TW202317756A - 分離腫瘤浸潤淋巴球之方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述之主題係關於用於測定經分離且擴增之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之效能及產生TIL之治療群體的方法，及涉及其之組合物及涉及其之治療方法。

Description

分離腫瘤浸潤淋巴球之方法及其用途
本發明提供經由腫瘤之半自動無菌組織處理自切除腫瘤分離、擴增及冷凍腫瘤浸潤淋巴球(TIL)且藉此產生TIL之治療群體的方法及裝置。
T細胞衍生自駐留於骨髓中但隨後遷移至胸腺中且在胸腺中成熟之造血幹細胞。在成熟過程期間，T細胞經歷一系列選擇事件，由此產生多樣化T細胞組庫。隨後此等細胞釋放至外周循環中以執行其作為後天免疫系統之一部分的特定功能。
T細胞並非均質細胞群，而是由許多譜系組成，其中主要類型由兩種其他細胞標記物之表現定義。表現CD4之T細胞一般稱為輔助細胞(Th)且認為藉由細胞-細胞接觸及經由產生稱為細胞介素之介體分子來協調免疫系統之許多功能。CD8 T細胞視為具有細胞毒性(Tc)且被認為係執行目標細胞之直接殺滅的細胞。此等活性均經由T細胞受體/抗原/MHC相互作用來控制-因此，在成功識別目標細胞上之肽/MHC後，CD4及CD8細胞經由細胞介素產生及細胞毒性活性協同起作用以消除目標細胞，包括感染之病毒及腫瘤細胞。
T細胞並不識別完整蛋白質(抗原)，但對藉由稱為主要組織相容性複合體(MHC)之特定蛋白質呈現於目標細胞之表面上的短蛋白質片段起反應。在成熟過程期間，T細胞在其細胞表面上表現抗原特異性T細胞受體(TCR)，該受體識別MHC分子所呈現之此等短蛋白質(肽)抗原。因此，僅當正確肽呈現於與正確MHC分子相關之目標細胞表面上時，T細胞將活化其免疫效應功能。因此，腫瘤特異性T細胞常常在腫瘤中富集，使得其成為腫瘤特異性T細胞(亦即腫瘤浸潤淋巴球(TIL))之理想來源(Andersen等人, Cancer Res. 2012年4月1日;72(7):1642-50. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2614. 電子出版2012年2月6日)。
當然，此為高度簡化之觀點且代表T細胞功能之簡短一般概述。後天性免疫反應不單獨起作用，而是需要與一系列免疫及非免疫細胞之廣泛相互作用以促進T細胞高效移行至所需活性位點，以確保起始正確的免疫反應且在不再需要之後控制及停止免疫反應。因此，即使在所製造之TIL起始針對腫瘤之免疫反應的患者中，其可隨後由患者自身之免疫系統及腫瘤環境支援或減弱。
腫瘤特異性TIL為自患有原發性或轉移性癌症之患者之腫瘤分離的T細胞。在大多數癌症患者中，血液中幾乎不能偵測到循環腫瘤特異性T細胞。然而，某些諸如皮膚黑素瘤之癌症似乎具有免疫原性，因為其具有在腫瘤生長之自然過程期間，尤其在腫瘤區域內誘導相當大數目之具有抗腫瘤活性之T細胞的能力(Muul等人, J Immunol. 1987年2月1日;138(3):989-95)。「選擇為對腫瘤具有特異性之T細胞」的腫瘤反應性T細胞可自腫瘤材料分離且離體擴增成高數目。報導已展示此等細胞含有抗腫瘤反應性，其可在再輸注至患者中時引起腫瘤破壞及臨床反應(Dudley等人, Science. 2002年10月25日;298(5594):850-4. 電子出版2002年9月19日)。在後續試驗中，確認T細胞特徵之重要性且確認「年輕」快速生長細胞「年輕TIL」的益處，從而根本「不針對特異性選擇」細胞。明顯地，此在TIL或CD8選擇之TIL中產生約50%之極佳反應率(Besser等人, Anticancer Res. 2009年1月;29(1):145-54; Dudley等人, Clin Cancer Res. 2010年12月15日;16(24):6122-31. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-1297. 電子出版2010年7月28日)。
Andersen等人之研究(Cancer Res. 2012年4月1日;72(7):1642-50. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2614. 電子出版2012年2月6日)鑑別出，與末梢血液中之T細胞相比，黑素瘤特異性T細胞(針對已知癌症抗原)在腫瘤內富集。此支持一理念，當與使用自末梢血液分離且以類似含量之IL2或單獨靜脈內IL-2擴增之T細胞之黑素瘤患者中之早期試驗相比時，經分離之TIL群體為富集之引起增強之抗腫瘤活性的腫瘤特異性T細胞(LAK細胞-Bordignon等人, Haematologica. 1999年12月;84(12):1110-49)。
美國專利第10,398,734號係關於用於擴增TIL及產生TIL之治療群體的方法。'734專利之腫瘤作為主體腫瘤運送，且主體腫瘤內部之TIL快速變得缺氧且隨時間推移逐漸劣化。'734專利之腫瘤亦處理成具有劣化之內部細胞群體的片段。此外，用於製造之TIL將僅為自組織片段擴增之TIL且不為任何保留於內部之TIL。因此，所得細胞群體可能不會反映腫瘤環境之完全多樣性。
收集TIL需要在培養及擴增TIL群體之前將作為主體腫瘤的固體組織無菌解聚。在固體組織解聚期間之條件及收集細胞所花費的時間對最終細胞化材料之存活率及恢復率具有實質性影響。使用習知方法獲得之固體組織來源之細胞懸浮液通常包括廣泛多種不同細胞類型、解聚培養基、組織碎片及/或流體。此可能需要使用選擇性靶向及/或分離細胞類型，例如在製造再生藥品、過繼細胞療法、ATMP、診斷性活體外研究及/或科學研究之前。
目前，選擇或富集技術一般利用以下中之一者：大小、形狀、密度、黏附性、強蛋白質-蛋白質相互作用(亦即抗體-抗原相互作用)。舉例而言，在一些情況下，選擇可藉由提供生長支援環境及藉由控制培養條件或與半永久或永久偶合至磁性或非磁性固相或半固相受質相關之更複雜細胞標記物相互作用進行。
對於富集、分離或選擇，可使用任何分選技術，例如親和層析或此項技術中已知之任何其他抗體依賴性分離技術。此項技術中已知之任何配位體依賴性分離技術可與依賴於細胞之物理特性的正及負分離技術結合使用。尤其有效分選技術為磁性細胞分選。以磁性方式分離細胞之方法可商購自例如Thermo Fisher、Miltenyi Biotech、Stemcell Technologies、Cellpro Seattle、Advanced Magnetics、Boston Scientific或Quad Technologies。舉例而言，單株抗體可與磁性聚苯乙烯粒子(如Dynal M 450或類似磁性粒子)直接偶合且用於例如細胞分離。戴諾磁珠(Dynabeads)技術並非基於管柱，而是此等磁性珠粒與附著之細胞在樣品管中具有液相動力學，且藉由將管置放於磁性支架上來分離細胞。
自樣品富集、分選及/或偵測細胞包括使用單株抗體以及具有例如多醣之有機塗層的膠態超順磁微粒(例如磁活化細胞分選(MACS)技術(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany))。粒子(例如奈米珠粒或微珠粒)可與單株抗體直接結合或與抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白或抗半抗原特異性微珠粒組合使用，或塗佈有具有選擇性結合特性之其他哺乳動物分子。
磁性粒子選擇技術(諸如上文所描述之彼等技術)藉由使細胞與塗佈有針對特定表面標記物之抗體或其他部分的磁性奈米粒子一起培育而使細胞正或負分離。此使得表現此標記物之細胞附著至磁性奈米粒子。之後，將細胞溶液置於強磁場中之固體或可撓性容器內。在此步驟中，細胞附著至奈米粒子(表現標記物)且保持在管柱上，而其他細胞(不表現標記物)流動通過。利用此方法，細胞可關於特定標記物正或負分離。
在正選擇之情況下，在自磁場移出管柱之後，將附著至磁性管柱之表現相關標記物的細胞洗出至不同容器中。
在負選擇之情況下，所用抗體或選擇性部分係針對已知存在於細胞上的不相關之表面標記物。在細胞/磁性奈米粒子溶液施加至管柱上之後，表現此等抗原之細胞結合於管柱且收集穿過之部分，因為其含有相關細胞。由於此等細胞未經偶合至奈米粒子之選擇性抗體或部分標記，因此其「未改變」。已知的人工或半自動化固體組織處理步驟為勞力密集的且需要此項技術之知識。
另外，當材料用於治療目的時，處理在細胞培養操作期間需要嚴格調節之環境條件，例如作為解聚、酶消化及轉移至儲存裝置中之一部分或在其之前的組織處理，或用於解聚/細胞化之培育條件及活組織產率。通常，此過程將需要多件實驗室及組織處理設備，及具有科學技術之技能及知識的人員，其中關鍵階段位於危害封鎖或組織處理設施無菌環境內以便安全地進行相同活動且亦使污染風險最小化。
來自組織之所要產物存活率及恢復率可受在組織收集、解聚及細胞收集期間的條件影響。本發明起因於提供改良之組織處理的需求，包括進行達成上文所描述之未滿足需求之該處理的設備/裝置。
本申請案中任何文獻之引用或鑑別並非承認此類文獻可用作本發明之先前技術。
在某些實施例中，本文中所揭示之主題係針對一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
在某些實施例中，本文中所揭示之主題係針對一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之該群體與該等癌細胞之樣品共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段或其任何組合； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
在某些實施例中，本文所描述之主題係針對一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a)         獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體，其包含表現抗FOLR1 scFv之TIL亞群； b)         將該等TIL之該群體與表現FOLR1且經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； b-i)       在rhFOLR1或連接至標籤之rhFOLR1存在下培育該TIL活化群體； c)         向步驟b-i)之該TIL活化群體添加經螢光標記之抗標籤抗體或其抗原結合片段及/或經螢光標記之抗FOLR1抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD3或抗CD2抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d)         偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD3+或CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e)         測定該TIL活化群體之該效能百分比。
在某些實施例中，本文所描述之主題係針對一種用於製備腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： a) 將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此製備解聚腫瘤產物，其中該解聚包含在高達6 N/cm 2下在培養基酶溶液存在下施加120至360次/分鐘之重複物理壓力，其中該腫瘤充分解聚為細胞懸浮液，使得可冷凍保存該解聚腫瘤產物； b) 在製備該解聚腫瘤產物之24小時內，將該解聚腫瘤產物冷卻至適合的冷凍保存溫度以製備冷凍保存之解聚腫瘤產物； c) 將該冷凍保存之解聚腫瘤產物儲存在冷凍狀態下； d) 解凍該冷凍保存之解聚腫瘤產物； e) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養冷凍保存之解聚腫瘤產物來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； f) 由該TIL之第一群體在細胞培養基中與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 g) 冷凍保存該TIL之第二群體以製備TIL之冷凍保存治療群體； 其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)在封閉系統中進行； h) 獲得步驟f)之該TIL之第二群體之樣品或步驟g)之TIL之該冷凍保存治療群體之樣品； i) 將來自步驟h)之該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； j) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； k) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， l) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
在某些實施例中，本文所描述之主題係針對一種分離冷凍保存未經修飾之腫瘤浸潤淋巴球(UTIL)之治療群體的方法，其可包含： (a)自個體切除腫瘤； (b)將切除腫瘤儲存於單次使用無菌套組中，其中該無菌套組包含： 用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組； 用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及 用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組， 其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及 其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中； (c)在解聚模組中無菌解聚所切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若該切除腫瘤可在最少細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚； (d)在穩定化模組中冷凍保存該解聚腫瘤； (e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體； (f)藉由將UTIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體； (g)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
解聚可包含物理解聚、酶解聚或物理及酶解聚。在有利實施例中，解聚腫瘤經細胞化或純化。
在本發明中，經互連且具有特定個別功能之容器之組維持無菌封閉系統以處理、視情況富集但穩定化解聚及細胞化之腫瘤。基本上本發明提供一種快速預滅菌環境以使切除腫瘤之處理期間所需時間及污染風險或操作員暴露最小化。
與標準非封閉組織處理相比，無菌套組允許封閉的固體組織處理，消除最終細胞化產物之污染風險，尤其當在組織獲取/獲得地點內進行過程，且需要在最終細胞處理之前儲存以達到其最終效用時。此外，操作員之安全性由於與可含有感染性生物體，諸如病毒的生物有害材料之直接接觸減少而增加。套組亦使得所有或一部分最終經處理之細胞化材料能夠在處理以達到其最終效用之前穩定化以輸送或儲存。
本發明將使得切除腫瘤能夠在切除時或隨後視需要在不影響細胞化腫瘤之獲取程序或存活率下處理。
在一些實施例中，可採用經由一種形式之物理純化之視情況選用之富集，以減少雜質，諸如不再需要之試劑；細胞碎片；未解聚之腫瘤組織及脂肪。出於此目的，無菌套組在穩定化之前可具有視情況選用之富集模組。單個細胞或小細胞數目聚集體可藉由排除小於5 μm之粒子及流體或總體約200 μm或更大之不完全解聚材料來富集以在解聚之後穩定化，但此將根據組織及解聚之效率而變化，且取決於組織或解聚腫瘤之最終效用，可採用呈組織特異性套組形式之各種實施例。
在另一實施例中，在步驟(c)之後提供單細胞懸浮液。
在另一實施例中，第一UTIL群體需要約100至2000萬個UTIL。在另一實施例中，第一UTIL群體需要約100-25000萬個UTIL，包括約100-2000萬個UTIL、或約2000-4000萬個UTIL、或約4000-6000萬個UTIL、或約6000-8000萬個UTIL、或約8000-10000萬個UTIL、或約10000-12500萬個UTIL、或約12500-15000萬個UTIL、或約15000-20000萬個UTIL、或約20000-25000萬個UTIL。
在另一實施例中，步驟(e)可進一步包含自切除腫瘤起始材料生長出UTIL繼之以步驟(f)之快速擴增。
在另一實施例中，步驟(e)可進行約兩週且步驟(f)可進行約兩週。
在另一實施例中，額外步驟(h)涉及懸浮第二UTIL群體。懸浮可在緩衝鹽水、人類血清白蛋白及/或二甲亞碸(DMSO)中。
本發明亦可包含藉由本文所揭示之方法中之任一者獲得的冷凍保存之UTIL之治療群體。治療群體可包含約5×10 9至5×10 10個T細胞。
本發明亦涵蓋本文所揭示之治療群體之冷凍保存袋。冷凍保存袋可用於靜脈內輸注。
本發明亦涵蓋一種治療癌症之方法，其可包含投與本文所揭示之治療群體或本文所揭示之冷凍保存袋。本發明亦涵蓋本文揭示之治療群體、醫藥組合物或冷凍保存袋，其用於治療癌症。該癌症可為膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、子宮頸癌、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，無菌套組之一或多個可撓性容器包含彈性可變形材料。
在另一實施例中，無菌套組之解聚模組之一或多個可撓性容器包含一或多個可密封開口。解聚模組及/或穩定化模組之一或多個可撓性容器亦可包含可熱密封熔接口。
在另一實施例中，無菌套組之一或多個可撓性容器包含內部圓化邊緣。
在另一實施例中，無菌套組之解聚模組之一或多個可撓性容器包含經調適以機械地擠壓及剪切其中的實體腫瘤之解聚表面。
在另一實施例中，無菌套組之富集模組之一或多個可撓性容器包含保留細胞化解聚實體腫瘤之保留物的過濾器。
在另一實施例中，無菌套組之穩定化模組之一或多個可撓性容器包含用於將活細胞儲存為溶液形式或冷凍保存狀態下之培養基調配物。
在另一實施例中，無菌套組進一步包含數位、電子或電磁標籤識別符。標籤識別符可關於一種特定程式，其定義一種類型之解聚及/或富集及/或穩定化過程，在該等過程中使用之一或多種類型之培養基，包括適合於受控速率冷凍之視情況選用之冷凍溶液。
在另一實施例中，相同可撓性容器可形成解聚模組、穩定化模組及視情況選用之富集模組中之一或多者之一部分。
在另一實施例中，無菌套組之解聚模組包含用於接收待處理之組織的第一可撓性容器。
在另一實施例中，無菌套組之解聚模組包含第二可撓性容器，其包含用於解聚之培養基。
在另一實施例中，無菌套組之視情況選用之富集模組包含用於接收富集之濾液的第一可撓性容器及第三可撓性容器。
在另一實施例中，無菌套組之解聚模組及穩定化模組均包含第二可撓性容器且第二可撓性容器包含消化培養基及穩定化培養基。
在另一實施例中，無菌套組之穩定化模組包含第四可撓性容器，其包含穩定化培養基。
在另一實施例中，無菌套組之穩定化模組亦包含用於儲存及/或經歷冷凍保存之第一可撓性容器及/或第三可撓性容器。
本發明亦提供一種分離冷凍保存之TIL之治療群體的方法，其包含： (a)自個體切除腫瘤； (b)將切除腫瘤儲存於單次使用無菌套組中，其中該無菌套組包含： 用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組； 用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及 用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組， 其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及 其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中； (c)在解聚模組中無菌解聚所切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若該切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚； (d)在穩定化模組中冷凍保存該解聚腫瘤； (e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； (f)藉由用額外IL-2、OKT-3及TIL活化劑培養TIL的第一群體來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體； (g)收集及/或冷凍保存TIL之第二群體。 在某些非限制性實施例中，TIL活化劑包含抗原呈現細胞(APC)或人工抗原呈現細胞(aAPC)或抗原片段或複合物或抗體。
在另一實施例中，自動化裝置進一步包含用於識別無菌套組之射頻鑑別標籤讀取器，使得無菌套組可在自動化處理期間，諸如在本發明之實施例中之自動化裝置內被掃描及識別。關鍵地，標籤提供關於自動處理所需之條件及步驟之資訊，因此簡單地藉由掃描套組，與套組一起使用以處理組織之任何自動化系統可在無進一步干預或污染之情況下運行。在已將組織樣品置放於解聚模組中後，其可例如在處理開始之前人工地或自動地密封。
自動化裝置之可程式化處理器亦可經由標籤識別無菌套組且隨後可執行定義解聚、富集及穩定化過程類型及該等過程所需的各別培養基類型，其包括適用於受控速率冷凍之視情況存在之冷凍溶液之套組程式。自動化裝置之可程式化處理器經調適以與以下通信且控制以下：解聚模組；富集模組；及/或穩定化模組。換言之，套組因此可由自動化裝置讀取，該裝置用於執行特定全自動方法以在插入此類裝置中時處理腫瘤。
自動化裝置之可程式化處理器可控制解聚模組以使得能夠物理及/或生物分解固體組織材料。此分解可為固體組織材料之物理或酶分解。固體組織材料之酶分解可藉由一或多種選自由以下組成之群之培養基酶溶液：膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、釋放酶HI、胃蛋白酶及其混合物。
在另一實施例中，可程式化處理器控制解聚可撓性容器內之解聚表面，其機械地擠壓及剪切固體組織。在一些實施例中，解聚表面係藉由機械活塞控制。
在另一實施例中，可程式化處理器控制穩定化模組以冷凍保存容器中之富集解聚固體組織。此可使用可程式化溫度設定來達成，該可程式化溫度設定為藉由讀取插入裝置中之套組之標籤所確定的條件。
在另一實施例中，為進行過程之不同功能，提供裝置及/或套組之額外組件中之一或多者且可以任何組合使用。此可包括：能夠在將解聚之固體組織轉移至視情況選用之富集模組之前識別解聚過程是否已在解聚模組中完成之感測器；測定解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者的容器中所需之培養基的量，且控制材料在各別容器之間的轉移的重量感測器；控制解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者之容器內的溫度之感測器；控制培養基在模組中之各容器之輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個氣泡感測器；控制培養基在輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個泵，視情況蠕動泵；評估富集模組內之壓力的壓力感測器；控制富集模組內之切向流過濾過程之一或多個閥；及/或控制培養基在各模組之輸入與輸出端口之間的轉移之一或多個夾具。
在另一實施例中，自動化裝置之可程式化處理器經調適以維持穩定化模組中之最佳儲存溫度範圍直至容器經移除；或執行受控冷凍步驟。此允許UTIL在其最終效用之前儲存較短時段(數分鐘至數天)或儲存較長時段(數天至數年)，此視與穩定化模組一起使用之類型或穩定化過程而定。
在另一實施例中，自動化裝置進一步包含使用者介面。介面可包含用以顯示指令之顯示幕，該等指令指導使用者輸入參數、確認預程式化之步驟、警告錯誤或其組合。
在另一實施例中，自動化裝置經調適成可移動的且因此可包含准許容易操縱及/或輔助移動之維度，諸如車輪、輪胎及/或把手。
本發明亦提供一種用於分離冷凍保存之UTIL之治療群體的半自動無菌組織處理方法，其包含以下步驟： (a)自與無菌處理套組相關之數位、電子或電磁標籤識別符自動確定無菌解聚組織處理步驟及其相關條件，其中無菌套組包含： 用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組； 用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及 用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組， 其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及 其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中； (b)自個體切除腫瘤； (c)將腫瘤置放於無菌套組之解聚模組之可撓性塑膠容器中； (d)藉由與以下通信且控制以下自動執行一或多個組織處理步驟來處理腫瘤： 解聚模組；其中無菌解聚切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚； 視情況選用之富集模組，其中過濾該解聚腫瘤以移除解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液； 穩定化模組，其中冷凍保存該解聚腫瘤； (e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體； (f)藉由將UTIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體； (g)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
可撓性容器(諸如袋)可用於處理組織材料。處理可包括可分離或分解組織之處理，例如物理分解可使用攪拌，例如平緩攪拌實現，生物及/或酶分解可包括酶消化，及/或提取袋中組織材料之組分。
