TWI547694B - 微流道生物反應器及其套組和使用方法 - Google Patents

微流道生物反應器及其套組和使用方法 Download PDF

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顏孟華
郭書文
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國立陽明大學
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Description

微流道生物反應器及其套組和使用方法
本發明提供一種快速及大量培養細胞，特別是適於培養幹細胞之微流道生物反應器，其特點在於利用負壓密合原理而達到開蓋式培養的設計，因此能使細胞均勻分布在細胞培養基材上，並具有微氣泡移除裝置，利於長時間細胞培養。
細胞培養是生物醫學領域中非常基本且重要之工具，尤其是幹細胞的培養，因生物體由胚胎到成熟個體過程中，幹細胞皆扮演著關鍵性的角色，故其在再生醫療的潛力無限。然而，體外培養幹細胞的環境條件非常嚴苛且技術難度高，此外，在過去研究中亦發現，傳統細胞培養的結果包括細胞行為與生理模式，都與體內細胞的表現有極大差異。因此，目前亟需一種穩定的細胞培養裝置及方法，以量產細胞。
微流體裝置應用於細胞培養已多年，然而，目前一般微流體裝置的缺點包括：(1)細胞容易分佈不均勻，而影響細胞的生長與品質；(2)通常微流體裝置已經是密合的狀態，然後才將細胞及培養液注入，因此於培養過程中無法再進一步去除不好的細胞或微氣泡，易影響其他正常細胞的生長；(3)當細胞注入微流體裝置時，易殘留細胞 於注入口及微流道中，使其養分不足導致不正常生長或死亡，而影響到其他正常細胞的生長；(4)細胞培養面積不夠大或整體裝置的體積過大，不利於細胞大量增殖。
有鑒於此，本發明提供一種微流道生物反應器，其係包含以下結構：一第一細胞培養層，該第一細胞培養層係為一封閉迴路，使其內部形成一第一細胞培養室；一微流道底板，其位於該第一細胞培養層之上面，該底板具有一第一通道、一第二通道以及一孔洞，該第一通道及該第二通道的位置係相對於該第一細胞培養室之內，且該孔洞的位置係相對於該第一細胞培養層之封閉迴路中；一微流道層，其位於該微流道底板之上面；以及一微流道頂板，其位於該微流道層之上面。其中，該微流道層係包含：一注入口，其一端為一開口，另一端連接一彎曲通道；一第一擴散裝置，其一端連接於該彎曲通道，另一端與一間隔層連接，該第一擴散裝置內具有一開口，可與該微流道底板之該第一通道連接；一微氣泡消除裝置，其係為一真空通道，該微氣泡消除裝置之一端與該間隔層連接，另一端與一真空口連接，且其真空通道與該微流道底板之孔洞連接；及一輸出口，其一端為一開口，另一端連接一第二擴散裝置，該第二擴散裝置內具有一開口，可與該微流道底板之該第二通道連接。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第一擴散裝置及該第二擴散裝置係為扇形。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該注入口與輸出口可位於同側或異側。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養層、該微流道層以及該間隔層係為聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane，簡稱PDMS)。於較佳實施例中，其係利用雷射直刻技術(二氧化碳雷射機器，ILS-II，LASER TOOLS and TTECHNICS CORP.)將該聚二甲基矽氧烷製作成具有微流道之薄膜。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養層以及該微流道層之厚度係為100-400μm。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，其進一步包含一第一細胞培養基材，其位於該第一細胞培養層之下面，且該第一細胞培養基材之面積係大於該第一細胞培養層。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，可進一步搭配一細胞加載裝置及一黏合材料使用。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，其進一步包含以下結構：一第二細胞培養層，其位於該微流道頂板之上面，該第二細胞培養層係為一封閉迴路，使其內部形成一第二細胞培養室；以及一第二細胞培養基材，其位於該第二細胞培養層之上面，且該第二細胞培養基材之面積係大於該第二細胞培養層，其中，該微流道頂板進一步具有一第三通道、一第四通道以及一孔洞，該第三通道及該第四通道的位置係相對於該第二細胞培養室之內，該孔洞的位置係相對於該第二細胞培養層之封閉迴路中，且與該微流道層之該真空通道連接。