KR20160007659A

KR20160007659A - 세포 박리 방법

Info

Publication number: KR20160007659A
Application number: KR1020157035563A
Authority: KR
Inventors: 료 스에나가; 타카히고 토타니
Original assignee: 도요세이칸 그룹 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2016-01-20
Also published as: JP2015008667A; EP3015544A4; WO2014208004A1; EP3015544A1; CN105339488B; KR101828910B1; CN105339488A; US20160208219A1; JP6268770B2; US9688963B2

Abstract

가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기를 사용하여 배양한 접착 배양계 세포를 손상을 주지 않고 배양 용기에서 선택적으로 박리 가능하게 한다. 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기에 부착시켜서 배양한 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 세포 박리 방법이며, 접착 배양계 세포가 부착하는 배양 용기의 필름 면에 마주하는 배양 용기의 필름 면을 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 접착 배양계 세포에 압력을 가함으로써 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 세포 박리 방법으로 한다.

Description

세포 박리 방법{CELL RELEASE METHOD}

본 발명은 배양 용기를 사용하여 배양한 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 방법에 관한 것이며, 특히 가요성을 가진 필름으로 구성된 밀폐계의 배양 용기를 사용하여 배양한 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 방법에 관한 것이다.

최근 의약품의 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 효율 좋게 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있으며, 가스 투과성이 있는 배양 백을 사용하여 폐쇄계에서 자동적으로 세포의 대량 배양이 이루어지고 있다.

그런데 최근에는 특히 분화 만능성을 가진 iPS세포나 간엽계에 속하는 세포에 대한 분화 능을 가진 간엽계 줄기 세포 등을 사용하는 재생 의료 등의 연구 개발이 급속히 발전하고 있지만, 이러한 연구 개발에서 사용되는 세포의 대부분은 접착 배양계 세포이다.

접착 배양계 세포는 배양 용기에 부착하여 증식하는 세포이므로, 배양액 내에서 부유 상태에서 증식하는 부유 배양계 세포와 달리, 배양한 후에 배양 용기에서 떼어 낼 필요가 있다. 그래서, 종래, 접착 배양계 세포는 박리 작업을 가능하게 하기 위해, 페트리 디쉬 등 개방계의 배양 용기에서 배양하는 일이 많았다.

그러나, 페트리 디쉬에서 대량 배양을 하는 것은 번잡하고 시간이 걸리기 때문에 앞으로 보다 효율적으로 대량 배양하기 위해서는 폐쇄계의 배양 백을 사용하여 배양하는 것이 바람직하다.

또한 접착 배양계 세포 배양에 있어서는 상태가 좋은 것 등 선택한 것만을 배양할 필요가 있기 때문에 배양 용기에서 원하는 부분만을 떼어내는 것도 요망되고 있다.

기존의 세포 박리 방법으로서는 먼저 트립신 처리에 의한 방법을 들 수 있다. 이 방법으로는, 단백질 분해 효소인 트립신에 의해서 접착 배양계 세포와 배양 용기의 접착 인자를 분해함으로써 세포를 박리한다.

즉 도 8에 도시한 바와 같이 배양액 (2)을 넣은 페트리 디쉬 (10)에 접착 배양계 세포 (3)를 파종하여 증식시킨 후, 페트리 디쉬 (10)에서 배양액 (2)을 제거한다(1). 다음으로, 인산 완충 생리 식염수(PBS용액)로 배양액 성분을 세척하고(2), 트립신 용액을 주입한다(3). 인큐베이터 내에서 수 분간 유지함으로써 접착 인자가 분해되고 접착 배양계 세포 (3)는, 페트리 디쉬 (10)에서 조각조각 떨어진다(4). 마지막으로, 페트리 디쉬 (10)에 배양액 (2)을 주입하고, 트립신을 실활 (활성을 잃게 함)시키고 배양액 (2)과 함께 접착 배양계 세포 (3)를 회수한다.

이와 같은 트립신 처리에 의하면, 접촉성 배양 세포 (3)를 배양 용기에서 떼어 낼 수 있다.

또한 기존의 세포 박리 방법으로 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 물리적으로 긁어내는 방법도 있다(특허 문헌 1참조). 이 방법에 따르면 트립신 처리에 비해서 조작이 간단해서 어느 정도면 원하는 범위의 세포를 뗄 수 있다.

또한 특허 문헌 2에는 탐침을 가진 주사형 프로브 현미경을 이용하여 특정 세포에 대해서 탐침을 미리 정해진 힘으로 눌러서 물리적 자극을 주어 세포를 기판 상에서 박리하는 방법이 명시되어 있다. 이 방법에 따르면 세포를 선택적으로 뗄 수 있게 되어 있다.

