JP7322384B2 - 培地充填液、培地充填方法、培養容器、及び培地充填用気泡除去装置 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養技術に関し、特に微小な凹部を備えた培養容器を用いて培養を行う技術に関する。
近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞等の接着細胞を大量に培養する場合には、細胞を培養容器に接着させて増殖させるだけではなく、細胞に対して接着性の低い材料を塗工したマイクロウェルプレートなどの培養容器を使用して、スフェア（スフェロイド，凝集塊）を形成させることによって、細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養する方法が用いられている。
このような培養では、微小な凹部（ウェル）が多数形成されている培養容器が用いられる場合がある。ところが、この培養容器に培地を充填すると、微小凹部に気泡が閉じ込められて溜まってしまい、細胞培養に支障が出るという問題があった。すなわち、微小凹部に気泡が残ると、スフェアの形成が阻害されてしまうが、微小凹部から全ての気泡を除去することは、極めて困難であった。
ここで、微小凹部に溜まった気泡を除去するために、マイクロピペットなどを用いて気泡に液を拭きかけることにより、水圧で気泡を除去することが行われている。
しかしながら、このようなピペットによる操作では気泡を除去できない場合があった。
しかしながら、このようなピペットによる操作では気泡を除去できない場合があった。
すなわち、このようなピペット操作による方法では、凹部の開口部の直径が１ｍｍ以下の場合には、気泡を除去することが難しく、凹部の開口部の直径が０．２ｍｍ以下の場合には、気泡を除去することが非常に困難であった。
また、この方法では、たとえ気泡を除去できても、培養容器の培養面が大きい場合には、非常に手間がかかり、また培養容器を長時間開放させた状態での操作が必要になるため、培養容器内を汚染する危険性が高くなるという問題もあった。
また、この方法では、たとえ気泡を除去できても、培養容器の培養面が大きい場合には、非常に手間がかかり、また培養容器を長時間開放させた状態での操作が必要になるため、培養容器内を汚染する危険性が高くなるという問題もあった。
このような問題の解消に関連する技術として、特許文献１に記載の加振装置を挙げることができる。
この加振装置には、培養容器を底面と直交する方向へ加振する加振部が備えられており、培養容器に振動を与えることによって、培養容器の凹部に溜まった気泡を除去する構成となっている。
このような加振装置によれば、気泡の大きさや形状によってはこれを除去することができるが、一方で振動だけでは除去できない場合があった。また、培養容器の培養面が大きい場合には手間がかかり、加振装置を用いるためのコストが必要になるという問題があった。さらに、振動によって培養容器から液が飛び出し、周辺に培地をこぼす危険性もあった。
この加振装置には、培養容器を底面と直交する方向へ加振する加振部が備えられており、培養容器に振動を与えることによって、培養容器の凹部に溜まった気泡を除去する構成となっている。
このような加振装置によれば、気泡の大きさや形状によってはこれを除去することができるが、一方で振動だけでは除去できない場合があった。また、培養容器の培養面が大きい場合には手間がかかり、加振装置を用いるためのコストが必要になるという問題があった。さらに、振動によって培養容器から液が飛び出し、周辺に培地をこぼす危険性もあった。
また、特許文献２に記載のマイクロウェルプレート用撹拌・脱泡装置を挙げることもできる。この装置によれば、マイクロウェルプレートを公転及び自転させることにより、マイクロウェルプレートのウェル内の溶液を同時に均一に撹拌して、溶液中の微小な気泡を除去することを可能としている。
この撹拌・脱泡装置によれば、直径が約２ｍｍ程度のウェル（１５３６ウェル）の場合は、気泡を除去できるが、直径が１ｍｍ以下のウェルや、さらに直径が０．２ｍｍ以下のウェルに対しては、この装置のような遠心による方法では、気泡を完全に除去することは難しかった。
この撹拌・脱泡装置によれば、直径が約２ｍｍ程度のウェル（１５３６ウェル）の場合は、気泡を除去できるが、直径が１ｍｍ以下のウェルや、さらに直径が０．２ｍｍ以下のウェルに対しては、この装置のような遠心による方法では、気泡を完全に除去することは難しかった。
また、これらの従来の方法や装置では、Ａ４サイズなどの大きな培養面を有する培養容器の凹部から気泡を除去する場合には、適用することが難しかった。
そこで、本発明者らは鋭意研究し、培養容器に培地を充填するのに先だって、培養容器にまず脱気した培地充填液を充填して一定時間静置させることにより、培養容器における微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去できることを見いだした。
また、培養容器に培地を充填するのに先だって、培養容器に培地充填液を充填した後、真空排気装置により培養容器を真空にさらすことにより、培養容器における微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去できることを見いだした。
さらに、これらの方法によれば、培養面の大きな培養容器にも容易に適用することが可能であるため、スフェアなどの大量培養に好適に用いることが可能となる。
また、培養容器に培地を充填するのに先だって、培養容器に培地充填液を充填した後、真空排気装置により培養容器を真空にさらすことにより、培養容器における微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去できることを見いだした。
