizing device 5 is connected to the pressing member 4 via the piston rod 5a and the connection link 5b, and moves the pressing member 4 forward and backward with respect to the gantry 2 under the control of the control device 13 described later.
  • a known piston pump or the like can be applied as the pressurizing device 5 and the piston rod 5a.
  • the piston rod 5a is connected to the pressing member 4 through connection links 5b, one at each of the four corners of the pressing member 4, and the bottom surface of the pressing member 4 (the surface on the side facing the gantry 2). ) Can be lowered (moved in the ⁇ Z direction) while the horizontal state is maintained.
  • each piston rod 5a can be controlled independently, and its posture can be appropriately adjusted while the piston rod 5a is being lowered.
  • the number of piston rods 5a and connection links 5b for one pressing member 4 is not limited to the above-described four, and may be one set or more.
  • the pressurization apparatus 5 was described separately in the figure, the pressurization apparatus 5 may be combined as long as each piston rod 5a can be controlled independently.
  • the container connection port 6 is installed so as to be connectable to the port FP 1 of the flexible culture container FP.
  • the controller 13 controls the opening and closing of the container connection port 6, and a new culture medium is supplied to the flexible culture container FP placed on the placement surface 2 a through the tube T by this control.
  • the spent medium is collected from the flexible culture container FP via the tube T.
  • a medium supply tank 9 and a medium collection tank 10 described later are installed independently of the flexible culture container FP will be described, but the present invention is not limited thereto. That is, the culture medium supply tank and the culture medium recovery tank may be attached to the flexible culture container FP as dedicated bags, respectively, so that the dedicated bag can be replaced for each culture of the cells C.
  • the container connection port 6 is provided with an identification tag reading unit (not shown) so that the contents of the flexible culture container FP connected to the container connection port 6 can be identified.
  • an identification tag is attached to a part of the flexible culture container FP (eg, near the port FP 1 ), and the type of the cell C filled in the container and the composition of the culture solution are associated with the identification tag. It has been.
  • the control device 13 can execute an appropriate culture process such as start or stop of the culture operation based on the information read by the identification tag reading unit.
  • the culture operation referred to in this embodiment includes temperature control / humidity control around the flexible culture container FP, operation control of the pressing member 4 (adjustment of pressing force, etc.), supply and recovery of the culture medium, and the like.
  • the identification tag used in the present embodiment is not particularly limited, and a known member may be used, but a bar code, a QR code, an RF tag, an IC tag, and the like are preferable examples.
  • the observation device 7 is a device that observes the state of the cells C in the flexible culture vessel FP via an objective lens or the like, and examples thereof include an optical microscope and a fluorescence microscope equipped with a CCD or CMOS image sensor. .
  • the observation device 7 is disposed below the gantry 2 so as to be movable in a horizontal direction on a stage device 12 described later.
  • one observation device 7 is provided for one gantry 2, but the present invention is not limited to this, and a plurality of observing devices 7 may be arranged according to the position of the recess 2 b.
  • the observation device 7 may be installed.
  • the observation device 7 can also be displaced around the X-axis direction ( ⁇ X direction) and around the Y-axis direction ( ⁇ Y direction). It is adjustable. Note that the observation device 7 can capture an image of the observed region as necessary, and store the captured data in a memory (not shown) or the like.
  • the illumination device 8 is a device that emits light necessary for the observation device 7 to observe the state of the cells C in the flexible culture vessel FP.
  • the illumination device 8 is provided in a pair with the observation device 7. Yes.
  • Various known light sources may be used as the illuminating device 8.
  • the observation device 7 is a fluorescent microscope, a mercury lamp that generates excitation light is exemplified.
  • the illumination device 8 is arranged on the opposite side of the imaging device 7 with respect to the gantry 2 (mounting surface 2a).
  • the lighting device 8 may be arranged on the same side as the device 7.
  • the illumination device 8 may be movable in the horizontal direction while matching the optical axis with the imaging device 7 by a driving mechanism such as an XY stage 12 a, or the optical axis with the imaging device 7. You may provide the adjustment mechanism which adjusts.
  • the lighting device 8 may be fixedly disposed on the frame 11 or the like without moving the lighting device 8.
  • the medium supply tank 9 is a container in which a medium (such as a culture solution) necessary for culturing the cells C is stored. And the control apparatus 13 performs control which supplies the culture medium stored by this culture medium supply tank 9 to the flexible culture container FP via the tube T by controlling the valve Va and the pump P.
  • the medium supply tank 9 is equipped with a temperature control device (not shown), and the temperature inside the container is maintained at a temperature at which the freshness and quality of the medium can be maintained.
  • the medium recovery tank 10 is a container for recovering a medium that has been used for culturing cells C in the flexible culture container FP and has finished its effect.
  • the control device 13 controls the valve Va and the pump P so as to collect an unnecessary medium (culture solution) from the flexible culture vessel FP via the tube T.
  • the medium collected in the medium collection tank 10 may be discarded or supplied to the medium supply tank 9 after being subjected to appropriate processing and reused.
  • a pinch valve is used as the valve Va and a pump P is used so that the culture solution does not contact the valve Va or the pump P.
  • a peristaltic pump is preferred.
  • the frame 11 is a frame that forms an accommodation space in which the above-described members necessary for culturing the cell C such as the gantry 2 and the pressing member 4 are arranged.
  • the frame 11 of the present embodiment is formed of a metal such as stainless steel or aluminum, for example, and further includes a partition wall 11a, a side wall 11b, a front door 11c, and a back plate 11d as shown in FIGS. .
  • the partition wall 11a partitions a space in which the gantry 2 and the pressing member 4 are disposed and a space in which the culture medium supply tank 9 and the culture medium recovery tank 10 are disposed.
  • the space in which the flexible culture container FP is accommodated can be air-conditioned independently of the space in which the medium supply tank 9 and the like are disposed.
  • the front door 11c is provided with a handle OP, and an operator can open and close the front door 11c through the handle OP at an arbitrary timing.
  • the stage device 12 includes an XY stage 12a that drives the observation device 7 biaxially in a direction parallel to the placement surface 2a under the control of the control device 13.
  • a known biaxial drive mechanism such as a feed screw mechanism, a linear ball guide, a cross roller guide, or a planar motor system can be applied.
  • the stage device 12 further includes a Z stage 12 b for adjusting the focus of the observation device 7.
  • the focus may change depending on the film thickness of the flexible culture vessel FP and the degree of swelling of the concave portion described above. Therefore, the Z stage 12b for focus adjustment is particularly useful for realizing high-precision observation. It is valid.
  • a specific focus adjustment method is not particularly limited, but for example, a contrast method using image processing can be cited as a non-limiting method.
  • the Z stage 12b is disposed below the observation device 7, and moves the observation device 7 in a direction (Z direction) perpendicular to the placement surface 2a.
  • Various mechanisms such as a known screw type or air cylinder type can be applied as the Z stage 12b, and the Z stage 12b may be arranged on the XY stage 12a, or may be moved up and down in the Z direction together with the XY stage 12a.
  • the XY stage 12a and the Z stage 12b may be integrated to have a stage configuration capable of driving at least three axes.
  • the illuminating device 8 when the illuminating device 8 is also disposed below the gantry 2, the illuminating device 8 may also be driven biaxially by the stage device 12.
  • the air conditioning equipment U is a device that is installed on the back plate 11 d side and adjusts the temperature or humidity of the space in which the flexible culture vessel FP and the gantry 2 are accommodated. Therefore, in this embodiment, the air conditioning equipment U performs the air conditioning operation under the control of the control device 13 so that the optimum temperature and humidity for culturing the cells C are maintained.
  • the control device 13 is, for example, a computer including a memory in which a predetermined program is stored and a CPU having a calculation function, and has a function of controlling the above-described members to control cell C culture.
  • the control device 13 is arranged on the frame 11 for convenience, but is not limited to this example.
  • the control device 13 may be incorporated in the side plate 11b with a display, or may be in the form of a personal computer or laptop computer connected to the above-described members to be controlled via a wired or wireless connection.
  • the cell culture method of this embodiment is demonstrated using FIG.
  • the cell culture method of the present embodiment is applied to the culture vessel while placing a flexible culture vessel filled with cells and a predetermined culture solution on a placement surface having one or a plurality of depressions. This is mainly characterized by culturing the cells in the flexible culture container in a state where the pressure is applied and the outer surface of the flexible culture container in contact with the mounting surface is deformed by the application of this pressure.
  • a flexible culture vessel FP as a culture vessel is placed on the placement surface 2a of the gantry 2 (step 1).
  • the gantry 2 is formed with a recess 2b that is recessed with respect to the mounting surface 2a.
  • the outer surface FPs of the flexible culture vessel FP does not have an uneven portion that follows the recess 2b.
  • the temperature of the gantry 2 may be adjusted by adjusting the temperature of the gantry 2 in step 1 and subsequent steps.
  • the cells C in the flexible culture vessel FP are stirred (suspended) (step 2).
  • the stirring (suspension) treatment is preferably performed at the same time as the flexible culture vessel FP is placed on the placement surface 2 a or immediately before the pressurization by the pressing member 4.
  • the timing of the stirring (suspension) treatment is not limited to the above, and it is performed one or more times after the flexible culture container FP is placed on the placement surface 2a until the pressurization is started. Also good. Further, when the cell C has already been stirred (suspended) when the flexible culture vessel FP is placed on the placement surface 2a, this step 2 may be omitted.
  • the flexible culture vessel FP is pressed by using the pressing member 4 as shown in FIG. Concave and convex portions are formed on the outer surface FPs of the culture vessel FP along the depression 2b (step 3).
  • the control device 13 of the cell culture device 1 controls the pressurizing device 5 to move the pressing member 4 downward, and by this movement, the upper surface of the flexible culture container FP (opposing the pressing member 4).
  • the pressing member 4 is pressed against the surface on the side to be pressed.
  • the outer surface FPs of the flexible culture vessel FP is deformed into a shape that follows one or more irregularities by application of pressure by the pressing member 4.
  • the cells C that have diffused or floated in the flexible culture vessel FP are in the depressions (regions that have entered the recess 2b). Begins to aggregate.
  • the cells C are cultured in a state in which the concavo-convex portion following the depression 2b of the placement surface 2a is formed on the outer surface of the flexible culture vessel FP.
  • the pressurizing state of the flexible culture container FP by the pressing member 4 is allowed to stand so as to continue for a time required for all the cells to settle, for example, for several minutes to several tens of minutes. Thereby, all the cells C which have floated in the culture solution after standing are precipitated.
  • step 4 the culture of the cells C is continued while the pressurization to the flexible culture container FP by the pressing member 4 is maintained (step 4).
  • the aggregate C ′ is formed by the aggregation of the cells C in the above-described recess. Note that the size of the aggregate C ′ varies depending on the type of the cell C to be cultured, and may be appropriately determined by experiment or simulation.
  • step 3 or step 4 the pressing force by the pressing member 4 is varied based on the state of the outer surface FPs of the flexible culture container FP obtained from the observation device 7 and the degree of aggregation of the cells C. May be adjusted.
  • the observation device 7 of the present embodiment can observe the inside and the outer surface of the flexible culture container FP in a state where the pressing by the pressing member 4 is applied to the flexible culture container FP. Moreover, the observation apparatus 7 of this embodiment can observe the inside of the flexible culture container FP through the recess 2b.
  • step 5 the control device 13 of the cell culture device 1 controls the pressure device 5 to move the pressing member 4 upward, and is pressed against the upper surface of the flexible culture container FP by this movement.
  • the pressing member 4 is retracted upward.
  • the outer surface FPs in contact with the mounting surface 2a in the flexible culture vessel FP released from the pressing force is substantially parallel to the mounting surface 2a and is in a flat state.
  • the cell culture further proceeds by allowing to stand for a predetermined time in the state of step 5, and the cell culture is terminated after the predetermined time has elapsed. After the cell culture is completed, the operator completes the operation by releasing the front door 11c and taking out the flexible culture container FP from the mounting table 2a.