[특허 문헌 1] 일본 실용 신안 제2531969호 [특허 문헌 2] 일본 특허 제4831543호

그러나 트립신 처리로는 인큐베이터 내에서의 유지 시간이 너무 길면 세포막까지 분해되고, 세포를 손상하는 경우가 있었다. 또한 조작이 번잡하고, 배양 백에 적용하기는 어려웠다. 또한 일부 세포군만을 박리하기는 어렵고 원하는 부분만을 박리하고 싶다는 요망을 만족하는 것은 아니었다.

또한 특허 문헌 1에 기재된 셀 스크레이퍼를 사용하는 방법은 개구부가 큰 개방형 배양 용기에 적합한 것이며, 개구부가 작은 배양 백에 적용하는 것은 어렵다는 문제가 있었다.

또한 특허 문헌 2에 기재된 탐침을 가진 주사 프로브 현미경을 이용하는 방법은 탐침을 사용하는 것이기 때문에 배양 백에 적용하기가 어렵고, 또한 세포를 한 개씩 선택적으로 떼어 내는 것이어서 배양 백에 대량 배양된 접착 배양계 세포를 효율적으로 뗄 수 없다.

그러므로 배양 백을 사용하여 배양한 접착 배양계 세포를 배양 백에서 선택적이고 효율적으로 뗄 수 있는 기술이 요구되고 있었다.

그래서 본 발명자들은 배양 백에 적용할 수 있는 세포 박리 방법에 대해서 예의 연구를 하였다. 그리고 접착 배양계 세포가 부착된 배양 백의 필름 면에 마주하는 필름의 면을 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 접착 배양계 세포에 압력을 가함으로써, 접착 배양계 세포를 배양 백의 내면에서 박리할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기를 사용하여 배양한 접착 배양계 세포를 손상을 주지 않고, 배양 용기에서 선택적이고 효율적으로 박리 가능한 세포 박리 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 세포 박리 방법은 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기에 부착해서 배양한 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 세포 박리 방법이며, 접착 배양계 세포가 부착하는 배양 용기의 필름 면에 마주하는 배양 용기의 필름 면을 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 접착 배양계 세포에 압력을 가함으로써 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 방법으로 되어 있다.

본 발명에 따르면 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기를 사용하여 배양한 접착 배양계 세포에 손상을 주지 않고 쉽게 배양 용기에서 선택적이고 효율적으로 박리하는 세포 박리 방법을 제공할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 제1 실시형태의 세포 박리 방법의 공정을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시형태의 세포 박리 방법에서의 누름 부재의 예를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 제2 실시형태의 세포 박리 방법의 공정을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 제3 실시형태의 세포 박리 방법의 공정을 나타내는 도이다.
도 5는 실시예 1의 결과의 현미경 사진을 나타내는 도이다.
도 6은 실시예 2의 실시 상황 및 결과의 현미경 사진 등을 나타내는 도이다.
도 7은 종래의 방법으로 박리하여 계대 배양한 접착 배양계 세포와, 실시예 2의 결과로 얻은 접착 배양계 세포를 동일한 밀도로 파종하여 각각 배양한 결과의 현미경 사진을 나타내는 도이다.
도 8은 종래의 트립신 처리에 의한 세포 박리 방법을 나타내는 도이다.

본 발명의 세포 박리 방법은 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기에 부착시켜서 배양한 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 세포 박리 방법이며, 접착 배양계 세포가 부착하는 배양 용기의 필름 면에 마주하는 배양 용기의 필름 면을 접착 배양계 세포에 접촉시켜서, 접착 배양계 세포에 압력을 가함으로써 접착 배양계 세포를 배양 용기에서 박리하는 방법이면 되고, 기타 구성으로 특별히 한정되는 것은 아니다.

즉, 접착 배양계 세포에 압력을 가하는 수단으로는 접착 배양계 세포가 부착하는 배양 용기의 필름 면에 마주하는 배양 용기의 필름 면을 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 접착 배양계 세포에 압력을 가할 수 있으면 되고, 배양 용기의 외부에서 압력을 가함으로써 세포에 압력을 가해도, 배양 용기 내의 공기를 음압으로 함으로써 세포에 압력을 가해도 된다.

또한 배양 용기의 외부에서 압력을 가하는 방법으로는 누름 부재 등으로 배양 용기를 누르거나 혹은 공기압 등으로 배양 용기를 누를 수도 있다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 구체적으로 설명한다.