さらに、これらの方法によれば、培養面の大きな培養容器にも容易に適用することが可能であるため、スフェアなどの大量培養に好適に用いることが可能となる。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、微小凹部を有する培養容器を用いて細胞を培養するにあたり、微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、また培養面の大きな培養容器に容易に適用することが可能な培地充填液、培地充填方法、培養容器、及び培地充填用気泡除去装置の提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の培地充填液は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、前記凹部に溜まった気泡を除去する培地充填液であって、脱気されている構成としてある。
また、本発明の培地充填方法は、上記の培地充填液を、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に充填して一定時間静置させ、ついで前記培養容器に培地を通液して、前記培地充填液を培地に置き換える方法としてある。
また、本発明の培地充填方法は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、前記凹部に溜まった気泡を除去する培地充填方法であって、前記培養容器に培地充填液を充填した後、前記培地充填液を充填した状態で前記培養容器を真空排気装置に入れて、前記培地充填液における溶存空気量が５０％以下になるように真空引きを行う方法としてある。
また、本発明の培養容器は、上記の培地充填方法に用いられる複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器であって、前記培養容器が、軟包材からなる閉鎖系の培養バッグであり、チューブを接続したポートを有し、前記チューブの端部にフィルタを備えた構成としてある。
また、本発明の培地充填用気泡除去装置は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、前記凹部に溜まった気泡を除去する培地充填用気泡除去装置であって、真空排気装置を備え、前記培養容器に培地充填液を充填した後、前記培地充填液を充填した状態で前記培養容器を前記真空排気装置に入れて真空引きを行う構成としてある。
本発明によれば、微小凹部を有する培養容器を用いて細胞を培養するにあたり、微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、また培養面の大きな培養容器に容易に適用することが可能な培地充填液、培地充填方法、培養容器、及び培地充填用気泡除去装置の提供が可能となる。
以下、本発明の培地充填液、培地充填方法、培養容器、及び培地充填用気泡除去装置の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
まず、本発明の実施形態に係る培地充填液について詳細に説明する。
本実施形態の培地充填液は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、凹部に溜まった気泡を除去する培地充填液であって、脱気されていることを特徴とする。
本実施形態の培地充填液は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、凹部に溜まった気泡を除去する培地充填液であって、脱気されていることを特徴とする。
「脱気」とは、液体中の溶存空気を排出することであり、上記の「脱気されている」とは、培地充填液に溶存していた空気が一定程度まで除去された状態であることを意味する。
脱気は、減圧、加熱、超音波等の方法により行うことができる。減圧による脱気は、気圧を低くすることによって液体を沸騰させ、液体中に溶存していた空気を除去する方法である。減圧による真空度と水の沸騰する温度との関係は、以下の通りである。
脱気は、減圧、加熱、超音波等の方法により行うことができる。減圧による脱気は、気圧を低くすることによって液体を沸騰させ、液体中に溶存していた空気を除去する方法である。減圧による真空度と水の沸騰する温度との関係は、以下の通りである。
＜水の沸騰する温度＞ ＜真空度＞
１００．０℃ ７６０ Torr
５１．３℃ １００ Torr
３７．８℃ ５０ Torr
２２．０℃ ２０ Torr
１７．５℃ １５ Torr
１１．４℃ １０ Torr
７．９℃ ８ Torr
（１Torr≒１３３Pa）
１００．０℃ ７６０ Torr
５１．３℃ １００ Torr
３７．８℃ ５０ Torr
２２．０℃ ２０ Torr
１７．５℃ １５ Torr
１１．４℃ １０ Torr
７．９℃ ８ Torr
（１Torr≒１３３Pa）
例えば、室温が２２℃の場合、培地充填液を収容した容器を真空チャンバに入れて減圧し、２０Torr（２．６７ｋPa)の真空度で、１分程度保持することによって、培地充填液における溶存空気量を１０％以下にすることができる。
本実施形態の培地充填液は、溶存空気量が５０％以下に脱気されていることが好ましく、１０％以下に脱気されていることがより好ましい。
本実施形態の培地充填液は、溶存空気量が５０％以下に脱気されていることが好ましく、１０％以下に脱気されていることがより好ましい。
本実施形態の培地充填液は、培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝液のいずれかを脱気させて得られたものとすることが好ましく、その後の培養に悪影響を及ぼさないものであれば、特に限定されない。