  • the reason for releasing the pressure (pressing force) applied during the cultivation of the cells C is as follows. That is, depending on the type of cell C to be cultured, the culture efficiency is greatly improved by forming an agglomerate, but on the other hand, there is a possibility that inconvenience may occur during the culture while the recess is maintained. More specifically, during the cultivation of cells C, a part of the medium in the container is replaced to increase freshness, or gas (carbon dioxide, oxygen, etc.) that permeates into the container is efficiently diffused in the container. It must be assumed that there is a need to make it happen.
  • the concavo-convex portions are maintained on the outer surface FPs of the flexible culture container FP, particularly when the amount of the culture medium (culture solution, etc.) is small, there is a gap between the convex portion and the surface facing the bottom surface of the container. There is a possibility that the culture medium circulation or gas diffusion may be interrupted due to the insufficiency. Therefore, in this embodiment, after the aggregate C ′ having a predetermined size is formed as shown in FIG. 5 (e), the unevenness portion of the flexible culture vessel FP is flattened to thereby improve the efficiency of the medium and gas. Circulation and diffusion were realized.
  • a new medium may be appropriately supplied from the medium supply tank 9 into the container during the above-described step 1 to step 5 or in parallel therewith, and the used medium may be supplied from the container to the medium recovery tank 10. May be recovered.
  • the observation of the cells C and their aggregates by the observation device 7 may be performed continuously between Step 1 to Step 5, or may be performed intermittently.
  • the observation device 7 may be appropriately driven by the stage device 12 to sequentially observe aggregates at a plurality of different locations in the concavo-convex portion of the flexible culture vessel FP.
  • the flexible culture container FP has a reduced risk of contamination and is easy to handle. Therefore, in this embodiment, the portable cell culture jig holding the flexible culture container FP is used. It was adopted.
  • One of the purposes of using this cell culture jig is that it can be carried by hand like conventional flasks, petri dishes, well plates, etc., but is more efficient and has less contamination risk.
  • the culture is realized. That is, the cell culture jig of this embodiment is provided with a mounting surface that deforms the outer surface of a flexible culture container filled with cells and a culture solution, and the mounting surface.
  • a first position capable of holding the flexible culture vessel between the placement surface while pressurizing the flexible culture vessel placed on the placement surface, and at least a part of the first position relative to the placement surface And a pressing lid that can move to a second position that is further away from the first position.
  • a CO 2 incubator generally used in cell culture
  • a clean bench for adding or exchanging a culture solution
  • a culture vessel It is possible to move to and from a microscope that observes the cells inside.
  • the cell culture jig 20 is opposed to the base 21, a mounting surface 22 provided on the base 21 and having one or a plurality of depressions, and the mounting surface 22.
  • the pressure lid 26 is provided.
  • the pressing lid 26 is connected to the upper lid 24 via the support column 25, and can approach or be separated from the upper lid 24 while maintaining the posture by the support column 25.
  • the upper lid 24 is connected to the base 21 via a hinge 23, and the upper lid 24 is configured to be rotatable about the hinge 23 as an axis.
  • the placement surface is first opened with the upper lid 24 opened via the hinge 23 (the pressing lid 26 is in the second position).
  • the flexible culture container FP is placed on the base plate 22 and then the upper lid 24 is closed until the upper lid 24 is locked with respect to the base 21 by a lock mechanism (not shown) (at least a part of the pressing lid 26 approaches the placement surface).
  • the first position At this time, as the upper lid 24 moves, the pressing lid 26 moves to the upper lid 24 side via the support column 25, whereby a pressing force is applied to the flexible culture vessel FP by the pressing lid 26.
  • the pressing force at this time can be generated by the mass of the pressing lid 26, or can be locked in a state where the pressing lid 26 is pressed against the flexible culture vessel FP using an unillustrated lock. Can also be generated. Then, the operator carries the cell culture jig 20 in a state where the pressing force by the pressing lid 26 is applied to the flexible culture vessel FP by hand in the CO 2 incubator, etc., in the flexible culture vessel FP. Work to cultivate cells.
  • the cell culture jig 20 of this embodiment in addition to embodiments for use in a CO 2 incubator may be used, for example, cell culture apparatus 1.
  • the gantry 2 may be omitted. In that case, the base 21 and the tip of the gantry support column 3 are connected and fixed. It is preferable that
  • the cell culture jig 30 is provided so as to face the placement surface of the lower lid 31 having a placement surface having one or a plurality of depressions, and the lower lid 31.
  • the pressing lid 33 is configured to include a parallel link 32 that connects the lower lid 31 and the pressing lid 33.
  • FIG. 2 shows an example in which only one gantry is arranged in the X direction
  • the present invention is not limited to this, and two or more may be arranged side by side.
  • a plurality of frames 11 that accommodate the gantry 2 may be arranged side by side in the height direction (Z direction).
  • the inside of the frame 11 may be divided into a plurality of sections in the height direction, and the gantry 2 and the pressing member 4 may be disposed in the separated sections.
  • Second Embodiment a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the difference between the second embodiment and the first embodiment is that the pressure applied to the flexible culture vessel FP is generated by the negative pressure source 14 via the gantry 2 ′, and the imaging device 7 ′.
  • the gantry 2 ′ of the cell culture device 1 of the present embodiment includes a mounting surface 2 ′ a and a recess 2 ′ b that is recessed downward ( ⁇ Z direction) from the mounting surface 2 ′ a. It has.
  • the dent 2′b of the present embodiment is not a through hole penetrating the mount 2 ′ in the Z direction, and is a bottomed recess with respect to the mounting surface 2′a.
  • a channel 14b is formed at the bottom of 2'b.
  • the cell culture device 1 of the present embodiment is a negative electrode that generates a suction force through the recess 2'b with respect to the flexible culture container FP placed on the placement surface 2'a of the gantry 2 '.
  • a pressure generator is provided.
  • the negative pressure generator includes a negative pressure source 14, and a pipe 14a that connects the negative pressure source 14 and the flow path 14b of the gantry 2 '.
  • the imaging device 7 ′ of the present embodiment is disposed above the gantry 2 ′ and can move in the X direction or the Y direction. It has become.
  • the illumination device 8 ′ is also arranged side by side with the imaging device 7 ′.
  • the outer surface FPs of the flexible culture container FP is sucked by using the negative pressure generator without using the pressing member, so that the outer surface FPs of the flexible culture container FP is negative pressure.
  • the negative pressure source 14 is used to make the inside of the depression 2'b a negative pressure.
  • a positive pressure source is used and the depression 2'b is passed through the flexible culture container FP. A positive pressure may be applied.
  • the third embodiment differs from the first embodiment in that the gantry 2 ′′ is made of a transparent member such as acrylic resin, and the recess 2 ′′ b of the gantry 2 ′′ is not a through hole but a bottomed recess. There are some points.
  • the observation device 7 of the present embodiment is capable of observing the medium on the mounting surface 2 ′′ a and the like. It is possible to observe floating cells C as necessary. In other words, in this embodiment, the observation apparatus 7 can observe and image all the locations of the flexible culture container FP.
  • the recess 2 ′′ b is not a through hole but a bottomed recess.
  • the present invention is not limited to this, and the shape of the recess 2 ′′ b may be a through hole. According to the third embodiment described above, it is possible to confirm whether the cells C are unevenly distributed in addition to the concave portions of the flexible culture container FP, thereby efficiently collecting the cells C in the concave portions and aggregating the aggregates. Can be formed.
  • a fourth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the difference of the fourth embodiment from the first embodiment is that the gantry 2 ′′ is made of a transparent member such as acrylic resin, and the depression 2 ′′ b of the gantry 2 ′′ is not a through hole but a bottomed recess.
  • the pressing member 4 is further deleted and the pressure adjusting device 15 is provided.
  • the pressure (atmospheric pressure) of the space SP in which the flexible culture vessel FP is disposed is increased by the pressure adjusting device 15.
  • the gantry 2 ′′ b of the present embodiment is a recess
  • the recess is a closed space when the flexible culture vessel FP is placed on the placement surface 2 ′′ a. Therefore, when the pressure of the pressure regulator 15 increases the pressure in the space SP higher than that in the closed space, an uneven portion that follows the depression 2 ′′ b is formed on the outer surface FPs of the flexible culture vessel FP. Become.
  • the flexible culture vessel FP is pressurized in a non-contact state rather than physically pressurized by the pressing member 4 or the like, so that damage to the flexible culture vessel FP is suppressed as much as possible.
  • a desired uneven part can be formed.
  • the fifth embodiment is different from the first embodiment in that this embodiment includes a culture liquid stirring device and a stirring method, and further, the flexible culture container FP pressed by the pressing member 4 and the pressing member. 4 and the like, and a stirring member driving device 17 that drives the stirring member 16 and the like.
  • the cells C in the culture solution in the flexible culture vessel FP can exist as an aggregate C ′.
  • the aggregate C ′ is formed in the flexible culture vessel FP, it is desirable to stir only the culture solution without moving the aggregate C ′ as much as possible. Therefore, in the present embodiment, the culture solution stirring apparatus and stirring method described below are employed.
  • the culture medium agitation apparatus of the present embodiment is mounted on the mounting surface that deforms the outer surface of the flexible culture container FP filled with the cells C and the culture solution, and on the mounting surface.
  • the pressing member 4 that applies pressure to the placed flexible culture vessel FP, the stirring member 16 that can be inserted between the pressing member 4 and the flexible culture vessel FP, and the stirring member 16 are driven.
  • a stirring member driving device 17 As the mounting surface, a mounting surface corresponding to the gantry (the gantry 2, the gantry 2 ′, and the gantry 2 ′′) disclosed in any of the first to fourth embodiments described above may be applied. Good.
  • the agitating member 16 has a function of being inserted between the pressing member 4 and the flexible culture vessel FP while maintaining the pressurized state of the flexible culture vessel FP by the pressing member 4.
  • a material of this stirring member 16 For example, resin materials, such as metal materials, such as stainless steel, and a plastic are applicable.
  • at least the surface of the stirring member 16 that comes into contact with the flexible culture vessel FP may be subjected to various surface treatments such as coating with a fluorine-based material or polishing treatment to reduce friction. From the viewpoint of suppressing wear due to contact between the pressing member 4 and the stirring member 16, the surface of the stirring member 16 that faces the pressing member 4 may also be subjected to the surface treatment described above. More specifically, as shown in FIG.
  • the stirring member 16 of the present embodiment a rectangular parallelepiped having a rectangular cross section and chamfered corners at four corners can be exemplified.
  • the thickness of the stirring member 16 in the Z direction is appropriately set according to the thickness of the flexible culture vessel FP, etc., but when it is excessively thick relative to the thickness of the flexible culture vessel FP, The flexible culture container FP is bitten and the aggregate C ′ is moved. Therefore, the thickness (a non-limiting example) of the stirring member 16 is preferably 3 mm or less.
  • the width in the Y direction of the stirring member 16 (a non-limiting example) is appropriately set according to the width in the Y direction of the flexible culture vessel FP, and is preferably about 5 to 10 mm, for example.
  • the length (one non-limiting example) of the stirring member 16 in the X direction is appropriately set according to the width of the flexible culture vessel FP in the X direction, and the like, for example, the X direction of the flexible culture vessel FP.
  • the width is preferably larger than
  • the stirring member driving device 17 supports the stirring member 16 and has a function of moving the stirring member 16 in the insertion direction (Y direction) between the flexible culture vessel FP and the pressing member 4.
  • Various known power mechanisms can be applied as the stirring member driving device 17, and examples thereof include a gas cylinder, a rack and pinion mechanism, a ball screw linear motion mechanism, and a linear motion mechanism using a magnet.
  • the stirring member driving device 17 of the present embodiment is mounted on one side (upper surface side) of the pressing member 4 and is installed on the other side (bottom surface side) of the pressing member 4. It is connected to the member 16. Thereby, even when the pressing member 4 moves forward and backward with respect to the gantry 2 by the pressurizing device 5, it is possible to follow the movement of the pressing member 4.
  • the stirring member drive device 17 does not necessarily need to be mounted on the pressing member 4, and may be provided, for example, on the mounting surface side.
  • an elastic member such as a spring mechanism
  • the stirring member driving device 17 may support the stirring member 16 through a known lifting mechanism such as a piston so that the stirring member 16 can be moved up and down (moved in the Z direction). Accordingly, for example, the position of the stirring member 16 in the Z direction can be adjusted independently of the movement of the pressing member 4 under the control of the control device 13.