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第二細胞培養層係為聚二甲基矽氧烷。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第二細胞培養層之厚度係為100-400μm。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養基材與該第二細胞培養基材係為可用於細胞培養之基材，例如：培養皿、玻片等。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該真空口可進一步連接一真空裝置。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該微流道底板及該微流道頂板係為玻璃。於較佳實施例中，其係利用玻璃鑽孔機(LAPIDARY & SONIC ENT.)製作該微流道底板之第一通道、第二通道以及孔洞與該微流道頂板之第三通道、第四通道以及孔洞。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該聚二甲基矽氧烷與該玻璃係利用電漿處理機(PX-250，Plasma treatment System，AMERICA North)結合。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養基材與該第二細胞培養基材係利用雷射直刻技術(二氧化碳雷射機器，ILS-II，LASER TOOLS and TTECHNICS CORP.)切割成特定尺寸。
較佳地，本發明之微流道生物反應器，可進一步搭配一溫度控制裝置、一唧筒式幫浦、一液體注入管線、一液體輸出管線以及一真空裝置使用。
本發明提供一種使用微流道生物反應器培養細胞的方法，包含：(1)將細胞均勻培養於一細胞培養基材上；(2)將本發明之微流道生物反應器置於該細胞培養基材上，使微流道反應器之該第一細胞培養層與該細胞培養基材作結合；(3)使用一真空裝置藉由該真空口將該微流道生物反應器抽真空，用以產生負壓，使該第一細胞培養層與該細胞培養基材緊密貼合；(4)該真空裝置持續產生負壓，使該微氣泡消除裝置持續維持真空狀態；(5)將培養液體經由該注入口注入，該培養液經該第一擴散裝置之該開口通過該微流道底板之該第一通道進入該第一細胞培養層，其中該培養液所含之微氣泡經由該間隔層進入該微氣泡消除裝置；(6)該第一細胞培養層之培養液體經該微流道底板之該第二通道通過該第二擴散裝置之該開口流向該輸出口。
較佳地，本發明之培養細胞的方法，該細胞係為幹細胞。
本發明提供一種培養細胞的套組，包含：本發明之微流道生物反應器；一細胞加載裝置；及一黏合材料。
較佳地，本發明之培養細胞的套組，可進一步包含一細胞培養基材。
較佳地，本發明之培養細胞的套組，該黏合材料為雙面膠或聚二甲基矽氧烷。
較佳地，本發明之培養細胞的套組，該細胞加載裝置可進一步包含一真空管線，該真空管線可以連接一真空裝置，用以產生負壓，使該細胞加載裝置與該細胞培養基材能緊密貼合。
綜上所述，本發明利用不同於習知之細胞培養裝置及方法，提供一種微流體生物反應器，其具有以下優點：(1)能快速及大量培養細胞，特別適於培養幹細胞；(2)在培養過程中不會改變細胞的特性；(3)利用負壓密合原理而達到開蓋式培養的設計，因此能使細胞均勻分布在細胞培養基材上，於培養過程中亦能隨時移除掉生長不好的細胞；(4)具有微氣泡移除裝置，利於長時間細胞培養；(5)可進一步搭配細胞加載裝置的使用，使細胞生長在培養基材之特定區域內，因此在結合微流道主體時不會造成細胞受損或死亡。
10‧‧‧第一細胞培養基材
20‧‧‧第一細胞培養層
21‧‧‧第一細胞培養室
30‧‧‧微流道底板
31‧‧‧第一通道
32‧‧‧第二通道
33‧‧‧孔洞
40‧‧‧微流道層
41‧‧‧注入口
42‧‧‧輸出口
43‧‧‧真空口
44‧‧‧彎曲通道
45‧‧‧第一擴散裝置
46‧‧‧第二擴散裝置
47‧‧‧微氣泡消除裝置
48‧‧‧間隔層
49‧‧‧通道
50‧‧‧微流道頂板
51‧‧‧第三通道
52‧‧‧第四通道
53‧‧‧孔洞
60‧‧‧第二細胞培養層
61‧‧‧第二細胞培養室
70‧‧‧第二細胞培養基材
80‧‧‧細胞加載裝置
81‧‧‧真空管線
90‧‧‧黏合材料
100‧‧‧微流道生物反應器
200‧‧‧上下雙層培養之微流體生物反應器
500‧‧‧微氣泡
第一圖顯示本發明之微流道生物反應器的結構。
第二圖顯示本發明微流道生物反應器之微流道層的結構。
第三圖顯示本發明上下雙層培養之微流道生物反應器的結構。
第四圖顯示本發明上下雙層培養微流道生物反應器之微流道層的另一結構分解圖。
第五圖顯示本發明之細胞加載裝置及黏合材料的結構。
第六圖顯示本發明微流道生物反應器之微氣泡消除過程之側面示意圖。
第七圖顯示本發明微流道生物反應器之微氣泡消除過程。