ここで、培地充填液にタンパク質が含まれていると、培養容器の凹部から気泡が除去されて凹部の表面が一旦培地充填液によって濡れた後に、その状態を保持しやすいことが分かった。このため、培地充填液としては、培地を用いることが好ましく、また生理食塩水やリン酸緩衝液に例えばアルブミンなどのタンパク質を溶解したものを用いることも好ましい。
ここで、培地充填液にタンパク質が含まれていると、培養容器の凹部から気泡が除去されて凹部の表面が一旦培地充填液によって濡れた後に、その状態を保持しやすいことが分かった。このため、培地充填液としては、培地を用いることが好ましく、また生理食塩水やリン酸緩衝液に例えばアルブミンなどのタンパク質を溶解したものを用いることも好ましい。
また、本実施形態の培地充填液は、ガスバリア性を有する容器に封入されたものとすることが好ましい。具体的には、例えば、ガラスやアルミパックなどからなる容器に封入されたものとすることが好ましい。
本実施形態の培地充填液をこのような構成にすれば、長期保存に適したものとすることができる。
本実施形態の培地充填液をこのような構成にすれば、長期保存に適したものとすることができる。
なお、本実施形態において、培養対象物としては、シングルセル（単一細胞）やスフェア（スフェロイド，凝集塊）、オルガノイド等とすることができ、培養可能なものであればよく、特に限定されない。
ここで、マイクロウェルプレートに培地を充填した直後の状態の写真を図１に示す。
左側の写真は、箱形（四角柱状）のウェルを備えたマイクロウェルプレートを示し、右側の写真は、四角錐状のウェルを備えたマイクロウェルプレートを示す。これらの凹部の開口部の一辺は、０．２ｍｍである。
これらの図に示すように、いずれの写真でも全てのウェルに気泡が溜まっていることが分かる。
左側の写真は、箱形（四角柱状）のウェルを備えたマイクロウェルプレートを示し、右側の写真は、四角錐状のウェルを備えたマイクロウェルプレートを示す。これらの凹部の開口部の一辺は、０．２ｍｍである。
これらの図に示すように、いずれの写真でも全てのウェルに気泡が溜まっていることが分かる。
なお、箱形のウェルでは気泡は球状を示し、四角錐状のウェルでは気泡は四角錐状を示している。その理由は、箱形のウェルでは気泡が球状でウェルに収容されるサイズである一方、四角錐状のウェルでは気泡が球状でウェルに収容できないサイズであるため、表面張力によりウェルの壁面に沿った形状で収容されていると考えられる。
次に、四角錐状のウェルを備えたマイクロウェルプレートを２枚用意し、一方に本実施形態に係る培地充填液を充填し（実施例１）、もう一方に培地を充填して（比較例１）、１２時間静置させた状態を図２に示す（詳細については、実施例において後述する）。
その結果、実施例１のマイクロウェルプレートでは、気泡が完全に除去されたことが分かる。これに対して、比較例１のマイクロウェルプレートでは、気泡の一部が自然になくなっているものの、完全には除去されてはおらず、多くの気泡がウェルに残存していることが分かる。
その結果、実施例１のマイクロウェルプレートでは、気泡が完全に除去されたことが分かる。これに対して、比較例１のマイクロウェルプレートでは、気泡の一部が自然になくなっているものの、完全には除去されてはおらず、多くの気泡がウェルに残存していることが分かる。
このように本実施形態の培地充填液によれば、培養容器の微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することが可能である。また、これを培養面の大きな培養容器に適用することも容易である。さらに、従来の加振装置などを用いる必要がないため、周辺を汚染する危険性を排除することも可能となっている。
本実施形態の培地充填方法は、上記の培地充填液を、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に充填して一定時間静置させ、ついで培養容器に培地を通液して、培地充填液を培地に置き換えることを特徴とする。
このとき、培養容器の複数の凹部における開口部の円又は内接円の直径は、２ｍｍ以下であることが好ましく、１．５ｍｍ以下であることがより好ましく、１．０ｍｍ以下であることがさらに好ましい。また、０．５ｍｍ以下、０．２ｍｍ以下、０．１ｍｍ以下等にしてもよいが、０．３ｍｍ～０．５ｍｍとすることが特に好ましい。
なお、凹部における開口部の形状は、円や多角形の場合がある。そのため、これらの直径として、多角形に内接する円の直径を含めている。
なお、凹部における開口部の形状は、円や多角形の場合がある。そのため、これらの直径として、多角形に内接する円の直径を含めている。
ここで、脱気した培地充填液は、培養に必要な酸素が含まれておらず、培養には適さないため、気泡の除去が完了した後、培養容器から排出することが望ましい。
そこで、本実施形態の培地充填方法では、培地充填液を培養容器に充填して一定時間静置させ、気泡の除去が完了した後に、培養容器に培地を通液することによって、培地充填液を培地に混合し、培地充填液を培地に次第に置き換えていくようにしている。
そこで、本実施形態の培地充填方法では、培地充填液を培養容器に充填して一定時間静置させ、気泡の除去が完了した後に、培養容器に培地を通液することによって、培地充填液を培地に混合し、培地充填液を培地に次第に置き換えていくようにしている。
本実施形態の培地充填方法では、上記のように、培養を開始する時間の前に予め培養容器に培地充填液を充填して気泡を除去するようにしている。その理由は、本実施形態の脱気された培地充填液を用いる方法では、直ぐには気泡が消えず、気泡の除去に一定の時間がかかるためである。