用於處理組織的可撓性容器(諸如袋)可包括一或多個由可密封聚合物製成的層，其具有至少三個在製造期間密封的可撓性容器邊緣及在使用期間插入組織材料的可撓性容器上的開放邊緣。一或多個連接器可用於經由導管將可撓性容器耦接於至少一個元件。在將組織置放於可撓性容器中之後，可密封或熔接接近開放邊緣之可撓性容器之區段以形成密封口。密封口可具有至少3 mm之寬度且實質上平行於開放邊緣安置且與可撓性容器之開放邊緣間隔開。在一些情況下，密封口可具有大於約5 mm之寬度。舉例而言，袋可在組織置放於內部之後經密封以具有接近於袋之開放邊緣定位的至少5 mm之密封口。密封口可平行於開放邊緣且與袋之開放邊緣間隔開。
可撓性容器可使用具有突起且接近密封口安置且與密封口相比進一步與可撓性容器之開放邊緣間隔開之夾具進一步緊固。
在一些情況下，密封口及可撓性容器經構築使得可撓性容器可耐受在使用期間施加至可撓性容器之100 N力。在一些情況下，取決於所使用材料之類型及/或密封口之結構，使用與此類密封口結合之夾具可為有利的。因此，在可撓性容器，諸如袋之使用期間，密封口與夾具之組合可能能夠承受施加至可撓性容器之100 N力。
在一些情況下，密封口及可撓性容器經構築使得可撓性容器可耐受在使用期間施加至可撓性容器之75 N力。在一些情況下，取決於所使用材料之類型及/或密封口之結構，使用與此類密封口結合之夾具可為有利的。因此，在可撓性容器，諸如袋之使用期間，密封口與夾具之組合可能能夠承受施加至可撓性容器之75 N力。
可撓性容器可用於在處理，諸如組織材料之解聚期間容納組織。
在一些實施例中，諸如袋之可撓性容器可用於解聚組織材料、過濾解聚之組織材料及/或分離未解聚之組織及濾液。
諸如袋之可撓性容器可由彈性可變形材料形成。可針對一或多種特性選擇用於可撓性容器(諸如袋)之材料，該等特性包括但不限於密封性，諸如歸因於熱熔接之密封性，或射頻能量使用、透氣性、例如低溫可撓性(例如，在-150℃或-195℃下)之可撓性、例如低溫彈性之彈性、耐化學性、光學透明度、諸如細胞毒性之生物相容性、溶血活性、抗浸出性、具有低微粒、特定氣體(例如氧氣及/或二氧化碳)之高傳輸率、及/或對監管要求之遵從性。
可撓性容器，諸如袋，可包括指示符。指示符可用於鑑別樣品、樣品所來源之患者及/或追蹤在處理過程中特定樣品之進展。在一些情況下，指示符可由自動化或半自動化系統掃描以追蹤樣品之進展。
可在可撓性容器(諸如袋)上使用標記以鑑別何處袋應置放、處理、密封或可關於包括組織之袋採取的任何其他動作。各袋可包括密封之多個標記。
袋之開放末端可在組織插入袋中之後經密封。可使用在預定壓力、預定溫度及預定時間範圍下操作之密封裝置(例如，加熱密封機)形成任何密封口。
在一些情況下，諸如袋之可撓性容器可用作解聚容器以用作亦可包括解聚裝置之解聚元件的一部分。在一些實施例中，可將培養基及/或酶添加至裝置之解聚元件內的袋中。舉例而言，袋可與機械地擠壓置放於可撓性容器中之組織材料的裝置一起使用。
在一些實施例中，可在解聚期間剪切可撓性容器(諸如袋)中之組織。特定言之，可撓性容器可經組態以剪切組織材料。
可撓性容器可用於半自動化或自動化過程以用於哺乳動物細胞或細胞聚集體之無菌解聚、穩定化及/或視情況富集。
用於自組織提取所要材料之套組可包括解聚元件，其中至少一些組織經處理以形成經處理流體；富集元件(例如過濾器)，其能夠富集至少一些經處理流體以形成所要材料；穩定化元件，其能夠儲存一部分所要材料；及指示標籤，其安置於解聚元件中之至少一者上；富集元件；或穩定化元件，其能夠提供組織來源中之至少一者；相對於處理之組織的狀態；或識別符。
所要材料可為特定大小之生物材料或組分。舉例而言，所要材料可為腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
不同類型之培養基可用於藉由解聚元件及穩定化元件進行之各種過程中。舉例而言，可將冷凍保存培養基提供於套組且用於穩定化元件中以控制冷凍速率。
用於其中解聚元件可包括第一可撓性容器且穩定化元件可包括第二可撓性容器之裝置中的套組。
用於來自哺乳動物固體組織之細胞或細胞聚集體之半自動化無菌解聚及/或富集及/或穩定化的自動化裝置可包括可程式化處理器及包括本文所描述之可撓性容器之套組。自動化裝置可進一步包括指示標籤讀取器。舉例而言，指示標籤讀取器可安置在任何元件處(例如套組中之組織材料之解聚、富集或穩定化)。
在一些情況下，自動化裝置可進一步包括射頻鑑別標籤讀取器以識別套組中之可撓性容器中之樣品。
自動化裝置可包括能夠經由諸如QR碼之指示標籤識別定位於諸如袋之套組之組件上的指示符的可程式化處理器。在確定何種樣品在袋中之後，可程式化處理器隨後執行定義解聚、富集及穩定化過程類型之程式且提供彼等過程所需的各別培養基類型。
用於自動化裝置之套組可包括解聚可撓性容器或袋。可程式化處理器可控制解聚元件及解聚可撓性容器以使得能夠物理及/或生物分解固體組織。
可程式化處理器可控制自動化裝置之元件，使得接近於解聚可撓性容器定位之解聚表面可機械地擠壓及剪切解聚可撓性容器中之固體組織，視情況其中解聚表面為機械活塞。
系統之解聚元件可由處理器控制，使得解聚可撓性容器中之組織能夠實現固體組織之物理及酶分解。可將一或多種選自膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、釋放酶HI、胃蛋白酶或其混合物之培養基酶溶液提供至解聚可撓性容器以幫助組織之酶分解。
系統可包括套組，該套組包括解聚可撓性容器及穩定化可撓性容器及可程式化處理器。可程式化處理器可經調適以控制以下中之一或多者：解聚元件；富集元件；及穩定化元件。
可程式化處理器可控制穩定化元件以冷凍保存穩定化容器中之富集解聚固體組織。在一些實施例中，預定溫度可經程式化。
自動化裝置可以多個組合包括額外組件。組件可包括：能夠在將解聚之固體組織轉移至視情況存在之富集元件之前識別解聚過程是否已在解聚模組中完成之感測器；測定解聚元件、富集元件及/或穩定化元件中之一或多者的容器中所需之培養基的量，且控制材料在各別容器之間的轉移的重量感測器；控制解聚元件、富集元件及/或穩定化元件中之一或多者之容器內的溫度之感測器；控制培養基在元件中之各容器之輸入與輸出端口之間的轉移的至少一個氣泡感測器；控制培養基在輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個泵，視情況蠕動泵；評估富集元件內之壓力的壓力感測器；控制富集元件內之切向流過濾過程的一或多個閥；及/或控制培養基在各元件之輸入與輸出端口之間的轉移之一或多個夾具。
自動化裝置可包括可程式化處理器，其經調適以維持穩定化模組中之最佳儲存溫度範圍直至容器經移除。在一實施例中，可程式化處理器可執行受控冷凍步驟。
在一些情況下，自動化裝置可包括使用者介面。自動化裝置之介面可包括用以顯示指令之顯示幕，該等指令指導使用者輸入參數、確認預程式化之步驟、警告錯誤或其組合。
如本文所描述之自動化裝置可經調適成可移動的。
自動組織處理方法可以包括自與套組之組件相關之數位、電子或電磁標籤指示符自動確定用於處理步驟之條件及其相關條件。在使用期間，可將組織樣品置放於套組之具有至少一個開放邊緣的可撓性容器中。在將組織定位於可撓性容器中之後，可密封開放邊緣。在使用期間，組織可藉由傳達與指示符相關的資訊及控制靠近可撓性容器的條件及/或可撓性容器之位置自動執行一或多個組織處理步驟來處理。另外，可基於與指示符相關之資訊控制將材料添加至套組中。可過濾經處理組織中之至少一些以使得產生經過濾流體。經過濾流體中之至少一些可提供至冷凍保存可撓性容器以使經過濾流體中存在之所要材料穩定化。
如本文所描述之處理可包括攪拌、提取及酶消化可撓性容器中組織樣品之至少一部分。在一些情況下，組織之此處理可引起自組織樣品提取所要材料。舉例而言，可自組織樣品提取腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
用於本文所描述之方法中之可撓性容器(諸如袋)可包括可熱密封材料。
使用冷凍保存套組自組織材料進行組織處理及提取可引起所要材料之分離。特定言之，諸如腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之材料可為所要材料。
在一些情況下，本文所描述之冷凍保存套組及/或其組分可在自動化及/或半自動化過程中單次使用以用於細胞或細胞聚集體之解聚、富集及/或穩定化。在一些實施例中，諸如收集袋之用於冷凍保存套組中之袋可在一些實施例中用於多個過程。舉例而言，收集袋可在不同位置重複密封以產生用於處理組織樣品(諸如生檢樣品及/或固體組織)之單獨區室。
用於本文中所描述之本發明之可撓性容器，諸如袋包括收集袋及冷凍保存袋，其可包括由預定材料製成之至少一部分，該預定材料諸如熱塑性材料、聚烯烴聚合物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、摻合物(諸如共聚物，例如乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物(亦即，OriGen Biomedical EVO膜))、包括EVA之材料及/或可密封塑膠之共擠層。收集袋，諸如本發明之組織收集袋可包括由預定材料製成之用於接收組織的袋，該預定材料諸如乙烯乙酸乙烯酯(EVA)及/或包括EVA之材料。可針對特定特性選擇供用於袋之材料。在一實施例中，包括收集袋之袋可實質上由乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物製成。舉例而言，可用以選擇用於冷凍保存套組組件(諸如收集袋及/或相關聯導管)之材料的相關特性可係關於熱密封。
可針對特定特性及/或一系列特性選擇用於袋中之材料，例如諸如熱密封性之密封性；透氣性；可撓性，例如低溫可撓性；彈性，例如低溫彈性；耐化學性；光學透明度；生物相容性，諸如細胞毒性、溶血性活性、抗浸出性；具有低碳氣體顆粒。
在一些實施例中，可針對用於形成袋之至少一個層的共擠材料之特定特性選擇材料。層可經構築以使得當構築時，袋之內部層為相對生物相容的，亦即袋之內表面上的材料為穩定的且不浸濾至袋之內容物中。
舉例而言，可用以選擇用於諸如收集袋、冷凍保存袋及/或相關聯導管之套組組件的材料之相關特性可關於密封，例如熱密封。
袋(諸如收集袋及/或冷凍保存袋)及任何相關聯導管可為大體上澄清、透明、半透明、任何所要顏色或其組合。組織收集袋及/或導管通常可以類似於封閉及/或密封血液及/或冷凍保存袋及相關聯導管之製造的方式製造。本發明中之導管可由任何所要材料構築，包括但不限於聚氯乙烯(PVC)。舉例而言，PVC可為所要材料，因為PVC有利於熔接及/或密封。
在一些實施例中，收集袋之至少一個末端可開放用於接收組織。特定言之，在一實施例中，例如來自生檢之組織樣品可經由開放末端(例如頂部末端)置於袋中。在一些情況下，生檢樣品可為來自動物(例如，家畜，諸如狗或貓)或人類的癌組織。
在組織定位於袋中之後，袋可經密封，且隨後可經處理。處理可包括組織在袋中攪拌，例如平緩攪拌、提取及/或酶消化。組織處理及提取所要材料(諸如腫瘤浸潤淋巴球(TIL))可在封閉系統中。有利或較佳實施例可包括鑑別收集組織所來自之患者的指示符及/或展示在儀器中收集袋可夾持、密封、受裝置作用及/或貼附固定位置的標記。
在一些實施例中，袋可由可密封材料形成。舉例而言，袋可由包括但不限於聚合物之材料形成，該等聚合物諸如包括脂族或半芳族聚醯胺(例如，耐綸)、乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)及其摻合物、熱塑性聚胺甲酸酯(TPU)、聚乙烯(PE)、乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物及/或聚合物組合之合成聚合物。袋之部分可使用能量，諸如熱、射頻能量、高頻(HF)能量、介電質能量及/或此項技術中已知之任何其他方法密封及/或熔接。
收集袋可用作處理及/或解聚袋。收集袋可具有在約4 cm至約12 cm範圍內之寬度及在約10 cm至約30 cm範圍內之寬度。舉例而言，用於處理之收集袋可具有約7.8 cm之寬度及約20 cm之長度。特定言之，袋可為可熱密封的，例如使用EVA聚合物或其摻合物、乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物及/或一或多種聚醯胺(耐綸)。
指示符可包括但不限於代碼、字母、字組、名稱、文數碼、數字、影像、條碼、快速回應(QR)碼、標籤、追蹤器(諸如智慧型追蹤器標籤或藍芽追蹤器)及/或此項技術中已知之任何指示符。在一些實施例中，指示符可印刷於、蝕刻於及/或黏附於套組之組件之表面上。指示符亦可使用黏著劑定位於袋上，例如，貼紙或追蹤器可置放於一個袋上及/或多個袋上。收集袋及/或冷凍保存套組可包括多個指示符，諸如數字碼及/或QR碼。
指示符(例如QR碼、諸如智慧型標籤之標籤及/或追蹤器)可用於鑑別袋內之樣品以及發指令給裝置之處理器，以使得裝置根據在冷凍保存套組中進行之解聚、富集及/或穩定化過程的類型運行特定程式。不同類型之培養基可用於此等過程中，例如可允許受控冷凍速率之酶培養基、腫瘤消化培養基及/或冷凍保存培養基。在一些實施例中，冷凍保存套組及/或其組件可包括可由自動化裝置讀取之指示符。裝置隨後可執行用於在插入至此類裝置時處理組織的特定全自動方法。本發明特別適用於樣品處理，特別是自動化處理。在一些情況下，本文所描述之冷凍保存套組及/或其組分可在自動化及/或半自動化過程中單次使用以用於細胞或細胞聚集體之解聚、富集及/或穩定化。在一些實施例中，諸如收集袋之用於冷凍保存套組中之袋可在一些實施例中用於多個過程。舉例而言，收集袋可在不同位置重複密封以產生用於處理組織樣品(諸如生檢樣品及/或固體組織)之單獨區室。
另外，標記可置放於袋，諸如組織收集袋上之各種位置處以指示袋可密封、夾持及/或貼附至物件之位置。在一些實施例中，展示袋可夾持、密封及/或貼附至物件(諸如儀器)之位置的標記可在使用之前安置於袋上。舉例而言，一或多個標記可在製造期間定位於袋上。
定位器可用於確保袋中之組織材料可在使用期間恰當地處理，例如接近於儀器定位。在一些系統中，定位器可有助於本文中所描述之袋在自動化系統中之使用。特定言之，定位器可用於使袋移動穿過自動化系統。
使用諸如QR碼之指示符可允許追蹤特定樣品之過程步驟，使得有可能在給定過程中跟蹤樣品。
本發明涉及且提供治療性細胞群體，如以下編號段落中所論述：
1. 一種腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體，其中： a)該群體中之T細胞包含至少25%效應記憶(EM) T細胞，或該群體中之CD4 T細胞包含至少25% EM CD4 T細胞，或該群體中之CD8 T細胞包含至少25% EM CD8 T細胞，或 b)該群體中之T細胞包含至少20%中央記憶(CM) T細胞，或該群體中之CD4 T細胞包含至少20% CM CD4 T細胞，或該群體中之CD8 T細胞包含至少20% CM CD8 T細胞，或 c)該群體中之EM及CM T細胞之組合比例占該等T細胞之至少40%，或該群體中之EM及CM CD4 T細胞之組合比例占該等CD4 T細胞之至少40%，或其中該群體中之EM及CM CD8 T細胞之組合比例占該等CD8 T細胞之至少40%，或 (d) UTIL群體中之效應T細胞的比例為該等T細胞之10%或更低，或該群體中之效應CD4 T細胞的比例為該等CD4 T細胞之10%或更低，或該群體中之效應CD8 T細胞的比例為該等CD8 T細胞之10%或更低，或 (e)該群體中幹細胞記憶T細胞之比例為該等T細胞之10%或更少，或該群體中幹細胞記憶CD4 T細胞之比例為該等CD4 T細胞之10%或更少，或該群體中幹細胞記憶CD8 T細胞之比例為該等CD8 T細胞之10%或更少，或 (f)該群體中效應細胞與幹細胞記憶T細胞之組合比例為該等T細胞之15%或更少，或該群體中效應細胞與幹細胞記憶CD4 T細胞之組合比例為該等CD4 T細胞之15%或更少，或該群體中效應細胞與幹細胞記憶CD8 T細胞之組合比例為該等CD8 T細胞之15%或更少。
2. 如段落1之TIL之治療群體，其中該等EM細胞之特徵在於CD62L-/CD45RO+或CCR7 lo/CD62L lo或CX3CR1 hi/CD27 lo或CD127 hi或CD27-/CD45RA-，或其中該等CM細胞之特徵在於CD62L+/CD45RO+或CCR7 hi/CD62L hi或CX3CR1 lo/CD27 hi或CD127 hi或CD27+/CD45RA-，或其中該等效應細胞之特徵在於CD62L-/CD45RO-，或其中該等幹細胞記憶細胞之特徵在於CD62L+/CD45RO-。
3. 一種分離冷凍保存之未經修飾(U)或經修飾(M)之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： (a)    (i)冷凍保存切除腫瘤且解聚冷凍保存之腫瘤，或 (ii)解聚所切除腫瘤且冷凍保存所解聚腫瘤，或 (iii)冷凍保存所切除腫瘤且將該腫瘤處理成多個腫瘤片段，或 (iv)將所切除腫瘤處理成多個腫瘤片段且冷凍保存該等腫瘤片段， 獲得精細切除腫瘤產物， (b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養精細切除腫瘤產物來進行第一次擴增以產生UTIL或MTIL之第一群體； (c)藉由將UTIL或MTIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生UTIL或MTIL之第二群體；及 (d)收集及/或冷凍保存UTIL或MTIL之第二群體。
4. 如段落3之方法，其進一步包含： (a')自個體切除腫瘤以獲得該切除腫瘤。
5. 如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的CD4 T細胞包含至少25%效應記憶(EM) CD4 T細胞，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的CD8 T細胞包含至少25% EM CD8 T細胞，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的T細胞包含至少25% EM T細胞。
6. 如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的CD4 T細胞包含至少20%中央記憶(CM) CD4 T細胞，或其中UTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的CD8 T細胞包含至少20% CM CD8 T細胞，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的T細胞包含至少20% CM T細胞。
7. 如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的EM及CM CD4 T細胞之組合比例占CD4 T細胞之至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的EM及CM CD8 T細胞之組合比例占CD8 T細胞之至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的EM及CM T細胞之組合比例占T細胞之至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
8. 如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應CD4 T細胞之比例為CD4 T細胞之10%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應CD8 T細胞之比例為CD8 T細胞之10%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應T細胞之比例為T細胞之10%或更低。
9. 如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的幹細胞記憶CD4 T細胞之比例為CD4 T細胞之10%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL之第二群體中的幹細胞記憶CD8 T細胞之比例為CD8 T細胞之10%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的幹細胞記憶T細胞之比例為T細胞之10%或更低。
10.     如段落3或4之方法，其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應細胞及幹細胞記憶CD4 T細胞之組合比例為CD4 T細胞之15%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應細胞及幹細胞記憶CD8 T細胞之組合比例為CD8 T細胞之15%或更低，或其中UTIL或MTIL之第一群體或UTIL或MTIL之第二群體中的效應細胞及幹細胞記憶T細胞之組合比例為T細胞之15%或更低。
11.     如段落5至10中任一者之方法，其中該等EM細胞之特徵在於CD62L-/CD45RO+或CCR7 lo/CD62L lo或Cx3Cr1 hi/CD27 lo或CD127 hi或CD27-/CD45RA-，或其中該等CM細胞之特徵在於CD62L+/CD45RO+或CCR7 hi/CD62L hi或Cx3Cr1 lo/CD27 hi或CD127 hi或CD27+/CD45RA-，或其中該等效應細胞之特徵在於CD62L-/CD45RO-，或其中該等幹細胞記憶細胞之特徵在於CD62L+/CD45RO-。
12.     如段落3至11中任一者之方法，其中該解聚包含物理解聚、酶解聚或物理及酶解聚。
13.     如技術方案3至12中任一項之方法，其中該解聚腫瘤係經細胞化的。
14.     如段落3至13中任一者之方法，其中單細胞懸浮液獲自精細切除腫瘤產物且用於步驟(b)中，或其中來自步驟(a)之精細切除腫瘤產物包含單細胞懸浮液。
15.     如段落3至14中任一者之方法，其中該UTIL或MTIL之第一群體包含約100-2000萬個UTIL或MTIL。
16.     如段落1至15中任一者之方法，其中步驟(b)包括生長UTIL或MTIL以產生第一群體且步驟(c)之第二次擴增步驟包含快速擴增。
17.     如段落16之方法，其中步驟(b)進行約兩週且步驟(c)進行約兩週。
18.     如段落3至17中任一者之方法，其中在步驟(b)及/或步驟(c)中培養包括添加IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其組合。
19.     如段落3至18中任一者之方法，其進一步包含： (e)將該UTIL或MTIL之第二群體懸浮以獲得懸浮UTIL或MTIL。
20.     如段落19之方法，其中該懸浮係在包含緩衝鹽水及/或人類血清白蛋白及/或二甲亞碸(DMSO)之組合物中。
21.     如段落18至19中任一者之方法，其進一步包含： (f)冷凍保存所懸浮之UTIL或MTIL。
22.     如段落3至21中任一者之方法，其進一步包含： 將該UTIL或MTIL之第二群體或該等懸浮之UTIL或MTIL之經冷凍保存之UTIL或MTIL、或來自或衍生自該UTIL或MTIL之第二群體或該等懸浮之UTIL或MTIL之經冷凍保存之UTIL或MTIL解凍的最終步驟，以獲得解凍之UTIL或MTIL。
23.     如段落22之方法，其中該等解凍之UTIL或MTIL準備好以單劑量形式輸注而無需進一步修改。
24.     如段落3至23中任一者之方法或如段落1或2之治療群體，其中該等TIL係未經修飾的或係UTIL。
25.     如段落3至23中任一者之方法或如段落1或2之治療群體，其中該等TIL係經修飾的或係MTIL。
26.     如技術方案v中任一項之方法或如段落1或2之治療群體，其中該等TIL係藉由基因工程改造方法獲得的MTIL。
27.     如段落3至23或26中任一者之方法，其包括包含使TIL經歷基因工程改造方法及自其獲得MTIL之步驟。
28.     如段落26至27中任一者之方法或治療群體，其中該基因工程改造方法包含CRISPR方法或TALE或TALEN方法或鋅指方法或轉染方法或轉導方法或轉位子系統方法。
29.     如段落1、2或24至28中任一者之治療群體，其藉由或可藉由如段落3至28中任一者之方法獲得。
30.     一種冷凍保存之UTIL之治療群體，其可藉由或藉由如段落3至28中任一者之方法獲得。
31.     一種冷凍保存之MTIL之治療群體，其可藉由或藉由如段落3至28中任一者之方法獲得。
32.     如段落1、2、24至28、29、30或31之治療群體，其中該群體包含約5×10 9至約5×10 10個T細胞。
33.     一種冷凍保存袋，其含有包含如段落1、2、24至28、29、30、31或32之治療群體的內容物。
34.     如段落33之冷凍保存袋，其中該袋經密封。
35.     如段落33或34之冷凍保存袋，其用於靜脈內輸注；或靜脈內輸注袋、容器或器皿，其包含如段落33或34之冷凍保存袋或含有包含如段落1、2、24至28、29、30、31或32之治療群體的內容物。
36.     一種醫藥調配物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑及如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體，或如段落33或34之冷凍保存袋之內容物，或如段落35之靜脈內輸注袋、容器或器皿之內容物。
37.     一種用於治療患者或個體之癌症的方法，其包含投與有效量之以下： (i)如段落36之調配物，或 (ii)如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體，或 (iii)包含如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體的調配物，或 (iv)如段落33或34之冷凍保存袋之內容物，或 (v)如段落35之靜脈內輸注袋、容器或器皿之內容物，或 (vi)包含(i)至(v)中任一者之藥劑。 其中該患者或個體需要治療該癌症及/或該投與。
38.     一種以下之用途： (i)如段落36之調配物，或 (ii)如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體，或 (iii)包含如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體的調配物，或 (iv)如段落33或34之冷凍保存袋之內容物，或 (v)如段落35之靜脈內輸注袋、容器或器皿之內容物， 其係用於製備用於治療癌症之藥劑，該治療包含向患者或個體投與該藥劑，該藥劑包含： (i)如段落36之調配物，或 (ii)如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體，或 (iii)包含如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體的調配物，或 (iv)如段落33或34之冷凍保存袋之內容物，或 (v)如段落35之靜脈內輸注袋、容器或器皿之內容物， 其中該患者或個體需要治療該癌症及/或接受該投與。