第八圖顯示小鼠間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養 皿中之生長型態。
第九圖顯示小鼠間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之生長曲線。
第十圖顯示小鼠間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之幹細胞表面抗原標記分析。
第十一圖顯示人類間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之生長曲線。
第十二圖顯示人類間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之幹細胞表面抗原標記分析。
第十三圖顯示人類胚胎幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之生長曲線。
第十四圖顯示人類誘導性多功能幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之生長曲線。
第十五圖顯示人類誘導性多功能幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之生長型態。
第十六圖顯示人類誘導性多功能幹細胞於本發明之微流道生物反應器及一般培養皿中之螢光表現結果。
請參考第一圖，本發明之微流道生物反應器100，其係包含以下結構：一第一細胞培養層20，該第一細胞培養層20係為一封閉迴路，使其內部形成一第一細胞培養室21；一微流道底板30，其位於該第一細胞培養層20之上面，該底板具有一第一通道31、一第二通 道32以及一孔洞33，該第一通道31及該第二通道32的位置係相對於該第一細胞培養室21之內，且該孔洞33的位置係相對於該第一細胞培養層20之封閉迴路中；一微流道層40，其位於該微流道底板30之上面；以及一微流道頂板50，其位於該微流道層40之上面。
其中，請參考第二圖，該微流道層40係包含：一注入口41，其一端為一開口，另一端連接一彎曲通道44；一第一擴散裝置45，其一端連接於該彎曲通道44，另一端與一間隔層48連接，該第一擴散裝置45內具有一開口，可與該微流道底板30之該第一通道31連接；一微氣泡消除裝置47，其係為一真空通道，該微氣泡消除裝置47之一端與該間隔層48連接，另一端與一真空口43連接，且其真空通道與該微流道底板30之孔洞33連接；及一輸出口42，其一端為一開口，另一端連接一第二擴散裝置46，該第二擴散裝置46內具有一開口，可與該微流道底板30之該第二通道32連接。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器100，該第一擴散裝置及45該第二擴散裝置46係為扇形，但本發明不限於此。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器100，該注入口41與輸出口42位於異側，但本發明不限於此。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器100，該第一細胞培養層20、該微流道層40以及該間隔層48係為聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane，簡稱PDMS)。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器100，該聚二甲基矽氧烷係利用雷射直刻技術(二氧化碳雷射機器，ILS-II， LASER TOOLS and TTECHNICS CORP.)製作成具有微流道之薄膜。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器100，該第一細胞培養層20以及該微流道層40之厚度係為100-400μm。
本發明之微流道生物反應器，請參考第一圖，其進一步包含一第一細胞培養基材10，其位於該第一細胞培養層20之下面，且該第一細胞培養基材10之面積係大於該第一細胞培養層20。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，可進一步搭配一細胞加載裝置及一黏合材料使用。
請參考第三圖，本發明之微流道生物反應器，其進一步包含以下結構，以形成上下雙層培養之微流道生物反應器200：一第二細胞培養層60，其位於該微流道頂板50之上面，該第二細胞培養層60係為一封閉迴路，使其內部形成一第二細胞培養室61；以及一第二細胞培養基材70，其位於該第二細胞培養層60之上面，且該第二細胞培養基材70之面積係大於該第二細胞培養層60，其中，該微流道頂板50進一步具有一第三通道51、一第四通道52以及一孔洞53，該第三通道51及該第四通道52的位置係相對於該第二細胞培養室61之內，該孔洞53的位置係相對於該第二細胞培養層60之封閉迴路中，且與該微流道層40之該真空通道連接。