本実施形態の培地充填用気泡除去装置は、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、凹部に溜まった気泡を除去する培地充填用気泡除去装置であって、真空排気装置を備え、培養容器に培地充填液を充填した後、培地充填液を充填した状態で培養容器を真空排気装置に入れて真空引きを行うことを特徴とする。
具体的には、図３に示すように、本実施形態の培地充填用気泡除去装置１は、真空排気装置を備えてなり、真空排気装置は、真空チャンバ１０、真空ポンプ１１、大気開放弁１２、及びフィルタ装置１３を有するものとすることが好ましい。
真空チャンバ１０は滅菌機能を有しており、大気開放弁１２は、真空チャンバ１０及び真空ポンプ１１の間の配管部材に接続して備えられている。この滅菌機能としては、例えば、ＵＶランプや１６０℃，２時間の乾熱滅菌などによるものとすることができる。また、フィルタ装置１３は、大気開放弁１２が備えられた配管部材の端部に備えられている。
真空チャンバ１０は滅菌機能を有しており、大気開放弁１２は、真空チャンバ１０及び真空ポンプ１１の間の配管部材に接続して備えられている。この滅菌機能としては、例えば、ＵＶランプや１６０℃，２時間の乾熱滅菌などによるものとすることができる。また、フィルタ装置１３は、大気開放弁１２が備えられた配管部材の端部に備えられている。
本実施形態の培地充填用気泡除去装置は、真空チャンバ１０に収容された培養容器の培地充填液における溶存空気量が５０％以下になるように、真空ポンプ１１によって真空引きを行う。
そこで、本実施形態の培地充填方法を、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、凹部に溜まった気泡を除去する培地充填方法であって、培養容器に培地充填液を充填した後、培地充填液を充填した状態で培養容器を真空排気装置に入れて、培地充填液における溶存空気量が５０％以下になるように真空引きを行う方法とすることも好ましい。
また、このとき、培養容器の培養面が水平になるように真空排気装置内に配置し、培養容器を押圧板により押圧して、真空引きを行うことも好ましい。
例えば、培養容器の上面にガイドピンに沿って上下移動する押圧板を載せ、この押圧板の自重により培養容器を一定の圧力で押圧するように固定して、真空引きを行うことができる。また、ガイドピンにバネ材を設置し、押圧板を培養容器に適宜押し付けることによって、実現することも可能である。
本実施形態の培地充填方法をこのような方法にすれば、培養容器のサイズが比較的大きい場合でも、培養容器の全ての凹部から気泡を適切に除去することが可能である。
例えば、培養容器の上面にガイドピンに沿って上下移動する押圧板を載せ、この押圧板の自重により培養容器を一定の圧力で押圧するように固定して、真空引きを行うことができる。また、ガイドピンにバネ材を設置し、押圧板を培養容器に適宜押し付けることによって、実現することも可能である。
本実施形態の培地充填方法をこのような方法にすれば、培養容器のサイズが比較的大きい場合でも、培養容器の全ての凹部から気泡を適切に除去することが可能である。
また、本実施形態の培養容器は、このような本実施形態の培地充填方法に用いられる複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器であって、培養容器が、軟包材からなる閉鎖系の培養バッグであり、チューブを接続したポートを有し、チューブの端部にフィルタを備えた構成とすることが好ましい。
具体的には、図４に示すように、本実施形態の培養容器２は、容器本体２０に多数の微小な凹部２１を備え、またポート２２を備えている。ポート２２にはチューブ２３が接続され、他方の端部にフィルタ装置２４が配置されている。このフィルタ装置２４には無菌フィルタ２４１が備えられている。
無菌フィルタ２４１としては、例えば０．２μｍや０．４５μｍの孔を有するメンブレンフィルタや多孔質膜などを用いることができる。
無菌フィルタ２４１としては、例えば０．２μｍや０．４５μｍの孔を有するメンブレンフィルタや多孔質膜などを用いることができる。
また、本実施形態の培養容器２の凹部２１における開口部の円又は内接円の直径は、２ｍｍ以下であることが好ましく、１．５ｍｍ以下であることがより好ましく、１．０ｍｍ以下であることがさらに好ましい。また、０．５ｍｍ以下、０．２ｍｍ以下、０．１ｍｍ以下等にしてもよいが、０．３ｍｍ～０．５ｍｍとすることが特に好ましい。
また、本実施形態の培養容器２の凹部２１の深さは、２ｍｍ以下であることが好ましく、１．５ｍｍ以下であることがより好ましく、１．０ｍｍ以下であることがさらに好ましく、０．３ｍｍ～０．５ｍｍとすることが特に好ましい。なお、凹部２１において貫通孔は形成されていない。
本実施形態の培養容器２の材料としては、ポリエチレン、エチレン-α－オレフィンの共重合体、環状オレフィンコポリマー、エチレン-酢酸ビニル共重合体、アイオノマー、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、フッ素系樹脂等、またはそれらを組み合わせて用いることが好ましく、ポリエチレン系樹脂を用いることが特に好ましい。
本実施形態の培地充填用気泡除去装置の真空チャンバ１０に、培養容器２を収容して、真空引きすることで、培養容器２における培地充填液が脱気されて凹部２１から気泡が除去されるようになっている。
このとき、真空チャンバ内において、培養容器２の内外で圧力差がないため、容器が破裂することはない。
このとき、真空チャンバ内において、培養容器２の内外で圧力差がないため、容器が破裂することはない。
また、図４に示す培養容器２に、培養面が直立した状態で、培養面の半分が浸漬する程度に培地充填液を充填して真空引きを行うと、培地充填液が毛細管現象により培養面全体に伝わり、凹部２１が培地充填液により濡れることで、気泡が凹部２１から除去されて、チューブ２３を通じて培養容器２の外部へ排出される。