39.     如段落37或38之方法或用途，其中該癌症係膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、子宮頸癌、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌[HNSCC])、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌或腎細胞癌。
40.     如段落37或38之方法或用途，其中該患者或個體係人類。
41.     如段落37或38之方法或用途，其中該患者或個體係非人類哺乳動物。
42.     如段落41之方法或用途，其中該非人類哺乳動物係靈長類動物、嚙齒動物、大鼠、小鼠、家養哺乳動物、家養貓、家養狗、家養馬、天竺鼠、實驗室動物或伴侶動物。
43.     如段落37至42中任一者之方法或用途，其中該患者或個體為成體或具有第二性征之個體。
44.     如段落37至41中任一者之方法，其中該患者或個體不為成體或具有第二性征之個體，或為幼兒或身體尚未成熟之哺乳動物。
45.     如段落37至44中任一者之方法或用途，其中該投與係進行超過一次，或在一段時程內進行超過一次，其中該時程係一週且該投與係一週內兩次、三次、四次或五次，或其中該時程係一個月且該投與係一個月內兩次、三次或四次，或其中該時程係三個月、六個月、九個月或十二個月且該時程係每月一次或每週一次；及/或其中該有效量包含如前述編號段落中之任一者中所述之TIL的量；及/或其中該投與係經靜脈內。
46.     一種套組，其包含： (i)如段落36之調配物，或 (ii)如段落1、2、24至28、29、30、31或32中任一者之治療群體，或 (iii)包含如技術方案1、2、24至28、29、30、31或32中任一項之治療群體的調配物，或 (iv)如技術方案33或34之冷凍保存袋之內容物，或 (v)如技術方案35之靜脈內輸注袋、容器或器皿之內容物， 及 容器，其用於容納及/或摻合賦形劑(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)，及視情況選用之用於摻合及/或投與之說明書。
因此，本發明之一個目標為本發明內不涵蓋任何先前已知的產物、製造該產物的製程，或使用該產物的方法，使得申請人保留權利且特此揭示任何先前已知產物、製程或方法的免責聲明。另外應注意，本發明不意欲在本發明之範疇內涵蓋不符合USPTO (35 U.S.C. §112，第一段)或EPO (EPC之第83條)之書面描述及實現要求的任何產物、製程或該產物之製造或使用該產物之方法，以使得申請人保留權利且特此揭示任何先前所述產物、製造該產物之製程或使用該產物之方法的免責聲明。本發明之實踐遵循EPC第53(c)條以及EPC規則28(b)及(c)可為有利的。明確地保留明確地放棄作為本申請案之譜系中或任何其他譜系中或任何第三方之任何先前所申請申請案中申請人之任何所授予專利之主題的任何實施例的所有權利。本文中之任何內容不應被視作承諾。
應注意，在本發明中且尤其在申請專利範圍及/或段落中，諸如「包含(comprises/comprised/comprising)」之術語及其類似術語可具有美國專利法中賦予其之含義；例如其可意謂「包括(includes/included/including)」及其類似術語；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of/consists essentially of)」之術語具有美國專利法中賦予其之含義，例如其允許不明確列舉要素，但排除先前技術中所發現或影響本發明之基本或新穎特徵的要素。
此等及其他實施例揭示於以下實施方式中或自以下實施方式顯而易見且由以下實施方式涵蓋。
相關申請案及以引用的方式併入
參考2019年12月20日申請之美國專利申請案序列號62/951,559、2020年2月27日申請之美國專利申請案序列號62/982,470、2020年7月2日申請之美國專利申請案序列號29/740,293、2020年7月2日申請之美國專利申請案序列號63/047,431，及2020年12月18日申請且作為WO2021/123832在2021年6月24日公開之PCT/GB2020/053315，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。亦參考2021年6月24日申請之美國專利申請案序列號63/214,735及2021年6月24日申請之美國專利申請案序列號63/214,662。
參考2017年1月13日申請之英國專利申請案序列號GB1700621.4，2018年1月12日申請之歐洲專利申請案EP18701791.8，2018年1月12日申請之國際專利申請案序列號PCT/GB2018/050088，其作為PCT公開案第WO 2018/130845號在2018年7月19日公開，及2019年12月20日申請之美國專利申請案序列號62/951,559，其以引用的方式併入本文中。
參考2019年3月1日申請之英國專利申請案序列號GB1902763.0、2019年3月27日申請之英國專利申請案序列號GB1904249.8，及2020年2月28日申請之國際專利申請案序列號PCT/EP2020/000053，其在2020年9月10日作為WO 2020/177920公開。
前述申請案，Biomarker Predictive of Tumour Infiltrating Lymphocyte Therapy and the Uses Thereof，WO2019/145711A1 PCT/GB2019/050188，Tumor Infiltrating Lymphocyte Therapy and Uses Thereof USA，PCT/GB2020/051790及美國申請案序列號62/878,001，Receptors Providing Targeted Costimulation for Adoptive Cell Therapy WO 2020/152451，美國申請案序列號62/951,770及GB1900858.0，Cells Expressing Recombinant Growth Factor Receptors WO 2017/103596A1，美國申請案序列號16/061,435及歐洲專利公開案EP3390436，及Chimeric Growth Factor Receptors WO2019243835A1 PCT/GB2019/051745，及其中或在其審查期間所引用之所有文獻(「申請案引用文獻」)，及申請案引用文獻中所引用或參考之所有文獻，及本文中所引用或參考之所有文獻(「本文引用文獻」)，及本文引用文獻中所引用或參考之所有文獻，以及本文中或以引用方式併入本文中之任何文獻中所提及之任何產品的任何製造商說明書、描述、產品規格及產品介紹，皆以引用之方式特此併入本文中，且可用於本發明之實施。更特定言之，所有參考文獻均以引用的方式併入，其引用的程度如同特定且個別地指示各個別文獻以引用的方式併入一般。
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解之含義相同的含義。
術語「抗CD3抗體」係指抗體或其變異體，例如單株抗體且包括人類、人類化、嵌合、鼠類或哺乳動物抗體，其針對成熟人類T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗(muromonab)。抗CD3抗體亦包括UHCT1純系，亦稱為T3及CD3.ε。其他抗CD3抗體包括例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizuma)及維西珠單抗(visilizumab)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，本發明組合物待投與的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病狀的個別差異來確定。一般可規定，包含本文所描述之腫瘤浸潤淋巴球(例如二級TIL或經基因修飾之細胞毒性淋巴球)之醫藥組合物可以10 4至10 11個細胞/公斤體重(例如，10 5至10 6、10 5至10 10、10 5至10 11、10 6至10 10、10 6至10 11、10 7至10 11、10 7至10 10、10 8至10 11、10 8至10 10、10 9至10 11或10 9至10 10個細胞/公斤體重)的劑量投與，包括在彼等範圍內之所有整數值。腫瘤浸潤淋巴球(在一些情況下包括經基因修飾之細胞毒性淋巴球)組合物亦可以此等劑量多次投與。腫瘤浸潤淋巴球(在一些情況下，包括基因上的)可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術進行投與(參見例如Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。熟習醫學技術者可藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整療法而容易確定特定患者之最佳劑量及治療方案。
如本文所用，術語「共同投與(co-administration/co-administering)」、「與…組合投與(administered in combination with/administering in combination with)」、「同時(simultaneous)」及「並行(concurrent)」涵蓋向個體投與兩種或更多種活性醫藥成分(在本發明之一較佳實施例中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)，以使得活性醫藥成分及/或其代謝物兩者同時存在於個體中。共同投與包括以分開的組合物同時投與、以分開的組合物在不同時間投與或以其中存在兩種或更多種活性醫藥成分之組合物之形式投與。以分開的組合物形式同時投與及以存在兩種試劑之組合物形式投與係較佳的。
如本文所用，「細胞化(cellularized/cellularization)」係指解聚之過程，其使固體組織，亦即通常由多種細胞譜系/類型構成之多細胞材料分解為少量細胞，包括但不限於一個細胞但可為極少量之各種譜系或細胞類型之多個細胞，亦即細胞凝集物或細胞聚集體。
如本文所用，「封閉系統」係指對外部環境封閉之系統。適用於細胞培養方法之任何封閉系統均可用於本發明之方法。封閉系統包括例如但不限於封閉G-Rex容器或細胞培養袋。一旦將腫瘤區段添加至封閉系統中，該系統不對外部環境開放，直至TIL準備好向患者投與。在一有利實施例中，封閉系統為PCT公開案第WO 2018/130845號中所揭示之系統。
如本文所用，「冷凍保存培養基(cryopreservation media)」或「冷凍保存培養基(cryopreservation medium)」係指可用於冷凍保存細胞之任何培養基。此類培養基可包括包含2%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包括CryoStor CS10、HypoThermosol、Bloodstor BS-55以及其組合。
本文中之術語「冷凍保存之TIL」意謂初級、主體或經擴增之TIL (REP TIL)經處理且儲存在約-190℃至-60℃範圍內。用於冷凍保存之通用方法亦描述於本文別處，包括在實例中。為了清楚起見，「冷凍保存之TIL」可與可用作初級TIL來源之冷凍組織樣品區分。
如本文所用，「耗乏」係指將所需細胞與非所要細胞分離之負向選擇之過程，該等非所要細胞經偶合至固相之一種標記物結合片段標記。
如本文所用，「解聚(disaggregation/disaggregate)」係指將固體組織轉化成單個細胞或小細胞數目聚集體，其中單個細胞作為球狀體之直徑在5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm、10 μm、20 μm、30 μm、40 μm、50 μm、60 μm、70 μm、80 μm、90 μm、100 μm或更大範圍內，其中此更常在7至20 μm之間。
術語「有效量」或「治療有效量」係指足以影響預期應用(包括但不限於疾病治療)的如本文所述之化合物或化合物之組合的量。治療有效量可視預期應用(活體外或活體內)或所治療之個體及疾病病狀(例如，個體之體重、年齡及性別)、疾病病狀之嚴重程度或投與方式而變化。該術語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如血小板黏附及/或細胞遷移減少)之劑量。特定劑量將視以下而變化：所選特定化合物、所依循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投與、投與時序、其所投與之組織及其中攜帶化合物之物理遞送系統。
如本文所用之「工程改造」係指添加核酸材料或因子，其將組織來源之細胞功能自其原始功能改變為具有新的或改良之其最終效用之功能。
如本文所用之「酶培養基」係指具有酶活性之培養基，諸如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、釋放酶HI、胃蛋白酶或其混合物。
如本文所用之「濾液」係指穿過過濾器、網狀物或膜之材料。
如本文所用，「可撓性容器」係指具有一或多種不同類型之膜的呈多種形式之可撓性封裝系統。各膜類型經選擇以提供特定特徵以保存無菌流體、固體組織來源之細胞材料之物理、化學及功能特徵及容器完整性，視過程步驟而定。
亦在本領域中稱為冷凍保護劑之「冷凍溶液」或「冷凍保存溶液」為含有冷凍保護添加劑之溶液。此等一般為滲透性的無毒化合物，其改變細胞在冷凍期間暴露於的物理應力以最小化冷凍損傷(亦即歸因於冰形成)且最常為某% vol/vol之以下中之一或多者：二甲亞碸(DMSO)；乙二醇；丙三醇；2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)；丙二醇；蔗糖；及海藻糖。
術語「惡性血液病」係指哺乳動物癌症及造血及淋巴組織之腫瘤，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織。惡性血液病亦稱為「液體腫瘤」。惡性血液病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。術語「B細胞惡性血液病」係指影響B細胞之惡性血液病。
術語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-2，包括人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-2描述於例如Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。舉例而言，術語IL-2涵蓋IL-2之人類重組形式，諸如阿地介白素(aldesleukin) (普留淨(PROLEUKIN)，可以2200萬IU/單次使用小瓶形式購自多個供應商)，以及由CellGenix公司, Portsmouth, N.H., USA (CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene有限公司, East Brunswick, N.J., USA (目錄號CYT-209-b)商業供應的重組IL-2形式，及來自其他供應商之其他商業等效物。阿地介白素(消-丙胺醯基-1，絲胺酸-125人類IL-2)為分子量大約15 kDa之IL-2之非糖基化人類重組形式。術語IL-2亦涵蓋如本文所描述之IL-2之聚乙二醇化形式，包括可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, Calif., USA之聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案第WO 2012/065086 A1號中。適用於本發明之結合IL-2之替代形式描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4902,502號中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中。
術語「IL-4」(在本文中亦稱「IL4」)係指稱為介白素4之細胞介素，其由Th2 T細胞及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。在由IL-4活化後，Th2 T細胞隨後在正反饋迴路中產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖及II類MHC表現，且誘導類別轉換至自B細胞之IgE及IgG1表現。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司, East Brunswick, N.J., USA (目錄號CYT-211)及ThermoFisher Scientific公司, Waltham, Mass., USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。
術語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化之組織源性細胞介素，其可獲自基質及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7結合於IL-7受體，由IL-7受體α及共同γ鏈受體組成之異二聚體，其屬於對於T細胞在胸腺內之產生及外周內之存活重要之一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司, East Brunswick, N.J., USA (目錄號CYT-254)及ThermoFisher Scientific公司, Waltham, Mass., USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。
術語「IL-12」(在本文中亦稱為「IL12」)係指稱為介白素-12之T細胞生長因子。介白素(IL)-12為一種分泌性異二聚細胞介素，其包含2個二硫鍵連接之糖基化蛋白質子單元，其針對其近似分子量命名為p35及p40。IL-12主要由抗原呈現細胞產生且藉由結合於表現於T細胞或自然殺手(NK)細胞表面上之雙鏈受體複合物來驅動細胞介導之免疫性。IL-12受體β-1 (IL-12Rpi)鏈結合於IL-12之p40子單元，提供IL-12與其受體之間的主要相互作用。然而，係第二受體鏈IL-12RP2之IL-12p35接合賦予細胞內信號傳導。與抗原呈現同時發生的IL-12信號傳導被認為針對T輔助1 (Thl)表型引起T細胞分化，其特徵為干擾素γ (IFNy)產生。咸信Thl細胞促進針對一些細胞內病原體之免疫性，產生補體固定(complement-fixing)抗體同型，且有助於腫瘤免疫監視。因此，IL-12被認為係宿主防禦免疫機制之重要組分。IL-12為細胞介素之IL-12家族之一部分，其亦包括IL-23、IL-27、IL-35、IL-39。
術語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包括所有形式之IL-15，包括人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共有β及γ信號傳導受體子單元。重組人類IL-15為含有114個胺基酸(及N端甲硫胺酸)及12.8 kDa之分子量的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司, East Brunswick, N.J., USA (目錄號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific公司, Waltham, Mass., USA (人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。
術語「IL-18」 (在本文中亦稱為「IL18」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子。介白素-18 (IL-18)為由於其結構、受體家族及信號轉導路徑而屬於IL-1細胞介素家族之促炎性細胞介素。相關細胞介素包括IL-36、IL-37、IL-38。
術語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白，且包括所有形式之IL-21，包括人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變異體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。IL-21主要藉由自然殺手T細胞及活化之人類CD4 +T細胞產生。重組人類IL-21為分子量為15.4 kDa之含有132個胺基酸的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene有限公司, East Brunswick, N.J., USA (目錄號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific公司, Waltham, Mass., USA (人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。
術語「液體腫瘤」係指性質上為流體的異常細胞團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤之TIL在本文中亦可稱為骨髓浸潤淋巴球(MIL)。
如本文所用之「磁性粒子」中之「磁性」指代磁性粒子之所有亞型，其可用熟習此項技術者熟知之方法製備，尤其鐵磁性粒子、超順磁粒子及順磁性粒子。「鐵磁性」材料具有強磁場磁化率且能夠在磁場移除時保持磁特性。「順磁性」材料僅具有弱磁化率，且當移除磁場時快速失去其弱磁性。「超順磁」材料具有高感磁性，亦即當置放於磁場中時，其變為強磁性，但像順磁性材料，快速失去其磁性。
如本文所用，「標記物」係指特異性地由某一細胞類型表現之細胞抗原。較佳地，標記物為細胞表面標記物，使得可進行活細胞之富集、分離及/或偵測。
如本文所用，「標記物結合片段」係指優先結合於細胞之所要目標分子，亦即抗原的任何部分。術語部分包含例如抗體或抗體片段。如本文所用之術語「抗體」係指可藉由熟習此項技術者熟知之方法產生的多株或單株抗體。抗體可為任何物種，例如鼠類、大鼠、綿羊、人類。出於治療目的，若待使用非人類抗原結合片段，則此等片段可藉由此項技術中已知之任何方法人類化。抗體亦可為經修飾之抗體(例如寡聚物、經還原、經氧化及經標記之抗體)。術語「抗體」包含完整分子及抗體片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。另外，術語「標記物結合片段」包括除優先結合於細胞之所要目標分子之抗體或抗體片段以外的任何部分。適合部分包括但不限於結合於所要目標分子的稱為適體之寡核苷酸(Hermann及Pantel, 2000: Science 289: 820-825)、碳水化合物、凝集素或任何其他抗原結合蛋白(例如受體-配位體相互作用)。
「培養基」意謂用於減少細胞死亡之細胞培養、細胞操作及穩定化技術中已知之各種溶液，包括但不限於以下培養基中之一或多者：器官保藏溶液、選擇性溶解溶液、PBS、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、伊氏培養基(Iscove's medium)、X-VIVO™、乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer's solution)、乙酸林格氏溶液、生理鹽水、PLASMALYTE™溶液、類晶體溶液及IV流體、膠體溶液及IV流體、含5%右旋糖水溶液(D5W)、哈特曼氏溶液(Hartmann's Solution)。培養基可為標準細胞培養基，如以上提及之培養基，或用於例如初級人類細胞培養(例如用於內皮細胞、肝細胞或角質細胞)或幹細胞(例如樹突狀細胞成熟、造血擴增、角質細胞、間葉幹細胞或T細胞擴增)之特殊培養基。培養基可具有此項技術中熟知的補充劑或試劑，例如白蛋白及轉運蛋白、胺基酸及維生素、抗生素、連接因子(attachments factor)、生長因子及細胞介素、激素、代謝抑制劑或增溶劑。各種培養基可商購自例如ThermoFisher Scientific或Sigma-Aldrich。
如本文所用，術語「微環境」可指作為整體之實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所用，腫瘤微環境係指以下之複雜混合物：「細胞、可溶因子、信號傳導分子、細胞外基質及促進贅生性轉化、支援腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤避免宿主免疫性、促進治療抗性，及提供顯性轉移茁壯成長之生態棲位(niche)之機械信號」，如Swartz等人，Cancer Res., 2012, 72, 2473中所述。儘管腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但由於微環境之免疫抑制，免疫系統清除腫瘤為罕見的。
如本文所用，術語「陰性分離之」指有效分離由一個偶合至固相之標記物結合片段結合的細胞，且此等細胞並非所需細胞群體。
如本文所用之「未經標記之」或「未經觸摸之」係指未經偶合至固相之一個標記物結合片段結合的細胞。未經標記、未經觸摸之細胞部分含有所要目標細胞。
如本文所用之「非目標細胞」係指由一個標記物結合片段特異性結合之細胞，該標記物結合片段與用於移除不合需要之細胞類型的固相耦合。
「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的單株抗體或其生物類似物或變異體，包括人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或鼠類抗體，且包括可商購之形式，諸如OKT-3 (30 ng/mL，MACS CD3純，Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, Calif., USA)及莫羅單抗或其變異體、保守胺基酸取代、糖化形式或生物仿製藥。
