TWI509067B - 體外細胞自動抓取共養平台系統 - Google Patents

Description

體外細胞自動抓取共養平台系統

本發明係揭露一種體外細胞自動抓取共養平台系統，其目的在於開發一種運用於細胞培養系統之生物晶片設計，係利用微流道技術來達到減化製程的功效並有效解決細胞共養與細胞定位之相關問題。

細胞培養是生物科技中重要的一環，然而目前習知的培養技 術仍以在培養皿上進行液珠培養較為常見，單一細胞培養雖可容易控制培育參數，但忽略了實際多種細胞間之相互影響，再者，培養皿的培育環境並無法有效模擬細胞之培育環境，使著培育出的細胞品質仍有待提升。

有眾多學者提出可利用生物晶片來改善培育品質，並且發現對於培育細胞施以外加的物理性刺激(電場、流場、磁場、溫度場或其組合)能有效提升細胞的培育品質，但各種刺激參數之優劣尚未有所定論。

再者，細胞於生物晶片中的定位步驟仍有待突破，習知利用人工逐一配置容易因夾持力道的差異，而對細胞產生損傷進而影響到培育品質。

綜觀前所述，是故，本發明之發明人經多年苦心潛心研究、思索並設計一種體外細胞自動抓取共養平台系統，以針對現有技術之缺失加以改善，進而增進產業上之實施利用。

有鑑於上述習知之問題，本發明之目的係提出一種體外細胞自動抓取共養平台系統，係利用微流道技術來達到減化製程的功效並有效解決習知細胞共養與細胞定位之相關問題。

有鑑於上述習知之問題，本發明之目的係提出一種體外細胞自動抓取共養平台系統，係整合細胞共養、動態灌流及抓取定位等多項功能進行整合設計，並將晶片製程、結構與操作步驟簡化，以建構出適合細胞生長之微環境，進而達成細胞培養之目的。

有鑑於上述習知之問題，本發明之目的係提出一種體外細胞自動抓取共養平台系統，藉由動態灌流以適時汰換培養基，以避免細胞生成之排泄物或死亡細胞堆積於細胞共養平台中，進而影響到培育品質。

有鑑於上述習知之問題，本發明之目的係提出一種體外細胞自動抓取共養平台系統，藉由晶片化設計能有效提升操作人員之檢測效率並降低人為操作所造成之影響。

基於上述目的，本發明係提供一種體外細胞自動抓取共養平台系統，其包含動態培養流道模組、複數個細胞共養平台、抓取定位流道模組以及控制模組。

動態培養流道模組可包含培養基注入端、培養基回收端及複數個灌流流道，複數個灌流流道之一端係以培養基注入端為中心輻射排列，複數個灌流流道之另一端係匯流於培養基回收端。複數個細胞共養平台，可為提供複數個基底細胞與複數個培育細胞進行細胞共養之區域，複數個細胞共養平台係以培養基注入端為圓心排列，且每一複數個細胞共養平台係被相對應之每一複數個灌流流道貫穿，並於每一複數個細胞共養平台以形成相對應之每一複數個細胞定位區。

抓取定位流道模組可包含細胞注入端、細胞吸引端及細胞流道，細胞流道係環狀環繞且貫穿複數個細胞共養平台，並環繞於複數個細胞共養平台之外側且與複數個灌流流道相連接。

控制模組，當進行培育細胞定位程序時，控制模組先封閉培養基注入端及培養基回收端，並開啟細胞注入端及細胞吸引端，再於細胞注入端注入複數個培育細胞，複數個培育細胞可藉由細胞流道流經複數個細胞共養平台，並依據動態流阻之差異分別停留於相對應之複數個細胞定位區，當複數個培育細胞定位於複數個細胞定位區後，控制模組封閉細胞注入端及細胞吸引端並開啟培養基注入端及培養基回收端，並從培養基注入端注入培養基以進行細胞共養之一動態灌流培養程序。