このような本実施形態の培地充填用気泡除去装置を用いる真空引き方式によれば、上述した本実施形態の培地充填液を用いる脱気方式に比較して、極めて短時間で凹部における気泡を除去することが可能である。
このような本実施形態の培地充填用気泡除去装置を用いる真空引き方式によれば、上述した本実施形態の培地充填液を用いる脱気方式に比較して、極めて短時間で凹部における気泡を除去することが可能である。
さらに、本実施形態の培地充填用気泡除去装置を用いるにあたり、培養容器としては、本実施形態の培養容器に限定されず、シャーレなどのリジッドで凹部を有する培養容器を使用することもできる。
この場合でも、本実施形態の培地充填用気泡除去装置を用いることで、培養容器の凹部から気泡を効率的に除去することが可能である。またこの場合、シャーレ本体と蓋の隙間で空気の出し入れが行われ、極端に強い大気開放をしない限り基本的には汚染することなく、隙間から空気を抜くことが可能になっている。
この場合でも、本実施形態の培地充填用気泡除去装置を用いることで、培養容器の凹部から気泡を効率的に除去することが可能である。またこの場合、シャーレ本体と蓋の隙間で空気の出し入れが行われ、極端に強い大気開放をしない限り基本的には汚染することなく、隙間から空気を抜くことが可能になっている。
また、本実施形態の培地充填用気泡除去装置における真空チャンバ１０を、脱気モジュールで構成することによって、培地充填液を脱気モジュールに通液して真空引きを行い、培地充填液を脱気する構成とすることも可能である。
以下、本発明の実施形態に係る培地充填液、及びこれを用いた培地充填方法の実施例等、これらの効果を確認するために行った試験、並びに本発明の実施形態に係る培養容器、及びこれを用いた培地充填方法の実施例等について説明する。
（実施例１）
まず、本実施形態の培地充填液を次のように作成した。
培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））５００ｍLを１Lのボトルに入れ、これを真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置して真空引きを行った。真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、溶存空気量が１０％以下に脱気された培地充填液を得た。
まず、本実施形態の培地充填液を次のように作成した。
培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））５００ｍLを１Lのボトルに入れ、これを真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置して真空引きを行った。真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、溶存空気量が１０％以下に脱気された培地充填液を得た。
次に、得られた培地充填液をマイクロウェルプレート（株式会社クラレ，品番SQ200）に充填して、１２時間静置させた。マイクロウェルプレートは、四角錐状の凹部を複数備えており、凹部の開口部は一辺０．２ｍｍ、凹部の深さは０．５ｍｍであった。
培地充填液を充填した直後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図１（右側）に示す。また、１２時間経過後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図２（実施例１）に示す。
培地充填液を充填した直後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図１（右側）に示す。また、１２時間経過後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図２（実施例１）に示す。
これらの図に示されるように、培地充填液を充填した直後のマイクロウェルプレートでは、全ての凹部に気泡が溜まっていることが分かる。
これに対して、培地充填液を充填して１２時間経過後のマイクロウェルプレートでは、全ての凹部から気泡が除去されていることが分かる。
このように、本実施形態の培地充填液によれば、微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去できることが明らかとなった。
これに対して、培地充填液を充填して１２時間経過後のマイクロウェルプレートでは、全ての凹部から気泡が除去されていることが分かる。
このように、本実施形態の培地充填液によれば、微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去できることが明らかとなった。
（比較例１）
次に、脱気を行っていない通常の培地として、所定量のStemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N）をマイクロウェルプレート（株式会社クラレ，品番SQ200）に充填して１２時間静置させた。マイクロウェルプレートは、実施例１のものと同じである。
培地充填液を充填した直後のマイクロウェルプレートにおける凹部は、図１（右側）と同様の状態であった。また、１２時間経過後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図２（比較例１）に示す。
次に、脱気を行っていない通常の培地として、所定量のStemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N）をマイクロウェルプレート（株式会社クラレ，品番SQ200）に充填して１２時間静置させた。マイクロウェルプレートは、実施例１のものと同じである。