於較佳實施例中，本發明上下雙層培養之微流道生物反應器，該微流道層40之注入口41與輸出口42係位於同側，請參考第四圖所顯示之分解圖，且該微流道層40進一步具有一通道49，該通道49與該微流道底板30之該第二通道32以及該微流道頂板50之該第四通道 52相連接，因此在該第一細胞培養層20中的培養液體，能連續通過該微流道底板30之該第二通道32、該微流道層40之該通道49以及該微流道頂板50之該第四通道52，到達該第二細胞培養層60內，使培養液體具有最佳的使用方式。
於較佳實施例中，本發明上下雙層培養之微流道生物反應器，該第二細胞培養層60係為聚二甲基矽氧烷。
於較佳實施例中，本發明上下雙層培養之微流道生物反應器，該第二細胞培養層60之厚度係為100-400μm。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養基材10與該第二細胞培養基材70係為可用於細胞培養之基材，例如：培養皿、玻片等。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，該真空口43可進一步連接一真空裝置。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，該微流道底板30及該微流道頂板50係為玻璃。
於較佳實施例中，該玻璃係利用玻璃鑽孔機(LAPIDARY & SONIC ENT.)製作該微流道底板30之第一通道31、第二通道32以及孔洞33與該微流道頂板50之第三通道51、第四通道52以及孔洞53。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，該聚二甲基矽氧烷與該玻璃係利用電漿處理機(PX-250，Plasma treatment System，AMERICA North)結合。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，該第一細胞培養基材10與該第二細胞培養基材70係利用雷射直刻技術(二氧化碳雷射機器，ILS-II，LASER TOOLS and TTECHNICS CORP.)切割成特定尺寸。
於較佳實施例中，本發明之微流道生物反應器，可進一步搭配一溫度控制裝置、一唧筒式幫浦、一液體注入管線、一液體輸出管線以及一真空裝置使用。
本發明提供一種使用微流道生物反應器培養細胞的方法，包含：(1)將細胞均勻培養於一細胞培養基材上；(2)將本發明之微流道生物反應器置於該細胞培養基材上，使微流道反應器之該第一細胞培養層與該細胞培養基材作結合；(3)使用一真空裝置藉由該真空口將該微流道生物反應器抽真空，用以產生負壓，使該第一細胞培養層與該細胞培養基材緊密貼合；(4)該真空裝置持續產生負壓，使該微氣泡消除裝置持續維持真空狀態；(5)將培養液體經由該注入口注入，該培養液經該第一擴散裝置之該開口通過該微流道底板之該第一通道進入該第一細胞培養層，其中該培養液所含之微氣泡經由該間隔層進入該微氣泡消除裝置；(6)該第一細胞培養層之培養液體經該微流道底板之該第二通道通過該第二擴散裝置之該開口流向該輸出口。
本發明提供一種培養細胞的套組，請參考第五圖，包含：本發明之微流道生物反應器；一細胞加載裝置80；及一黏合材料90。
於較佳實施例中，本發明之培養細胞的套組，可進一步包含一細胞培養基材10。
於較佳實施例中，本發明之培養細胞的套組，該黏合材料90係為雙面膠或聚二甲基矽氧烷，但本發明不限於此。
於較佳實施例中，本發明之培養細胞的套組，該細胞加載裝置80可進一步包含一真空管線81，該真空管線連接一真空裝置，用以產生負壓，使該細胞加載裝置80與該細胞培養基材10能緊密貼合。
使用本發明套組之方法包含：(1)將該細胞加載裝置80以該黏合材料90貼合於該細胞培養基材10上；(2)將細胞用一般細胞種植方法使其均勻貼附在細胞培養基材10上，使細胞被限定在細胞加載裝置80區域內生長；(3)移除該細胞加載裝置80；(4)將本發明之微流道生物反應器置於該細胞培養基材10上，並用上述之培養細胞的方法培養。
本發明微流道生物反應器之微氣泡消除過程，請同時參考第一圖、第二圖及第六圖，其描述如下：將培養液體由該微流體層40之注入口41注入，並流入至該第一擴散裝置45，微氣泡500會聚集在該第一擴散裝置45的邊緣，因間隔層48係為PDMS材質，該材質具有氣體通透性，能使微氣泡500通過而進入微氣泡消除裝置47，當真空口43抽真空時，所產生之負壓，可將微氣泡500抽離，而使其不會進入第一細胞培養層20中。同理，在上下雙層微流體生物反應器中，亦透過此負壓產生方式，而使微氣泡不會進入第二細胞培養層60中。請參考第 七圖所示具體實施例，圖中時間長度代表為小時，可見微氣泡從微流道層40逐漸消失。