較佳地，複數個培育細胞可包含胚胎細胞、器官組織細胞或幹細胞。

較佳地，複數個基底細胞可為相對應複數個培育細胞之共生細胞族群。

較佳地，複數個細胞定位區之結構尺寸係小於相對應之複數個培育細胞之尺寸。

較佳地，當複數個細胞共養平台進行一初步培養程序時，控制模組先封閉細胞注入端及細胞吸引端，再於培養基注入端注入包含複數個基底細胞之培養基，培養基可藉由複數個灌流流道以流動分散至複數個細胞共養平台中，複數個基底細胞附著於複數個細胞共養平台中，以進行初步培養程序。

較佳地，當複數個培育細胞分別定位於複數個細胞定位區後，未定位於複數個細胞定位區之複數個培育細胞係於細胞吸引端回收。

較佳地，控制模組從複數個灌流流道輸入培養基，以將複數個培育細胞回沖至培養基注入端，並於培養基注入端取出複數個培育細胞。

較佳地，複數個培育細胞之注入流量範圍可為0.05~10μl/min。

較佳地，動態灌流培養程序之培養基之注入流量範圍可為0.01~5μl/min。

本發明之主要目的係在於提供一種體外細胞自動抓取共養平台，其可具有下述多個優點：

1.微環境建構：藉由不同之微流道結構，以建構出適合細胞生長之微環境，進而達成細胞培養之目的。

2.共養平台建構：建構適合同時培養多種細胞之結構平台，以模擬多種細胞於培養過程中之相互影響，以改善習知僅針對單一細胞培養之缺點。

3.動態灌流系統：除了能動態汰換培養基以外，更能於培養基置換過程中對細胞施加外力刺激，以提升細胞培養之品質及效率。

4.細胞抓取定位：藉由計算微流道系統中之動態流阻以進行微流道結構設計，並讓細胞在適當之驅動流速下能自動定位於所預設之區域內，以避免細胞受損。

5.環狀陣列設計：複數個細胞共養平台係以培養基注入端為圓心進行環狀陣列排列，能有效降低流場之紊流現象，以降低流場之剪應力對培育細胞造成過多的外力影響，進而提升細胞培養之品質。

為了讓上述目的、技術特徵以及實際實施後之增益性更為明顯易懂，於下文中將係以較佳之實施範例輔佐對應相關之圖式來進行更詳細之說明。

10‧‧‧動態培養流道模組

11‧‧‧培養基注入端

12‧‧‧培養基回收端

13‧‧‧複數個灌流流道

20‧‧‧細胞共養平台

30‧‧‧抓取定位流道模組

31‧‧‧細胞注入端

32‧‧‧細胞吸引端

33‧‧‧細胞流道

35‧‧‧細胞定位區

40‧‧‧控制模組

50‧‧‧培育細胞

51‧‧‧基底細胞

511‧‧‧生成基底細胞

60‧‧‧培養基

70‧‧‧流道系統外模

80‧‧‧基板

Q‧‧‧流體流量

R1‧‧‧第一路徑

R2‧‧‧第二路徑

R3‧‧‧第三路徑

A~I‧‧‧流道系統節點

本發明之上述及其他特徵及優勢將藉由參照附圖詳細說明其例示性實施例而變得更顯而易知，其中：

第1圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之晶片流道系統結構示意圖。

第2圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之晶片流道系統示意圖。

第3圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之動態流阻概念示意圖。

第4圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之細胞抓取定位流程示意圖。

第5圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之共養平台流道示意圖。

第6圖係為本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之體外細胞培育流程示意圖。

為利 貴審查員瞭解本發明之特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍。

本發明之優點、特徵以及達到之技術方法將參照例示性實施例及所附圖式進行更詳細地描述而更容易理解，且本發明或可以不同形式來實現，故不應被理解僅限於此處所陳述的實施例，相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。

請同時參閱第1圖及第2圖，由圖中可知悉，本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統係包含動態培養流道模組10、細胞共養平台20、抓取定位流道模組30及控制模組40。動態培養流道模組10包含培養基注入端11、培養基回收端12及複數個灌流流道13，複數個灌流流道13之一端係以培養基注入端11為中心輻射排列，複數個灌流流道13之另一端係匯流於培養基回收端12。