培地充填液を充填した直後のマイクロウェルプレートにおける凹部は、図１（右側）と同様の状態であった。また、１２時間経過後のマイクロウェルプレートにおける凹部の写真を図２（比較例１）に示す。
このように、通常の培地を充填して１２時間経過後のマイクロウェルプレートでは、一部の凹部から気泡が除去されているものの、多くの凹部には気泡が残存していることが分かる。
（試験１）
次に、実施例１の気泡が除去されたマイクロウェルプレートを用いて、スフェアを形成させた試験について説明する。
具体的には、このマイクロウェルプレートに10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を含むStemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N）を通液して、脱気に使用した培地充填液を当該培地に置き換えた。
次に、実施例１の気泡が除去されたマイクロウェルプレートを用いて、スフェアを形成させた試験について説明する。
具体的には、このマイクロウェルプレートに10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を含むStemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N）を通液して、脱気に使用した培地充填液を当該培地に置き換えた。
次に、このマイクロウェルプレートの各凹部にiPS細胞（1231A3株）が500個ずつ収容されるように播種し、48時間培養してスフェアの形成を行った。その結果を図５（試験１）に示す。
同図に示されるように、各凹部において、スフェアが形成されていることが分かる。
このように、本実施形態の培地充填液によって気泡が除去されたマイクロウェルプレートを用いることで、スフェアを好適に形成できることが明らかとなった。
同図に示されるように、各凹部において、スフェアが形成されていることが分かる。
このように、本実施形態の培地充填液によって気泡が除去されたマイクロウェルプレートを用いることで、スフェアを好適に形成できることが明らかとなった。
（試験２）
次に、比較例１の気泡が除去されていないマイクロウェルプレートを用いて、スフェアを形成させた試験について説明する。
具体的には、このマイクロウェルプレートの培地に10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を添加して、各凹部にiPS細胞（1231A3株）が500個ずつ収容されるように播種し、48時間培養してスフェアの形成を行った。その結果を図５（試験２）に示す。
同図に示されるように、各凹部に気泡が溜まっているため、凹部間の培養面に多くの細胞が堆積し、スフェアを適切に形成することができなかった。
次に、比較例１の気泡が除去されていないマイクロウェルプレートを用いて、スフェアを形成させた試験について説明する。
具体的には、このマイクロウェルプレートの培地に10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を添加して、各凹部にiPS細胞（1231A3株）が500個ずつ収容されるように播種し、48時間培養してスフェアの形成を行った。その結果を図５（試験２）に示す。
同図に示されるように、各凹部に気泡が溜まっているため、凹部間の培養面に多くの細胞が堆積し、スフェアを適切に形成することができなかった。
（実施例２）
培養容器として、図４の培養容器２に示すものを準備した。
培養容器の材料としては、ポリエチレン（東洋製罐製培養バッグ）を使用し、１００ｍｍｘ７０ｍｍの２枚のフィルムを作成した。培養容器の培養面には、開口部の直径が０．３ｍｍ、深さの０．２ｍｍの凹部を０．４ｍｍの間隔で形成した。そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介して無菌フィルタ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，０．４５μｍメンブレンフィルタ７２３－２５４５）を接続した。
培養容器として、図４の培養容器２に示すものを準備した。
培養容器の材料としては、ポリエチレン（東洋製罐製培養バッグ）を使用し、１００ｍｍｘ７０ｍｍの２枚のフィルムを作成した。培養容器の培養面には、開口部の直径が０．３ｍｍ、深さの０．２ｍｍの凹部を０．４ｍｍの間隔で形成した。そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介して無菌フィルタ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，０．４５μｍメンブレンフィルタ７２３－２５４５）を接続した。
この培養容器に、培養面が直立した状態で、培養面の半分程度が浸漬するように、培地充填液として、培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。そして、そのまま培養面が直立した状態で、真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置し、真空引きを行った。
真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、培地充填液における溶存空気量を１０％以下にすることができる。
その結果、培地充填液が毛細管現象により培養面全体に伝わり、凹部が培地充填液により濡れることによって、気泡を全ての凹部から除去することができた。
真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、培地充填液における溶存空気量を１０％以下にすることができる。