[제1 실시형태]

먼저 본 발명의 제1 실시형태의 세포 박리 방법을 도 1 및 도 2를 참조하여 자세히 설명한다.

도 1의 (1)에서 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기 (1)(배양 백)에 배양액 (2)과 접착 배양계 세포 (3)가 봉입되어 적재대 (4)에 재치되어, 누름 부재 (5)가 배양 용기 (1)의 상부에 배치되어 있는 모습이 모식적으로 도시되어있다. 배양 용기 (1)내 필름의 저면에는 접착 배양계 세포 (3)가 부착되어, 배양되고 있다.

다음에 도 1의 (2)와 같이, 누름 부재 (5)로 배양 용기 (1)를 위쪽에서 누른다. 이 때, 배양 용기 (1)내 필름의 상면을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서, 접착 배양계 세포 (3)에 대해서 접착 배양계 세포 (3)가 손상되지 않을 정도의 압력을 가한다.

그리고 도 1의 (3)과 같이 누름 부재 (5)를 배양 용기 (1)에서 떼면 접착 배양계 세포 (3)가 배양 용기 (1)내 필름의 저면에서 벗겨진다.

여기서 배양 용기 (1)내 필름의 저면에 부착한 접착 배양계 세포 (3)는 배양 용기 (1)의 아래에서 문질러도 박리할 수 없었다. 즉, 접착 배양계 세포가 부착한 배양 용기 (1)의 필름 면에 대해서 배양 용기 (1)의 외부에서 힘을 가해도 필름이 상처를 입거나 또는 늘어질 뿐이며, 접착 배양계 세포 (3)를 박리하지는 못 하였다.

이에 대해서, 상술한 본 실시형태의 세포 박리 방법에 따르면 배양 백 내에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)를 손상시키지 않고, 어느 정도 원하는 범위의 것을 선택적이고 효율적으로 박리할 수 있다.

그 이유는 분명치 않지만, 본 실시형태와 같이 배양 용기 (1)의 필름을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 압력을 가함으로써, 접착 배양계 세포 (3)와 배양 용기 (1)의 접착력보다 큰 응력이 접착 배양계 세포에 대해서 작용하여, 배양 용기 (1)에서 접착 배양계 세포 (3)를 분리하고 있다고 추측된다.

배양 용기 (1)는 연포(軟包)재를 재료로 주머니 모양으로 형성한 가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 백이다. 배양 용기 (1)는 접착 배양계 세포 (3)의 배양에 사용하기 때문에 가스 투과성이 있으며, 내용물을 확인할 수 있도록 일부 또는 전부가 투명성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 조건을 충족시키는 필름의 재료로서는 폴리올레핀, 에틸렌-초산 비닐 공중 합체, 스티렌계 일래스터머, 폴리에스테르계 열 가소성 일래스터머, 실리콘계 열 가소성 일래스터머, 실리콘 고무 등을 들 수 있다.

또한 배양 용기 (1)내에 접착 배양계 세포 (3)가 부착할 수 있도록 하기 위해서 배양 용기 (1)내를 친수성으로 하거나, 또는 충분한 양의 접착 인자, 예를 들면 피브로넥틴 등을 코팅할 필요가 있다. 배양 용기 (1)내를 친수성으로 하는 방법으로서는 예를 들면 UV오존 처리 또는 코로나 처리한 필름을 사용하여 배양 용기 (1)를 형성하는 것이다. 접착 인자를 코팅하는 방법으로는 예를 들면 접착 인자의 용액으로 배양 용기 (1)내를 적시고, 소정 시간 유지하므로서 접착 인자를 배양 용기 (1)내면에 흡착시키는 방법을 들 수 있다.

또한 배양 용기 (1)에는 배양액 (2)및 접착 배양계 세포 (3)를 넣었다 꺼내기 위한 포토가 하나 또는 둘 이상 갖추어져 있다.

배양액 (2)은 접착 배양계 세포 (3)를 배양 가능한 것이면 되고, 기존의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면 DMEM( Dulbecco’modified Eagle’medium)에 FBS(소 태아 혈청)10%를 가한 것 등을 알맞게 사용할 수 있다.

접착 배양계 세포 (3)는 배양 용기 (1)내에 부착되어 증식하는 것이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 iPS세포나 간엽계 줄기 세포 등을 사용할 수 있다.