複數個細胞共養平台20，為提供複數個基底細胞51與複數個培育細胞50進行細胞共養之區域，複數個細胞共養平台20係以培養基注入端11為圓心排列，且每一複數個細胞共養平台20係被相對應之每一複數個灌流流道13貫穿，並於每一複數個細胞共養平台20以形成相對應之每一複數個細胞定位區35。

抓取定位流道模組30包含細胞注入端31、細胞吸引端32及細胞流道33，細胞流道33係環狀環繞且貫穿複數個細胞共養平台20，並環繞於複數個細胞共養平台20之外側且與複數個灌流流道13相連接。

控制模組40，係控制體外細胞自動抓取共養平台系統之各流程步驟，此控制模組40可藉由操作者於培育台中進行手動操控，亦可藉由自動化設備以可程式化自動操控，以降低人員操作之影響及提升細胞之培育效率。

本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統係以晶片型態呈現，故利用光阻顯影以建構整體之流道系統之母模，再經由軟模翻印製程方式將母模翻製成流道系統外模70，並結合於基板80上以便於移動檢測，基板80可為壓克力基板或玻璃基板。

其中流道系統外模70之材質為具生物相容性之高分子材料，合成高分子生醫材料有聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、聚乙烯(polyethylene,PE)、矽膠(silicone rubber or polydimethylsiloxane)、聚酯類高分子(polyester)、四氟化聚乙烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)、聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)與聚胺基甲酸酯(polyurethane,PU)等。天然生醫高分子材料膠原蛋白(collagen)、明膠(gelatin)、透明質酸(hyaluronic acid)、幾丁質(chitin)、幾丁聚醣(chitosan)、褐藻酸(alginate)、纖維素(cellulose)及其衍生物等。

請參閱第3圖，由圖中可知悉，本發明係利用動態流阻之概念以將細胞自動定位於細胞定位區35，藉由計算微流道系統中之動態流阻以進行微流道結構設計，並讓細胞在適當之驅動流速下能自動定位於所預設之區域內，以避免細胞受損，其概念詳述如下：

當流體流量Q由細胞注入端31注入到細胞流道33中時，首先第一路徑R1係依序通過流道系統節點A、B、C及D，此第一路徑R1之流阻較小使得第一路徑R1之流量較大，能將細胞優先定位於細胞共養平台20與灌流流道13所形成之細胞定位區35中，以第3圖為例說明時，流道系統節點C即為細胞定位區35。

當細胞自動抓取定位於流道系統節點C時，因流道系統節點C阻塞使流阻增加，流體流量Q則沿流道系統節點A、B、E、F、G、H及D所形成之第二路徑R2流動，將細胞定位於流道系統節點G。

當各細胞定位區35均被細胞所阻塞時，流體流量Q則沿流道系統節點A、B、E、F、I、H及D所形成之第三路徑R3流動，將未定位之細胞藉由流經細胞流道33於細胞吸引端32匯集以回收細胞檢體。

請參閱第4圖，其係為細胞抓取定位流程之示意圖。由圖中可知悉，當進行培育細胞50定位程序時，控制模組40先封閉培養基注入端11及培養基回收端12，使動態培養流道模組10成封閉態樣，並開啟細胞注入端31及細胞吸引端32以暢通細胞流道33，再於細胞注入端31注入複數個培育細胞50，複數個培育細胞50可藉由細胞流道33流經複數個細胞共養平台20，並依據動態流阻之差異分別停留於相對應之複數個細胞定位區35。

細胞定位區35之結構尺寸係小於相對應之培育細胞50之尺寸，再者細胞定位區35的結構可為單層結構或利用多重結構以調整灌流流道13貫穿細胞共養平台20之開口尺寸。

請參閱第5圖，由圖中可知悉，細胞共養平台20為提供基底細胞51與培育細胞50進行細胞共養之區域，複數個細胞共養平台20係以培養基注入端11為圓心排列，且每一複數個細胞共養平台20係被相對應之每一複數個灌流流道13貫穿，並於每一複數個細胞共養平台20以形成相對應之每一複數個細胞定位區35。