  • the culture liquid stirring method of the present embodiment places the flexible culture container FP filled with the cells C and the culture liquid on the placement surface, and presses against the flexible culture container FP.
  • the stirring member 16 is inserted between the pressing member 4 and the flexible culture container FP in a state where the outer surface of the flexible culture container FP that is pressed by the pressure member 4 and further pressed by the pressing member 4 is deformed.
  • FIG. 11A shows the initial position of the stirring member 16.
  • the stirring member 16 4 or at an initial position corresponding to the end of the mounting surface.
  • the standby position described above is not limited to the pressing member 4 or the end portion of the placement surface, and may be, for example, the end portion of the flexible culture vessel FP as long as the internal pressure of the flexible culture vessel FP does not change. Other positions may be used.
  • the control device 13 controls the stirring member driving device 17 after a predetermined time has elapsed since the aggregate C ′ is formed in the flexible culture vessel FP. Then, control is performed to move the stirring member 16 in the insertion direction (Y direction). Thereby, the stirring member 16 is slid and inserted between the pressing member 4 and the flexible culture vessel FP in a state where the pressing to the flexible culture vessel FP by the pressing member 4 is maintained.
  • the moving speed of the stirring member 16 in the insertion direction is appropriately set according to the thickness of the flexible culture container FP, but is preferably relatively low (for example, 1 to 5 mm / sec). Further, the moving speed may be changed intermittently, for example, between 1 mm / sec and 2 mm / sec without making the moving speed of the stirring member 16 in the insertion direction constant.
  • the stirring member 16 As the stirring member 16 is inserted (moved) as described above, in the flexible culture vessel FP, the local movement of the culture solution occurs only in the vicinity of the region in contact with the stirring member 16.
  • the local movement of the culture solution transitions in the insertion direction (Y direction) as the stirring member 16 moves.
  • the movement of this culture solution is local, there is no influence on the aggregate C ′ sinking to the bottom in the flexible culture vessel FP.
  • the existing culture solution can be efficiently stirred. In other words, it is possible to gently agitate the culture solution while the aggregate C ′ is submerged in the flexible culture vessel FP.
  • the control device 13 presses the pressing member 4 so that the pressure applied to the flexible culture vessel FP is substantially constant. May be adjusted.
  • the control device 13 controls the pressing member 4 so that the internal pressure of the flexible culture vessel FP does not change before and after the stirring member 16 is inserted between the pressing member 4 and the flexible culture vessel FP.
  • the stirring member 16 a shape having a rectangular cross section and chamfering R processing at four corners is used.
  • the present invention is not limited to this.
  • a cylindrical shape extending in the X direction with a circular or elliptical cross section may be used.
  • a shape having a semicircular or semi-elliptical cross section and a flat upper surface in contact with the pressing member 4 may be used.
  • the stirring member 16 of this embodiment was arrange
  • the stirring member 16 may be disposed so as to be inclined with respect to the insertion direction of the stirring member 16. More specifically, as shown in FIG. 13A, the stirring member 16 has a shape in which the center in the X direction protrudes to the Y direction side (also referred to as a “boomerang shape” or a “bow shape”). It may be. As a result, it is possible to reduce the friction generated between the stirring member 16 and the flexible culture vessel FP. Furthermore, as shown in FIG.
  • the stirring member 16 may be inclined with respect to the X direction even if the stirring member drive devices 17 disposed on both sides of the pressing member 4 are displaced in the Y direction. Good. Also with this configuration, it is possible to reduce the friction generated with the flexible culture vessel FP as the stirring member 16 is inserted.
  • the culture medium agitation apparatus in the present embodiment described above may be incorporated in the above-described cell culture apparatus, for example.
  • the stirring method of the culture solution in this embodiment may be incorporated into the above-described cell culture method, for example.
  • the stirring member 16 is placed between the pressing member 4 and the flexible culture vessel FP in a state where the outer surface of the flexible culture vessel FP that contacts the placement surface is deformed by the pressing of the pressing member 4.
  • the present invention is not limited to this embodiment. That is, for example, in the state where the outer surface of the flexible culture vessel FP on the placement surface side is deformed without using the pressing member 4 as in the second embodiment or the fourth embodiment, the upper surface of the flexible culture vessel FP is formed.
  • the stirring member 16 may be slid and moved. In other words, the stirring member 16 is moved to slide at least on the upper surface of the flexible culture vessel FP in a state where the outer surface on the mounting surface side of the flexible culture vessel FP is deformed by applying an external force. May be.
  • FIG. 14 is a front view showing a modification of the cell culture device 1 applicable to each of the above embodiments.
  • the control device 13 of the cell culture device 1 according to this modification has a function of controlling the pressurizing device 5 to rotate the pressing member 4 around the X axis. More specifically, the control device 13 of the present modification displaces the posture of the pressing member 4 by shifting the period of the advance / retreat operation by the pressurizing devices 5 a and 5 b connected to the pressing member 4. And the control apparatus 13 controls the pressurization apparatus 5 and maintains a press after giving a pressing force using the pressing member 4 with respect to the flexible culture container FP mounted in the mounting surface of the mount frame 2. However, control is performed to rotate (swing) the pressing member 4 around the X axis within a minute range.
  • the culture medium in the flexible culture container FP is agitated by swinging the pressing member 4 around the X axis, so that the culture medium and permeate gas in the flexible culture container are effective.
  • the pressing member 4 is swung around the X axis.