その結果、培地充填液が毛細管現象により培養面全体に伝わり、凹部が培地充填液により濡れることによって、気泡を全ての凹部から除去することができた。
（実施例３）
培養容器として、実施例２と同様の構成を備え、サイズがより大きいものを準備した。
培養容器の材料としては、ポリエチレン（東洋製罐製培養バッグ）を使用し、３００ｍｍｘ２００ｍｍの２枚のフィルムを作成した。培養容器の培養面には、開口部の直径が０．３ｍｍ、深さの０．２ｍｍの凹部を０．４ｍｍの間隔で形成した。そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介して無菌フィルタ（（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，０．４５μｍメンブレンフィルタ７２３－２５４５）を接続した。
培養容器として、実施例２と同様の構成を備え、サイズがより大きいものを準備した。
培養容器の材料としては、ポリエチレン（東洋製罐製培養バッグ）を使用し、３００ｍｍｘ２００ｍｍの２枚のフィルムを作成した。培養容器の培養面には、開口部の直径が０．３ｍｍ、深さの０．２ｍｍの凹部を０．４ｍｍの間隔で形成した。そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介して無菌フィルタ（（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，０．４５μｍメンブレンフィルタ７２３－２５４５）を接続した。
この培養容器に、培地充填液として、所定量の培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。そして、真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置して、真空引きを行った。
真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、培地充填液における溶存空気量を１０％以下にすることができる。
真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。これにより、培地充填液における溶存空気量を１０％以下にすることができる。
このとき、図６に示すように、培養容器の培養面が水平になるように、培養容器を真空排気装置内に配置した。そして、培養容器の上面にガイドピン５に沿って上下移動する重さ２ｋｇの押圧板４を載せ、この押圧板４の自重により培養容器を一定の圧力で押圧するように固定した。
その結果、培地充填液３の沸騰により生じた気体が、直径５０ｍｍ程度の比較的大きい気泡にまとまって培養容器内の上方へ移動し、そのまとまった大きな気泡６がポート側の引圧に引かれ、ポートを介して培養容器から排出された。この際、気体の発生とポートからの排出に伴って、押圧板は上下に移動した。また、培地充填液３からの気体の発生が終了すると、押圧板は静止し、培養容器における全ての凹部から気泡は除去されていた。
（参考例１）
実施例３で作成した培養容器を用いて、実施例３と異なる態様で真空引きを行った。
具体的には、図７に示すように、この培養容器に、培養面が直立した状態で、培養面の半分程度が浸漬するように、培地充填液として、培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。なお、図７において、培養容器の培養面に形成されている凹部は省略している。
実施例３で作成した培養容器を用いて、実施例３と異なる態様で真空引きを行った。
具体的には、図７に示すように、この培養容器に、培養面が直立した状態で、培養面の半分程度が浸漬するように、培地充填液として、培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。なお、図７において、培養容器の培養面に形成されている凹部は省略している。
そして、そのまま培養面が直立した状態で、真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置し、真空引きを行った。真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。
その結果、培養容器の培養面全体に培地充填液が移動することができず、全ての凹部の気泡を除去することはできなかった。
すなわち、培養容器のサイズが大きいと、それに応じて培養面全体を濡らすために必要な培地充填液の量が多く必要になるが、培養面が直立した状態で設置すると、図７のように培地充填液が下方に多く溜まってしまう。このため、２枚のフィルムが離れ、毛細管現象が生じ得る状態にならず、培地充填液に浸漬していない上方の凹部の気泡を除去することができなかった。
すなわち、培養容器のサイズが大きいと、それに応じて培養面全体を濡らすために必要な培地充填液の量が多く必要になるが、培養面が直立した状態で設置すると、図７のように培地充填液が下方に多く溜まってしまう。このため、２枚のフィルムが離れ、毛細管現象が生じ得る状態にならず、培地充填液に浸漬していない上方の凹部の気泡を除去することができなかった。
（参考例２）
実施例３で作成した培養容器を用いて、実施例３と異なる態様で真空引きを行った。
具体的には、この培養容器に、培地充填液として、所定量の培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。そして、図８に示すように、培養面が水平になるように、真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置して、真空引きを行った。真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。なお、図８において、培養容器の培養面に形成されている凹部は省略している。