進一步說明，本實施例之複數個細胞共養平台20僅以5個為例，但不以此為限。複數個細胞共養平台20以培養基注入端11為圓心進行環狀陣列排列，能有效降低流場之紊流現象，以降低流場之剪應力對培育細胞50造成過多的外力影響，進而提升細胞培養之品質。培育細胞50可包 含胚胎細胞、器官組織細胞或幹細胞，而基底細胞51則為相對應培育細胞50之共生細胞族群。

請參閱第6圖，其係為體外細胞培育流程示意圖。由圖中可知悉，流程步驟說明如下：當複數個細胞共養平台20進行一初步培養程序時，控制模組40先封閉細胞注入端31及細胞吸引端32，再於培養基注入端11注入包含複數個基底細胞51之培養基60。培養基60可藉由複數個灌流流道13以流動分散至複數個細胞共養平台20中，複數個基底細胞51附著於複數個細胞共養平台20中，以進行初步培養程序。

動態灌流培養一段時間後，附著於細胞共養平台20之基底細胞51可培育為生成基底細胞511，此生成基底細胞511填充於細胞共養平台20內部以建構出適合培育細胞50生長之微環境。利用細胞共養平台20以模擬多種細胞於培養過程中之相互影響，能改善習知僅針對單一細胞培養之缺點。

當微環境建構完成後，則進行培育細胞50之自動定位程序，控制模組40先封閉培養基注入端11及培養基回收端12，並開啟細胞注入端31及細胞吸引端32，再於細胞注入端31注入複數個培育細胞50。複數個培育細胞50可藉由細胞流道33流經複數個細胞共養平台20，並依據動態流阻之差異分別停留於相對應之複數個細胞定位區35。其中培育細胞50之注入流量範圍可為0.05~10μl/min。

當複數個細胞定位區35分別自動定位複數個培育細胞50後，尚未定位於複數個細胞定位區35之複數個培育細胞50則經由細胞流道33流至細胞吸引端32以進行檢體回收。

續言之，當複數個培育細胞50定位於複數個細胞定位區35後，控制模組40封閉細胞注入端31及細胞吸引端32並開啟培養基注入端11及培養基回收端12，並從培養基注入端11注入培養基60以進行細胞共養之動態灌流培養程序。培養基60之種類係可依據相對應之培養步驟以調整替換。動態灌流培養程序除了能動態汰換培養基60以外，更能於培養基60置換的過程中對培育細胞50施加外力刺激，以提升培育細胞50之培養品質及效率。其中動態灌流培養程序之培養基60之注入流量範圍可為0.01~5μl/min。

當培育細胞50生長到目標階段時，可選擇發育最佳之培育細胞50，藉由控制模組40從複數個灌流流道13反向輸入培養基60，以將培育細胞50回沖至培養基注入端11，並於培養基注入端11取出發育最佳之培育細胞50，以提升後續細胞培養之成功機率及品質。

舉例說明，本發明之體外細胞自動抓取共養平台系統之培育係採用子宮內膜細胞為基底細胞51，小鼠之受精胚胎為培育細胞50為例進行說明，但不以此為限。

培養基60則隨培育過程中選擇適當之種類，例如：在培育基底細胞51時，選用DMEM培養基以將子宮內膜細胞穩定且均勻地於細胞共養平台20中進行初步培育，以建構成適合培育細胞50成長之微環境。此時之動態灌流培養之培養基60注入流量範圍為0.05~2μl/min。由顯微鏡等觀察設備檢測紀錄得知，基底細胞51在第二天時已趨於穩定成長，此時即可將培育細胞50由抓取定位流道模組30注入以進行細胞定位。此時之培育細胞 50之注入流量範圍係為0.01~1μl/min。由觀察設備可得知，本發明之晶片系統能有效將培育細胞50定位於相對應之細胞定位區35中。

隨之，將培養基60置換成可同時培育子宮內膜細胞與胚胎細胞之M16培養基，以進行共養步驟。此時此時之動態灌流培養之培養基60注入流量範圍為0.01~1μl/min，以適時汰換汰換培養基60，以避免細胞生成之排泄物或死亡細胞堆積於細胞共養平台20中，進而影響到培育品質。