  • the pressing member 4 may be swung around the Y axis, or around any axis other than the X axis and the Y axis. May be swung.
  • the first modification it is possible to cause a large movement of the culture solution in the flexible culture vessel FP even with a relatively small inclination by the pressing member 4. Therefore, it can be said that this modified example 1 is suitable when stirring (suspension) strong enough to wind up the cells C in the flexible culture vessel FP is performed. That is, the first modification is not limited to the cell culture device, but is effective as a culture solution stirring method and stirring device. Such a stirring method of the culture solution is such that the flexible culture vessel FP filled with the cells C and the culture solution is placed on the placement surface, and the flexible culture vessel FP is pressed with the pressing member 4.
  • the culture medium agitating device includes a mounting surface that deforms the outer surface of the flexible culture container FP filled with the cells C and the culture liquid, and a flexible culture container that is mounted on the mounting surface.
  • FIG. 15 is a perspective view and a cross-sectional view showing a gantry of the cell culture device in Modification 2.
  • the gantry 2? Of this modification has a mounting surface 2? A and a depression 2? B formed by a tapered surface 2? C.
  • the tapered surface 2? C is provided such that the diameter gradually increases toward the placement surface 2? A.
  • the boundary between the mounting surface 2? A and the depression 2? B becomes obtuse due to the tapered surface 2? C, so that the flexible culture vessel FP is placed on the gantry 2 ?. Inadvertent damage or the like is suppressed.
  • the mounting surface that deforms the outer surface of the flexible culture vessel is configured by providing one or a plurality of depressions (through holes or recesses) on the mounting surface, but the present invention is not limited thereto.
  • a form in which a plurality of protrusions such as short pins
  • a mesh pattern member such as a wire mesh
  • the present invention can be suitably used particularly in the case of mass culture while forming a condensed mass of cells in the process of cell culture.

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Abstract

【課題】可撓性を有する培養容器を用い、必要に応じて細胞の凝集塊を形成可能としつつコンタミネーションリスクが抑制された細胞の大量培養手法を提供する。 【解決手段】１又は複数の窪みを有する載置面に細胞と培養液とが充填された可撓性を有する培養容器を載置しつつ前記培養容器に対して圧力を印加し、前記圧力の印加によって前記窪みに倣った凹凸部を前記培養容器の外面に形成した状態で、前記培養容器内の細胞を培養する。

Description

細胞培養方法、細胞培養用治具および細胞培養装置
　本発明は、可撓性を有する培養容器を用いた細胞培養に関し、より具体的には可撓性培養容器内の細胞培養面に安定して細胞の凝集塊を形成可能な細胞培養方法、細胞培養用治具および細胞培養装置に関する。
　遺伝子治療や再生医療に代表される近代医療分野では、目的とする細胞や組織などを人工的な環境下で培養することが行われている。例えば現時点における細胞培養の手法としては、次に挙げる技術が知られている。
　まず第１の手法としては、実験室などで好適に用いられるウェルプレートを用いた培養手法が挙げられる。この手法では、１又は複数個のウェル（凹部）が形成されたプレートを用い、細胞と培養液とを個々のウェル内に導入して細胞培養が行われる。しかしながらこの第１の手法においては、ウェルが大気解放されているため異物が混入するリスクが高く、さらにはウェル毎の注入、回収動作が煩雑であるといった課題がある。
　これに対し密閉性を改善させた第２の手法として、特許文献１に例示される如き密閉型トレイ容器も存在する。この手法では、細胞及び培養液を導入する凹部を有するトレイの上面がフィルムで封止される。したがってこの第２の手法によれば第１の手法に比して密閉性が改善されることで上記したコンタミネーションリスクが抑制される。
　しかしながら第２の手法であっても、培養液の出し入れの際には空気の出し入れを伴うため依然としてコンタミネーションリスクは高いと言える。さらに凹部を備えた培養容器として立体形状となるため、かさばってしまい取扱いが容易とは言えない。
　このように現在の細胞培養の多くは凹部やウェルといった固形の底に細胞を集めて培養を行うものであるが、再生医療などの急速な進歩から近年では細胞の大量培養が求められている。
　かような要求に応える大量培養の手法として、例えば特許文献２に例示される如きガス透過性のある可撓性培養容器を用いて閉鎖系で自動的に細胞の大量培養を行う手法が開発されている。この可撓性培養容器は比較的大きなサイズで製造することが可能であるので細胞の大量培養が可能であり、さらには閉鎖系であるために培養期間中における異物（菌やウイルスなど）のコンタミネーションリスクを低減できるというメリットもあり好ましい。
　一方で、例えば特許文献３に示されるごとく、神経幹細胞などの再生医療用幹細胞の培養においては、その培養初期に細胞の凝集塊を形成することで効率よく細胞が大量培養できる旨が開示されている。
　そしてこの特許文献３の手法では、細胞の凝集塊が形成されやすい断面Ｕ字型の凹部が一側に形成された断面Ｕ字型容器を用い、この凹部で細胞の凝集塊を形成した後に容器を回転させることで他側の断面平型部で細胞培養を継続する技術が開示されている。
特許第５０９８４７１号 特許第５３４４０９４号 特許第４５４３２１２号
　しかしながら、上記したウェルプレート、密閉型トレイ容器及び断面Ｕ字型容器のいずれもその取扱いには熟練を要し、作業者の熟練度に依って培養された細胞の品質がばらつくという課題がある。また、作業者が介在しなければならないという点でそもそも大量生産には極めて不向きであり、操作ミスやコンタミネーションリスクが依然として高い点においても課題は大きい。
　一方で可撓性培養容器を用いた培養手法を用いれば上記したリスクは概ね解消することが出来るのであるが、例えば神経幹細胞などの再生医療用幹細胞などの大量培養を如何にして行うかについてはまだまだ発展の余地がある。
　本発明は上記した課題を一例として解決することを鑑み、その趣意は可撓性を有する培養容器を用いて、種々の細胞を安価に高品質で且つ大量に培養可能な細胞培養方法、細胞培養用治具及び細胞培養装置を実現することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して圧力を印加し、前記圧力の印加によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、前記可撓性培養容器内の細胞を培養することを特徴とする。
　また、上記目的を達成するため、本発明の細胞培養用治具は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、前記載置面に対向して設けられ、前記可撓性培養容器を加圧しながら前記載置面との間で当該可撓性培養容器を保持可能な第１の位置と、少なくともその一部が前記載置面に対して前記第１の位置よりも離れた第２の位置とを移動可能な押圧蓋と、を含むことを特徴とする。
　また、上記目的を達成するため、本発明の細胞培養装置は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、前記載置面に可撓性培養容器が載置された後に、前記可撓性培養容器に圧力を印加して前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させる制御を行う制御装置と、を含むことを特徴とする。
　また、上記目的を達成するため、本発明の培養液の撹拌方法は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して押圧部材で押圧し、前記押圧部材の押圧によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、前記押圧部材と前記可撓性培養容器との間に撹拌部材を挿通させることを特徴とする。
　また、上記目的を達成するため、本発明の培養液の撹拌装置は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、前記載置面に載置された前記可撓性培養容器に対して圧力を印加する押圧部材と、前記押圧部材と前記可撓性培養容器の間を挿通可能な撹拌部材と、前記撹拌部材を駆動する撹拌部材駆動装置と、を含むことを特徴とする。
　また、上記目的を達成するため、本発明の培養液の撹拌方法は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して押圧部材で押圧し、前記押圧部材の押圧によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、さらに前記押圧部材を揺動させて前記培養液の撹拌を行うことを特徴とする。
　本発明によれば、可撓性を有する培養容器を用いて、細胞の凝集塊を必要に応じて形成可能としつつ、コンタミネーションリスクが抑制された高品質な細胞の大量培養が可能となる。
第１実施形態における細胞培養装置の正面図である。 第１実施形態における細胞培養装置の側面図である。 第１実施形態で用いられる可撓性培養容器を示す図である。 第１実施形態における細胞培養装置のうち架台の詳細を示す斜視図である。 第１実施形態における細胞培養方法を示すフロー図である。 第１実施形態で適用可能な細胞培養用治具を示す斜視図である。 第２実施形態における細胞培養装置の正面図である。 第３実施形態における細胞培養装置の正面図である。 第４実施形態における細胞培養装置の正面図である。 第５実施形態における培養液の撹拌装置および細胞培養装置の正面図である。 第５実施形態における撹拌方法を説明する状態遷移図である。 第５実施形態における撹拌部材１６の変形例を示す図である。 第５実施形態における撹拌部材１６の他の変形例を示す図である。 変形例１における細胞培養装置の正面図である。 変形例２における細胞培養装置の架台を示す斜視図及び断面図である。
　以下、適宜図面を参照しつつ本発明の細胞培養方法、細胞培養用治具および細胞培養装置について具体的に説明する。なお、説明の便宜上、以下の記載においてＸ方向、Ｙ方向、およびＺ方向をそれぞれ規定したが、本発明の権利範囲を意図的に限定又は減縮するものでない。
≪第一実施形態≫
　まず本発明の第一実施形態について、図１～６を参照しつつ説明する。
［細胞培養装置］
　図１は本発明の第一実施形態にかかる細胞培養装置１の正面図を示し、図２は同細胞培養装置１の側面図を示している。
　細胞培養装置１は、１又は複数の窪み２ｂが形成された載置面２ａを有する架台２と、この載置面２ａに可撓性培養容器ＦＰが載置された後に可撓性培養容器ＦＰに圧力を印加してその外面ＦＰｓに窪み２ｂに倣った凹凸部を形成する制御を行う制御装置１３を少なくとも含んで構成される。この細胞培養装置１は、適切な温度（例えば３７℃）、炭酸ガス濃度（例えば５～１０％ＣＯ２濃度）、及び湿度（例えば約９５％）に調整されたフレーム１１内において可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃを培養するものである。
　ここで可撓性培養容器ＦＰとは、フィルムベースの軟包材を材料として袋状に形成された可撓性を有する培養容器のことである。この可撓性培養容器ＦＰは、細胞Ｃの培養に好適なガス透過性を有し、かつ内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有していることが好ましい。
　可撓性培養容器ＦＰは、例えば図３（ａ）～（ｃ）に例示されるとおり、基層ｆ１、内層ｆ２および外層ｆ３の３層構造の多層フィルムで構成されるとともに、公知の培養液及び細胞Ｃの出し入れなどを行うためのポートＦＰ１が１又は２以上備えられている。
　基材ｆ１及び内層ｆ２は、高ガス透過性、ヒートシール性、及び透明性を備えた材料を用いて構成される。また、内層２は上記特性に加え、低細胞毒性を備える材料で構成される。このような材料としては、例えば直鎖状低密度ポリエチレン（LLDPE，Linear　Low　Density　Polyethylene）や、超低密度ポリエチレン（VLDPE，Very　Low　Density　Polyethylene／ULDPE，Ultra　Low　Density　Polyethylene）、低密度ポリエチレン（LDPE,　Low　Density　Polyethylene）、あるいはこれらのブレンドなどのポリエチレン系樹脂を用いることができる。