如本文所用之「粒子」係指固相，諸如膠態粒子、微球體、奈米粒子或珠粒。產生此類粒子之方法在此項技術領域中已熟知。粒子可為磁性粒子或具有其他選擇性特性。粒子可呈溶液或懸浮液形式或其可在用於本發明之前呈凍乾狀態。凍乾粒子接著在接觸關於本發明待處理之樣品之前在便利緩衝液中復原。
術語「外周血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之外周血液細胞，包括淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。較佳地，外周血液單核細胞為經照射之同種異體外周血液單核細胞。PBMC為一種類型的抗原呈現細胞。
術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途為此項技術中所熟知。除非任何習知醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則考慮其在本發明之治療組合物中之用途。諸如其他藥物之額外活性醫藥成分亦可併入所描述之組合物及方法中。
本文中之術語「細胞群體」(包括TIL)意指許多具有共同特質之細胞。一般而言，群體一般數目在1×10 6至1×10 12之範圍內，其中不同的TIL群體包含不同數目。
如本文所用，「陽性分離之」係指有效分離由一個偶合至固相之標記物結合片段結合的細胞，且此等細胞為所需細胞群體。
如本文所用，「陰性分離之」指有效分離由一個偶合至固相之標記物結合片段結合的細胞，且此等細胞並非所需細胞群體。
如本文所用，「純度」係指目標群體或自原始固體組織所需之群體的百分比。
「快速擴增」意謂抗原特異性TIL之數目在一週時段內增加至少約3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更佳地在一週時段內增加至少約10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、800倍或90倍)，更佳地在一週時段內增加至少約100倍(或200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍或900倍)，或最佳地在一週時段內增加至少約1000倍或2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍或9000倍)。下文概述多個快速擴增方案。
「(一或多種)再生藥品」、「(一或多種)過繼細胞療法」或「(一或多種)晚期療法醫藥產品」在本文中可互換地使用，係指藉由以下任一用於一或多種哺乳動物之治療目的之細胞材料：一部分或所有細胞材料之作用；一部分或所有細胞材料之支援性作用，其旨在施用後改善哺乳動物之健康。治療性細胞可直接使用或可需要進一步處理、擴增及/或工程改造以提供此等作用。
如本文所用，「樣品」係指含有任何比率之細胞的樣品。較佳地，此等細胞為活細胞。在一些情況下，此等細胞亦可為可用於後續核酸或蛋白質提取之固定或冷凍細胞。樣品可來自動物，尤其哺乳動物，諸如小鼠、大鼠或人類。可使用含有細胞之任何可壓縮固體組織。本發明主要經由自實體腫瘤組織分離造血及癌細胞來說明。然而，本發明係關於一種用於自任何哺乳動物固體組織分離一系列細胞之方法。
如本文所用，「固相」係指結合於另一受質(例如粒子、螢光團、如生物素之半抗原、聚合物或諸如培養皿及微量滴定盤之較大表面)之標記物結合片段(例如抗體)之偶合。在一些情況下，偶合使得抗原結合片段直接固定化，例如若抗原結合片段偶合至培養皿之較大表面。在其他情況下，此偶合引起間接固定化，例如直接或間接(經由例如生物素)偶合至磁性珠粒之抗原結合片段，若該珠粒保持於磁場中，則固定化。在其他情況下，抗原結合片段與其他分子之偶合不引起直接或間接固定化，但允許根據本發明之細胞富集、分離、分隔及偵測，例如若標記物結合片段與化學或物理部分偶合，其接著允許例如經由流式細胞量測術方法，如FACS分選或螢光顯微術或基於筒匣(cartridge)之方法鑑別經標記之細胞及未經標記之細胞。
如本文所用，「固體組織」係指一片或多片動物來源之哺乳動物固體組織，其三維，即作為幾何體的長度、寬度及厚度大於多個基於個別細胞之單元的大小，且通常含有結締材料，諸如膠原蛋白或構成組織結構之類似基質，由此該固體組織不能流過管或由注射器或類似的小導管或收容器收集，且亦即具有在500 μm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、1 cm、2 cm、3 cm、4 cm、5 cm、10 cm、20 cm、30 cm或更大範圍內的尺寸。
「實體腫瘤」係指通常不含孢囊或液體區域的異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。術語「實體腫瘤癌症」係指惡性、贅生性或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌症包括但不限於肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、大腸癌、直腸癌及膀胱癌。實體腫瘤之組織結構包括相互相依組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支援微環境之支援基質細胞。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸部鱗狀細胞癌[HNSCC])神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實體腫瘤之組織結構包括相互相依組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支援微環境之支援基質細胞。
本文之「解凍之冷凍保存之TIL」意謂先前經冷凍保存且隨後處理以恢復至室溫或更高溫度(包括但不限於細胞培養溫度或可向患者投與TIL之溫度)的TIL群體。
術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」、「治療(treat)」及其類似術語係指獲得所要藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病之任何治療，且包括：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即促使疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意謂涵蓋遞送試劑以便提供藥理學效應，即使在不存在疾病或病狀之情況下亦如此。舉例而言，「治療」涵蓋可在不存在疾病病狀之情況下引發免疫反應或賦予免疫性的組合物之遞送，例如在疫苗之情況下。
本文中「腫瘤浸潤淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包括但不限於CD8 +細胞毒性T細胞(淋巴球)、Thi及Thi 7 CD4 +T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及Ml巨噬細胞。TIL包括初級TIL及二級TIL兩者。「初級TIL」係如本文所概述之獲自患者組織樣品的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，且「二級TIL」係任何如本文所論述之經擴增或增殖的TIL細胞群體，包括但不限於主體TIL及經擴增之TIL (「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞群體可包括經基因修飾之TIL。TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標記物)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL一般可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD62L、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力功能上定義。TIL可進一步藉由活體外效能或離體表徵，例如若回應於TCR接合其活化，產生細胞介素且展現細胞毒性潛力，則TIL可視為強效的或功能性的。在另一實施例中，TIL可進一步藉由效能表徵，例如，若回應於TCR接合其產生之例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可視為強效或功能性的。效能亦可在TCR誘導之刺激後，藉由流式細胞量測術經由CD137、CD107a、INF-γ TNF-α及IL-2之細胞內染色來測定。
如本文中所用之「保留物」係指不通過過濾器、網狀物或膜之材料。
如本文所用，「最終效用」係指再生藥品、過繼細胞療法、ATMP、活體外診斷研究或科學研究之製造或直接使用。
下文描述額外定義。
本發明係關於腫瘤浸潤淋巴球(TIL)，特定言之未經修飾之TIL (UTIL)，其可分離自轉移癌患者之腫瘤，涉及自相同癌症患者產生且返回至相同癌症患者之自體TIL。本發明亦關於分離冷凍保存之TIL或UTIL之治療群體的方法，且關於經由使用包含單次使用無菌套組之裝置以藉由本文所描述之方法處理切除腫瘤，而獲得或可獲得的TIL及UTIL。
一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣品(「初級TIL」)且隨後擴增成用於如本文所描述之進一步操縱、如本文所概述之冷凍保存、再刺激，且視情況評估作為TIL健康之指標的表型及代謝參數的更大群體。
患者腫瘤樣品可使用此項技術中已知之方法獲得，一般經由手術切除、針吸生檢或用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣品的其他方式獲得。一般而言，腫瘤樣品可來自任何實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣品亦可為液體腫瘤，諸如獲自惡性血液病之腫瘤。實體腫瘤可為任何癌症類型，包括但不限於乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰臟癌、前列腺癌、大腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)。在一些實施例中，適用的TIL係獲自惡性黑素瘤腫瘤，因為報導指出此等腫瘤具有特別高含量之TIL。
產生一般涉及雙階段過程。在階段1中，解剖初始腫瘤材料，置於具有解聚模組之無菌套組中，酶消化及/或片段化，且使解聚模組中之腫瘤均質化，得到單細胞懸浮液。儘管均質化細胞可在無菌套組內在單獨富集模組中進一步純化以移除組分，諸如不再需要之試劑；細胞碎片；未解聚組織，細胞可直接冷凍保存以使起始材料穩定化以用於TIL製造及儲存於無菌套組之穩定化模組中，直至需要階段2。階段2一般涉及TIL自切除腫瘤起始材料之生長(2週)，隨後為TIL細胞之快速擴增過程(快速擴增方案「REP」-2週)。洗滌且收集最終產物，隨後懸浮於緩衝鹽水、8.5% HSA及10% DMSO中，且冷凍保存以形成固體無菌產物，其在輸注之前以單次劑量形式解凍，無進一步修飾。
對於治療存在可能有助於治療活性之三個各別要素。核心要素為TIL，亦即腫瘤衍生T細胞，其可藉由T細胞用作其正常功能之一部分的多種方法靶向及消除腫瘤細胞。此等方法包括直接方法(亦即，穿孔蛋白介導之細胞毒性)及間接方法(亦即，細胞介素產生)。雖然小鼠模型表明干擾素γ之產生對於有效療法至關重要，但此等方法中之哪一者對活體內抗腫瘤作用最重要並不明確。有助於療法之兩種其他要素為預處理化學療法及高劑量靜脈內IL-2。認為此等兩種要素藉由支援輸注後患者中之T細胞之移植起作用：最初經由調節化學療法，其移除競爭及調節免疫細胞；隨後為支援T細胞存活之IL-2組分。
細胞療法產物之結構藉由藉助於生長支援細胞培養基及T細胞支援生長因子介白素-2 (IL-2)自酶消化之腫瘤塊直接生長出TIL而產生。此使得腫瘤特異性T細胞能夠選擇性地存活且生長出腫瘤細胞混合物，而不識別腫瘤抗原之T細胞將不被刺激且被選擇性地損失。產物包含基於自體T細胞之產物，其中T細胞已來源於患者自身之癌症組織且快速擴增以形成純T細胞群體及如由CD3表面標記物所定義之T細胞。
簡言之，TIL，尤其UTIL，可在雙階段過程中使用腫瘤生檢體作為起始材料產生：階段1 (通常經2至3小時進行)經由使用套組及半自動裝置使用解剖、酶消化及均質化初始收集及處理腫瘤材料，以產生單細胞懸浮液，其可使用套組之穩定化模組直接冷凍保存以穩定化起始材料以用於後續製造；及階段2，其可在數天或數年後發生。階段2可經4週進行，其可為以階段1之產物解凍開始，及自腫瘤起始材料生長TIL (約2週)，隨後TIL細胞快速擴增過程(約2週)以增加細胞量且因此增加劑量的連續製程。將TIL，尤其UTIL濃縮且在調配為細胞之液體懸浮液之前洗滌。無菌藥物產品可在袋中冷凍保存，其將在靜脈內輸注之前以單次劑量形式解凍，無進一步修飾。
在一個實施例中，本發明之袋為收集袋及/或冷凍保存袋。袋及任何相關聯導管可為大體上澄清、透明、半透明、任何所要顏色或其組合。組織收集袋及/或導管通常可以類似於封閉及/或密封血液及/或冷凍保存袋及相關聯導管之製造的方式製造。本發明中之導管可由任何所要材料構築，包括但不限於聚氯乙烯(PVC)。舉例而言，PVC可為所要材料，因為PVC有利於熔接及/或密封。
收集袋，諸如本發明之組織收集袋可包括由預定材料製成之用於接收組織之袋的至少一部分，該預定材料諸如聚烯烴聚合物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、共聚物(諸如乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物(亦即OriGen Biomedical EVO膜))及/或包括EVA之材料。可針對特定特性及/或一系列特性選擇用於袋中之材料，例如諸如熱密封性之密封性；透氣性；可撓性，例如低溫可撓性；彈性，例如低溫彈性；耐化學性；光學透明度；生物相容性，諸如細胞毒性、溶血性活性、抗浸出性；具有低碳氣體顆粒。
密封口可用能量(例如熱)在使用期間形成以產生熔接區。在使用期間形成之密封口可具有在約2.5 mm至約7.5 mm範圍內之寬度。一般而言，在將組織材料置放於袋140中之後形成密封口140且可具有約5 mm之寬度。可使用密封剝離測試(亦即ASTM F88/F88M)及/或爆發測試(burst test) (亦即ASTM F1140/F1140M或ASTM F2051/F2054M)來測試密封的強度。
在一些實施例中，袋或可撓性容器可以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受100牛頓之力。袋或可撓性容器實施例可經構築以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受75牛頓之力。
當在可撓性容器(諸如袋，例如收集袋及/或冷凍保存袋)上形成密封口或熔接口時，密封裝置可用於視用於袋之材料而定在預定溫度、壓力及時間量下施加熱及/或壓力。舉例而言，一些熱封機可能需要施加熱及壓力約八秒。在8秒之後，可關斷裝置之熱，然而，可施加壓力額外2至3秒。
在一些實施例中，袋可具有在約10 cm至約50 cm範圍內之長度。特定言之，用於本文所描述之本發明的袋可具有在約15 cm至約30 cm範圍內之長度。舉例而言，袋可具有在約18 cm至約22 cm範圍內之長度。
一些導管可為可熔接的。可熔接導管可由例如聚氯乙烯(PVC)之聚合物材料製成。
可在沿著導管之位置處使用包括但不限於無針閥之閥。在一些實施例中，袋可具有在約10 cm至約40 cm範圍內之長度。特定言之，用於本文所描述之本發明的袋可具有在約15 cm至約30 cm範圍內之長度。舉例而言，袋可具有在約18 cm至約22 cm範圍內之長度。
冷凍保存袋可能需要適合於使用諸如二甲亞碸(「DMSO」)之冷凍保護劑的冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存袋可經構築以使得袋可容納在約5 ml至約45 ml範圍內之材料體積。詳言之，冷凍保存袋可包括容納在約10 ml至約35 ml範圍內之材料體積。舉例而言，一些實施例包括可容納在約15 ml至約30 ml範圍內之待儲存材料體積的冷凍保存袋。冷凍保存袋可具有使得達成所要預定體積的大小。在一些實施例中，冷凍保存袋可具有在約4 cm至約11 cm範圍內之寬度及在約10 cm至約18 cm範圍內之長度。舉例而言，冷凍保存袋可具有在約5.8 cm至約9.8 cm範圍內之寬度及在約12 cm至約16 cm範圍內之長度。詳言之，冷凍保存袋之實施例可具有約7.8 cm之寬度及約14 cm之長度。
在使用之前，冷凍保存套組及/或其特定組件可經滅菌。用於形成袋之材料可為可熱密封的。用於袋之材料可包括但不限於聚合物，諸如EVA、聚醯胺(例如耐綸)及其組合。開放袋可用於在使用密封口及/或夾具封閉袋之後進行處理及/或解聚。
過濾器可為管線過濾器(inline filter)、血液過濾器(諸如血液投與過濾器)、生物過濾器及/或管線凝集物移除過濾器。過濾器可經組態以自經處理組織移除大於預定大小之材料以形成所要材料。舉例而言，組織之團塊可使用過濾器與解聚組織分離。特定言之，在過濾之後進入導管之組織組合物可具有平均大小小於約200 µm的組分，以使得形成所要材料。舉例而言，所要材料可包括平均大小小於約170 µm之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
過濾器可經選擇以使得自導管進入之經處理組織組合物可富集，使得在過濾器之後，在穩定化元件方向上流入導管中的所要材料具有大小在約15 µm至約500 µm範圍內的組分。在一些實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後在穩定化元件方向上進入導管之組織組合物具有大小在約50 µm至約300 µm範圍內之組分。舉例而言，在一實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後進入導管之組織組合物具有大小在約150 µm至約200 µm範圍內的組分。
在一些實施例中，富集元件之過濾器可自經處理組織移除在約5 µm至約200 µm的預定大小範圍之外之材料，以形成所要材料。舉例而言，所要材料可包括平均大小在約5 µm至約200 µm範圍內之TIL。可將閥置放在距收集袋預定距離處。舉例而言，無針閥可距收集袋約20 cm定位。諸如無針閥之閥可用以將材料添加至收集袋。舉例而言，可將酶培養基插入無針閥中，以便添加培養基至收集袋。待經由閥提供之材料包括例如腫瘤消化培養基及/或冷凍保護劑或冷凍保存培養基，諸如DMSO及/或其溶液，諸如55% DMSO及5%聚葡萄糖冷凍保存培養基(例如BloodStor 55-5)。
注射器可用於分別經由無針閥290、292提供腫瘤消化培養基及55% DMSO溶液，諸如55% DMSO及5%聚葡萄糖冷凍保存培養基。在處理期間，可在預定時間將材料選擇性地提供至冷凍保存套組。此外，夾具可用於控制諸如腫瘤消化培養基及/或冷凍保護劑之所提供材料的流動，諸如DMSO溶液可在預定時間提供至諸如收集袋、過濾器及/或冷凍保存袋之裝置。
在一些實施例中，在此類閥之後，可存在預定量之導管以允許存在對冷凍保存套組熔接上額外組件的空間。舉例而言，在一些閥之後，至少十(10) cm導管可定位於下一元件之前。導管199可為可密封及/或可熔接的。舉例而言，用於導管之材料可包括但不限於聚氯乙烯(PVC)及/或此項技術中已知的其他材料。在一些實施例中，導管可經設定大小以適配連接器。舉例而言，導管可具有在約1.5 mm至約4.5 mm範圍內之內徑及在約2.1 mm至約6.1 mm範圍內之外徑。舉例而言，冷凍保存套組之實施例可包括內徑在約2.9 mm至約3.1 mm範圍內且外徑在約4.0 mm至約4.2 mm範圍內之導管。用於冷凍保存套組191中之導管的長度可變化，其中個別導管元件之長度在約1 cm至約30 cm範圍內。
夾具可用於阻止及/或防止酶培養基及/或經消化組織移動至過濾器中。舉例而言，夾具可用於阻止及/或防止酶培養基及/或經消化組織在所要過濾步驟之前移動至過濾器中。另一夾具198阻止及/或防止冷凍保護劑不合需要地移動至過濾器中。
在特定實施例中，兩個或更多個袋可耦接在一起以確保可恰當地儲存解聚產物材料。
在一些實施例中，本發明可包括用於半自動化無菌解聚、富集及/或穩定化來自組織(例如固體哺乳動物組織)之細胞及/或細胞聚集體的自動化裝置。與本發明一起使用之自動化裝置可包括可程式化處理器及冷凍保存套組。在一些實施例中，冷凍保存套組可為單次使用的。本發明進一步關於半自動無菌組織處理方法。
在一些實施例中，諸如收集袋之袋可用於收集套組中。具有開放末端的袋允許添加樣品，諸如組織樣品。收集套組中連接器可將袋耦接於導管。導管材料可為可密封及/或可熔接的。舉例而言，導管可使用能量(諸如熱、射頻等)密封。導管材料可由PVA製成。
在一些實施例中，導管可與閥耦接以允許添加一或多種培養基酶溶液，包括但不限於膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、釋放酶HI、胃蛋白酶或其混合物。舉例而言，閥可為無針閥。用於冷凍保存套組中之導管可包括外徑在約3.0 mm至約5.0 mm範圍內之導管，其中導管之內徑在約2.0 mm至約4 mm範圍內。特定言之，導管可具有4.1+/-0.1 mm之外徑及約3.0+/-0.1 mm之內徑。導管之長度可視收集套組之組態而定。舉例而言，收集套組之實施例可包括長度在約10 cm至約20 cm範圍內之導管。
在收集套組之一些實施例中，原型可包括一或多個夾具以阻止及/或防止組織及/或酶培養基移動。特定言之，可阻止酶培養基及/或組織在過濾步驟之前移動至過濾器中。
對於治療存在可能有助於治療活性之三個各別要素。核心要素為TIL，諸如UTIL，其具有藉由T細胞用作其正常功能之一部分的多種機制消除腫瘤細胞的潛能。
此等機制包括：直接細胞毒性，其藉由[a]釋放細胞毒素(例如穿孔蛋白、顆粒酶及顆粒溶素)，其藉由緊密接合進入目標細胞且誘導細胞死亡；及藉由[b] T細胞與目標之間的細胞表面相互作用，諸如結合FAS配位體介導之細胞毒性誘導細胞凋亡；及間接方法(例如細胞介素產生)，其能夠募集且刺激二級效應細胞以參與及誘導腫瘤細胞死亡。
TIL，尤其UTIL，係自體產物；因此，製造之各批次提供指定患者之單次劑量。不存在子批次或批次之彙集。藥物產品為在解凍之後用於單次靜脈內輸注的在125-270 mL之間的具有8.5%人類血清白蛋白及10% DMSO之基於生理鹽水之溶液中冷凍保存之少量無菌製備T細胞(5×10 9至5×10 10)批次。
與美國專利第10,398,734號(「'734專利」)相比，本發明中存在若干優勢。'734專利中之第一步驟將腫瘤主體轉化為自其培養TIL的片段。相比之下，本發明自腫瘤釋放TIL，該腫瘤在切除之後在無菌條件下在無菌套組中保存及解聚，自其製備細胞懸浮液，且藉由冷凍冷凍保存所得TIL。本發明提供表示腫瘤內部存在之多樣性的多樣化TIL群體。且因為其為均質懸浮液，所以在培養物中擴增之TIL將保留該多樣性，此提供解決存在於腫瘤內之癌細胞之多樣化群體的最大機會。
相比之下，'734專利之製造過程開始於組織之片段，該等片段在裝運及在開始處理之前的任何其他延遲期間已經經歷內部細胞群體之劣化。另外，用於製造之TIL將僅為自組織片段擴增之TIL，且不為任何保留於內部中之TIL，以使得所得細胞群體可能無法反映腫瘤環境之完全多樣性。
另一差異在於，進入封閉製造處理在本發明之過程中比'734專利之過程中早得多發生且污染的機率更小。特定言之，在本申請案中腫瘤組織之破壞發生在封閉處理系統中，而非'734專利描述為以在生物安全櫃中之開放操作形式發生的深入片段化過程。
因為本發明之起始材料在無菌套組中在無菌條件下保存，所以可對冷凍保存之腫瘤細胞懸浮液進行的完整製造過程可以高容量及效率安排且進行。相比之下，由於'734專利開始於解凍組織，因此片段化及「生長」步驟係在備用基礎上以較低容量利用效率運行。在'734專利中，移除此中間冷凍步驟總體縮短製造製程，但意謂整個製程在備用基礎上執行，此意謂製造停工時間對'734專利的製造設施具有顯著後果，此係因為不存在任何延遲，且製造計劃所需的停工期需要完成製程中的所有產品且停止新的手術。
本申請案之過程之優勢為，可在需要TIL療法之前收集呈切除腫瘤形式之組織，輸送、處理、冷凍保存且儲存於無菌套組中直至且若需要製造，所以可對患有較早期疾病之患者，在其具有替代療法的同時，進行收集及儲存。因此，對腫瘤收集及後續製造之時間或地理位置存在極小影響或無影響。而在'734專利中，此並不可能，且藥物產品之完全製造必須在可冷凍及保存細胞之前發生。
如上文所提及，此等為極不同培養過程，其將產生供起始REP培養物之不同細胞群體，如接種REP培養物所需的極不同數目之細胞所反映，100至2000萬(本發明)相對於2500-20000萬('734專利)。在本發明中，在初始TIL擴增期間，培養物接種使用細胞懸浮液(亦即自解聚及冷凍保存細胞生長出之細胞，其將為駐留及新生T細胞(emergent T cell)之混合物) (相對於自碎塊的突起生長(亦即新生細胞))；此意謂REP不僅接種有新生T細胞。另外，本發明可利用固體及可撓性封閉容器兩者，其中可撓性容器能夠實現基於所衍生之腫瘤懸浮液(而非如'734專利中所定義之多個碎塊)之量的更佳環境。
使用標準手術實踐在手術操作室內以手術方式移出轉移性腫瘤材料。在解聚之前，移除額外材料(亦即如宏觀上所定義之非腫瘤材料)且將腫瘤材料轉移至無菌袋中。
以下可涉及腫瘤起始材料驗收測試。首先，來源組織經確認為腫瘤材料。其次，評估解聚組織之代表性樣品的微生物負荷且其中當前抗生素敏感性經定義(製造可在抗生素風險下進行)，但最終材料必須對微生物生長呈陰性。第三，可藉由流式細胞量測術及/或基於筒匣之分析技術評估TIL及腫瘤細胞之純度、數量及存活率。
本發明之方法包含以下步驟：將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此產生解聚腫瘤，其中若所切除之腫瘤可在無細胞損傷之情況下冷凍保存，則充分解聚該腫瘤。在一有利實施例中，半自動裝置之可程式化處理器可控制解聚，使得解聚可撓性容器內之表面能夠機械地擠壓及剪切固體組織(參見例如PCT公開案第WO 2018/130845)。解聚表面可例如藉由機械活塞控制。
對於酶消化，使用DNA酶1及膠原酶(IV型)之酶混合物自切除之轉移性腫瘤產生細胞懸浮液(含有T細胞及腫瘤細胞兩者)。重複機械壓縮之組合暴露額外表面以供酶獲取，且酶反應使固體組織在視情況選用之冷凍保存之前變成細胞懸浮液之過程加速。在一個實施例中，在解聚步驟完成後，臨在受控速率冷凍循環之前添加基於DMSO之冷凍保護劑。在一些實施例中，固體組織之酶分解可藉由選擇及提供一或多種培養基酶溶液，諸如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、釋放酶H1、胃蛋白酶或其任何混合物。切除之轉移性腫瘤之酶消化可在半自動裝置之解聚可撓性容器中進行。