적재대 (4)는 그 윗면에 배양 용기 (1)를 얹어놓는 평면의 대이다. 적재대 (4)에는 예를 들면 배양 용기 (1)를 적재대 (4)에 고정하기 위한 고정 도구 등, 배양 용기 (1)를 고정시키기 위한 각종 구성을 형성할 수 있다.

누름 부재 (5)는 배양 용기 (1)외부에서 배양 용기 (1)를 누름으로써, 접착 배양계 세포 (3)가 부착하는 배양 용기 (1)의 필름 면에 마주하는 배양 용기 (1)의 필름 면을, 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 접착 배양계 세포 (3)에 압력을 가하는 부재이다.

이 누름 부재 (5)로서는 예를 들면 도 2의 (A)와 같이, 그 저면이 평면인 입체 형상의 것을 사용할 수 있다. 이런 바닥면이 평면 누름 부재 (5-1)를 사용하면 평면으로 눌리는 배양 용기 (1)내의 일정 영역에서의 필름에 부착한 접착 배양계 세포 (3)를 선택적이고 효율적으로 박리할 수 있다. 이러한 입체 형태로서는 직육면체, 정육면체, 원기둥, 원뿔, 다각 기둥 등의 형상을 들 수 있다.

또한 누름 부재 (5)로서 예를 들면 도 2의 (B)와 같이 그 저면이 곡면(아래쪽으로 돌출된 볼록면)인 입체 형상의 것을 사용할 수도 있다. 이와 같은 바닥이 곡면인 누름 부재 (5-2)를 사용하면 배양 용기 (1)내의 더욱 좁은 일정 영역에서의 필름에 부착한 접착 배양계 세포 (3)를 선택적으로 박리할 수 있게 된다.

또한 누름 부재 (5)로서 예를 들면 도 2의 (C)와 같이 롤러 (5-3)를 사용할 수도 있다. 즉, 배양 용기 (1)를 위에서 롤러로 누르고 접착 배양계 세포 (3)가 부착하는 배양 용기 (1)의 필름 면에 마주하는 배양 용기 (1)의 필름 면을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 접착 배양계 세포 (3)에 압력을 가하면서 롤러 (5-3)를 적재대 (4)에 평행으로 이동시킴으로써, 배양 용기 (1)내의 보다 넓은 일정 영역에서의 필름에 부착한 접착 배양계 세포 (3)를 선택적이고 효율적으로 박리할 수 있다. 특히 배양 용기 (1)내에서의 모든 접착 배양계 세포 (3)를 효율적으로 박리하려면 누름 부재 (5)로서 롤러 (5-3)를 사용하는 것이 적당하다.

[제2 실시형태]

다음에 본 발명의 제2 실시형태의 세포 박리 방법에 대해서, 도 3을 참조하여 설명한다. 본 실시형태는 적재대 (4)로서 구멍 (4-1)을 갖춘 것을 사용함으로써 박리 대상인 접착 배양계 세포 (3)를 보다 선택하기 쉽게 한 것이다. 기타의 점에 대해서는 제1 실시형태와 마찬가지이며 배양 용기 (1), 배양액 (2), 접착 배양계 세포 (3) 및 누름 부재 (5)에 대해서는 제1 실시형태와 같은 것을 사용할 수 있다.

즉, 본 실시형태의 세포 박리 방법으로는 도 3과 같이 적재대 (4)로서 그 일정 영역에 구멍 (4-1)을 형성한 것을 사용하고 배양 용기 (1)의 내면에 부착해서 배양한 접착 배양계 세포 (3)중 박리하고 싶지 않은 접착 배양계 세포 (3)가 부착되어 있는 배양 용기 (1)내의 일정 영역을 구멍 (4-1)위에 배치한다. 그리고, 해당 영역을 포함한 범위를 배양 용기 (1) 외부에서 누름 부재 (5)로 누르고, 해당 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)를 박리하지 않고, 해당 영역 이외의 누른 범위에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)만을 선택적으로 박리할 수 있다.

구체적으로는 도 3의 (1)에서 가요성을 가진 필름으로 구성된 밀폐계의 배양 용기 (1)(배양 백)에 배양액 (2)과 접착 배양계 세포 (3)가 봉입되어, 구멍 (4-1)을 갖춘 적재대 (4)에 재치되어 누름 부재 (5)가 배양 용기 (1)의 상부에 배치되어 있는 모습이, 모식적으로 도시되어 있다. 배양 용기 (1)내의 필름의 바닥면에는 접착 배양계 세포 (3)가 부착하여, 배양되고 있다.