　また、外層ｆ３としては密度０．８８６ｇ／ｃｍ３～０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂が好適である。なお、外層ｆ３は適宜省略してもよい。
　なお、本実施形態に好適な可撓性培養容器ＦＰのより詳細な構造は、例えば特許第５３４４０９４号などを参照してもよい。
　可撓性培養容器ＦＰ内で培養される細胞Ｃに特に制限はないが、細胞の凝集塊を形成することが有効な細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、神経幹細胞、肝細胞、角膜幹細胞、及び膵島細胞など）が特に好適である。
　また可撓性培養容器ＦＰに供給される培地としての培養液も、培養する細胞Ｃに応じて適宜選択される。
　以下、かような細胞Ｃ及び培養液が充填された可撓性培養容器ＦＰを用いて細胞培養を行う細胞培養装置１につき、更に付属する各構成の詳細を説明する。
　架台２は、後述する可撓性培養容器ＦＰが載置される板材であり、例えば金属や硬質樹脂などから形成されている。なお、図１などにおいては、構造の理解を容易にするために架台２は断面で示されているが、実際は板状の外形を有している。この架台２は、図４に示されるように、可撓性培養容器ＦＰが載置される載置面２ａと、この載置面２ａ内において１又は複数だけ形成される窪み２ｂとを有している。また、架台２に、例えば可撓性培養容器ＦＰを架台２に固定するための固定具などを設けてもよい。さらに、架台２に、コイル線や熱電対あるいはペルチェ素子などの温調装置を設け、この架台２に搭載された温調装置によって可撓性培養容器ＦＰの温調を行ってもよい。さらに、架台２に、細胞Ｃが窪み２ｂに集まることを助長したり、培養液を攪拌するための機構として、例えば振動モータや振動子などを付けても良い。かような振動子としては、例えば超音波振動子、ピエゾ駆動型振動子、水晶振動子などが挙げられる。また、この振動子の設置個所としては特に制限はないが、例えば載置面２ａ上や窪み２ｂ内、あるいは架台２の載置面２ａとは反対側の裏面などが挙げられる。
　載置面２ａは、可撓性培養容器ＦＰの外面に変形を与える機能を有し、架台２のうち可撓性培養容器ＦＰが載置される平坦な面であるとともに、この平坦な面内に１または複数の窪み２ｂが形成されている。
　窪み２ｂは、載置面２ａから窪んだ部位をいい、本実施形態においては架台２の載置面２ａから反対側の背面にかけて貫通した貫通孔の形状を備えている。このように載置面２ａにおいて窪み２ｂが１又は複数設けられることで、この載置面２ａには１又は複数の凹凸が形成されることになる。なお、本発明でいう「窪み」は、可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓ（後述）が載置面２ａから窪み２ｂ側に突出することで凹凸状になる形状であればよく、必ずしも貫通させずに凹部となっていてもよい。
　架台支持柱３は、架台２を支持する金属または樹脂材であり、その内側の空間に観察装置７およびステージ装置１２などを収容可能である。本実施形態では、架台２の四隅を計４本の架台支持柱３が支持する形態となっている。
　押圧部材４は、可撓性培養容器ＦＰに対向して配置され、可撓性培養容器ＦＰを押圧する底面が例えば平面である立体形状の部材である。この押圧部材４の材質としては、本実施形態ではアクリルなどの透明な樹脂が用いられている。押圧部材４の平面形状は、少なくとも可撓性培養容器ＦＰより大きいことが望ましいが、可撓性培養容器ＦＰより小さくても可撓性培養容器ＦＰに所望の圧力がかけられれば大きさなどに特に制限はない。なお、後述する照明装置８が不要であれば、押圧部材４の材質は透明な樹脂でなくともよく、例えば金属で構成されていてもよい。
　なお、押圧部材４の上述した底面は平らである必要は必ずしもなく、例えば底面が曲面（－Ｚ方向（下方）に出っ張った凸面）である立体形状のものを用いることもできる。また、可撓性培養容器ＦＰ内のガス交換を促進するため、押圧部材４の底面（載置面２ａと対向する側の面）には１又は複数の穴などが設けられていてもよい。
　加圧装置５は、ピストンロッド５ａおよび接続リンク５ｂを介して押圧部材４と接続され、後述する制御装置１３の制御の下で押圧部材４を架台２に対して進退させる。加圧装置５およびピストンロッド５ａとしては公知のピストンポンプなどが適用可能である。
　なお、本実施形態では、押圧部材４の概ね四隅に１本ずつピストンロッド５ａが接続リンク５ｂを介して押圧部材４と接続されており、押圧部材４の底面（架台２と対向する側の面）が水平状態を維持したまま当該押圧部材４を下降（－Ｚ方向へ移動）させることが可能となっている。また、後述するとおり、各々のピストンロッド５ａは独立して制御させることが可能となっており、ピストンロッド５ａの下降中に適宜その姿勢を調整することが可能となっている。
　なお、１つの押圧部材４に対するピストンロッド５ａおよび接続リンク５ｂの数は上記した４つに限られず、１セット以上あればよい。また、図示では加圧装置５は別個に記載したが、各ピストンロッド５ａを独立して制御可能であれば加圧装置５は兼用されていてもよい。
　容器接続口６は、可撓性培養容器ＦＰのポートＦＰ１と接続可能に設置されている。本実施形態では制御装置１３により容器接続口６の開閉が制御され、この制御によって載置面２ａに載置された可撓性培養容器ＦＰにはチューブＴ経由で新たな培地が供給されるとともに、使用済の培地が可撓性培養容器ＦＰからチューブＴ経由で回収される。
　なお、以下では、後述する培地供給タンク９や培地回収タンク１０が可撓性培養容器ＦＰとは独立して設置される例を説明するが、これに限られない。すなわち、培地供給タンクおよび培地回収タンクはそれぞれ専用バッグとして可撓性培養容器ＦＰに付属させて、細胞Ｃの一回の培養毎に専用バッグごと交換可能とされていてもよい。
　なお、本実施形態では、容器接続口６には識別タグ読取部（不図示）が設けられており、容器接続口６と接続される可撓性培養容器ＦＰの内容が識別可能となっている。すなわち可撓性培養容器ＦＰの一部（ポートＦＰ１付近など）には識別タグが添付されており、容器内に充填された細胞Ｃの種別や培養液の組成などが当該識別タグに紐づけられている。これにより、例えば制御装置１３は識別タグ読取部で読み取られた情報に基づいて培養動作の開始や停止など適切な培養処理を実行することが可能となる。なお本実施形態でいう培養動作とは、可撓性培養容器ＦＰ周りの調温・調湿、押圧部材４の動作制御（押圧力の調整など）、培地の供給や回収などが含まれる。また、本実施形態で用いる識別タグに特に制限はなく公知の部材を用いてもよいが、バーコードやＱＲコードさらにはＲＦタグやＩＣタグなどが好適な例である。
　観察装置７は、対物レンズなどを介して可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃの状態を観察する装置であり、例えば光学顕微鏡、ＣＣＤやＣＭＯＳイメージセンサーが搭載された蛍光顕微鏡などが例示される。この観察装置７は、後述するステージ装置１２上で水平方向に移動可能なように架台２の下方に配置されている。なお本実施形態では１つの架台２に対して１つの観察装置７が設けられているが、これに限られずに窪み２ｂの位置に応じて複数配置される形態など１つの架台２に対して複数の観察装置７を設置してもよい。また、観察装置７は水平方向に移動可能であることに加えてＸ軸方向周り（θＸ方向）およびＹ軸方向周り（θＹ方向）にも変位可能であり、観察時の観察装置７の姿勢が調整可能となっている。なお、観察装置７は、必要に応じて観察した領域を撮像し、この撮像したデータを不図示のメモリなどに記憶することが可能となっている。
　照明装置８は、観察装置７が可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃの状態を観察するときに必要な光を発する装置であり、本実施形態では観察装置７と対となって設けられている。なお照明装置８としては公知の種々の光源を用いてよいが、例えば観察装置７が蛍光顕微鏡である場合には励起光を発生させる水銀ランプなどが例示される。なお本実施形態では架台２（載置面２ａ）に対して撮像装置７と反対側に照明装置８が配置されているが、これに限られずに架台２（載置面２ａ）に対して撮像装置７と同じ側に照明装置８が配置されていても良い。また、図１に示されるように、照明装置８をＸＹステージ１２ａなどの駆動機構により撮像装置７との光軸を一致させながら水平方向に移動可能としてもよいし、撮像装置７との光軸を調整する調整機構を備えていてもよい。あるいは、照明装置８は移動させずに、１又は複数の照明装置８をフレーム１１上などに固定配置してもよい。
　培地供給タンク９は、細胞Ｃの培養に必要な培地（培養液など）が貯留される容器である。そして制御装置１３は、バルブＶａおよびポンプＰを制御することでチューブＴを介してこの培地供給タンク９に貯留された培地を可撓性培養容器ＦＰへ供給する制御を行う。なお、培地供給タンク９には不図示の温調装置が搭載されており、この温調装置によって容器内が培地の鮮度や品質を維持できる温度に維持されている。
　培地回収タンク１０は、可撓性培養容器ＦＰで細胞Ｃの培養に用いられて効用を終えた培地を回収するための容器である。制御装置１３は、バルブＶａおよびポンプＰを制御することでチューブＴを介して可撓性培養容器ＦＰから不要な培地（培養液）を回収する制御を行う。なお、培地回収タンク１０に回収された培地は、廃棄されるか、又は適切な処理を経た後に培地供給タンク９に供給され再利用が為されてもよい。
　また、培地供給タンク９および培地回収タンク１０が上述した専用バッグの形態である場合には、バルブＶａやポンプＰに培養液が接触しないように、バルブＶａとしてはピンチバルブが、ポンプＰとしてはペリスタポンプがそれぞれ好適となる。
　フレーム１１は、架台２や押圧部材４など細胞Ｃの培養に必要な上記各部材が配置される収容空間を形成する枠体である。本実施形態のフレーム１１は、例えばステンレスやアルミなどの金属で形成されてなり、図１および図２に示すとおり隔壁１１ａ、側壁１１ｂ、正面扉１１ｃおよび背面板１１ｄを更に含んで構成されている。このうち隔壁１１ａは、架台２や押圧部材４が配置される空間と、培地供給タンク９および培地回収タンク１０が配置される空間とを区画する。したがって本実施形態では可撓性培養容器ＦＰが収容される空間は、培地供給タンク９などが配置される空間とは独立して空調制御することが可能となっている。また、正面扉１１ｃには取っ手ＯＰが設けられ、作業者は任意のタイミングで取っ手ＯＰを介して正面扉１１ｃを開閉させることが可能となっている。
　ステージ装置１２は、制御装置１３の制御の下で、上記した観察装置７を載置面２ａと平行な方向に二軸駆動させるＸＹステージ１２ａを含む。このＸＹステージ１２ａとしては、例えば送りねじ機構やリニアボールガイド、クロスローラーガイド、平面モータシステムなど公知の二軸駆動機構が適用可能である。
　また、ステージ装置１２は、観察装置７の焦点を調整するためのＺステージ１２ｂをさらに含んで構成されている。本実施形態では可撓性培養容器ＦＰのフィルム厚や上述した凹部の膨らみ度合いによって焦点が変化する可能性もあるので、焦点調整用のＺステージ１２ｂは高精度な観察を実現するためには特に有効である。なお、具体的な焦点の調整手法に特に制限はないが、例えば画像処理を用いたコントラスト方式が非制限的な手法として挙げられる。このＺステージ１２ｂは、観察装置７の下方に配置され、観察装置７を載置面２ａと垂直な方向（Ｚ方向）に移動させる。Ｚステージ１２ｂとしては、公知のネジ式やエアシリンダ式など種々の機構が適用可能であり、ＸＹステージ１２ａ上に配置されてもよいし、ＸＹステージ１２ａごとＺ方向に上下動させてもよい。また、ＸＹステージ１２ａとＺステージ１２ｂとを一体化して少なくとも３軸駆動が可能なステージ構成としてもよい。
　なお、上記したとおり、照明装置８も架台２の下方に配置する場合には、この照明装置８もステージ装置１２で二軸駆動してもよい。
　空調設備Ｕは、図２に示すとおり、背面板１１ｄ側に設置されており、可撓性培養容器ＦＰや架台２が収容される空間の温度または湿度の調整を行う装置である。したがって本実施形態では、空調設備Ｕは、制御装置１３の制御の下で、細胞Ｃの培養に最適な温度および湿度が維持されるように空調動作を実行する。
　制御装置１３は、例えば所定のプログラムが保存されたメモリや演算機能を有するＣＰＵを備えたコンピュータであり、上記した各部材の制御を行って細胞Ｃの培養を統括する機能を備えている。
　なお、図示では制御装置１３はフレーム１１上に便宜的に配置したが、この例に限られない。例えばディスプレイを伴って側面板１１ｂに制御装置１３が組み込まれた形態でもよいし、制御対象の上記各部材と有線又は無線を介して接続されたパーソナルコンピュータやラップトップコンピュータの形態でもよい。
［細胞培養方法］
　次に図５を用いて本実施形態の細胞培養方法について説明する。
　ここで、本実施形態の細胞培養方法は、１又は複数の窪みを有する載置面に細胞と所定の培養液とが充填された可撓性を有する培養容器を載置しながら培養容器に対して圧力を印加し、この圧力の印加によって載置面と接する可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、可撓性培養容器内の細胞を培養することなどに主として特徴がある。
　すなわち、まず図５（ａ）に示されるように、培養容器としての可撓性培養容器ＦＰが架台２の載置面２ａに載置される（ステップ１）。架台２は載置面２ａに対して陥没した窪み２ｂが形成されているが、この状態のままでは可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓは窪み２ｂに倣った凹凸部が形成されていない。
　なお、架台２に温調装置が搭載されている場合には、このステップ１以降において架台２を温調することで可撓性培養容器ＦＰ内の培地温度などを調整することとしてもよい。
　続いて図５（ｂ）に示されるように、可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃを撹拌（懸濁）させる（ステップ２）。このように可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃを攪拌（懸濁）することで、後の工程において各凹部に入る細胞Ｃの数がおおよそ均一化することが可能となる。撹拌（懸濁）処理は、可撓性培養容器ＦＰが載置面２ａに載置されるのと同時か、あるいは押圧部材４による加圧の直前に行うことが好ましい。しかしながら撹拌（懸濁）処理のタイミングは上記に限定されず、可撓性培養容器ＦＰが載置面２ａに載置されてから加圧が開始されるまでの間で１又は複数回実施されてもよい。また、可撓性培養容器ＦＰが載置面２ａに載置された時点で既に細胞Ｃが撹拌（懸濁）されている場合には、このステップ２は省略してもよい。
　載置面２ａに可撓性培養容器ＦＰが載置された後は、図５（ｃ）に示されるように、押圧部材４を用いて可撓性培養容器ＦＰを押圧することで可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓに窪み２ｂに倣った凹凸部を形成する（ステップ３）。換言すれば、細胞培養装置１の制御装置１３は、加圧装置５を制御して押圧部材４を下方に移動させ、この移動によって可撓性培養容器ＦＰのうちの上面（押圧部材４と対向する側の面）に押圧部材４が押し当てられる。可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓは、この押圧部材４による圧力の印加によって１又は複数の凹凸に倣った形状に変形する。