舉例而言，在本發明方法之另一實施例中，在解聚過程補充有酶消化之情況下，用於酶消化之培養基調配物必須補充有幫助蛋白分解，使得細胞至細胞邊界分解之酶。
細胞培養或細胞操作之技術中已知的各種液體調配物可用作用於固體組織的細胞解聚及酶消化的液體調配物，包括但不限於以下培養基中之一或多者：器官保藏溶液、選擇性溶解溶液、PBS、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、伊氏培養基、XVIVO™、AIM-V™、乳酸林格氏溶液、乙酸林格氏溶液、生理鹽水、PLASMALYTE™溶液、類晶體溶液及IV流體、膠體溶液及IV流體、含5%右旋糖水溶液(D5W)、哈特曼氏溶液、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、AIM-V™、伊氏培養基、XVIVO™，其各自可視情況補充有額外的細胞支援因子，例如胎牛血清、人類血清或血清替代物或其他養分或細胞介素以輔助細胞恢復及存活或特定細胞耗乏。培養基可為標準細胞培養基，如以上提及之培養基，或用於例如初級人類細胞培養(例如用於內皮細胞、肝細胞或角質細胞)或幹細胞(例如樹突狀細胞成熟、造血擴增、角質細胞、間葉幹細胞或T細胞)之特殊培養基。培養基可具有此項技術中熟知的補充劑或試劑，例如白蛋白及轉運蛋白、胺基酸及維生素、金屬離子、抗生素、連接因子、去連接因子、界面活性劑、生長因子及細胞介素、激素或增溶劑。各種培養基可商購自例如ThermoFisher、Lonza或Sigma-Aldrich或類似培養基製造商及供應商。
酶消化所需之液體調配物必須具有以至少0.1 mM至多50 mM，最佳範圍2至7 mM，理想地5 mM存在的足夠鈣離子。
待消化之固體組織可在解聚之後用含有螯合劑EGTA及EDTA之液體調配物洗滌，以移除黏附因子及抑制性蛋白質，隨後洗滌且移除EDTA及EGTA，隨後酶消化。
酶消化所需之液體調配物更佳具有最少螯合劑EGTA及EDTA，其可藉由移除酶穩定性及活性所需之鈣離子而嚴重抑制酶活性。另外，β-巰基乙醇、半胱胺酸及8-羥基喹啉-5-磺酸酯為其他已知抑制性物質。
使用解剖、酶消化及均質化處理腫瘤材料產生TIL，尤其UTIL之單細胞懸浮液，其可直接冷凍保存以穩定化供後續處理之起始材料，其用於經由TIL，尤其UTIL之細胞懸浮液在IL-2中之第一次擴增，以獲得TIL，尤其UTIL之第一群體。
該等方法亦包含冷凍保存所解聚腫瘤，例如細胞懸浮液之步驟。在與進行無菌解聚自個體切除之腫瘤由此產生解聚腫瘤之步驟同一天進行解聚腫瘤之冷凍保存，其中若切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚。舉例而言，冷凍保存係在解聚腫瘤之步驟之後2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22小時進行。解聚腫瘤，作為在半自動裝置之解聚模組中酶解聚獲得之單細胞懸浮液之冷凍保存，藉由在8℃與至少-80℃之間的溫度下冷卻或維持懸浮液來進行。解聚可快至5分鐘，但最常45分鐘至1小時，且冷凍保存可快至60分鐘或高達150分鐘。在一個實施例中，該等方法包括儲存冷凍保存之解聚腫瘤。如較佳實施例中所描述，裝置包含至少一個用於冷凍保存之細胞容器，其中容器為由彈性可變形材料製成之可撓性容器。在裝置之此實施例中，將最終容器直接轉移至-20至-190℃之冷凍器或更佳地位於受控速率冷凍設備中，該受控速率冷凍設備與裝置相關聯或分開供應(藉由例如Planer產品或Asymptote有限公司製造)，其中用於容納富集的解聚固體組織容器的冷凍室及可撓性儲存容器的溫度藉由以下來控制：注入冷氣(通常為氮氣，例如Planer產品)；或藉由自受控冷卻表面移除熱量。兩種方法使得能夠以小於1℃或更佳0.1℃之誤差精確地基於冷凍溶液及產物之所要存活率控制待冷凍特定細胞所需之速率的冷凍過程。此冷凍保存過程必須考慮冰長晶溫度，其理想地儘可能接近於冷凍溶液之熔融溫度。隨後在水性溶液中晶體生長，水作為冰自系統移除，且殘餘未冷凍溶液之濃度增加。隨著溫度降低，更多冰形成，減少殘餘未冷凍部分，其濃度進一步增加。在水性溶液中，存在較大溫度範圍，其中冰與濃縮之水性溶液共存。最終經由溫度降低，溶液達到玻璃轉移狀態，此時冷凍溶液及細胞自黏稠溶液變為固體樣狀態，低於此溫度細胞不會經歷進一步生物變化且因此在數年，可能數十年內穩定化，直至需要。
冰長晶及晶體生長涉及熱量釋放至冷凍溶液及細胞微環境，且期望保持細胞及冷凍溶液之冷卻，即使在經歷相變時冷凍流體抵抗溫度變化時亦如此。取決於解聚是否包括酶解聚及針對給定酶、酶濃度及組織類型之酶消化的最佳溫度為何，在冷凍保存開始時之溫度包括但不限於40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃及20℃，亦即哺乳動物體溫至室溫範圍內之溫度，且進一步包括低於室溫之溫度，包括但不限於冷藏溫度，諸如但不限於19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃及2℃。低溫冷卻之目標溫度包括但不限於-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-85℃、-90℃及其間溫度以及低至液氮蒸氣儲存溫度(-195.79℃)之更低溫。在某些實施例中，根據本發明使用之方法及裝置經設計或程式化以使自生理溫度或消化溫度至冷凍儲存溫度之時間降至最低。在某些實施例中，根據本發明使用之用於冷凍保存之方法及裝置有利地經設計及程式化以用於在一定條件下冷卻，從而當培養基結晶時，例如藉由維持冷凍保存培養基之預定溫度變化速率，釋放至包括細胞之環境中、至該環境內部、在該環境周圍或在該環境中的熱量被最小化或避免，即使在培養基之凝核及結晶釋放阻止溫度變化之熱時亦如此。在某些實施例中，調節或程式化溫度變化速率包括調節自冷凍保存樣品之熱提取率以維持預定溫度變化速率。在某些實施例中，藉由量測冷凍保存樣品之溫度及經由反饋製程之相變調節熱提取速率來維持冷凍保存樣品之冷卻速率。在某些實施例中，藉由在相變之預期時間處預期相變及提高熱量提取速率來維持冷凍保存樣品之冷卻速率。在某些實施例中，方法經設計及/或裝置經程式化以用於自解聚溫度連續冷卻至冷凍目標溫度。例示性程式化冷卻速率包括但不限於-0.5℃/min、-1℃/min、-1.5℃/min、-2℃/min或-2.5℃/min。冷卻速率為程式目標且可在冷卻循環中變化。冷卻速率可變化，例如變化±0.1℃/min、±0.2℃/min、±0.3℃/min、±0.4℃/min或±0.5℃/min。在本發明之一實施例中，冷凍保存溫度為-80℃±10℃且裝置經程式化以將溫度降低1℃/min或1.5℃/min或2℃/min或1℃/min±0.5℃/min或1.5℃/min±0.5℃/min或2℃/min±0.5℃/min。
將顯而易見的係需要TIL之精確受控冷卻。因此，為了最佳化量測及控制來自TIL之熱傳遞，使用最佳化表面與體積比、使用卡匣來容納冷凍保存容器且促進熱傳遞且最佳定位溫度感測器為有利的。
冷凍保存可在整個TIL生產中使用，包括但不限於i)藉由解凍及TIL擴增將經處理之腫瘤樣品冷凍保存以在稍後的時間使用，ii)藉由解凍及使用腫瘤細胞將經處理之腫瘤樣品冷凍保存以在稍後的時間使用，iii)將經處理之腫瘤樣品冷凍保存以用於稍後的分析，iv)藉由解凍及REP擴增將REP前擴增培養物冷凍保存以在稍後的時間使用，v)藉由解凍及REP擴增冷凍保存REP前擴增培養物之一部分(諸如但不限於來自REP前培養物之預定部分或超過預定量的過量細胞)以在稍後的時間使用，vi)冷凍保存後REP培養物以在隨後的REP前擴增或REP中在稍後時間使用，或vii)冷凍保存後REP培養物以在稍後時間藉由解凍及投與個體來使用。
冷凍保存之TIL中間物、產品及樣品可在解凍後在使用前洗滌。在某些實施例中，將冷凍保存之腫瘤消化物解凍，在生長培養基中稀釋，且洗滌一或多次。在某些實施例中，洗滌包含離心及生長培養基變化。在某些實施例中，洗滌包含過濾及生長培養基變化。在某些實施例中，將洗滌培養基混合，隨後自封閉之TIL容器(諸如袋或盤)中取出且替換為新鮮培養基。洗滌液可在封閉系統或用於TIL之容器、洗滌培養基及藉由導管及閥互連之其他組件中自動化。
在某些實施例中，增加TIL、TIL子集之比例。TIL存活率及或TIL效能，在解凍、稀釋及視情況選用之洗滌下，冷凍保存之TIL在突起生長之前保持在培養物中(亦即REP前擴增)。在某些實施例中，選擇保持時間以最大化總活細胞或藉由CD3量測之擴增倍數。在某些實施例中，保持時間可包含以下或由以下組成：2至4小時或4至6小時或6至9小時或9至12小時或12至18小時或18至24小時。
在一些實施例中，本發明方法提供獲得年輕TIL，其能夠在投與個體/患者時提供增加之複製循環且因此可提供優於較老TIL (亦即，在投與個體/患者之前進一步經歷更多輪複製之TIL)之額外治療益處。年輕TIL之特徵已在文獻中描述，例如Donia等人，Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley等人，Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang等人，J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser等人，Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser等人，J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins,等人，J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen等人，J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou,等人，J Immunother, 28:53-62 (2005)；及Tran,等人，J Immunother, 31:742-751 (2008)，其皆以全文引用之方式併入本文中。
T及B淋巴球之多樣化抗原受體係藉由有限但大量基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：可變(V)、多樣(D)、接合(J)及恆定(C)，決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收集之TIL及/或使用除提供之方法以外的其他方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞組庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收集之TIL及/或TIL，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞組庫多樣性。在一些實施例中，在第一次擴增中獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，多樣性之增加為免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (即，TCRα/β)之表現增加。
本發明之方法亦包含藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤以產生TIL，尤其UTIL之第一群體來進行第一次擴增之步驟。由上述步驟產生之細胞在相比於腫瘤及其他細胞促進TIL生長的條件下，在含有IL-2之血清中培養。在一些實施例中，在2 mL孔中在包含具有6000 IU/mL IL-2之不活化人類AB血清之培養基中培育腫瘤消化物。培養此初級細胞群體數天時間，一般3至14天，產生主體TIL群體，通常約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，培養此初級細胞群體7至14天之時段，產生主體TIL群體，通常約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，培養此初級細胞群體10至14天之時段，產生主體TIL群體，通常約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，培養此初級細胞群體約11天之時段，產生主體TIL群體，通常約1×10 8個主體TIL細胞。
在較佳實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始主體TIL擴增步驟，隨後如下文及本文所描述之第二次擴增(包括快速擴增方案(REP)步驟且隨後再刺激REP步驟)來進行。
在一有利實施例中，冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍且1:9再懸浮於T細胞培養基(為Immetacyte契約製造之T細胞培養基，補充有以下添加劑10% FBS及3000 IU/mL IL-2)中，隨後經由管線100至270 μm過濾器過濾且在50 mL離心管中離心，隨後再懸浮於20 mL中。可獲取樣品以用於分析，諸如流式細胞量測術或基於筒匣之方法，諸如但不限於由Chemometec https :// chemometec . com / products / nucleocounter - nc - 200 - automated - cell - counter /或Accellix https :// www . accellix . com / technology /)產生之筒匣，以定量多種HLA-A、HLA-B、HLA-C及CD58 +及DRAQ7¯細胞。在一些實施例中，此可使用替代的人工(諸如但不限於血球計)或替代的自動化總活細胞計數裝置(諸如但不限於NucleoCounter™；Guava ®；自動化血液分析及計數器；基於移液管之細胞計數器，諸如但不限於Scepter™)接種。
在一個實施例中，經再懸浮之冷凍保存解聚腫瘤組織在相比於腫瘤及其他細胞較有利於TIL生長的條件下，在含有IL-2之血清中培養。在一些實施例中，腫瘤消化物在2 mL孔中在包含不活化人類AB血清(或在一些情況下，如本文所概述，在人工抗原呈現[aAPC]細胞群體存在下)之培養基中與6000 IU/mL之IL-2一起培育。培養此初級細胞群體數天時間，一般10至14天，產生主體TIL群體，通常約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，生長培養基在第一次擴增期間包含IL-2或其變異體。在一些實施例中，IL為重組人類IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，對於1 mg小瓶，IL-2儲備溶液具有20至30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，對於1 mg小瓶，IL-2儲備溶液具有20×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，對於1 mg小瓶，IL-2儲備溶液具有25×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，對於1 mg小瓶，IL-2儲備溶液具有30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備溶液之最終濃度為4-8×10 6IU/mg IL-2。在一些實施例中，IL-2儲備溶液之最終濃度為5-7×10 6IU/mg IL-2。在一些實施例中，IL-2儲備溶液之最終濃度為6×10 6IU/mg IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-12、約400 IU/mL IL-12、約300 IU/mL IL-12、約200 IU/mL IL-12、約180 IU/mL IL-12、約160 IU/mL IL-12、約140 IU/mL IL-12、約120 IU/mL IL-12或約100 IU/mL IL-12。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-12至約100 IU/mL IL-12。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-12至約100 IU/mL IL-12。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-12至約100 IU/mL IL-12。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-12。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-12。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-12。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-12。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-18、約400 IU/mL IL-18、約300 IU/mL IL-18、約200 IU/mL IL-18、約180 IU/mL IL-18、約160 IU/mL IL-18、約140 IU/mL IL-18、約120 IU/mL IL-18或約100 IU/mL IL-18。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-18至約100 IU/mL IL-18。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-18至約100 IU/mL IL-18。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-18至約100 IU/mL IL-18。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-18。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-18。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-18。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-18。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。
培養基亦考慮介白素之組合，諸如但不限於IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21。亦考慮其他細胞介素，諸如IL-23、IL-27、IL-35、IL-39、IL-18、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-α、IFN-β、IFN-γ或其以及IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21之組合。亦考慮抗體，諸如Th2阻斷試劑，諸如但不限於IL-4 (aIL4)、抗IL-4 (aIL4R)、抗IL-5R (aIL5R)、抗IL-5 (aIL5)、抗IL13R (aIL13R)或抗IL13 (aIL13)。
在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行12天至13天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至12天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。在一些實施例中，REP第10天係電穿孔之後3天。
在一些實施例中，使用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，在第一次擴增期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，使用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為第一次擴增期間之組合。
在一些實施例中，第一次擴增係在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用封閉系統進行如本文中所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100或有利地為WO 2018/130845之裝置。在一些實施例中，封閉系統生物反應器為單一生物反應器。
有利地，獲自第一次擴增之TIL群體(稱為第二TIL群體)可經歷第二次擴增(其可包括有時稱為REP之擴增)。類似地，在經基因修飾之TIL將用於療法的情況下，第一TIL群體(有時稱為主體TIL群體)或第二TIL群體(其在一些實施例中可包括稱為REP TIL群體之群體)可在擴增之前或在第一次擴增之後及在第二次擴增之前進行基因修飾以用於適合的治療。
慢病毒由於其轉導分裂細胞及非分裂細胞之能力而為有效基因轉移媒劑。儘管最充分研究之豆狀病毒基因療法載體衍生自1型人類免疫缺乏病毒(HIV)，但亦已研發基於其他靈長類動物及非靈長類動物豆狀病毒，包括HIV-2、SIV、貓免疫缺乏病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)、威司奈病病毒(visna virus)及布拉娜病病毒(Jembrana disease virus，JDV)之基因療法載體。
複製缺陷型病毒載體為預防患者感染潛在致命病毒所必需的。慢病毒載體已經研發以變得更安全且更有效。最新第三代載體移除所有輔助毒性及病原性之輔助基因同時分開其餘基因，其對於轉殖基因在三種質體中之表現至關重要。參見例如美國專利公開案2006/0024274。
EIAV基因轉移載體展示有效地在活體外轉導增殖性及G 1抑制細胞。Mitrophanous等人，1999. Stable gene transfer to the nervous system using a non-primate lentiviral vector. Gene Ther. 6: 1808-1818; Olsen, J. C. , 1998, Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. Gene Ther. 5 : 1481-1487; Olsen, J.C., 2001, EIAV, CAEV and Other Lentivirus Vector Systems, Somat Cell Mol Genet, 第26卷, 第1/6期, 131-45。
Heemskerk, B.等人，2008, Adoptive cell therapy for patients with melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered to secrete interleukin-2. Human gene therapy, 19(5), 496-510描述經基因工程改造以表現IL-2以延長TIL存活之TIL。患者TIL在第一次擴增期間用基於莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)之反轉錄病毒載體轉染，隨後進行第二次擴增以獲得足夠數目以用於治療。
簡言之，含有來源於莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)的MFG主鏈以及處於5'長末端重複序列(LTR)啟動子的控制下的人類IL-2基因之cDNA拷貝之SBIL2載體在PG13封裝細胞株中假型化，該細胞株提供長臂猿白血病病毒(GaLV)包膜蛋白。產生含有整合反轉錄病毒IL-2 DNA之三個拷貝的穩定生產純系(PG13SBIL2#3)。臨床GMP級SBIL2反轉錄病毒上清液由Indiana University (Indianapolis, IN)的國立基因載體實驗室(National Gene Vector Laboratory)產生。對於TIL轉導，6孔非組織培養盤(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)塗佈有重組人纖維蛋白片段(Retronectin) (CH-296，25 μg/ml磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]溶液，GMP級；Takara Bio, Otsu, Japan)，用PBS-2%人類血清白蛋白(HSA)阻斷，且在32℃及10% CO2下用解凍之SBIL2病毒上清液(5 ml/孔)預負載4小時。在37℃及5% CO2下以3 ml/孔添加TIL持續18-24小時，轉移至第二組SBIL2負載盤，且再培養18-24小時，其後收集TIL且將其再懸浮於新鮮培養基中。
Zhang, L.等人，2015, Tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered with an inducible gene encoding interleukin-12 for the immunotherapy of metastatic melanoma, Clinical Cancer Research 21(10), 2278-2288描述經基因工程改造以在腫瘤部位選擇性地分泌IL-12之TIL。TIL經攜有由活化T細胞核因子(NFAT)啟動子驅動之編碼單鏈IL-12之基因的MSGV1 γ-反轉錄病毒載體轉導。活化T細胞啟動子。
MSGV-1衍生自利用鼠類幹細胞病毒長末端重複序列且含有延長之gag區及Kozak序列的MSGV載體。編碼人類單鏈IL-12之基因係由NFAT反應性啟動子驅動以IL-12 p40、連接子G6S及IL-12 p35次序合成，且與5' LTR方向相反插入至MSGV-1載體中。產生基於高效價PG13細胞之生產細胞株且反轉錄病毒上清液由NCI Surgery Branch Vector Production Facility (Bethesda, MD)在良好生產規範(GMP)條件下產生。測試載體上清液且通過產生用於臨床應用的重組γ-反轉錄病毒載體的所有當前需要之美國食品與藥物管理局(US Food and Drug Administration)規範。