다음에 도 3의 (2)와 같이, 누름 부재 (5)로 배양 용기 (1)를 구멍 (4-1)을 포함한 범위의 위쪽에서 누른다. 이 때, 배양 용기 (1)내의 필름의 윗면은 접착 배양계 세포 (3)에 접촉하고, 구멍 (4-1)의 위쪽 이외의 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)에 대해서는 접착 배양계 세포 (3)가 손상되지 않을 정도의 압력이 가해진다. 한편 구멍 (4-1)의 위쪽의 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)는 위에서 누르면 구멍 (4-1)에 가라앉고, 떼어내기에 필요한 압력이 접착 배양계 세포 (3)에 가해지지 않는다.

그 결과, 도 3의 (3)와 같이 누름 부재 (5)를 배양 용기 (1)에서 떼면, 구멍 (4-1)의 위쪽 이외의 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)만이 배양 용기 (1)내 필름의 바닥면에서 떨어지고 구멍 (4-1)의 위쪽의 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)는 배양 용기 (1)내 필름의 바닥면에서 박리되지 않는다.

이와 같이 본 실시형태의 세포 박리 방법에 따르면, 박리하고 싶지 않은 접착 배양계 세포 (3)가 적재대 (4)의 구멍 (4-1)의 상부에 위치하도록 배양 용기 (1)를 적재대 (4)에 배치함으로써 박리할 접착 배양계 세포 (3)를 보다 섬세하게 선택할 수 있게 된다.

또한, 구멍 (4-1)은 도 3에서는 적재대 (4)를 관통하여 형성된 구멍으로서 도시되어 있지만, 이에 한정되지 않고 적재대 (4)를 움푹하게 형성해도 된다. 또한 적재대 (4)의 수평면에서의 구멍 형상도 임의의 것으로도 되고, 원형, 직사각형, 다각형 등 외에 곡선 등으로 구성된 자유로운 형상으로 할 수도 있다. 또한 그 개수도 한 개에 한정되지 않고 적재대 (4)에 두개 이상의 구멍 (4-1)을 형성할 수도 있다.

또한, 본 실시형태에서 누름 부재 (5)를 사용하는 일 없이, 예를 들면 공기압과 액압 등에 의해서 구멍 (4-1) 위에 배치된 영역을 포함한 범위를 누를 수도 있다.

[제3 실시형태]

다음에 본 발명의 제3 실시형태의 세포 박리 방법에 대해서, 도 4를 참조하여 설명한다. 본 실시형태의 세포 박리 방법은 배양 용기 (1)내를 음압으로 함으로써, 접착 배양계 세포 (3)가 부착하는 배양 용기 (1)의 필름 면에 마주한 배양 용기 (1)의 필름 면을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 접착 배양계 세포 (3)에 압력을 가하고 있다. 배양 용기 (1), 배양액 (2), 접착 배양계 세포 (3) 및 적재대 (4)에 대해서는 제1 실시형태와 같은 것을 사용할 수 있다.

즉, 본 실시형태의 세포 박리 방법으로는 배양 용기 (1)내에서 배양액 (2)을 배출하고, 이어서 배양 용기 (1)의 공기를 흡인하며 배양 용기 (1)내를 음압으로 함으로써, 접착 배양계 세포 (3)가 부착하는 배양 용기 (1)의 필름 면에 마주하는 배양 용기 (1)의 필름 면을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 접착 배양계 세포 (3)에 압력을 가한다. 이어서 배양 용기 (1)내에 배양액 (2)을 주입하여, 접착 배양계 세포 (3)를 배양 용기 (1)의 내면에서 박리한다.

구체적으로는 도 4의 (1)에서 가요성을 가진 필름을 구성된 밀폐계의 배양 용기 (1)(배양 백)에 배양액 (2)과 접착 배양계 세포 (3)가 봉입되어 적재대 (4)에 재치되어 있는 모습이, 모식적으로 도시되어 있다. 배양 용기 (1)내 필름의 바닥면에는 접착 배양계 세포 (3)가 부착하여, 배양되고 있다.

다음에 도 4의 (2)와 같이 배양 용기 (1)에서 배양액 (2)을 배출하고, 또한 펌프 등에 의해서 배양 용기 (1)내의 공기를 흡인하여, 배양 용기 (1)내를 음압으로 한다. 이로써 접착 배양계 세포 (3)가 부착하는 배양 용기 (1)의 필름 면에 마주하는 배양 용기 (1)의 필름 면을 접착 배양계 세포 (3)에 접촉시켜서 접착 배양계 세포 (3)에 압력을 가한다.