由實驗結果發現，利用本發明之晶片系統所培育的胚胎細胞成長速度較傳統之培養皿培育來著快，能將八細胞的小鼠胚胎於24小時後培育至囊胚期，證明子宮內膜細胞之生長因子有利於胚胎細胞之發展，且亦證明本發明之晶片系統亦確實能建構出適合胚胎細胞生長之微環境，本發明係可應用於生物晶片、細胞培養等有關之領域，尤其特別適用於輔助生殖技術，能協助各醫院生殖醫學中心進行相關研究。

以上所述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

10‧‧‧動態培養流道模組

11‧‧‧培養基注入端

12‧‧‧培養基回收端

13‧‧‧複數個灌流流道

20‧‧‧細胞共養平台

30‧‧‧抓取定位流道模組

31‧‧‧細胞注入端

32‧‧‧細胞吸引端

33‧‧‧細胞流道

35‧‧‧細胞定位區

40‧‧‧控制模組

70‧‧‧流道系統外模

80‧‧‧基板

Claims (8)

1. 一種體外細胞自動抓取共養平台系統，係包含：一動態培養流道模組，係包含一培養基注入端、一培養基回收端及複數個灌流流道，該複數個灌流流道之一端係以該培養基注入端為中心輻射排列，該複數個灌流流道之另一端係匯流於該培養基回收端；複數個細胞共養平台，係為提供複數個基底細胞與複數個培育細胞進行細胞共養之區域，該複數個細胞共養平台係以該培養基注入端為圓心排列，且該複數個細胞共養平台每一個係被相對應之該複數個灌流流道每一個貫穿，並於該複數個細胞共養平台每一個分別形成相對應之一細胞定位區，其中複數個該細胞定位區之結構尺寸係小於相對應之該複數個培育細胞之尺寸；一抓取定位流道模組，係包含一細胞注入端、一細胞吸引端及一細胞流道，該細胞流道係環狀環繞且貫穿該複數個細胞共養平台，並環繞於該複數個細胞共養平台之外側且與該複數個灌流流道相連接；以及一控制模組，當進行一培育細胞定位程序時，該控制模組先封閉該培養基注入端及該培養基回收端，並開啟該細胞注入端及該細胞吸引端，再於該細胞注入端注入該複數個培育細胞，該複數個培育細胞係藉由該細胞流道流經該複數個細胞共養平台，並依據動態流阻之差異分別停留於相對應之複數個該細胞定位區，當該複數個培育細胞定位於複數個該細胞定位區後，該控制模組封閉該細胞注入端及該細胞吸引端並開 啟該培養基注入端及該培養基回收端，並從該培養基注入端注入一培養基以進行細胞共養之一動態灌流培養程序。
2. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中該複數個培育細胞係包含胚胎細胞、器官組織細胞或幹細胞。
3. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中該複數個基底細胞係為相對應該複數個培育細胞之共生細胞族群。
4. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中當該複數個細胞共養平台進行一初步培養程序時，該控制模組先封閉該細胞注入端及該細胞吸引端，再於該培養基注入端注入包含該複數個基底細胞之該培養基，該培養基係藉由該複數個灌流流道以流動分散至該複數個細胞共養平台中，該複數個基底細胞附著於該複數個細胞共養平台中，以進行該初步培養程序。
5. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中當該複數個培育細胞分別定位於複數個該細胞定位區後，未定位於複數個該細胞定位區之該複數個培育細胞係於該細胞吸引端回收。
6. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中該控制模組從該複數個灌流流道輸入該培養基，以將該複數個培育細胞回沖至該培養基注入端，並於該培養基注入端取出該複數個培育細胞。
7. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統， 其中該複數個培育細胞之注入流量範圍係為0.05~10μl/min。
8. 如申請專利範圍第1項所述之體外細胞自動抓取共養平台系統，其中該動態灌流培養程序之該培養基之注入流量範圍係為0.01~5μl/min。