轉導程序藉由用30 ng/ml抗CD3 mAb Orthoclone OKT3 (Centocor Ortho Biotech, Raritan, NJ)、3000 IU/ml重組人類IL-12及4 Gy照射同種異體PBMC餵養細胞以每個TIL 200個餵養細胞之比率刺激腫瘤浸潤淋巴球(TIL)來起始。在第4天及/或第5天，收集細胞以用於使用重組人纖維蛋白片段(CH-296；Takara Bio公司, Otsu, Japan)塗佈之非組織培養6孔盤轉導。載體上清液藉由在2000 g下在32℃下離心2小時「旋轉裝載』至經塗佈盤上。自孔抽吸反轉錄病毒載體上清液，且各孔添加2×10 6個經刺激之TIL細胞，隨後在1000 g下離心10分鐘。盤在37℃下培育隔夜且第二天收集細胞用於第2次轉導。前21名患者之細胞經歷兩次轉導。患者12之細胞僅經歷一次轉導。
Jones, S.等人2009, Lentiviral vector design for optimal T cell receptor gene expression in the transduction of peripheral blood lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes. Human gene therapy, 20(6), 630-640描述開發用於豆狀病毒載體之啟動子以在經轉導T淋巴球中表現基因及構築有效抗腫瘤T細胞。
TIL自手術樣本獲得。PBL自-180℃下儲存之冷凍儲備液解凍且以300 IU/ml置於AIM-V及介白素-2 (IL-2；Cetus, Emeryville, CA)中之培養中。對於OKT3刺激，最初將細胞置於具有50 ng/ml之抗CD3抗體OKT3 (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ)之培養基中，或在轉導之後在培養基之初始更換時置於OKT3培養基中。對於PBL或TIL之轉導，在24孔組織培養處理盤中，用病毒上清液及凝聚胺(最終濃度，8 μg/ml)將1×10 6個細胞調節至1 ml之最終體積。藉由在1000× g、32℃下離心盤1.5小時來轉導細胞。將盤置放於37℃、潮濕的5% CO 2培育器中隔夜，且次日更換培養基。使用OKT3 (50 ng/ml)、IL-2 (5000 IU/ml)及來自三個不同供體之經照射之同種異體外周血液單核細胞(TIL:餵養細胞比率，1:100)對TIL進行如先前所述之快速擴增方案(REP)。REP後六天，如所描述轉導TIL且使其返回至培養物。
Beane, J. D.等人，2015, Clinical Scale Zinc Finger Nuclease-mediated Gene Editing of PD-1 in Tumor Infiltrating Lymphocytes for the Treatment of Metastatic Melanoma. Molecular therapy: 23(8), 1380-1390描述藉由編碼PD-1特異性鋅指核酸酶(ZFN)介導之基因編輯之mRNA之電穿孔之PD-1之臨床規模基因編輯。
為了產生足夠數目之經轉導T細胞以用於過繼細胞轉移，使用REP誘導TIL增殖。46簡言之，將1×10 7個TIL與1×10 9個同種異體經照射(5,000 rad)外周血液單核細胞(PBMC)合併，且將此等細胞懸浮於含有30 ng/ml OKT3之400 ml T細胞培養基中。在37℃及5% CO2下在G-Rex100燒瓶中培養細胞。五天後，抽吸且更換200 ml培養基。在REP開始之後七天，收集TIL且用Hyclone電穿孔緩衝劑(Hyclone Laboratories, Logan, UT)洗滌兩次。隨後計數細胞且以1×10 8/ml之濃度再懸浮於電穿孔緩衝劑中。細胞隨後轉移至MaxCyte CL-2處理總成且與120 μg/ml之PD-1 ZFN mRNA (或GFP mRNA，用於GFP轉染之TIL/GFP)混合。根據MaxCyte方案進行電穿孔。在電穿孔之後，將TIL自處理總成轉移至T-175燒瓶且置放於37℃下之培育器中20分鐘。在此培育步驟之後，將TIL以1×10 6/ml之濃度再懸浮於AIM-V培養基中。隨後將細胞置放於設定為30℃之培育器中進行如先前所描述之隔夜低溫培育。第二天，將TIL轉移至37℃培育器中且保持不受干擾直至REP第10天(電穿孔後3天)。
在某些實施例中，餵養細胞包含來自多個供體之PBMC池。在某些實施例中，PBMC包含藉由多個供體之血液樣品之菲科爾密度梯度離心(Ficoll density gradient centrifugation)獲得之白血球層細胞(白血球)。在某些實施例中，彙集包含多個供體之白血球層細胞之PBMC。在某些實施例中，待彙集之供體製劑之數目可為2-15或更多個，且供體之較佳數目為5至10、或10-15、或8至12、或9至11。在某些實施例中，彙集來自10個供體之PBMC。
已發現，使用自動化血球分離術獲得PBMC，可以提高PBMC之恢復率及存活率且可減少供體之數目。在某些實施例中的血球分離術產物，PBMC包含來自血球分離術之白血球。產生適合的血球分離術產物之例示性非限制性系統為Sefia細胞處理系統(Cytiva)。在某些實施例中，PBMC係商購獲得的。在某些實施例中，彙集包含多個供體之血球分離術產物的PBMC。在某些實施例中，待彙集之供體產物之數目可為2-15個或更多個。在更佳實施例中，供體之較佳數目為2至8個或2至6個或2至4個供體。在某些實施例中，PBMC包含來自3個供體之血球分離術產物。
在某些實施例中，PBMC經冷凍保存。冷凍保存使得能夠進行預篩選及PBMC庫存維持且減少TIL製造所需之供體數目。
經解聚之腫瘤組織係解凍的。在一些實施例中，儲存自第一次擴增獲得之TIL直至表型分型以供選擇。在一些實施例中，自第一次擴增獲得之TIL未經儲存且直接進行第二次擴增。因此，方法包含藉由將TIL，尤其UTIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體的步驟。在一些實施例中，自第一次擴增獲得的TIL在第一次擴增之後且在第二次擴增之前未經冷凍保存。在一些實施例中，第一次擴增至第二次擴增的轉變在冷凍保存的解聚之腫瘤組織解凍之後約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後約3天至21天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後約4天至14天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後約4天至10天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後約7天至14天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後約14天時發生。在一些實施例中，REP培養物之接種在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天發生。
在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天時發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後1天至14天發生。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後3天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後4天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後5天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後6天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後7天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後8天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後9天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後10天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後11天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後12天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後13天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後1天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後2天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後3天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後4天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後5天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後6天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後7天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後8天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後9天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後10天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在將冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍之後11天發生。
在一些實施例中，將來自第一次擴增之TIL或TIL之一部分冷凍保存。在某些實施例中，TIL劃分成兩個或更多個部分，一或多個部分進行至第二次擴增，且一或多個部分冷凍保存以用於稍後第二次擴增。在某些實施例中，確定在第一次擴增結束時之細胞數目且因此劃分培養物。在某些實施例中，測定來自第一次擴增之TIL的平均效能且相應地劃分培養物。在某些實施例中，TIL之預定最小數目或最佳數目繼續進行至第二次擴增且剩餘TIL經冷凍保存，且稍後解凍並用於進一步第二次擴增。在某些實施例中，視剩餘TIL之數目及/或活性而定，冷凍保存之TIL可替代地用於第一次擴增繼之以第二次擴增。
在一些實施例中，TIL在第一次擴增之後及在第二次擴增之前不儲存，且TIL直接繼續進行第二次擴增。在一些實施例中，該轉變係如本文所描述在封閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一次擴增之TIL (TIL之第二群體)在無轉變期之情況下直接進入第二次擴增。
在一些實施例中，第一次擴增至第二次擴增之轉變係在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用封閉系統進行如本文中所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所用單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100或Xuri WAVE生物反應器。在一些實施例中，封閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施例中，在收集及初始批量處理之後，TIL細胞群體之數目擴增。此進一步擴增在本文中被稱作第二次擴增，其可包括在此項技術中通常被稱作快速擴增過程之擴增過程。第二次擴增一般在透氣或氣體交換容器中使用包含多種組分，包括餵養細胞、細胞介素源及抗CD3抗體之培養基實現。
在一些實施例中，TIL之第二次擴增或第二TIL擴增可使用熟習此項技術者已知之任何TIL培養燒瓶或容器進行。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天至約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約13天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施例中，第二次擴增可使用本發明方法在透氣容器中進行。舉例而言，TIL可使用非特異性T細胞受體刺激在介白素-2 (IL-2)或介白素-7 (IL-7)或介白素-15 (IL-15)；或介白素-12 (IL-12)存在下快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包括例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/ml OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, N.J.或Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.)或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, Calif., USA)。TIL可經擴增以活體外誘導TIL之進一步刺激，其藉由在第二次擴增期間包括癌症之一或多種抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)，該抗原可視情況自載體表現，諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1:26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)，視情況在T細胞生長因子，諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下。其他適合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。或者，TIL可進一步用例如實例經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二次擴增之一部分發生。在一些實施例中，第二次擴增在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下進行。
在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或8000 IU/mL的IL-2。
在一個實施例中，細胞培養基包含OKT3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 μg/mL OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間、及50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT3抗體。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，在第二次擴增期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，可包括IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。
在一些實施例中，第二次擴增可在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞之補充細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二次擴增在補充細胞培養基中發生。在一些實施例中，補充細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施例中，第二次擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(亦即抗原呈現細胞)之細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包含約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在一較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞(APC)為PBMC。在一實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率在1:50與1:300之間。在一實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率在1:100與1:200之間。
在一實施例中，REP及/或第二次擴增在燒瓶中進行，其中主體TIL與100或200倍過量之不活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2/150 ml培養基混合。進行培養基更換(一般用新鮮培養基經由抽吸更換2/3培養基)，直至細胞轉移至替代生長箱。替代生長箱室包括G-REX燒瓶及透氣容器，如下文更完整論述。
在一些實施例中，第二次擴增(其可包括稱為REP過程之過程)縮短至7-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，將第二次擴增縮短至11天。
在一實施例中，REP及/或第二次擴增可使用如先前所述之T-175燒瓶及透氣袋(Tran等人，J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley等人，J. Immunother. 2003, 26, 332-42)或透氣培養器(G-Rex燒瓶)進行。在一些實施例中，第二次擴增(包括稱為快速擴增之擴增)在T-175燒瓶中進行，且可將懸浮於150 mL培養基中約1×10 6個TIL添加至各T-175燒瓶中。TIL可在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物中培養。T-175燒瓶可在37℃下在5% CO 2中培育。可在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，來自兩個T-175燒瓶之細胞可在3 L袋中合併且將具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM V添加至300 ml TIL懸浮液中。每日或每兩天計數各袋中之細胞數目，且添加新鮮培養基以使細胞計數保持在0.5與2.0×10 6個細胞/毫升之間。
在一實施例中，第二次擴增可在具有100 cm透氣矽底的500 mL容量透氣燒瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, Minn., USA)中進行，5×10 6或10×10 6個TIL可在補充有5%人類AB血清，3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3 (OKT3)的400 mL 50/50培養基中與PBMC一起培養。G-Rex 100燒瓶可在37℃下在5% CO 2中培育。在第5天，可移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491×g)離心10分鐘。TIL集結粒可用150 mL具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回原始G-Rex 100燒瓶中。當TIL在G-Rex 100燒瓶中連續擴增時，在第7天，各G-Rex 100中之TIL可懸浮於各燒瓶中存在之300 mL培養基中，且細胞懸浮液可分成可用於接種3個G-Rex 100燒瓶之3個100 mL等分試樣。隨後可將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各燒瓶中。G-Rex 100燒瓶可在37℃下在5% CO 2中培育且在4天之後，可將具有3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V添加至各G-REX 100燒瓶中。可在培養第14天收集細胞。
在一實施例中，第二次擴增(包括稱為REP之擴增)在燒瓶中進行，其中主體TIL在150 mL培養基中與100或200倍過量之不活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2混合。在一些實施例中，更換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，藉由抽吸用新鮮培養基更換2/3的培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包括G-REX燒瓶及透氣容器，如下文更完整論述。
在一實施例中，進行第二次擴增(包括稱為REP之擴增)且進一步包含針對優良腫瘤反應性選擇TIL之步驟。可使用此項技術中已知之任何選擇方法。舉例而言，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號中所述之方法可用於針對優良腫瘤反應性選擇TIL。
視情況，細胞存活率分析可在第二次擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後使用此項技術中已知之標準分析進行。舉例而言，可在主體TIL樣品上進行錐蟲藍排除分析，其選擇性標記死亡細胞且允許存活率評估。在一些實施例中，可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, Mass.)對TIL樣品進行計數及存活率測定。
在一些實施例中，TIL之第二次擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前所描述之T-175燒瓶及透氣袋(Tran K Q、Zhou J、Durflinger K H等人，2008, J Immunother., 31:742-751，及Dudley M E、Wunderlich J R、Shelton T E等人，2003, J Immunother., 26:332-342)或透氣G-Rex燒瓶進行。在一些實施例中，第二次擴增係使用燒瓶執行。在一些實施例中，第二次擴增係使用透氣G-Rex燒瓶執行。在一些實施例中，第二次擴增在T-175燒瓶中進行，且將約1×10 6個TIL懸浮於約150 mL培養基中且將其添加至各T-175燒瓶中。TIL與作為「餵養」細胞的經照射(50 Gy)同種異體PBMC以1:100之比率一起培養且細胞在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物(50/50培養基)中培養。T-175燒瓶在37℃下在5% CO 2中培育。在一些實施例中，在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，來自2個T-175燒瓶之細胞在3 L袋中合併且將具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM-V添加至300 mL TIL懸浮液中。可每日或每兩天計數各袋中之細胞數目，且可添加新鮮培養基以使細胞計數保持在約0.5與約2.0×10 6個細胞/毫升之間。
在一些實施例中，第二次擴增(包括稱為REP之擴增)在具有100 cm 2透氣矽底(G-Rex-100，Wilson Wolf)的500 mL容量燒瓶中進行，將約5×10 6或10×10 6個TIL與經照射之同種異體PBMC以1:100的比率在400 mL補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的50/50培養基中培養。G-Rex 100燒瓶在37℃下在5% CO 2中培育。在一些實施例中，在第5天，移出250 mL上清液且置放於離心瓶中且以1500 rpm (491 g)離心10分鐘。TIL集結粒可隨後用具有3000 IU/mL IL-2之150 mL新鮮50/50培養基再懸浮且添加回原始G-Rex 100燒瓶中。在G-Rex 100燒瓶中連續擴增TIL之實施例中，在第7天，使各G-Rex 100中之TIL懸浮於各燒瓶中存在之300 mL培養基中，且將細胞懸浮液分成三份100 mL等分試樣，使用該等分試樣接種3個G-Rex 100燒瓶。隨後將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各燒瓶中。G-Rex 100燒瓶在37℃下在5% CO 2中培育且在4天之後，將具有3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V添加至各G-REX 100燒瓶中。在培養第14天收集細胞。
T及B淋巴球之多樣化抗原受體係藉由有限但大量基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：可變(V)、多樣(D)、接合(J)及恆定(C)，決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二次擴增中獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多樣性之增加為免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab (亦即TCRα/β)之表現增加。
在一些實施例中，第二次擴增培養基(例如有時被稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施例中，第二次擴增係在封閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用封閉系統進行如本文中所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100或有利地為WO 2018/130845之裝置。在一些實施例中，封閉系統生物反應器為單一生物反應器。