또한 도 4의 (3)과 같이, 배양 용기 (1)내에 배양액 (2)을 주입함으로써 접착 배양계 세포 (3)를 배양 용기 (1)의 내면에서 박리한다.

본 실시형태의 세포 박리 방법에 따르면 배양 용기 (1)내의 접착 배양계 세포 (3)를 손상하지 않고 쉽고 효율적으로 박리할 수 있다.

[실시예]

(실시예 1)

상기 제1 실시형태의 세포 박리 방법으로 배양 백 (1)에서 접착 배양계 세포 (3)를 박리하는 실험을 하였다.

배양 백 (1)에는 폴리에틸렌(PE)제로, 사이즈가 100mm×225mm필름 두께가 0.1mm의 것을 사용하였다. 이 배양 백 (1)내에 피브로넥틴을 코팅하였다.

구체적으로는 PBS(인산 완충 생리 식염수)로 5μg/ml로 희석한 피브로넥틴 용액 100ml을 배양 백 (1)의 내면 전체에 젖게 한 상태에서 37℃에서 약 2시간 CO₂인큐베이터 내에 유지하였다.

이어서, 피브로넥틴 용액을 전량 배출한 뒤, PBS로 배양 용기 (1)의 내면을 1회 세정하였다(PBS 100ml을 배양 백의 내면 전체를 젖게 하여 바로 배출했다). 액체를 꺼내고 넣는 것은 배양 백 (1)에 비치되어 있는 포트에 시린지(syringe)를 접속하여 실시하였다.

접착 배양계 세포 (3)에는 CHO세포(Chinese Hamster Ovary, 중국 햄스터 난소)를 사용하였다. 또한 배양액 (2)에는 FBS(소 태아 혈청) 10%짜리 DMEM 배지를 사용하였다. 이 CHO세포 200만개를 배양액 150ml과 함께 배양 백 (1)내에 파종하고 72시간 정치하여 배양한 것을 사용하여, 박리 실험을 하였다.

배양은 CO₂인큐베이터로 37℃, CO₂농도 5%, 습도 97%의 조건으로 하였다.

박리실험에서는 누름 부재 (5)로서 끝이 둥근, 굵기 1mm의 핀(선단 SR1)을 사용하고 적재대 (4)로서 유리판을 사용하였다. 그리고 이 핀을 손가락으로 집어서 배양 백에 가볍게 눌렀다. 이때의 압력은 수십 gf이며 유리판의 응력이 느껴질 때까지 핀을 눌렀다. 그리고, 핀을 배양 백 (1)에서 분리하였다. 그 결과를 도 5에 도시한다.

도 5의 (1)에는 배양 백 (1)을 핀으로 누른 상태의 현미경 사진을 도시하고 도 5의 (2)에는 배양 백 (1)으로부터 핀을 뗀 상태의 현미경 사진을 도시하고 있다. 도 5의 (2)에서 배양 백 (1)의 핀으로 누른 영역에서만 접착 배양계 세포 (3)가 박리되어있음을 알 수 있다.

따라서 제1 실시형태의 세포 박리 방법에 따르면 배양 백 내에 부착되어 있는 접착 배양계 세포를 선택적이고 효율적으로 박리하는 것이 밝혀졌다.

(실시예 2)

상기 제2 실시형태의 세포 박리 방법으로 배양 백 (1)에서 접착 배양계 세포 (3)를 박리하는 실험을 하였다. 배양 용기 (1), 배양액 (2) 및 접착 배양계 세포 (3)는 실시예 1과 같은 것을 사용하였다. 본 실시예에서는 구멍 (4-1)을 갖춘 적재대 (4')에 배양 백 (1)을 얹어놓고, 롤러 (5-3')에 의해서 배양 백 (1)을 누르면서, 롤러 (5-3')를 적재대 (4')에 평행으로 회전 이동시켰다. 이 롤러 (5-3')로서, 아래와 같이, 일정 간격마다 배양 백 (1)을 밀어내릴 수 있는 것을 사용하였다.

구체적으로는 도 6의 (1)에 도시하는 바와 같이 누름 부재 (5)로서 스펀지가 붙은 롤러 (5-3')를 사용하였다. 스펀지가 붙은 롤러 (5-3')에는 가늘고 긴 판 형상의 스펀지 2개가 롤러의 길이 방향 전체에 걸쳐서 롤러의 둘레면 상의 일부에 마주하여 붙여져 있다. 이들 스펀지는, 경도가 아스카C15의 실리콘 스펀지이며, 폭이 6.5mm, 두께가 3mm, 길이가 롤러의 길이 방향의 길이와 동일한 것을 사용하였다.