実施例３で作成した培養容器を用いて、実施例３と異なる態様で真空引きを行った。
具体的には、この培養容器に、培地充填液として、所定量の培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））を充填した。そして、図８に示すように、培養面が水平になるように、真空排気装置（ヤマト科学株式会社，ADP300）内に静置して、真空引きを行った。真空引きは、室温２２℃の状態で２０Torrの真空度で、１分程度保持することにより行った。なお、図８において、培養容器の培養面に形成されている凹部は省略している。
その結果、培地充填液の沸騰により生じた気体が、培養容器の中央に溜まって培養容器が大きく膨らみ、ポートから気体を適切に排出することができず、培養容器の凹部から気泡を十分に除去することができなかった。
すなわち、押圧板がないため、まとまった気泡が中央に集まって、ポートが培地充填液３で塞がれてしまい、気泡がポート側に移動できなかった。そして、培養容器内と外部の圧力差が増大し、培養容器のフィルム材を伸ばしてしまう程に気泡が膨らみ、気泡を排出することはできなかった。
すなわち、押圧板がないため、まとまった気泡が中央に集まって、ポートが培地充填液３で塞がれてしまい、気泡がポート側に移動できなかった。そして、培養容器内と外部の圧力差が増大し、培養容器のフィルム材を伸ばしてしまう程に気泡が膨らみ、気泡を排出することはできなかった。
このように培養容器のサイズが比較的大きい場合は、培養面が水平になるように、培養容器を真空排気装置内に静置させると共に、培地充填液が沸騰して生じる気体により培養容器の中央が膨らむことを防止するために、実施例３に示すように、培養容器の上方から一定の荷重が掛かるように押圧板を配置して、真空引きを行うことが好ましい。これにより、培養容器の膨らみが抑えられて気体をポートから適切に排出することができ、培養容器の全ての凹部から気泡を除去することが可能である。
以上説明したように、本発明の培地充填液、培地充填方法、培養容器、及び培地充填用気泡除去装置によれば、微小凹部を有する培養容器を用いて細胞を培養するにあたり、微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、またこれを培養面の大きな培養容器に適用することが可能である。
本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器として、例えば５０万個～１００万個のスフェアを形成可能な大きさのものを用いるなど適宜変更することが可能である。
例えば、培養容器として、例えば５０万個～１００万個のスフェアを形成可能な大きさのものを用いるなど適宜変更することが可能である。
本発明は、スフェアなどの培養対象物を効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
１ 培地充填用気泡除去装置
１０ 真空チャンバ
１１ 真空ポンプ
１２ 大気開放弁
１３ フィルタ装置
２，２ａ 培養容器
２０，２０ａ 容器本体
２１ 凹部
２２ ポート
２３ チューブ
２４，２４ａ フィルタ装置
２４１ 無菌フィルタ
３ 培地充填液
４ 押圧板
５ ガイドピン
６ 気泡
１０ 真空チャンバ
１１ 真空ポンプ
１２ 大気開放弁
１３ フィルタ装置
２，２ａ 培養容器
２０，２０ａ 容器本体
２１ 凹部
２２ ポート
２３ チューブ
２４，２４ａ フィルタ装置
２４１ 無菌フィルタ
３ 培地充填液
４ 押圧板
５ ガイドピン
６ 気泡
Claims (8)
- 複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、前記凹部に溜まった気泡を除去するために用いられる培地充填液であって、脱気されていることを特徴とする培地充填液。
- 溶存空気量が５０％以下に脱気されていることを特徴とする請求項１記載の培地充填液。
- 培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝液のいずれかを脱気させて得られたことを特徴とする請求項１又は２記載の培地充填液。
- ガスバリア性を有する容器に封入されていることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の培地充填液。
- 請求項１～４のいずれかに記載の培地充填液を、複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に充填して一定時間静置させ、ついで前記培養容器に培地を通液して、前記培地充填液を培地に置き換えることを特徴とする培地充填方法。
- 前記複数の凹部における開口部の円又は内接円の直径が２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項５記載の培地充填方法。
- 複数の凹部が形成された培養面を有する培養容器に培地を充填する際に、培地の充填に先立って、前記凹部に溜まった気泡を除去するために用いられる培地充填液の充填方法であって、
前記培養容器に培地充填液を充填した後、前記培地充填液を充填した状態で前記培養容器を真空排気装置に入れて、前記培地充填液における溶存空気量が５０％以下になるように真空引きを行う
ことを特徴とする培地充填液の充填方法。 - 前記培養容器の培養面が水平になるように、前記培養容器を前記真空排気装置内に配置し、前記培養容器を押圧板により押圧して、真空引きを行う
ことを特徴とする請求項７記載の培地充填液の充填方法。
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