在一實施例中，本文所描述之第二次擴增程序以及稱為REP之程序)在REP TIL擴增期間及/或在第二次擴增期間需要過量餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理不活化，且用於REP程序，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之複製非勝任的例示性方案。
在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞為人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，第二次擴增中TIL與抗原呈現餵養細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500。在一實施例中，第二次擴增中TIL與抗原呈現餵養細胞之比率在1:50與1:300之間。在一實施例中，第二次擴增中TIL與抗原呈現餵養細胞之比率在1:100與1:200之間。
在一實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個餵養細胞:約100×10 6個TIL之比率。在另一實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個餵養細胞:約50×10 6個TIL之比率。在又一實施例中，本文所述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個餵養細胞:約25×10 6個TIL。
在一實施例中，本文所描述之第二次擴增程序在第二次擴增期間需要過量餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理不活化，且用於TIL擴增程序。
在一實施例中，人工抗原呈現細胞代替PBMC或與PBMC組合用於第二次擴增中。
本文所描述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)之培養基，如此項技術中所已知。
或者，使用細胞介素組合用於快速擴增及/或第二次擴增TIL為另外可能的，其中IL-2、IL-15及IL-21中之兩者或更多者之組合如國際公開案第WO 2015/189356號及W國際公開案第WO 2015/189357號中所大體上概述，該等文獻以全文引用的方式明確併入本文中。因此，可能組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21以及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別係如其中所描述之T細胞。
在一些實施例中，本文所描述之擴增方法(包括稱為REP之擴增方法)中所用之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合在TIL群體中誘導T細胞活化及細胞分裂。在全長抗體以及Fab及F(ab')2片段的情況下可見此作用，其中前者通常為較佳的；參見例如Tsoukas等人，J. Immunol. 1985, 135, 1719，以全文引用之方式併入本文中。
如熟習此項技術者將瞭解，一些合適的抗人類CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠類、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在特定實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, N.J.或Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.)。
在第二次擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在一個、兩個、三個、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在兩個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。TIL收集方法為此項技術中熟知的且任何此類已知方法均可與本發明製程一起使用。在一些實施例中，TIL使用自動化系統收集。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多種來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International公司。任何基於細胞之收集器可與本發明方法一起使用。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統為基於膜之細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)。術語「LOVO細胞處理系統」亦係指由任何供應商製造之任何儀器或裝置，其可於無菌及/或封閉系統環境中將包含細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)，從而允許連續流動及細胞處理以移除上清液或細胞培養基而不發生集結粒化。在一些實施例中，細胞收穫機及/或細胞處理系統可在封閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，收集物自封閉系統生物反應器進行。在一些實施例中，採用封閉系統進行如本文中所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用之單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100或有利地為WO 2018/130845之裝置。在一些實施例中，封閉系統生物反應器為單一生物反應器。
細胞轉移至容器以用於投與患者。在一些實施例中，在使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，立即將其轉移至容器中以用於向患者投與。
在一實施例中，使用本發明之APC擴增之TIL以醫藥組合物形式投與患者。在一實施例中，醫藥組合物為TIL在無菌緩衝劑中之懸浮液。使用本發明之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知的任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞以單次動脈內或靜脈內輸注形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內。
在一實施例中，使用本發明之方法擴增之TIL以醫藥組合物形式投與患者。在一實施例中，醫藥組合物為TIL在無菌緩衝劑中之懸浮液。使用本發明之PBMC擴增的TIL可藉由此項技術中已知的任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞以單次動脈內或靜脈內輸注形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。
可投與任何適合劑量之TIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 10至約13.7×10 10個TIL，平均約7.8×10 10個TIL，尤其在癌症為黑素瘤之情況下。在一實施例中，投與約1.2×10 10至約4.3×10 10個TIL。在一些實施例中，投與約3×10 10至約12×10 10個TIL。在一些實施例中，投與約4×10 10至約10×10 10個TIL。在一些實施例中，投與約5×10 10至約8×10 10個TIL。在一些實施例中，投與約6×10 10至約8×10 10個TIL。在一些實施例中，投與約7×10 10至約8×10 10個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 10至約13.7×10 10。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 10個TIL，尤其在癌症為黑素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 10至約4.3×10 10個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 10至約12×10 10個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 10至約10×10 10個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 10至約8×10 10個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 10至約8×10 10個 TIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 10至約8×10 10個TIL。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之數目為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 68×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 102×10 102×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13。在一實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL的數目在以下範圍內：1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL的濃度小於例如醫藥組合物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL的濃度大於醫藥組合物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25% 19%、18.75%、18.50%、18.25% 18%、17.75%、17.50%、17.25% 17%、16.75%、16.50%、16.25% 16%、15.75%、15.50%、15.25% 15%、14.75%、14.50%、14.25% 14%、13.75%、13.50%、13.25% 13%、12.75%、12.50%、12.25% 12%、11.75%、11.50%、11.25% 11%、10.75%、10.50%、10.25% 10%、9.75%、9.50%、9.25% 9%、8.75%、8.50%、8.25% 8%、7.75%、7.50%、7.25% 7%、6.75%、6.50%、6.25% 6%、5.75%、5.50%、5.25% 5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度在以下範圍內：醫藥組合物之約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之濃度在以下範圍內：醫藥組合物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物中所提供之TIL之量超過0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
本發明之醫藥組合物中所提供之TIL在廣泛劑量範圍內有效。準確劑量將視投與途徑、化合物投與形式、待治療個體之性別及年齡、待治療個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。適當時亦可使用TIL之臨床確定劑量。使用本文之方法投與之醫藥組合物的量，諸如TIL之劑量將視所治療之人類或哺乳動物、病症或病狀之嚴重程度、投與速率、活性醫藥成分之配置及開處方醫師之判斷而定。
在一些實施例中，TIL可以單次劑量投與。此類投與可藉由注射，例如靜脈內注射。在一些實施例中，TIL可以多次劑量投與。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為每月一次、每兩週一次、一週一次或每隔一天一次。TIL之投與可視需要持續。
在一些實施例中，TIL之有效劑量為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13。在一些實施例中，TIL之有效劑量在以下範圍內：1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13。
在一些實施例中，TIL之有效劑量在以下範圍內：約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg。
在一些實施例中，TIL之有效劑量在以下範圍內：約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg。
有效量之TIL可藉由具有類似效用之試劑的任一種公認投藥模式，包括鼻內及經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、局部、藉由移植或藉由吸入，以單次或多次劑量投與。
本發明亦包括適用於使用本發明之TIL，尤其UTIL進行診斷及預後分析的套組。本發明之套組包括緩衝劑、細胞介素、燒瓶、培養基、產品容器、試劑及說明書。
下文呈現非限制性多步驟實施例，以設置自腫瘤之TIL生長，設置快速擴增過程，確認經照射之PBMC餵養細胞不會擴增，及將靜態培養物轉移至WAVE生物反應器(參見例如https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/rocking-bioreactors/consumables-and-accessories/single-use-readytoprocess-wave-cellbag-bioreactors-p-00346#overview)，及調配及填充。
在步驟一(第0天)中，冷凍保存之解聚腫瘤組織解凍且1:9再懸浮於補充有10% FBS及3000 IU/mL IL-2的T細胞培養基中，隨後經由管線100至270 μm過濾器過濾且在50 mL離心管中離心，隨後再懸浮於20 mL中。獲取樣品以用於分析，諸如流式細胞量測術或基於筒匣之方法，諸如但不限於由Chemometec https :// chemometec . com / products / nucleocounter - nc - 200 - automated - cell - counter /或Accellix https :// www . accellix . com / technology /)產生之筒匣，以定量多種HLA-A、HLA-B、HLA-C及CD58 +及DRAQ7¯細胞。
在步驟二中，細胞懸浮液隨後在細胞培養容器中，以≥0.25×10 6至≤0.75×10 6個HLA-A、B、C及CD58 +及DRAQ7¯細胞/毫升接種在補充有添加之抗細菌劑及抗真菌劑(兩性黴素B(Amphotericin B)及慶大黴素(Gentamicin))及介白素-2 (IL-2) 1000 IU/ml的CM-T (補充有10%胎牛血清之T細胞培養基)中。T細胞經2週時段在CM-T中生長出來，自第5天，移除一半培養基且用補充有10%胎牛血清、兩性黴素B及慶大黴素及IL-2之新鮮培養基CM-T替換。此在第5天與第10天之間每2/3天重複以確保細胞維持在≤0.1×10 6至2×10 6個CD45 +CD3 +磷脂結合蛋白-V -ve(Annexin-V -ve) DRAQ7 -ve細胞/毫升。根據PH Eur 2.6.27對TIL培養物上清液進行之微生物檢查測試(第5天至第7天)證實無微生物生長。分析(第7天至第10天)定量CD45 +CD3 +磷脂結合蛋白-V ¯及DRAQ7¯細胞之濃度。該分析法可為流式細胞量測術或基於筒匣之方法，諸如但不限於由Chemometec https :// chemometec . com / products / nucleocounter - nc - 200 - automated - cell - counter /或Accellix https :// www . accellix . com / technology /)產生之筒匣。特定言之，Chemometec NC200筒匣可用於分析存活率及細胞計數，且基於Accellix筒匣之方法可用於分析CD3純度。此外，Chemometec NC200筒匣可用於分析細胞計數及濃度，且基於Accellix筒匣之方法可用於制定圈選。
在步驟三中，用Ficoll (密度1.078 g/ml)自多個同種異體供體(健康血液供給來源之白血球層)分離4×10 9個經照射PBMC (25至50 Gy)。流式細胞量測術分析定量CD45 +磷脂結合蛋白-V¯及DRAQ7¯細胞。經照射PBMC之微生物檢查測試測定微生物生長。亦可考慮基於筒匣之分析技術。
在步驟四中，定量可供用於開始快速擴增過程之TIL之量(第12天)。分析對CD45 +CD3 +磷脂結合蛋白-V¯及DRAQ7¯細胞進行定量。分析可為流式細胞量測術或基於筒匣之方法，諸如但不限於由Chemometec https :// chemometec . com / products / nucleocounter - nc - 200 - automated - cell - counter /或Accellix https :// www . accellix . com / technology /)產生之筒匣。
在步驟5中，在封閉靜態細胞培養袋中，製備餵養細胞(經照射ficoll分離之PBMC)及生長補充劑於3 L T細胞混合培養基中之培養混合物，其含有：≥3至≤5×10 9個經照射PBMC - CD45 +磷脂結合蛋白-V¯及DRAQ7¯細胞、7-9%人類AB血清、2000至4000 IU/mL IL-2及20至40 ng/ml OKT-3抗體。
在步驟6中，在添加TIL之前，獲取餵養細胞(經照射ficoll分離之PBMC)之培養混合物的代表性樣品以用於對照燒瓶。
在步驟7中，將TIL添加至REP培養物：≥1至≤20×10 6個腫瘤來源之TIL - CD45 +CD3 +磷脂結合蛋白-V¯及DRAQ7¯細胞。
在步驟8中，靜態培養物在乾燥培育器中在3.5%至6%二氧化碳35℃至38.5℃下培育6天。在第14天及第18天評估含有無TIL以確保經照射之餵養細胞未擴增之REP混合物的對照燒瓶(在步驟6收集)中CD45 +磷脂結合蛋白-V -及DRAQ7 -細胞之數目及存活率。流式細胞量測術或基於筒匣之分析技術分析定量CD45 +磷脂結合蛋白-V¯及DRAQ7¯細胞。
在步驟9中，WAVE生物反應器袋在35至38.5℃與3.5%至6%二氧化碳下經補充有7至9%人類AB血清及2000至4000 IU/mL IL-2之1.7 L TCM預調節1至2小時。
在步驟10中，在WAVE生物反應器系統中轉移及擴增TIL。
在步驟11中，連接補充有2000至4000 IU/mL IL-2之灌注進料1×TCM 10 L袋。
在步驟12 (第19至22天)中，調整第19天與第22天之間的灌注速率。
在步驟13 (第24天)中，停止灌注，且斷開廢料與進料。
在步驟14中，濃縮且洗滌TIL。
在步驟15中，在總體積範圍為125至270 mL的輸注袋中，用懸浮於含有10% DMSO及8.5% HSA的PBS中之細胞製得最終藥物調配物。
在步驟16中，獲取含有TIL之最終產物袋之樣品用於QC分析及留樣。新鮮藥物產品之QC分析包括微生物檢查測試及顏色及可見粒子測試。製備保留樣品用於細胞劑量、存活率表型及效能；微生物檢查及內毒素分析。
在步驟17中，最終產物容器經標記且與最終產物標記重疊。
在步驟18中，藉由以-1℃/分鐘至-60℃受控速率冷凍來冷凍保存且轉移至≤-130℃儲存。冷凍保存藥物產品之QC分析包括qPCR支原體測試、T細胞劑量及存活率測試、如使用動力學顯色LAL測試所量測之內毒素測試及評估在與表現抗CD3片段之細胞株共同培養之後針對CD137 +、IFN-γ +、TNFα +或CD107a +之組合的CD2 +表現CD45 +DRAQ7 -的效能測試。
表1 - 僅使用靜態培養袋之製造概述
CTU - TIL編號(性別) 來自第一次擴增之腫瘤來源TIL (×10 7) 第二次擴增中之活CD3+細胞(×10 7) 擴增倍數* 最終回活CD3+ (×10 10)
1 (F) 2.1 1.5 690 1.0
3 (M) 3.8 2.0 1100 2.2
5 (M) 8.2 1.5 1281 2.0
平均值±SD 6.0±2.2 1.7±0.23 1023±303 1.7±0.52
* - 等於最終製造之TIL/REP中所用之TIL
表2 - 使用灌注生物反應器之製造概述
CTU - TIL編號(性別) 來自第一次擴增之腫瘤來源TIL (×10 7) 第二次擴增中之活CD3+細胞(×10 7) 擴增倍數* 最終回活CD3+ (×10 10)
12 (F) 5.4 2.0 1600 3.2
13 (M) 14.0 2.0 1010 2.02
14 (M) 5.8 2.0 2100 4.2
15(M) 5.1 2.0 3100 6.2
16 (M) 3.0 1.8 3000 5.4
19 (M) 7.6 2.0 3400 6.8
20 (M) 1.4 1.1 5409 5.95
21 (F) 1.4 1.4 3646 4.85
27(M) 5.1 2.0 1845 3.69
28 (F) 8.9 2.0 1590 3.18
32 (F) 34.0 2.0 1835 3.67
32 (F) N/A ** 2.0 1985 3.97
35 (M) 8.6 2.0 3125 6.25
36 (M) 3.2 1.6 2050 3.28
37 (F) 4.0 2.0 1265 2.53
38 (M) 0.55 0.32 3969 1.27
39 (M) 0.83 0.83 1398 1.16
40 (F) 1.4 0.71 7444 5.3
41 (M) 9.0 2.0 1555 3.11
42 (M) 9.8 2.0 1965 3.93
43 (F) 25.0 2.0 2310 4.62
47 (F) 2.67 2.0 1450 2.9
48 (F) 2.73 2.0 1865 3.73
51 (M) 4.1 2.0 1780 3.56
54 (M) 27.5 2.0 395 7.9
57 (M) 2.3 1.5 764 1.13
60 (F) 3.1 1.1 1486 1.56
63 (M) 0.84 0.89 5842 5.24
64 (M) 0.72 0.72 2993 2.14
67 (M) 0.38 0.37 7526 2.82
平均值±SD 6.61±8.2 1.56±0.61 2650±1770 3.52±1.69
* - 等於最終製造之TIL/REP中所用之TIL ** - 使用原始腫瘤來源TIL治療兩次的患者
本發明提供一種解聚系統或裝置。在一些實施例中，解聚裝置呈將組織解聚成個別細胞或細胞凝集物之踏綜裝置形式。在一些實施例中，解聚裝置在解聚過程期間提供熱控制。在一些實施例中，本發明提供一種冷凍保存系統或裝置。在一些實施例中，提供一種用於解聚及冷凍保存及熱控制之裝置。在另一態樣中，本發明提供一或多個可撓性容器或含有複數個容器之系統，該等容器包含一或多個經調適用於在本發明之解聚/冷凍保存系統或裝置中解聚、冷凍保存或解聚及冷凍保存兩者之可撓性容器。在一些實施例中，一或多個容器或複數個容器經互連且適用於封閉系統。上述態樣表示於本文隨附之申請專利範圍中。鑒於提供本發明之實例的以下詳細描述，本發明之更多優勢及益處對於熟習此項技術者將變得容易地顯而易見。
在某些實施例中，解聚器包含一或多個可移動表面，例如板及/或槳葉，且經設計以將壓縮力及剪切力施加至組織樣品。在一實施例中，消化器包含能夠相對於彼此移動之第一表面及第二表面。在某些實施例中，表面為經安置以向樣品施加壓力之相對表面。在一實施例中，表面中之至少一者在垂直於表面之方向的方向上移動，以便施加壓力至樣品。在一實施例中，表面經平行對準且經設計以重複或循環方式移動到一起且分開，使得樣品以循環方式於表面之間被重複地壓縮隨後鬆弛。在本發明之實施例中，樣品之壓縮及鬆弛在樣品中產生剪切力。
在一實施例中，第一及第二表面中之一者在另一表面移動時保持靜止。在另一實施例中，第一及第二表面皆移動。在一實施例中，組織樣品含於可撓性及/或彈性容器中，其含有組織樣品及視情況解聚流體或溶液。在某些實施例中，容器適應第一及第二表面之間隨著表面移動體積的變化。在某些實施例中，容器為彈性的且將組織樣品及解聚流體限制在相對表面之範圍內。在某些實施例中，容器為可撓性的且周圍氣壓幫助將組織樣品及解聚流體限制在相對表面之範圍內。在某些實施例中，氣壓為環境壓力。在某些實施例中，在圍封腔室中施加氣壓且壓力大於環境壓力。
在某些實施例中，解聚裝置包含並排安置之兩個或更多個相對表面組。在一些此類實施例中，表面組共用一個表面(例如單個板，視情況保持靜止)，而各組之第二表面並排定位且抵著靜止板施加壓力。第二表面可交替地以踏綜運動施加壓力。在某些此類實施例中，採用可撓性容器，其限制組織樣品及解聚流體在靜止表面與移動表面之間的空間內，同時允許容器內容物在移動表面之間來回流動。在某些實施例中，容器經調適以限制或防止內容物之此類來回移動。在一實施例中，跨越容器之密封口阻斷內容物自一側至另一側之流動。在另一實施例中，跨越容器之擋板限制內容物自一側至另一側之流動。
踏綜表面可藉由任何適合機構致動。本文揭示為裝置100的係經設計以抵著可撓性容器交替移動踏綜表面的側桿系統之實例。踏綜表面有彈簧，彈簧經設計以抵著容器按壓踏綜表面，同時允許容器厚度的變化及容器中之粒度變化。在某些實施例中，彈簧係預負荷的。本文中亦揭示為裝置200的係特徵在於兩個踏綜表面之凸輪致動設計之實例。在裝置200中，預負載彈簧抵著可撓性容器按壓踏綜表面且凸輪機構循環地升高一個踏綜表面，隨後另一個，遠離可撓性容器。在另一實施例中，一或多個搖臂或桿用以提昇踏綜表面遠離容器。在又一實施例中，踏綜表面以液壓方式升高及降低。在又一實施例中，踏綜表面以氣動方式升高及降低。雖然在200裝置中，存在交替地接觸解聚容器之兩個踏綜表面，但在某些實施例中，致動機構允許所有移動表面同時施加壓力，包括當系統靜止時。此類特徵可用於在解聚過程結束時清空解聚容器之內容物。舉例而言，代替踏綜表面位於中間位置或一個升高且一個降低，所有踏綜表面均相對於解聚容器降低，經由連接之導管擠壓出其內容物，視情況過濾，至二級接收容器，例如冷凍保存容器中。