이러한 스폰지가 붙은 롤러 (5-3')가 배양 백 (1) 위를 회전 이동하는 동안에, 스폰지가 아래쪽에 위치할 때 배양 백 (1)을 누를 수 있으며, 스폰지가 위쪽이나 가로방향으로 위치할 때는 배양 백 (1)을 누르지 않는다. 이러한 스폰지가 붙은 롤러 (5-3')를 사용하여 배양 백 (1) 위를 누르면서 회전 이동시키면 배양 백 (1)에서 스펀지가 붙은 롤러 (5-3')에 의해서 눌리는 부분과 눌리지 않은 부분이 생기게 된다.

또한 적재대 (4')로서는 스테인리스제의 펀칭 메탈판(구멍 지름 2, 개공률(開孔率) 40.2)을 사용하였다. 이 적재대 (4')에는 다수의 구멍이 있다. 본 실시예에서는 적재대 (4')에 올려놓은 배양 용기 (1)에 있어서의 스펀지가 붙은 롤러 (5-3')에 의해서 눌린 영역이며, 또한 적재대 (4')의 구멍의 위쪽이 아닌 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)만이 선택적으로 박리된다. 도 6의 (2)~(4)에는 그 결과가 도시되어 있다.

즉 도 6의 (2)에는 배양 백 (1)에서 스폰지가 접촉한 영역만이 검게, 기타 영역에는 세포가 부착하여 하얗게 보이는 모습이 도시되어 있다. 도 6의 (3)은 도 6의 (2)에서의 흰 테두리 부분을 확대한 사진이며 적재대 (4')의 구멍에 대응하는 영역에는 하얗게 세포가 부착되어 있는 것을 알 수 있다. 도 6의 (4)는 적재대 (4')의 구멍에 대응하는 영역 주변을 포함한 현미경 사진이며, 구멍에 대응하는 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)는 박리되지 않았고, 주변에 부착되어 있던 접착 배양계 세포 (3)만이 박리된 것을 알 수 있다.

그래서, 제2 실시형태의 세포 박리 방법에 따르면 배양 백 (1)내에 부착되어 있는 접착 배양계 세포 (3)를 보다 섬세하고 선택적으로 박리할 수 있는 것이 밝혀졌다.

(배양 시험)

본 실시형태의 세포 박리 방법으로 박리된 접착 배양계 세포에 손상이 없고, 배양이 가능한 것임을 확인하기 위해서 기존의 셀 스크레이퍼를 사용하여 박리한 후에 배양한 세포와, 본 실시형태의 세포 박리 방법으로 박리한 후에 배양한 세포와의 배양 상태를 비교 확인하기 위한 배양 시험을 하였다.

(1) 셀 스크레이퍼를 사용하여 박리된 접착 배양계 세포 배양 시험

배양 용기에는 팰콘 조직 배양용 접시(φ 6cm)를 사용하고, 배양액에는 FBS(소 태아 혈청) 10%짜리 DMEM 배지 4ml을 사용하였다. 또한 접착 배양계 세포에는 CHO세포를 사용하고, 파종 밀도를 1⁵cells/ml로 하여 CO₂인큐베이터를 사용하여 37℃, CO₂농도 5%, 습도 97%의 조건에서 배양하였다. 계대 간격은 72시간으로 하고, 계대는 다음의 방법으로 하였다.

먼저 배양 용기를 CO₂인큐베이터에서 꺼내어, 피펫으로 상등액을 걷어내어 전량 배출하였다. 다음에 셀 스크레이퍼로 배양 용기 내 전체 면을 문지르고, 세포를 박리하였다. 그리고, 배양 용기에 신선한 배양액을 2ml 넣고, 피페팅하여 세포를 풀었다. 일단 별도의 용기(코니컬 튜브)에 회수하고 거기에서 극소량 채취하여 혈구 계수판을 사용하여 세포 수를 카운트하였다. 카운트한 값을 바탕으로, 세포 밀도가 1⁵cells/ml가 되도록 배양액을 주입하였다. 그리고 얻어진 세포 현탁액을 새로운 배양 용기에 4ml 파종하고 다시 72시간 인큐베이터 내에 보관하였다. 이 계대 방법을 반복하여, 반년 이상 배양을 계속하였다.