　そして押圧部材４によって可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓに凹凸部が形成されると、可撓性培養容器ＦＰ内に拡散又は浮遊していた細胞Ｃは凹部（窪み２ｂに入り込んだ領域）内で凝集し始める。このように本実施形態では、載置面２ａの窪み２ｂに倣った凹凸部を可撓性培養容器ＦＰの外面に形成した状態で細胞Ｃが培養されることになる。押圧部材４による可撓性培養容器ＦＰへの加圧状態は、細胞が全て沈殿するのに要する時間、例えば数分～数十分間だけ継続されるようにして静置される。これにより、静置後には培養液中を浮遊していた細胞Ｃはすべて沈殿される。
　そして図５（ｄ）に示されるように、押圧部材４による可撓性培養容器ＦＰへの加圧が維持されたまま細胞Ｃの培養が継続される（ステップ４）。このステップ４では、上述した凹部内で細胞Ｃの凝集が進行することで凝集塊Ｃ´が形成される。なお、凝集塊Ｃ´をどの程度の大きさとするかは、培養する細胞Ｃの種類に応じて様々であるので、実験やシミュレーションによって適宜決定してもよい。
　なお、このステップ３又はステップ４においては、観察装置７から得られる可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓの状態や細胞Ｃの凝集度合などに基づいて、押圧部材４による押圧力を可変するなどして調整されるようにしてもよい。このように、本実施形態の観察装置７は、押圧部材４による押圧が可撓性培養容器ＦＰに印加された状態でこの可撓性培養容器ＦＰの内部や外面を観察可能となっている。また、本実施形態の観察装置７は、窪み２ｂを介して可撓性培養容器ＦＰの内部を観察することが可能となっている。
　そして上記した凹部内で細胞Ｃの凝集塊が形成されて所定の時間が経過した後、図５（ｅ）に示されるように、細胞Ｃの培養中に押圧部材４の押圧を解放することによって可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓに形成された凹凸部を平坦化する（ステップ５）。換言すれば、細胞培養装置１の制御装置１３は、加圧装置５を制御して押圧部材４を上方に移動させ、この移動によって可撓性培養容器ＦＰのうちの上面に押し当てられていた押圧部材４が上方へ退避する。これにより、押圧力から解放された可撓性培養容器ＦＰのうち載置面２ａと接する外面ＦＰｓは載置面２ａにほぼ平行で平らな状態となるので、細胞培養に使用される領域（面積）を拡大することができる。
　なお、このステップ５の状態で所定時間だけ静置することで細胞の培養が更に進行し、所定時間経過後に細胞の培養が終了する。細胞の培養が終了した後で、作業者は、正面扉１１ｃを解放して載置台２ａから可撓性培養容器ＦＰを取り出すことで作業を完結させる。
　ここで、細胞Ｃの培養中に印加した圧力（押圧力）を解放する理由は、次のとおりである。
　すなわち、培養する細胞Ｃの種類によっては凝集塊を形成したほうが培養効率は大きく向上するものの、一方で凹部を維持したままでは培養中に不都合が生じてしまう可能性も想定できる。
　より具体的には、細胞Ｃの培養中には、容器内の一部の培地を交換して鮮度を高めたり、容器内へ透過するガス（二酸化炭素や酸素など）を効率よく容器内で拡散させる必要も生ずることを想定せねばならない。しかしながら可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓに凹凸部が維持されたままであると、特に培地（培養液など）の量が少ない場合には、凸部において容器の底面と対向する面との間隙が充分に確保できず、培地の循環やガスの拡散などが途絶えてしまう恐れも考えられる。
　よって本実施形態では、図５（ｅ）のごとく所定の大きさの凝集塊Ｃ´が形成された後は、可撓性培養容器ＦＰの上記凹凸部を平坦化することで培地やガスの効率的な循環や拡散が実現されるようにした。
　なお、本手法を用いずに培地やガスの効率的な循環や拡散を実現しようとする場合には、例えば大きな容器へ凝集塊Ｃ´を移し替えることが考えられるが、以下に述べるような様々なリスクが伴う。すなわち、面積の大きな容器に凝集塊Ｃ´を移し替える作業を行う場合にはピペットなどを用いる必要があり、これにより培養液が強く攪拌されてしまうことで凝集塊Ｃ´が崩れてしまうことや、個々の細胞Ｃに剪断力などの物理的ストレスがかかってその後の培養に悪影響を及ぼすことなど様々なリスクが発生する。
しかしながら本実施形態のごとき方法を用いれば、押圧部材４による加圧を除荷するだけで、上記で述べたリスクは伴わずに実質的に大きな容器へ凝集塊Ｃ´を移し替えたに匹敵する効果を享受することが可能となる。
　なお、上記したステップ１～ステップ５の間もしくはこれに並行して、新たな培地が培地供給タンク９から容器内へ適宜供給されてもよいし、容器内から使用済の培地が培地回収タンク１０に回収されてもよい。
　また、観察装置７による細胞Ｃやその凝集塊などの観察は、ステップ１～ステップ５の間で連続して行われてもよいし、断続的に行われてもよい。また、観察装置７をステージ装置１２で適宜駆動させることにより、可撓性培養容器ＦＰの凹凸部のうち異なる複数の箇所の凝集塊などを順次観察してもよい。
［細胞培養用治具］
　上記したとおり、可撓性培養容器ＦＰはコンタミネーションのリスクが抑制されておりその取扱いが容易であるので、本実施形態ではこの可撓性培養容器ＦＰを保持する可搬性の細胞培養用治具を採用した。この細胞培養用治具を用いる目的の１つは、従来のフラスコやシャーレあるいはウェルプレートなどと同様に手で持ち運びが可能な利点は踏襲しつつ、更に効率的でコンタミリスクの少ない態様で細胞の培養を行うことを実現するものである。
　すなわち、本実施形態の細胞培養用治具は、細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、この載置面に対向して設けられ、載置面に載置される可撓性培養容器を加圧しながら載置面との間で当該可撓性培養容器を保持可能な第１の位置と、少なくともその一部がこの載置面に対して第１の位置よりも離れた第２の位置とを移動可能な押圧蓋と、を含むことを主な特徴としている。
　この細胞培養用治具によれば、可撓性培養容器ＦＰを保持した状態で、例えば一般的に細胞培養で用いられるＣＯ２インキュベータと、培養液の追加や交換を行うクリーンベンチと、培養容器内の細胞の観察を行う顕微鏡との間の移動を行うことなどが可能となる。
　具体的には、図６に示すとおり、本実施形態では細胞培養用治具２０と細胞培養用治具３０の二種類の治具のいずれかが好適に用いられる。
　細胞培養用治具２０は、図６（ａ）に示されるとおり、ベース２１と、ベース２１上に設けられて１又は複数の窪みを有する載置面２２と、この載置面２２に対向して設けられた押圧蓋２６を含んで構成されている。
　押圧蓋２６は、上蓋２４と支柱２５を介して接続されており、支柱２５によって姿勢を維持されたままで上蓋２４に対して接近又は離隔可能となっている。また、上蓋２４はヒンジ２３を介してベース２１と接続されており、上蓋２４がヒンジ２３を軸に回転できるように構成されている。
　よって、可撓性培養容器ＦＰを細胞培養用治具２０に収容する際には、まずヒンジ２３を介して上蓋２４が開いた状態（押圧蓋２６は第２の位置となる）で載置面２２に可撓性培養容器ＦＰを載置し、次いで不図示のロック機構により上蓋２４がベース２１に対してロックされるまで上蓋２４を閉じる（押圧蓋２６の少なくとも一部が載置面に近づいて第１の位置となる）。
　このとき、上蓋２４の移動に伴って押圧蓋２６が支柱２５を介して上蓋２４側に移動し、これにより可撓性培養容器ＦＰに押圧蓋２６によって押圧力が付与される。なお、このときの押圧力は、押圧蓋２６の質量によって発生させることもできるし、不図示の開き止めロックを用いて押圧蓋２６を可撓性培養容器ＦＰに押付けた状態でロックをかけることによっても発生させることができる。
　そして作業者は、押圧蓋２６による押圧力が可撓性培養容器ＦＰに付与された状態の細胞培養用治具２０を、ＣＯ２インキュベータ内に手などで持ち運んで可撓性培養容器ＦＰ内の細胞を培養する作業を行う。
　なお、本実施形態の細胞培養用治具２０は、ＣＯ２インキュベータ内で使用する態様以外にも、例えば細胞培養装置１内で使用してもよい。細胞培養用治具２０を細胞培養装置１で使用する場合には架台２を省略してもよく、その場合にはベース２１と架台支持柱３の先端とが接続して固定が可能な構造となっていることが好ましい。
　一方で細胞培養用治具３０は、図６（ｂ）に示されるとおり、１又は複数の窪みを有する載置面を有する下蓋３１と、この下蓋３１の載置面に対向して設けられた押圧蓋３３と、この下蓋３１と押圧蓋３３とを連結する平行リンク３２とを含んで構成されている。
　可撓性培養容器ＦＰを下蓋３１の載置面に載置する際には、図６（ｂ）の左側に示されるように、押圧蓋３３は第２の位置に移動される。
　そして載置面に可撓性培養容器ＦＰが載置された後は、図６（ｂ）の右側に示されるように、平行リンク３２を駆動させて押圧蓋３３を可撓性培養容器ＦＰに押し当てる。
　次いで、押圧蓋３３による可撓性培養容器ＦＰへの押圧力を維持しつつ不図示のロック機構で下蓋３１と押圧蓋３３とをロックする（押圧蓋３３は載置面に近づいて第１の位置となる）。
　なお、この細胞培養用治具３０をＣＯ２インキュベータ内又は細胞培養装置１内で用いる態様は、上述した細胞培養用治具２０の場合と同様なのでその説明は省略する。
　上記した第１実施形態では、図１でＹ方向に並んで２つの架台２が配置される例を示したが、これに限られず１つのみの配置でもよいし、３つ以上並べて配置してもよい。また、図２ではＸ方向に関して１つの架台のみ配置された例を示したが、これに限られずに２つ以上並べて配置してもよい。
　さらに、架台２を収容するフレーム１１を高さ方向（Ｚ方向）に複数並べて配置してもよい。または、フレーム１１内を高さ方向に複数の区画に分離し、この分離した区画内にそれぞれ架台２や押圧部材４を配置してもよい。
≪第２実施形態≫
　次に本発明の第２実施形態について、図７を参照して説明する。
　第２実施形態における第１実施形態との相違点は、可撓性培養容器ＦＰに付与される圧力を、架台２´を介して負圧源１４によって発生させている点、撮像装置７´が架台２´の上方に配置される点などが挙げられる。
　よって以下では第１実施形態との相違点を主として説明し、第１実施形態と同じ構成あるいは機能を有する要素については第１実施形態と同一の符号を付してその説明を適宜省略する（後述する第３～第５実施形態、および変形例１、２についても同じ）。
　図７に示されるとおり、本実施形態の細胞培養装置１の架台２´は、載置面２´ａと、この載置面２´ａから下方（－Ｚ方向）に陥没した窪み２´ｂを備えている。なお、本実施形態の窪み２´ｂは、架台２´をＺ方向に貫通する貫通孔とはなっておらず、載置面２´ａに対して有底の凹部となっており、さらに窪み２´ｂの底には流路１４ｂが形成されている。
　また、本実施形態の細胞培養装置１は、架台２´の載置面２´ａ上に載置された可撓性培養容器ＦＰに対して窪み２´ｂを介して吸引力を発生させる負圧発生装置を備えている。この負圧発生装置は、負圧源１４、この負圧源１４と架台２´の流路１４ｂとを結ぶ配管１４ａを含んで構成されている。
　このように架台２´の下方には負圧発生装置が配置されているため、本実施形態の撮像装置７´は架台２´に対して上方に配置されてＸ方向またはＹ方向に移動が可能となっている。なお、本実施形態では押圧部材４は存在しないため、照明装置８´も撮像装置７´と並んで配置されている。
　以上説明した第２実施形態によっても、押圧部材を用いずに負圧発生装置を用いて可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓを吸引することで、可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓは負圧の印加によって窪み２´ｂ（１又は複数の凹凸）に倣った形状に変形し、これにより架台２´の窪み２´ｂに倣った凹凸部を外面ＦＰｓに形成することができる。
　なお本実施形態では負圧源１４を用いて窪み２´ｂ内を負圧にしたが、負圧源に代えて陽圧源を用いて窪み２´ｂを介して可撓性培養容器ＦＰに陽圧を印加してもよい。
≪第３実施形態≫
　次に本発明の第３実施形態について、図８を参照して説明する。
　第３実施形態における第１実施形態との相違点は、架台２″がアクリル樹脂などの透明部材で構成されている点、架台２″の窪み２″ｂが貫通孔ではなく有底の凹部である点などが挙げられる。
　本実施形態の観察装置７は、透明な架台２″を介して可撓性培養容器ＦＰ内の細胞Ｃの凝集塊などを観察可能であることに加え、載置面２″ａ上の培地や浮遊する細胞Ｃなども必要に応じて観察することが可能となっている。
　換言すれば、本実施形態では、観察装置７は可撓性培養容器ＦＰのすべての箇所について観察や撮像することが可能となっている。
　なお、本実施形態では、窪み２″ｂが貫通孔ではなく有底の凹部であるとしたが、これに限られずに窪み２″ｂの形状を貫通孔としてもよい。
　以上説明した第３実施形態によれば、可撓性培養容器ＦＰの凹部以外に細胞Ｃが偏在していないか確認することができ、これにより効率的に凹部内に細胞Ｃを集めて凝集塊を形成することが可能となる。
≪第４実施形態≫
　次に本発明の第４実施形態について、図９を参照して説明する。
　第４実施形態における第１実施形態との相違点は、架台２″がアクリル樹脂などの透明部材で構成されている点、架台２″の窪み２″ｂが貫通孔ではなく有底の凹部である点、さらに押圧部材４が削除されて調圧装置１５が具備される点などが挙げられる。
　すなわち、図９に示すとおり、本実施形態では押圧部材４の押圧に代えて、調圧装置１５によって可撓性培養容器ＦＰが配置される空間ＳＰの圧力（気圧）が高められる。
　一方で本実施形態の架台２″ｂは凹部であるため、載置面２″ａに可撓性培養容器ＦＰが載置されたとき上記凹部が閉空間となっている。
　したがって、調圧装置１５による圧力の印加で空間ＳＰの圧力が上記閉空間よりも高まることで、窪み２″ｂに倣った凹凸部が可撓性培養容器ＦＰの外面ＦＰｓに形成されることとなる。
　以上説明した第４実施形態によれば、押圧部材４などによって物理的に加圧するのではなく非接触状態で可撓性培養容器ＦＰを加圧するので、可撓性培養容器ＦＰの損傷を極力抑制しつつ所望の凹凸部を形成することができる。
≪第５実施形態≫
　次に本発明の第５実施形態について、図１０～１３を参照して説明する。
　第５実施形態における第１実施形態との相違点は、本実施形態は培養液の撹拌装置と撹拌方法を含む点、さらには押圧部材４によって押圧された可撓性培養容器ＦＰと当該押圧部材４との間に挿通可能な撹拌部材１６とこの撹拌部材１６を駆動する撹拌部材駆動装置１７を有する点などが挙げられる。
　上記各実施形態で説明したとおり、可撓性培養容器ＦＰ内における培養液中の細胞Ｃは、凝集塊Ｃ´として存在することができる。ここで、細胞Ｃに養分を効果的に供給することなどを目的として、所定時間ごとに可撓性培養容器ＦＰ内の培養液を撹拌する作業が必要となる。このとき、可撓性培養容器ＦＰ内には凝集塊Ｃ´が形成されているので、この凝集塊Ｃ´は可能な限り移動させずに培養液だけ撹拌することが望ましい。
　そこで本実施形態では、以下で説明する培養液の撹拌装置および撹拌方法を採用した。
＜培養液の撹拌装置＞
　図１０に示すとおり、本実施形態の培養液の撹拌装置は、細胞Ｃと培養液とが充填された可撓性培養容器ＦＰの外面に変形を与える載置面と、この載置面に載置された可撓性培養容器ＦＰに対して圧力を印加する押圧部材４と、この押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰの間を挿通可能な撹拌部材１６と、この撹拌部材１６を駆動する撹拌部材駆動装置１７と、を含んで構成されている。
　なお、載置面については、上記した第１実施形態～第４実施形態のいずれかに開示された架台（架台２、架台２´および架台２″）に対応する載置面を適用してもよい。