經本發明微流道生物反應器所培養的細胞，其結果如以下實施例所示：
實施例一、小鼠間葉幹細胞於微流道生物反應器中之生長情形
小鼠間葉幹細胞係萃取自7週大C57BL/6J品系小鼠之骨髓，其中該小鼠來源為國家動物培養中心(National Laboratory Animal Center Taipei,Taiwan)。將取出的間葉幹細胞分別培養於一般生物培養皿(6公分，BD Falcon)及本發明之微流道生物反應器中，以940l/hr的流速來培養細胞，並加入DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Sigma-Aldrich)培養液體進行培養。
細胞培養的結果請參考第八圖所示，上排為採用一般生物培養皿所培養的結果，下排為使用本發明之微流道生物反應器所培養的結果。在第0-3天的生長過程中，小鼠間葉幹細胞於本發明之微流道生物反應器中的生長情形及形態，與一般培養皿中皆相同，且比較其生長曲線，如第九圖所示，亦無明顯差異。再分析其幹細胞表面抗原標記，如第十圖所示，圖中X座標軸代表相對螢光強度，Y座標軸代表細胞數目，小鼠間質幹細胞之CD29、CD34、CD73、CD105、CD117、Sca-1的表現於本發明微流道生物反應器及一般培養皿是一樣的，顯示用本發明微流道生物反應器培養小鼠間葉幹細胞，可維持其原本特性。
實施例二、人類間葉幹細胞於微流道生物反應器中之生長情形
人類間葉幹細胞(Lonza,PT-2501)的培養基為Iscove’s modified Dulbecco’s medium(IMDM,Gibco BRL,Grand Island,NY,USA)，將人類間葉幹細胞分別培養於一般生物培養皿及本發明微流道生物反應器中，以940l/hr的流速來培養細胞。請參考第十一圖，圖中星號代表有統計學上的差異，在第0-9天的生長過程中，人類間葉幹細胞於本發明微流道生物反應器中的生長速率優於一般培養皿中。進一步分析其幹細胞表面抗原標記，如第十二圖所示，圖中X座標軸代表相對螢光強度，Y座標軸代表細胞數目，人類間質幹細胞之IgG1、CD90、CD105、CD45的表現於本發明微流道生物反應器及一般培養皿是一樣的，顯示用本發明微流道生物反應器培養人類間葉幹細胞，可維持其原本特性。
實施例三、人類胚胎幹細胞及誘導性多功能幹細胞於微流道生物反應器中之生長情形
人類胚胎幹細胞GE09(美國國家衛生研究院)及誘導性多功能幹細胞CFB46(Y.C.Huang HP,Chen HF,Chen PH,Chuang CY,Lin SJ,"Factors from human embryonic stem cell-derived fibroblast-like)，其培養基皆為DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Sigma-Aldrich)，將人類胚胎幹細胞及誘導性多功能幹細胞分別培養於一般生物培養皿及本發明微流道生物反應器中，該微流道生物反應器之流速為1100μl/hr。請參考第十三、十四圖，圖中星號代表具 統計學上的差異，在第0-3天的生長過程中，人類胚胎幹細胞(第十三圖)及誘導性多功能幹細胞(第十四圖)於本發明微流道生物反應器中的生長速率皆優於一般培養皿中。且人類誘導性多功能幹細胞的生長情形及型態皆與一般培養皿中相同，如第十五圖所示。進一步利用免疫螢光染色法比較螢光表現的結果，請參考第十六圖，其中階段特異性抗原SSEA4(stage-specific embryonic antigen 4)及TRA1-60 &1-81(tumor rejection antigen 1-60 & 1-80)為人類胚胎幹細胞之表面抗原標記，DAPI係用來標示細胞核。由以上結果顯示用本發明微流道生物反應器培養人類胚胎幹細胞及誘導性多功能幹細胞，可維持其原本特性。
綜上所述，本發明提供之微流道生物反應器，其尺寸可根據培養細胞的需求量不同，而設計其相對應之細胞培養面積大小。於較佳實施例中，細胞培養面積的尺寸為324cm2，相對應之細胞產量大約為2x107cells細胞。不僅如此，相對於傳統微機電製程而言，利用雷射直刻式技術來製作微流體反應器，可加快製程速度，從幾天縮短至幾個小時。且相較於傳統微電製程，其不受限於加工面積限制，因此可用於製作更大型微流體生物反應器。本發明所提供之微流道生物反應器，主要利用快速且大面積之簡易製程來製作，並將此微流道生物反應器之主體與細胞培養基材利用負壓產生貼合，以形成密閉效果，而達成開蓋式之微流道生物反應器。
10‧‧‧第一細胞培養基材
20‧‧‧第一細胞培養層
21‧‧‧第一細胞培養室
30‧‧‧微流道底板
31‧‧‧第一通道
32‧‧‧第二通道
33‧‧‧孔洞
40‧‧‧微流道層
50‧‧‧微流道頂板
100‧‧‧微流體生物反應器

Claims (17)