(2) 실시예 2에서 박리된 접착 배양계 세포의 배양 시험

실시예 2에서 박리된 접착 배양계 세포를 코니컬 튜브에 회수하여 극소량 채취하고, 혈구 계수판을 사용하여 세포 수를 카운트하였다. 카운트한 값을 바탕으로, 세포 밀도가 1/ml가 되도록 배양액(FBS10%짜리 DMEM 배지)을 주입하였다. 그리고 얻어진 세포 현탁액을 새로운 배양 용기에 4ml 파종하여 72시간 인큐베이터 내에 보관하였다.

도 7의 (A)는 셀 스크레이퍼를 사용하여 박리되어 반년 이상 계대 배양한 접착 배양계 세포의 현미경 사진이다. 또한 도 7의 (B)는 실시예 2에서 박리된 접착 배양계 세포를 셀 스크레이퍼를 사용하여 박리된 접착 배양계 세포와 동일한 파종 밀도 및 배양 조건에서 72시간 배양한 것의 현미경 사진이다.

이들을 비교하면 거의 동등한 세포 증식률과 거의 동등한 접착률(가늘고 긴 세포가 접착되어있는 것)을 얻은 것으로 나타났다.

따라서 본 발명의 세포 박리 방법으로 박리된 접착 배양계 세포는 세포를 손상하지 않고, 박리된 것임이 밝혀졌다.

본 발명은 이상의 실시형태와 실시예에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것은 말할 필요도 없다.

예를 들면 누름 부재를 사용하는 대신 누름 부재를 사용한 경우와 같은 정도의 공기압과 액압을 배양 용기의 외부에서 접착 배양계 세포에 대해서 가함으로써 배양 용기에서 접착 배양계 세포를 박리하는 등 적절히 변경할 수 있다.

본 발명은 접착 배양계 세포를 대량 배양하는 경우에 알맞게 이용할 수 있다.

1 배양 용기
2 배양액
3 접착 배양계 세포
4 적재대
4' 적재대(펀칭 메탈 판)
4-1 구멍
5 누름 부재
5-1 바닥면이 평면인 누름 부재
5-2 바닥면이 곡면인 누름 부재
5-3 롤러
5-3'스펀지가 붙은 롤러
10 페트리 디쉬

Claims

가요성을 가진 필름으로 구성된 배양 용기에 부착시켜서 배양한 접착 배양계 세포를 상기 배양 용기에서 박리하는 세포 박리 방법이며,
상기 접착 배양계 세포가 부착하는 상기 배양 용기의 필름 면에 마주하는 상기 배양 용기의 필름 면을 상기 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 상기 접착 배양계 세포에 압력을 가함으로써 상기 접착 배양계 세포를 상기 배양 용기로부터 박리하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 용기에 부착시켜서 배양한 상기 접착 배양계 세포에 상기 배양 용기의 외부에서 누름 부재로 압력을 가함으로써 상기 접착 배양계 세포를 상기 배양 용기로부터 박리하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제2항에 있어서, 상기 누름 부재로서 바닥면이 평면인 것을 사용하여, 상기 배양 용기의 일정 영역 또는 전체 영역에 대해서 압력을 가하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제2항에 있어서, 상기 누름 부재로서 바닥면이 곡면인 것을 사용하여, 상기 배양 용기의 일정 영역에 대해서 압력을 가하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제2항에 있어서, 상기 누름 부재로서 롤러를 사용하여 상기 배양 용기의 일정 영역 또는 전체 영역에 대해서 압력을 가하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 용기를 적재하는 적재대로서 하나 또는 둘 이상의 구멍이 형성된 적재대를 사용하고,
상기 배양 용기에 부착해서 배양한 상기 접착 배양계 세포 중 박리하고 싶지 않은 접착 배양계 세포가 부착되어 있는 상기 배양 용기의 영역을 상기 구멍 위에 배치하고, 상기 구멍 위에 배치된 상기 영역을 포함한 범위를 누르고, 상기 영역에 부착되어 있는 접착 배양계 세포를 박리하지 않고, 상기 영역 이외의 누른 범위에 부착되어 있는 접착 배양계 세포만을 선택적으로 박리하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 용기 내에서 배양액을 배출하고, 이어서 상기 배양 용기의 공기를 흡인하여 상기 배양 용기 내를 음압으로 함으로써 상기 접착 배양계 세포가 부착하는 상기 배양 용기의 필름 면에 마주하는 상기 배양 용기의 필름 면을 상기 접착 배양계 세포에 접촉시켜서 상기 접착 배양계 세포에 압력을 가하고,
상기 배양 용기 내에 배양액을 주입하고, 상기 접착 배양계 세포를 상기 배양 용기로부터 박리하는 것을 특징으로 하는 세포 박리 방법.