　撹拌部材１６は、押圧部材４による可撓性培養容器ＦＰへの加圧状態が維持されたままで、これら押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間に挿通される機能を有する。この撹拌部材１６の材質としては特に制限はなく、例えばステンレスなどの金属材料やプラスチックなどの樹脂材料が適用できる。また、この撹拌部材１６の少なくとも可撓性培養容器ＦＰと接触する面に、例えばフッ素系材料によるコーティングや研磨処理などの各種表面処理が施されて低摩擦化されていてもよい。なお、押圧部材４と撹拌部材１６との接触による摩耗を抑制する観点からは、撹拌部材１６のうち押圧部材４と対向する面も上記した表面処理が施されていてもよい。
　より具体的には図１１にも示されるとおり、本実施形態の撹拌部材１６としては、その断面が矩形状で四隅の角がＲ状に面取り加工された直方体が例示できる。ここで、撹拌部材１６のＺ方向における厚みは、可撓性培養容器ＦＰの厚みなどに応じて適宜設定されるが、可撓性培養容器ＦＰの厚みに対して過度に厚い場合には撹拌時に可撓性培養容器ＦＰの噛み込みや凝集塊Ｃ´の移動を誘発してしまう。従って、撹拌部材１６の厚み（非限定的な一例）としては、３ｍｍ以下とすることが好ましい。また、撹拌部材１６のＹ方向における幅（非限定的な一例）は、可撓性培養容器ＦＰのＹ方向における幅に応じて適宜設定されるが、例えば５～１０ｍｍ程度が好ましい。さらに撹拌部材１６のＸ向における長さ（非限定的な一例）は、可撓性培養容器ＦＰのＸ方向における幅などに応じて適宜設定されるが、例えば可撓性培養容器ＦＰのＸ方向における幅よりも大きいことが好ましい。
　撹拌部材駆動装置１７は、撹拌部材１６を支持するとともに、この撹拌部材１６を可撓性培養容器ＦＰと押圧部材４との間における挿通方向（Ｙ方向）へ移動させる機能を有する。撹拌部材駆動装置１７としては公知の種々の動力機構が適用可能であり、例えばガスシリンダ、ラック＆ピニオン機構、ボールネジ直動機構、あるいは磁石を利用した直動機構などが挙げられる。
　図１０に示すとおり、本実施形態の撹拌部材駆動装置１７は、押圧部材４の一方の側（上面側）に搭載されており、押圧部材４の他方の側（底面側）に設置された撹拌部材１６と接続されている。これにより、加圧装置５によって押圧部材４が架台２に対して進退する際にも、この押圧部材４の移動に追従することが可能となる。
　なお、撹拌部材駆動装置１７は、必ずしも押圧部材４に搭載される必要はなく、例えば載置面側に設けられていてもよい。また、押圧部材４以外に撹拌部材駆動装置１７が設置される場合には、押圧部材４におけるＺ方向の変位に追従可能とするため、Ｚ方向に対して変位可能な弾性部材（バネ機構など）を介して撹拌部材１６と撹拌部材駆動装置１７が設置されることが好ましい。
　また、撹拌部材駆動装置１７は、ピストンなど公知の昇降機構を介して撹拌部材１６を昇降（Ｚ方向に関して移動）可能なように支持していてもよい。これにより、例えば制御装置１３の制御の下で、押圧部材４の移動とは独立して撹拌部材１６のＺ方向における位置を調整することが可能となる。
＜培養液の撹拌方法＞
　次に、図１１をさらに用いて本実施形態における培養液の撹拌方法について説明する。
　すなわち、本実施形態の培養液の撹拌方法は、細胞Ｃと培養液とが充填された可撓性培養容器ＦＰを載置面に載置し、この可撓性培養容器ＦＰに対して押圧部材４で押圧し、さらに押圧部材４の押圧によって載置面と接する可撓性培養容器ＦＰの外面を変形させた状態で押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間に撹拌部材１６を挿通させることを主とした特徴としている。
　まず図１１（ａ）に撹拌部材１６の初期位置を示す。同図に示すとおり、押圧部材４による可撓性培養容器ＦＰへの押圧がなされて可撓性培養容器ＦＰ内で凝集塊Ｃ´が形成され始めた初期においては、撹拌部材１６は、押圧部材４あるいは載置面の端部に対応する初期位置で待機している。
　なお、上記した待機位置としては、押圧部材４あるいは載置面の端部に限られず、可撓性培養容器ＦＰの内圧が変化しない位置であれば、例えば可撓性培養容器ＦＰの端部など他の位置でもよい。
　そして図１１（ｂ）および（ｃ）に示すとおり、可撓性培養容器ＦＰ内で凝集塊Ｃ´が形成されて所定の時間が経過した後、制御装置１３は、撹拌部材駆動装置１７を制御して撹拌部材１６を挿通方向（Ｙ方向）に移動させる制御を行う。これにより、押圧部材４による可撓性培養容器ＦＰへの押圧が維持された状態で、押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間に撹拌部材１６が滑り込んで挿通される。なお、撹拌部材１６の挿通方向への移動速度は、可撓性培養容器ＦＰの厚みなどに応じて適宜設定されるが、比較的低速（例えば１～５ｍｍ／ｓｅｃ）であることが好ましい。また、撹拌部材１６の挿通方向への移動速度を一定とせずに、例えば１ｍｍ／ｓｅｃ～２ｍｍ／ｓｅｃの間で断続的に移動速度を変化させてもよい。
　本実施形態では、撹拌部材１６の上記した挿通（移動）に伴って、可撓性培養容器ＦＰでは撹拌部材１６に接触している付近の領域のみ培養液の局所的な動きが発生し、この培養液の局所的な動きは撹拌部材１６の移動とともに挿通方向（Ｙ方向）に遷移していく。そしてこの培養液の動きは局所的なものであるため、可撓性培養容器ＦＰ内の底に沈む凝集塊Ｃ´には何ら影響を与えることがない。
　これにより、可撓性培養容器ＦＰに形成された凹部（ウェル）に存在する凝集塊Ｃ´が分散して不均一になってしまうのを抑制しつつ、可撓性培養容器ＦＰ内の上方に存在する培養液を効率的に撹拌することが可能となる。換言すれば、可撓性培養容器ＦＰ内で凝集塊Ｃ´が沈んだ状態のままで培養液を緩やかに撹拌することが可能となる。
　なお、制御装置１３は、撹拌部材１６が押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間を挿通するとき、可撓性培養容器ＦＰにかかる圧力がほぼ一定となるように押圧部材４の押圧を調整してもよい。換言すれば、制御装置１３は、撹拌部材１６が押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間を挿通する前後で、この可撓性培養容器ＦＰの内圧が変化しないように押圧部材４の押圧を調整してもよい。
　すなわち、撹拌部材１６の挿通によって可撓性培養容器ＦＰ内における内圧が変化することになるが、例えば制御装置１３によって押圧部材４をやや上昇させる（載置面に対して離間させる）ことで、撹拌部材１６による上記した内圧の上昇を相殺することが可能となる。
　これにより可撓性培養容器ＦＰ内の凝集塊Ｃ´に余計な刺激を与えずに、撹拌部材１６による上記した撹拌動作を実行することが可能となる。
　なお本実施形態では、撹拌部材１６として、断面が矩形状で面取りＲ加工が四隅に施された形状を用いたが、これに限定されない。
　例えば図１２（ａ）に示すとおり、断面が矩形状で可撓性培養容器ＦＰと接触する底面側の角のみ面取りＲ加工が施された形状を用いてもよい。
　さらには、図１２（ｂ）に示すとおり、断面が円または楕円形状でＸ方向に延びる円柱状の形状を用いてもよい。
　さらには、図１２（ｃ）に示すとおり、断面が半円または半楕円形状であって、押圧部材４と接する上面が平面となった形状を用いてもよい。
　また、本実施形態の撹拌部材１６は、挿通方向（Ｙ）に対して垂直（直角）となるように配置されていたが、これに限定されない。
　例えば図１３に示すとおり、撹拌部材１６は、当該撹拌部材１６の挿通方向に対して斜めに傾斜するよう配置されていてもよい。
　より具体的には、図１３（ａ）のとおり、撹拌部材１６は、Ｘ方向における中心がＹ方向側に飛び出た形状（「ブーメラン形状」、あるいは「くの字形状」とも称される）となっていてもよい。これにより、撹拌部材１６の挿通に伴って可撓性培養容器ＦＰとの間で生じる摩擦を減少させることが可能となる。さらには、図１３（ｂ）のとおり、撹拌部材１６は、Ｘ方向に対して傾斜するように、押圧部材４の両側に配置される撹拌部材駆動装置１７のＹ方向における位置をズラしてもよい。この形態によっても、撹拌部材１６の挿通に伴って可撓性培養容器ＦＰとの間で生じる摩擦を減少させることが可能となる。
　以上説明した本実施形態における培養液の撹拌装置は、例えば上記した細胞培養装置に組み込まれていてもよい。また、本実施形態における培養液の撹拌方法は、例えば上記した細胞培養方法に組み込まれていてもよい。
　また、本実施形態では、押圧部材４の押圧によって載置面と接する可撓性培養容器ＦＰの外面を変形させた状態で押圧部材４と可撓性培養容器ＦＰとの間に撹拌部材１６を挿通させたが、本発明はこの態様に限られるものではない。すなわち、例えば第２実施形態や第４実施形態のごとく押圧部材４を用いずに載置面側における可撓性培養容器ＦＰの外面を変形させた状態で、可撓性培養容器ＦＰの上面に撹拌部材１６を滑らせて移動してもよい。換言すれば、外力を付与することで可撓性培養容器ＦＰにおける載置面側の外面を変形させた状態で、少なくとも可撓性培養容器ＦＰの上面に撹拌部材１６を滑らせるように移動させてもよい。
　上記した各実施形態は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。以下、各実施形態に適宜適用が可能な変形例について説明する。なお、既述した各実施形態の構成と同じ機能・作用を奏するものは同じ参照番号を付し、その説明は適宜省略する。
≪変形例１≫
　図１４は、上記各実施形態に適用が可能な細胞培養装置１の変形例を示す正面図である。この変形例に係る細胞培養装置１の制御装置１３は、加圧装置５を制御して押圧部材４をＸ軸周りに回転させる機能を備えている。より具体的には、本変形例の制御装置１３は、押圧部材４に接続された加圧装置５ａと５ｂによる進退動作の周期をずらすことで、押圧部材４の姿勢を変位させる。
　そして制御装置１３は、架台２の載置面に載置された可撓性培養容器ＦＰに対して押圧部材４を用いて押圧力を付与した後に、加圧装置５を制御して押圧を維持しつつ押圧部材４をＸ軸周りに微小な範囲で回転（揺動）させる制御を行う。
　本変形例１によれば、押圧部材４をＸ軸周りに揺動させることで可撓性培養容器ＦＰ内の培地が撹拌され、これにより可撓性培養容器内の培地や透過ガスが効果的に撹拌される。
　なお、本変形例では押圧部材４をＸ軸周りに揺動させる例を説明したが、Ｙ軸周りに押圧部材４を揺動させてもよいし、Ｘ軸およびＹ軸以外の任意の軸周りに揺動させてもよい。
　このように、本変形例１によれば、押圧部材４による比較的小さな傾きでも可撓性培養容器ＦＰ内では培養液の大きな移動を生じさせることが可能となる。したがって、本変形例１は、可撓性培養容器ＦＰ内で細胞Ｃを巻き上げるほどの強い撹拌（懸濁）を行うときに好適であると言える。
　すなわち本変形例１は、細胞培養装置に限られず培養液の撹拌方法や撹拌装置としても有効である。かような培養液の撹拌方法は、細胞Ｃと培養液とが充填された可撓性培養容器ＦＰを載置面に載置しつつ、この可撓性培養容器ＦＰに対して押圧部材４で押圧し、この押圧部材４の押圧によって載置面と接する可撓性培養容器ＦＰの外面を変形させた状態で、さらに押圧部材４を揺動させて培養液の撹拌を行うことを特徴する。また、培養液の撹拌装置は、細胞Ｃと培養液とが充填された可撓性培養容器ＦＰの外面に変形を与える載置面と、この載置面に載置された可撓性培養容器ＦＰに対して圧力を印加する押圧部材４と、この押圧部材４によって可撓性培養容器ＦＰに対して圧力が印加された状態で押圧部材を揺動させる制御を行う制御装置１３を含むことを特徴とする。
≪変形例２≫
　図１５は、変形例２における細胞培養装置の架台を示す斜視図及び断面図である。
　図１５（ａ）に示されるとおり、本変形例の架台２?は、載置面２?ａと、テーパー面２?ｃによって形成された窪み２?ｂを有している。なお、本変形例では窪み２?ｂは５つ存在するが、５つ以外の任意の数でもよい。
　そして図１５（ｂ）に示されるとおり、テーパー面２?ｃは、載置面２?ａに向かうにつれて径が漸次広くなるように設けられている。
　本変形例２によれば、テーパー面２?ｃによって載置面２?ａと窪み２?ｂとの境界が鈍角状となるので、可撓性培養容器ＦＰが架台２?に載置された際に不用意に損傷してしまうことなどが抑制される。
　本発明は、以上で説明した各実施形態や各変形例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において種々の組み合わせや変更が可能であることを付言する。
　例えば上記では、１又は複数の窪み（貫通孔や凹部）が載置面に設けられることで可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面が構成されていたが、これに限られずに例えば複数の突起（短いピンなど）が載置面から立った形態や、金網のごとき網目状パターン部材の表面を載置面として構成してもよい。
　本発明は、特に細胞培養の過程において細胞の凝縮塊を形成しながら大量培養する場合などに、好適に利用することが可能である。
１　細胞培養装置
２、２´、２″、２? 　架台
３　架台支持柱
４　押圧部材
５　加圧装置
６　容器接続口
７　観察装置
８　照明装置
９　培地供給タンク
１０　培地回収タンク
１１　フレーム
１２　ステージ装置
１２ａ　ＸＹステージ
１２ｂ　Ｚステージ
１３　制御装置
１４　負圧源
１５　調圧装置
１６　撹拌部材
１７　撹拌部材駆動装置
Ｕ　　空調設備
ＦＰ　可撓性培養容器
Ｃ　　細胞

Claims (19)

  1. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して圧力を印加し、
    　前記圧力の印加によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、前記可撓性培養容器内の細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
  2. 　前記載置面には１又は複数の凹凸が形成されてなり、
    　前記可撓性培養容器の外面は、前記圧力の印加によって前記１又は複数の凹凸に倣った形状に変形する請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　押圧部材を用いて前記載置面上の前記可撓性培養容器を押圧することで、前記可撓性培養容器の外面を前記１又は複数の凹凸に倣った形状に変形させる請求項２記載の細胞培養方法。
  4. 　前記細胞の培養中に前記圧力の印加を解除することにより、前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を平坦化させる請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  5. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、
    　前記載置面に対向して設けられ、前記可撓性培養容器を加圧しながら前記載置面との間で当該可撓性培養容器を保持可能な第１の位置と、少なくともその一部が前記載置面に対して前記第１の位置よりも離れた第２の位置とを移動可能な押圧蓋と、
    　を含むことを特徴とする細胞培養用治具。
  6. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、
    　前記載置面に可撓性培養容器が載置された後に、前記可撓性培養容器に圧力を印加して前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させる制御を行う制御装置と、