  1. 一種微流道生物反應器，其係包含以下結構：一第一細胞培養層，該第一細胞培養層係為一封閉迴路，使其內部形成一第一細胞培養室；一微流道底板，其位於該第一細胞培養層之上面，且該底板具有一第一通道、一第二通道以及一孔洞，該第一通道及該第二通道的位置係相對於該第一細胞培養室之內，且該孔洞的位置係相對於該第一細胞培養層之封閉迴路中；一微流道層，其位於該微流道底板之上面，且該微流道層係包含：一注入口，一端為一開口，另一端連接一彎曲通道；一第一擴散裝置，一端連接於該彎曲通道，另一端與一間隔層連接，該第一擴散裝置內具有一開口，可與該微流道底板之該第一通道連接；一微氣泡消除裝置，其係為一真空通道，該微氣泡消除裝置之一端與該間隔層連接，另一端與一真空口連接，且其真空通道與該微流道底板之孔洞連接；及一輸出口，一端為一開口，另一端連接一第二擴散裝置，該第二擴散裝置內具有一開口，可與該微流道底板之該第二通道連接；一微流道頂板，其位於該微流道層之上面；以及一第二細胞培養層，其位於該微流道頂板之上面，該第二細胞培養層係為一封閉迴路，使其內部形成一第二細胞培養室；其中，該微流道頂板進一步具有一第三通道、一第四通道以及一孔洞， 該第三通道及該第四通道的位置係相對於該第二細胞培養室之內，該孔洞的位置係相對於該第二細胞培養層之封閉迴路中，且與該微流道層之該真空通道連接。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，該第一擴散裝置及該第二擴散裝置係為扇形。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，該注入口與輸出口可位於同側或異側。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，該第一細胞培養層、該微流道層以及該間隔層係為聚二甲基矽氧烷。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，進一步包含一第一細胞培養基材，其位於該第一細胞培養層之下面，且該第一細胞培養基材之面積係大於該第一細胞培養層。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之微流道生物反應器，該第一細胞培養基材係為培養皿、玻片。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，可進一步搭配一細胞加載裝置及一黏合材料使用。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，其進一步包含：一第二細胞培養基材，其位於該第二細胞培養層之上面，且該第二細胞培養基材之面積係大於該第二細胞培養層。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，該第二細胞培養層係為聚二甲基矽氧烷。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之微流道生物反應器，該第二細胞培養基材 係為培養皿、玻片。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器，該真空口可進一步連接一真空裝置。
  12. 一種使用微流道生物反應器培養細胞的方法，包含：(1).將細胞均勻培養於一細胞培養基材上；(2).將如申請專利範圍第1項所述之該微流道生物反應器置於該細胞培養基材上，使微流道反應器之該第一細胞培養層與該細胞培養基材作結合；(3).使用一真空裝置藉由該真空口將該微流道生物反應器抽真空，用以產生負壓，使該第一細胞培養層與該細胞培養基材緊密貼合；(4).該真空裝置持續產生負壓，使該微氣泡消除裝置持續維持真空狀態；(5).將培養液體經由該注入口注入，該培養液經該第一擴散裝置之該開口通過該微流道底板之該第一通道進入該第一細胞培養層，其中該培養液所含之微氣泡經由該間隔層進入微氣泡消除裝置；(6).於該第一細胞培養層之培養液體經該微流道底板之該第二通道通過該第二擴散裝置之該開口流向該輸出口。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，該細胞係為幹細胞。
  14. 一種培養細胞的套組，包含：一如申請專利範圍第1項所述之微流道生物反應器；一細胞加載裝置；及一黏合材料。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之套組，可進一步包含一細胞培養基材。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之套組，該黏合材料為雙面膠或聚二甲基矽氧烷。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之套組，該細胞加載裝置可進一步包含一真空管線。
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