    　を含むことを特徴とする細胞培養装置。
  7. 　前記載置面には１又は複数の凹凸が形成されてなり、
    　前記可撓性培養容器の外面は、前記圧力の印加によって前記１又は複数の凹凸に倣った形状に変形する請求項６に記載の細胞培養装置。
  8. 　前記載置面に対向して配置される押圧部材を更に具備し、
    　前記制御装置は、前記載置面に載置された前記可撓性培養容器に対して前記押圧部材を押し当てる制御を行う請求項６又は７に記載の細胞培養装置。
  9. 　前記圧力が印加された状態における前記可撓性培養容器の内部を観察する観察装置をさらに具備する請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  10. 　前記観察装置は、前記載置面を介して前記可撓性培養容器の内部を観察する請求項９に記載の細胞培養装置。
  11. 　前記観察装置を、少なくとも前記載置面と平行な方向に移動させるステージ装置を更に具備する請求項９又は１０に記載の細胞培養装置。
  12. 　前記観察装置は、前記載置面に対して複数設置されてなる請求項９～１１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  13. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して押圧部材で押圧し、
    　前記押圧部材の押圧によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、前記押圧部材と前記可撓性培養容器との間に撹拌部材を挿通させることを特徴とする培養液の撹拌方法。
  14. 　前記撹拌部材の挿通方向に対して当該撹拌部材を斜めに傾斜させて前記押圧部材と前記可撓性培養容器との間を挿通させる請求項１３に記載の培養液の撹拌方法。
  15. 　前記撹拌部材が前記押圧部材と前記可撓性培養容器との間を挿通する前後で、前記可撓性培養容器にかかる圧力が変化しないように前記押圧部材の押圧を調整する請求項１３又は１４に記載の培養液の撹拌方法。
  16. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器の外面に変形を与える載置面と、
    　前記載置面に載置された前記可撓性培養容器に対して圧力を印加する押圧部材と、
    　前記押圧部材と前記可撓性培養容器の間を挿通可能な撹拌部材と、
    　前記撹拌部材を駆動する撹拌部材駆動装置と、
    　を含むことを特徴とする培養液の撹拌装置。
  17. 　前記撹拌部材は、当該撹拌部材の挿通方向に対して斜めに傾斜するよう配置されてなる請求項１６に記載の培養液の撹拌装置。
  18. 　前記撹拌部材が前記押圧部材と前記可撓性培養容器との間を挿通する前後で、前記可撓性培養容器にかかる圧力が変化しないように前記押圧部材の押圧を調整する制御装置と、をさらに含む請求項１６又は１７に記載の培養液の撹拌装置。
  19. 　細胞と培養液とが充填された可撓性培養容器を載置面に載置しつつ、前記可撓性培養容器に対して押圧部材で押圧し、
    　前記押圧部材の押圧によって前記載置面と接する前記可撓性培養容器の外面を変形させた状態で、さらに前記押圧部材を揺動させて前記培養液の撹拌を行うことを特徴とする培養液の撹拌方法。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018025743A1 (ja) * 2016-08-03 2018-02-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 容器の製造方法およびその製造装置、並びに、細胞培養容器、細胞培養方法、細胞培養容器の製造方法及び細胞培養容器の製造装置
WO2018230544A1 (ja) * 2017-06-15 2018-12-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
WO2019138956A1 (ja) * 2018-01-09 2019-07-18 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP2020130090A (ja) * 2019-02-22 2020-08-31 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培地排出装置
JP2020162481A (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養トレイ
CN113061516A (zh) * 2021-04-09 2021-07-02 吴雪奎 一种多功能培养箱
WO2021241665A1 (ja) 2020-05-28 2021-12-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養バッグ内の空気を除去することを含む細胞培養システム
US20210371805A1 (en) * 2019-02-12 2021-12-02 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. Liquid thickness controlling mechanism, culture device, and liquid thickness controlling method
WO2021241668A1 (ja) 2020-05-28 2021-12-02 武田薬品工業株式会社 均一なサイズの細胞凝集体の大量製造方法
JP7264360B1 (ja) 2022-06-29 2023-04-25 ティシューバイネット株式会社 立体細胞構造体作製する培養バッグ

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109059418B (zh) * 2018-09-15 2023-06-09 上海简逸生物科技有限公司 一种生物制品冻存和复苏装置及冻存和复苏方法
TWI732357B (zh) 2018-12-27 2021-07-01 財團法人工業技術研究院 細胞培養裝置及方法
SE2050382A1 (en) * 2020-04-03 2021-10-04 Cellink Ab A cell monitoring device for use inside a humid incubator and a humid incubator system
WO2021262572A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-30 Corning Incorporated Ultrasonic devices and methods of use
KR102456955B1 (ko) 2020-12-28 2022-10-21 농업회사법인 한국발효 주식회사 바실러스 서브틸리스 낫토균 배양용 장치 및 이를 이용한 배양방법
CN113564046B (zh) * 2021-07-22 2023-08-22 深圳先进技术研究院 细胞表型控制装置的辅助拆装机构及拆装系统
IT202200019200A1 (it) * 2022-09-19 2024-03-19 Copan Italia Spa Dispositivo per l’acquisizione di immagini di campioni di materiale biologico e metodo associato

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2014045532A1 (ja) * 2012-09-24 2014-03-27 東洋製罐グループホールディングス株式会社 気泡除去方法、及び気泡除去装置
WO2014208004A1 (ja) * 2013-06-28 2014-12-31 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞剥離方法
WO2015004862A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 東洋製罐グループホールディングス株式会社 計数用装置
JP2015116150A (ja) * 2013-12-18 2015-06-25 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5344094U (ja) 1976-09-20 1978-04-15
JP4543212B2 (ja) 2004-08-20 2010-09-15 独立行政法人産業技術総合研究所 細胞培養容器及び培養方法
JP4780462B2 (ja) * 2006-08-23 2011-09-28 株式会社フコク 細胞培養用トレイ状容器
JP5098471B2 (ja) 2007-07-06 2012-12-12 株式会社フコク 細胞培養用トレイ状容器並びに同容器への収容物の充填方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2014045532A1 (ja) * 2012-09-24 2014-03-27 東洋製罐グループホールディングス株式会社 気泡除去方法、及び気泡除去装置
WO2014208004A1 (ja) * 2013-06-28 2014-12-31 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞剥離方法
WO2015004862A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 東洋製罐グループホールディングス株式会社 計数用装置
JP2015116150A (ja) * 2013-12-18 2015-06-25 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3312268A4 *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018025743A1 (ja) * 2016-08-03 2018-02-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 容器の製造方法およびその製造装置、並びに、細胞培養容器、細胞培養方法、細胞培養容器の製造方法及び細胞培養容器の製造装置
WO2018230544A1 (ja) * 2017-06-15 2018-12-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP2019000045A (ja) * 2017-06-15 2019-01-10 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP7035343B2 (ja) 2017-06-15 2022-03-15 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
EP3640322A4 (en) * 2017-06-15 2021-03-03 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. CELL CULTURE PROCESS AND DEVICE
WO2019138956A1 (ja) * 2018-01-09 2019-07-18 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
CN111511898A (zh) * 2018-01-09 2020-08-07 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置
CN111511898B (zh) * 2018-01-09 2024-01-02 东洋制罐集团控股株式会社 细胞培养方法及装置
JP2019118319A (ja) * 2018-01-09 2019-07-22 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
TWI815845B (zh) * 2018-01-09 2023-09-21 日商東洋製罐集團控股股份有限公司 細胞培養方法及裝置
EP3739037A4 (en) * 2018-01-09 2021-10-06 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. CELL CULTURE PROCESS AND DEVICE
JP7102734B2 (ja) 2018-01-09 2022-07-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
US20210371805A1 (en) * 2019-02-12 2021-12-02 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. Liquid thickness controlling mechanism, culture device, and liquid thickness controlling method
JP2020130090A (ja) * 2019-02-22 2020-08-31 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培地排出装置
JP7334421B2 (ja) 2019-02-22 2023-08-29 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培地排出装置
JP7215297B2 (ja) 2019-03-29 2023-01-31 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養トレイ
JP2020162481A (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養トレイ
WO2021241668A1 (ja) 2020-05-28 2021-12-02 武田薬品工業株式会社 均一なサイズの細胞凝集体の大量製造方法
WO2021241665A1 (ja) 2020-05-28 2021-12-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養バッグ内の空気を除去することを含む細胞培養システム
EP4159834A4 (en) * 2020-05-28 2024-09-25 Toyo Seikan Group Holdings Ltd CELL CULTIVATION SYSTEM WITH AIR REMOVAL IN A CELL CULTURE BAG
CN113061516A (zh) * 2021-04-09 2021-07-02 吴雪奎 一种多功能培养箱
CN113061516B (zh) * 2021-04-09 2023-12-22 杭州利孚泰生物科技有限公司 一种培养箱
JP7264360B1 (ja) 2022-06-29 2023-04-25 ティシューバイネット株式会社 立体細胞構造体作製する培養バッグ
JP2024004598A (ja) * 2022-06-29 2024-01-17 ティシューバイネット株式会社 立体細胞構造体作製する培養バッグ

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