在本文中例示之完全封閉的解聚及冷凍保存系統中，特徵在於自動化解聚，隨後人工過濾且藉由注射器及管之密封系統轉移至冷凍保存容器中且自動化冷凍保存。有利地，經解聚之腫瘤組織係人工地自解聚容器轉移至冷凍保存容器，而解聚及冷凍保存步驟係藉由經程式化以依序管理兩個步驟之同一自動化裝置進行。在其他實施例中，解聚程序經設計以使得在終止時，解聚腫瘤組織自解聚容器自動移動至冷凍保存容器。在某些實施例中，與連接管接觸之蠕動泵及閥控制內容物之流動。在某些實施例中，安置解聚器之踏綜表面以將解聚腫瘤溶液視情況經由過濾器自解聚容器推送或擠壓至冷凍保存容器中，閥控制內容物之流動。在此類實施例中，如本文所例示，較佳藉由相同裝置控制及進行封閉系統中之解聚及冷凍保存以及材料之任何轉移。
已關於包括力、消化時間及速度(RPM或循環/分鐘)之變數來測試及最佳化若干解聚系統。針對力、時間及速度變數之組合確定使用若干組織類型之結果及預測，包括至多及高於60 N之力、至多及高於60分鐘之消化時間及至多及高於240 RPM之速度。在本發明之某些實施例中，力係20-100 N、或30-80 N、或40-60 N、或10-20 N或20-30 N、或30-40 N、或40-50 N、或40-45 N、或45-50 N、或50-55 N、或55-60 N、或60-65 N、或65-70 N、或70-75 N、或75-80 N。典型踏綜腳具有約20至50 cm 2之表面積。基於30 cm 2踏綜表面，踏綜壓力為0.5-6.5 N/cm 2、或1-4 N/cm 2、或1-3 N/cm 2、或1-2 N/cm 2、或1.5-2.5 N/cm 2、或2-3 N/cm 2、或2.5-3.5 N/cm 2、或1.5 N/cm 2±0.5 N/cm 2、或2 N/cm 2±0.5 N/cm 2、或2.5 N/cm 2±0.5 N/cm 2、或3 N/cm 2±0.5 N/cm 2、或4 N/cm 2±0.5 N/cm 2、或5 N/cm 2±0.5 N/cm 2。標稱壓力可使用壓力感測器量測，較佳地針對解聚容器之厚度校正。在某些實施例中，解聚裝置併入壓力感測器。在本發明之某些實施例中，消化時間係90分鐘或更短、或75分鐘或更短、或60分鐘或更短、或50分鐘或更短、或5-120分鐘、或15-100分鐘、或30-90分鐘、或40-60分鐘、或5-10分鐘、或10-20分鐘、或20-30分鐘、或30-40分鐘、或40-45分鐘、或45-50分鐘、或50-60分鐘、或60-65分鐘、或65-70分鐘、或40分鐘±5分鐘、或45分鐘±5分鐘、或50分鐘±5分鐘、或55分鐘±5分鐘、或60分鐘±5分鐘、或65分鐘±5分鐘、或70分鐘±5分鐘。在某些實施例中，解聚裝置在60-360 RPM、或120-340 RPM、或180-300 RPM、或210-270 RPM、80-160 RPM、或120-200 RPM、或160-240 RPM、或200-280 RPM、或240-320 RPM、或280-360 RPM、或60 RPM±20 RPM、或80 RPM±20 RPM、或100 RPM±20 RPM、或120 RPM±20 RPM、或140 RPM±20 RPM、或160 RPM±20 RPM、或180 RPM±20 RPM、或200 RPM±20 RPM、或220 RPM±20 RPM、或240 RPM±20 RPM、或260 RPM±20 RPM、或280 RPM±20 RPM、或300 RPM±20 RPM、或320 RPM±20 RPM、或340 RPM±20 RPM、或360 RPM±20 RPM下操作。
在某些實施例中，物理解聚係連續的。在某些實施例中，物理解聚係週期性或間歇性的。舉例而言，當在解聚樣品中觀測到溫度提高時，可能有利的是短暫減緩或中斷物理解聚以降低或防止溫度提高或允許溫度平衡至設定點。不希望受理論約束，溫度提高可經由解聚裝置物理操縱樣品、來自裝置之活動踏綜機構之熱傳遞、在解聚過程活動時減少的物理接觸或自樣品至冷藏單元之熱傳遞或其他原因發生。在某些實施例中，週期性或間歇性解聚可有益於解聚裝置。在如本文中所揭示之凸輪驅動裝置中，凸輪機構之預期壽命可藉由週期性地將凸輪旋轉方向不時逆轉，因此藉由在凸輪之兩側上分佈磨損而延長凸輪之壽命而提高。在本發明之實施例中，物理解聚之活動時段包括但不限於15至30秒、20至40秒、30至60秒、45至75秒、60至90秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少1分鐘、至少1.5分鐘或至少2分鐘。不活動之持續時間可為但不限於1秒至10秒、10秒至20秒、20秒至30秒、30秒至40秒、40秒至60秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、60秒、90秒、120秒或之間的持續時間。不活動之持續時間可與解聚裝置逆轉方向所必需的時間一樣短。
在一些實施例中，表面為經安置以相對於彼此側向移動的相對表面。在某些此類實施例中，側向運動包含線性側向運動。在某些此類實施例中，側向運動包含軌道側向運動。在某一實施例中，存在線性及軌道側向運動兩者。
在一實施例中，相對表面為平的。在一實施例中，表面中之至少一者包含凸面區且經安置以相對於另一表面以搖擺運動移動。凸表面及搖擺運動之一個態樣係提供蠕動樣動作。
根據本發明，表面之移動受控，此類控制包含控制表面移動之一或多個態樣，包括但不限於速度、樣品壓縮、系統壓力、持續時間及循環頻率。在某些實施例中，板移動之一或多個態樣為恆定的。在某些實施例中，板移動之一或多個態樣取決於解聚之狀態。在某些實施例中，解聚之狀態係藉由解聚程序之時間定義，諸如一或多個預定義階段，諸如以小時、分鐘及秒為單位量測之早期、中期、晚期或更精確時段。在某些實施例中，解聚之狀態係由腫瘤塊之大小分佈定義。舉例而言，在本發明之一實施例中，隨著腫瘤塊之大小減小，壓力增加。
解聚裝置及替代方案之實例
參看圖41，展示在封閉及至少最初無菌大體上平邊且相對薄的樣品容器袋10內解聚組織成個別細胞或細胞凝集物之踏綜裝置100。裝置包括可以可移除方式插入至溫控裝置(諸如受控溫度速率變化冷凍器、解凍器或加溫器，例如稱為Via Freeze™之市售冷凍器，或提供受控速率之溫度變化的任何其他裝置，示意性地展示於圖41中且本文中一般描述為冷凍器40)中之由部件之總成形成的外殼110。在實踐中，外殼將包括未說明之蓋板。在使用中裝置及袋提供封閉系統，以解聚組織(例如切除之腫瘤、切除之腫瘤或穿刺生檢之部分等)，且隨後冷凍保存所得細胞懸浮液以供後續分析，而無需將解聚之樣品自袋10中轉移出來。
外殼110具有底盤112，該底盤連接有包括電馬達及變速箱之馬達單元114，其具有10至300 rpm之輸出速度。馬達及變速箱114之輸出軸具有驅動連接桿118之曲柄116，該連接桿轉而可樞轉地連接至踏綜機構120，其將經由對於曲柄116之各旋轉一個踏綜循環移動，亦即0.2與6秒之間的踏綜循環。更詳細而言，此踏綜機構具有平行四邊形四桿聯動裝置，其包括剛性地安裝至底盤112之兩個間隔開的樞軸122及124，其分別可樞轉地安裝兩個相對平行水平桿126及128。水平桿中之各者具有兩個平行踏綜桿130及132，其在樞軸122及124的各側上可樞轉地連接至一個，一起形成平行四邊形聯動裝置。連接桿118適宜地可樞轉地固持至頂部水平桿之延伸部，使得該延伸部之移動引起踏綜桿130及132之循環上下運動(在所展示之定向上)。各踏綜桿130及132連接有腳總成134及136，其藉助於上述循環運動，將隨曲柄116之運動以依序方式向上及向下移動，亦即，當一個腳向上時另一者將向下，且反之亦然。
腳總成134及136各自包括平面底板138及140，各板藉由螺旋金屬彈簧146分別被彈簧安裝至上部腳框架142及144。在上文所描述之配置或等效配置(若使用)中，彈簧146係預負荷的。在此情況下，對於各腳，組合之預負荷較佳為40至80 N，更佳為30至70 N，較佳為約60 N。組合之彈簧應變率為每毫米移動1 N至5 N，較佳地為每毫米約3 N，且預期腳移動為約8 mm至12 mm，較佳地為約10 mm。另外，各腳的表面積意欲為約20至50 cm 2，較佳約35cm 2。此使得袋上之假想壓力在零之間(當腳抬離袋或實質上空載，且高達約6 N/cm 2(約9 psi)。較佳假想壓力為約2 N/cm 2(約3 psi)。然而，鑒於袋可不，至少在踏綜過程開始時，含有均質材料，則將存在其中所施加之力將集中之材料團塊，且因此壓力描述為係理想情況之『假想』，例如踏綜過程即將結束時提供所施加之袋10之最小壓差阻力。
在底盤之底部為可撓性袋10的接收區域148且相鄰接收區域148為傳熱板150。區域148足夠大以准許樣品處理袋10可經由底盤之前部滑動至板150上(前部展示於圖41中)。板包括袋10位於其上之上表面151，及在使用中暴露以供外部影響之加熱或冷卻的下表面152。上表面151大體平行於各腳之底板138及140，使得底板大體平行於表面151移動。換言之，平底板在大體上垂直於表面151之方向上移動，此防止機構120上之顯著側面力。板150係由金屬、較佳鋁或銅或金或銀或含有彼等金屬之合金形成。熱導性較佳高於100且更佳高於200 W/m K，其在20℃下量測。板150材料之厚度為約3 mm或更小，且提供低熱質量，且因此提供跟隨在板之相對側上的溫度變化之袋10之內容物的更快速反應。
另外參看圖42及圖43，裝置藉由供應電流至馬達單元114，以在此實例中如藉由箭頭C所示順時針驅動曲柄116來操作。曲柄使連接桿118操作上述踏綜機構120。應注意，曲柄之衝程的頂部及底部(在此將最大力施加至機構120)與各腳總成134及136之最低位置一致。腳總成在箭頭U及D之方向上上下移動以依序按摩樣品袋10，使得袋10之內容物有機會移動至遠離各別踏綜腳之一側。由於袋中潛在固體的組織樣品可移動遠離踏綜腳，且因為各腳之底板138及140經彈簧負載，其中向腳提供額外的彈性移動，即使當其處於其衝程底部時，所以當意欲解聚較大組織質量時機構會卡住的可能性較小。依序踏綜動作亦降低袋10破裂之幾率。
圖44為上文所描述之裝置100的平面視圖，但在此視圖中，袋10未就位。特定言之，可看到腳總成134及136之相對並排位置，其間隔開且具有以平面視圖觀察到之集體區域，該面積約等於當平坦鋪設時袋10之面積，但袋10之面積的約±10%之面積差異具有效用。
圖45展示裝置100'之另一平面視圖，其在構造上類似於上文所描述之裝置100，但在此替代方案中，馬達單元114之馬達113藉由使用90度變速器115橫向於其變速器115之輸出軸而配置，使得馬達113並不突出超出裝置100'之背壁111。因此，必要時，此裝置100'可適配於較小冷凍器體積中。
在上述解聚處理期間，藉由腳總成134及136施加之力藉由傳熱板150反應。此意謂在處理期間將樣品袋10壓在板150之接觸表面151上，提供樣品袋10與板表面151之間的良好表面接觸，且因此改良熱能傳遞。
圖46、圖47及圖48展示上文所提及之可撓性樣品袋10之不同實施例。將使用中之袋滑動至裝置100或100'中之接收區域148中的適當位置且擱置在所提及之兩腳134及136下方。因此，袋具有約高達12 mm厚度之一般扁平構造，且具有一些額外順應性以便使組織樣品適配於其中。如自圖46可見，展示了袋10之一種構造，其由僅在其周邊14處密封以形成中心腔體12的兩層塑膠材料及用於進入腔體12的端口16形成。袋可由EVA形成。在使用中，較佳地，端口16或其中之至少一者足夠大，亦即直徑為約10 mm或更大，以接受在必要時已切碎成小塊且藉助於注射器傳遞至袋腔體12中之樣品。然而，亦有可能在袋與端口相對的末端包括所謂的『拉鏈鎖(zip-lock)』出入口，使得可將大的組織樣品放入袋中且隨後重新密封袋。『拉鏈鎖』可一或多次摺疊以形成接縫，於彈性通道內部或藉助於另一夾具或多個夾具(未圖示)摺疊固持以減小洩漏的機率。作為替代方案，袋10可打開且可添加組織。袋隨後可經熱密封，其中其內容物在原位。袋10包括用於在使用中將袋定位在裝置中且在踏綜期間將袋固持在適當位置的角孔18。儘管圖式展示具有一個腔體12之袋10，但將有可能提供具有超過一個腔體之袋，例如兩個、三個、四個或五個腔體，例如複數個腔體中之各者為細長的且具有最初開放的、可熱密封的末端，及在其另一端可密封的端口，其用於引入諸如解聚酶之試劑，且用於在解聚完成或實質上完成後取出解聚樣品。
圖47展示圖46之袋10，其藉助於框架上之栓釘24安裝於定位框架20中，該等栓釘裝配至角孔18中。框架20為將袋10定位及固持在裝置100/100'內之適當位置的替代方式。框架20包括定位孔22，其與裝置協作以用於在踏綜期間將袋定位且固持在適當位置。框架具有內部開放窗26，其具有光滑的圓化內部邊緣23，以在使用中容納腔體12及踏綜腳134及136。框架20使得將袋10裝載至裝置100/100'及自裝置100/100'卸載更容易。
圖48展示替代性框架20'，其具有各自類似於框架20之構造的兩個大體上對稱的半部。各框架半部另外具有可撓性殼30，其模製至框架20'，使得兩個半部如蚌蛤殼合於一起包封袋10。若袋10在使用中內部斷裂，則頂部及底部可撓性殼充當防護壁(bund)。此特徵尤其適用於感染性組織樣品。
又一替代方案(未圖示)，可採用簡單的袋於袋內(bag-in-bag)配置以容納洩漏。在又一替代方案中，袋可包括具有彈性(至少在室溫下)獨立孔之基底，使得可例如在如下文所描述冷凍之後在不使用整個樣品之情況下移出樣品之等分試樣。或者，可密封袋可進一步熱密封成份以允許樣品分離。
置入袋10之樣品之處理在一個實例中可主要遵循WO2018/130845中所描述之步驟。在此配置中，密封袋待含有之組織懸浮於水性溶液中，其可含有消化酶(諸如膠原酶及蛋白酶)以促進組織分解，經由端口16引入至袋中。此處將袋置放於板150上且自例如外部熱源升溫至大約35°C以促進組織消化速率。此處提出之一個重要差異為採用單個樣品處理袋，且消化酶可在解聚之前或期間經由袋中之端口16中之一者引入。傳熱板150可用於藉由在其底面加熱板來將熱能引入至袋中，以在用於酶作用之袋中提供所要溫度。彼熱量可方便地來自電加熱升溫板，或板150中或上之電加熱元件。解聚作用之量將視許多參數而定，例如初始組織樣品之大小、密度及彈性，且因此解聚之時間及踏綜之速率將顯著變化。過長或過度劇烈的踏綜可引起細胞存活率降低。因此，馬達單元速度及解聚時段係重要的。解決此問題之一個選項為根據包括解聚類似樣品所需之時間及輸出速度的查找表控制處理時間。另一選項為量測隨時間推移進行解聚處理所需之瞬時電功率或電能，或量測施加於板150或機構之另一部分上之力或應力，且在已達到預定臨限值之後停止，以指示樣品已充分解聚。隨著功率/力/應力減小，解聚更接近於完成。另一選項為量測通過袋之光吸光度-吸光度愈大，樣品愈接近完全解聚。在解聚完成之後，可轉移袋內容物，且可分離細胞或其他相關組分且置回新鮮袋中以供在裝置100/100'中冷凍。或者，且較佳全部解聚材料可留在袋及用於冷凍之裝置中。冷凍保護劑經由端口16引入至袋中。
本發明方法與WO2018/130845中所述之方法之間的另一差異為在引入冷凍保護劑後，將袋中具有解聚樣品及冷凍保護劑之裝置安裝(或保持於裝置中)，且整個裝置安裝於如上文所描述之冷凍器40中。冷凍器之基底係冷的，且因此經由傳熱板150自袋10吸取熱能。為了控制冰形成且防止樣品在袋冷卻時過冷，其可以上述方式由腳134及136按摩，儘管速率比解聚要慢，以控制冰長晶且因此增加解凍之後細胞存活率。電能可經由導線導體供應至馬達單元114，以維持機構120在冷凍器，例如冷凍器40 (圖41)內部之運動。
由於裝置可自冷凍器移除，因此在使用之後進行清潔更容易。
當需要使用時，袋10中之冷凍解聚樣品可藉由進一步外部加熱板150及/或藉由將裝置100/100'部分浸沒於溫暖水浴中、保持在約37℃下且移除冷凍保護劑而快速在裝置100/100'中解凍。在各情況下，可在解凍期間按摩袋。若酶仍存在，則其亦可在需要時例如藉助於過濾移除。一般而言，其在冷凍保存期間將對細胞具有極小影響或對細胞無影響，因為其在低溫下暫停作用。樣品之所有過程操縱、升溫、解聚、冷卻、冷凍及隨後解凍在相同密封可撓性袋10中發生，且可在單個裝置中進行。此不僅係時間及空間高效的，而且其使得單一紀錄能夠捕捉在處理期間樣品發生之所有事物，例如溫度、持續時間、解聚速度、冷凍方案，且減少誤差之機率，諸如樣品在處理機之間的不受控環境中渡過過多時間。
用於組織樣品處理及冷凍之設備及技術之更特定實例在下文給出。
圖49展示由諸如EVA或PVG膜之熱塑性材料形成且具有用於接受組織樣品T之開口11之袋10的實例。袋包括連接至一或多個端口16之導管13 (圖46)，該導管包括一或多個分流器17、壓縮閥19及標準Luer型連接器15。所展示之單一導管線僅為說明性的-袋10可包括經由複數個端口16連接之額外的平行導管。
一旦組織T在袋10內部。開口11可藉由以下密封：在圖50中展示為封閉及密封且同一圖中以連點線展示為開放之機械夾持密封口9，及/或藉助於使用如圖51a中所示之熱密封機器50進行熱密封以產生一或多個熱密封封閉條帶(例如複數個平行條帶) 8，各方法形成密封腔體12 (圖46、圖47及圖49)。
用於密封袋10之替代或額外方式展示於圖51b及圖51c中。如圖51c中所示，在密封口8處熱密封之後，袋10可夾持於兩部分夾具60中，其包含藉由一對螺釘66迫使在一起之頂部桿62及底部桿64。圖51b展示處於分解狀態之夾具60，但在使用中，螺釘66在插入袋10之前不必自剩餘夾具完全移除。頂部桿62具有錐形凹槽68，其中在夾持時具有互補楔形形成物61。凹槽及楔在楔之頂點65處集中夾持力，在頂點處提供比平夾持面可達成之夾持力更高的夾持力。為了甚至更多夾持力，頂點65在其峰處具有小通道67，該小通道在使用中在頂部桿中由互補脊形形成物69相接。在某些實施例中，力足以抵消對熱密封口8之需求。在某些實施例中，需要熱密封口或其他袋密封機構，例如以提供在解聚器外操作含樣品袋。在某些實施例中，夾持裝置確保密封口之完整性。夾持力藉由不容易彎曲之頂部及底部桿之厚度及剛度進一步增強，且因此維持由螺釘66施加之夾持力。圖51c展示處於夾持狀態下之夾具60。突起63與踏綜裝置100/100'或200 (如下文所描述)之零件相接以阻止在踏綜期間夾具，且因此夾持袋10之移動。夾具60之外部周邊及高度具有經設定大小及形狀以適配於樣品接收區域148 (或248，圖62及以下)之互補部分中，且因此在踏綜期間提供夾持袋10之進一步定位。儘管未說明，但夾具60亦可併入如圖47及圖48中所展示之額外框架20、20'，且使得夾具剛性地安裝至框架之一個末端且端口16 (圖46及圖49)支撐於框架之另一末端處。
參考圖52，在使用中，一旦密封，可經由導管13將消化酶E引入至腔體12中，例如藉由使用連接至分流連接件17之注射器5將酶注入至袋中。藉由固持袋處於直立定向，空氣可隨後藉由抽出注射器5之活塞而自腔體12移除，如圖53中所示。可手動進行酶E及組織T之初始混合，如圖54中所示。
隨後可開始將袋10裝載至踏綜裝置100中以解聚，具有或不具有框架20/20'及防護蓋板30，如圖55中所說明。
隨後如上文所描述進行解聚過程。一旦完成(其可耗費若干分鐘與若干小時之間，例如約10分鐘至7小時，較佳地40分鐘至1小時)，可例如使用上文所描述之袋裝置及連接至分流器17之額外樣品等分試樣袋7 (如圖56中所展示)將解聚之液化樣品次分為等分試樣。在彼情況下，使用注射器5以在箭頭F方向上將液化樣品抽取至袋10之外，打開閥19a及19b且關閉鄰近樣品等分試樣袋7之閥19c。一旦足夠樣品已抽取至注射器5中，關閉閥19b，閥19a保持打開，且打開閥19c。注射器隨後用以沿圖57中之箭頭F方向迫使液體，進入樣品等分試樣袋7中。等分試樣袋7之導管13可藉助於夾持熱密封機55熱密封且展示於圖58中。可重複彼過程直至獲得足夠等分試樣或直至不再有樣品留下。袋可已經部分地劃分區域以使得密封分隔各區室更簡單。
如上文所描述，樣品袋10可保持在踏綜裝置100 (圖55)中且隨後可將踏綜裝置裝載至受控速率溫度改變裝置，在此情況下如圖59中所示之冷凍器40中。技術允許在冷凍期間繼續踏綜以抑制冰晶體形成，但在實踐中可在冷凍之前移除袋10，且冷凍器40隨後僅在踏綜期間經由傳熱板冷卻樣品。在替代方案中，等分試樣樣品袋7可替代整個樣品袋10。在另一替代方案中，冷凍器40可用於藉由將踏綜裝置100安裝於冷凍器40之頂部上來將未經處理或經處理之樣品平緩地冷卻至約4℃，其中冷凍器蓋子打開因此使基底150冷卻，如圖60中所示。在另一替代方案中，有可能移除基底150且使其置於冷凍器中，其中冷凍器蓋子蓋好，如圖61中所示。在又一替代方案(未展示)中，袋10或7可直接於冷凍器40中冷凍。
本發明不應視為受上文所描述之實施例限制，而是可以在所附申請專利範圍之範疇內變化，如熟習此項技術者所易見。舉例而言，上文所描述之踏綜機構為較佳的，因為其提供完全樞轉機械互連，其相比滑動表面在寒冷條件下卡住之可能性較低，但該機構可用任何用於兩個或更多個腳依序踏綜之機械等效構件替換。所描述之平腳可用輥腳替換，其中踏綜運動係左右運動而非上下運動。所描述之踏綜或其機械等效運動之速率較佳為各腳每秒2或3次踏綜，以最佳化解聚且使細胞恢復率最大化，且為穩定踏綜，但對於不同細胞類型，踏綜可更快或更慢或為間歇性。
由於裝置100/100'意欲置放於冷凍器中且經受極低溫(例如，-80℃或更低)，因此使用金屬部件，尤其是如彈簧146的彼等部件為較佳的，此係因為聚合部件在低溫下變得剛性大得多。另外，緊密適配部件(如活塞及筒)可在極低溫度下變得卡住或適配不良，因此如所描述之機構120的簡單可樞轉聯動裝置係較佳的。
圖62、圖63及圖64展示替代性踏綜裝置200，其大小及功能類似於上文所描述的裝置100。裝置200具有在下文更詳細地描述的某些差異。
參看圖62，裝置100與裝置200之間的主要差異在於，裝置200具有不同於裝置100之機構120的踏綜機構220。兩個踏綜腳234、236以類似於圖42及圖43中所展示之運動的循環替代性踏綜運動由24伏特DC電馬達213 (圖63)驅動，該馬達為電馬達單元214之部件，該電馬達單元具有將回饋提供至控制器221 (圖63)以用於監測及控制踏綜運動之速度的旋轉編碼器。馬達經由齒形帶222驅動凸輪軸224。凸輪軸包括以180度偏移之一對凸輪230、232，在此情況下，各自輪廓為擺線形狀以提供凸輪從動件之簡單諧波運動。各凸輪可操作以移動包括騎在凸輪輪廓上之相關聯的彈性從動輪225、227，與帶彈簧從動件托架226、228呈力傳遞關係的從動輪軸221、223之凸輪從動件總成。各托架226、228在線性引導件229中滑動，且各別腳234、236連接至托架。隨著各別凸輪藉由馬達克服回動彈簧231之推力而旋轉，各總成轉而藉由從動輪中之各別一者隨著其連同腳騎著凸輪輪廓離開踏綜狀態被迫使朝上。當凸輪進一步旋轉且凸輪輪廓後退時，與各從動件總成相關聯之彈簧231用踏綜力迫使總成及腳朝下。
藉此，踏綜力限於相關聯從動件總成彈簧231之彈簧應變率而非驅動馬達之動力。1. 施加至袋之力在使用中受到彈簧限制，此係因為機構驅動腳向上且彈簧將其向下推動回去。此確保：
a. 馬達不會失速(不管腫瘤大小或質地如何)；
b. 樣品不經過量力壓縮且袋不會裂開；
c. 施加至袋之最大壓力低於袋製造期間測試之壓力；及
d. 如下文所描述，鉸接袋接收區域248可接受樣品袋及所使用之任何夾具，而不必預先定位腳。換言之，當接受袋時，腳可處於任何位置，此係因為鉸接樣品區域248抵著腳封閉，且若需要，則因為鉸接區域抵著腳封閉，任何樣品可在彼時由腳壓縮。
亦參考圖63及圖64，裝置200進一步包括自裝置外殼210延伸至兩個腳234、236之上部部分的可撓性密封膜241，其提供腳底與踏綜機構220之剩餘部分之間的流阻及防塵密封。若壓縮袋在使用中裂開，則彼配置阻止機構污染。儘管膜241為較佳的，但腳可在密封口中滑動，諸如安裝以將機構220自袋區域248分隔，且在需要時實現機構污染的類似阻止的唇形密封口(lipped seal)。
裝置200進一步包括傳熱板250，該傳熱板執行與傳熱板150相同的功能。然而，此板250鉸接至鉸鏈255處之外殼之一側(圖64)，使得待踏綜之袋之插入及移除(如圖46、圖47及圖48中所展示)更容易。傳熱板250包括溫度感測器256，其允許為了品質控制而由控制器監測及記錄板250及袋接收區域248之溫度。板250具有第一表面251及第二表面252，其具有與上文所描述之表面151及152相同的功能。
各腳可調整相對於裝置200之傳熱板250的高度，且其移動之指示亦由控制器監測。因此，即使旋轉編碼器可指示馬達正轉動，但諸如齒形帶222之故障的機械故障仍可由控制器偵測，且可實施適合動作，諸如發出警報。
裝置200具有與裝置100相同的外部尺寸，且裝置之外殼210意欲在受控速率冷凍器40內部滑動，其中冷凍器蓋如上文所描述且說明於圖61中蓋好。
為方便起見，諸如上部、下部、上及下之術語及更描述性術語，諸如腳、踏及踏綜已用於描述圖式中所展示之發明，但在實踐中，所展示之裝置可以任何方式定向，以使得彼等術語變成例如反過來或於彼新定向上不太具有描述性。因此，關於定向之限制性不應藉由此類術語或同義術語來解釋。
本發明提供用於在封閉可撓性袋(10)中將組織樣品解聚成個別細胞或細胞凝集物的裝置(100/100')，該裝置包括機械解聚機構(120)及組織樣品袋接收區域(148)，該裝置進一步包括用於將熱能轉移至區域(148)或自該區域轉移熱能之傳熱板(150)，板具有鄰近區域(148)之第一板表面(151)及背離區域(148)之暴露於外部熱影響的相對表面(152)。
在收集時腫瘤組織之冷凍保存使得能夠將製造與腫瘤收集分開。此意謂UTIL製造可作為自腫瘤消化物解凍直至最終TIL收集物洗滌、藥物產品調配、填充、標記及冷凍保存之單一製造過程規劃及進行。
最終產物之冷凍保存使得待在調節化學療法及患者治療之前進行的所有放行測試(release testing)能夠與最終產物製造位置分開。
使用流式細胞量測術表徵及定量製造之產物。除了流式細胞量測術以外，亦可考慮量測細胞計數、存活率及/或細胞純度之其他方法，諸如基於筒匣之方法，諸如但不限於由Chemometec https :// chemometec . com / products / nucleocounter - nc - 200 - automated - cell - counter /或Accellix https :// www . accellix . com / technology /)產生之筒匣。TIL定義為表現細胞表面標記物CD3之T細胞，其已藉由對起始材料之代表性樣品進行病理學評估培養衍生自轉移性腫瘤。存活率係基於不結合早期細胞死亡標記物磷脂結合蛋白-V及/或存活率染料DRAQ7 (等效於錐蟲藍或PI)之所有CD3 +細胞的百分比。純度定義為活T細胞(CD3 +、磷脂結合蛋白-V -ve及DRAQ7 -ve)在活造血細胞群體(CD45 +、磷脂結合蛋白-V -ve及DRAQ7 -ve)內之百分比。
在快速擴增方案(REP)之前絕大部分細胞為表現CD3之T細胞。在研究以及臨床批次中，觀測到CD3+CD8+及CD3+CD4+ TIL之不同分佈且其將包含含有腫瘤反應性細胞之子集。由於TIL在REP中使用抗CD3擴增，因此最終產物幾乎僅含有活CD3+ T細胞(＞94%)。
理論上，最終產物仍可含有腫瘤細胞，但此歸因於強烈且選擇性地促進T細胞生長及腫瘤細胞之T細胞介導殺滅的培養條件極不可能。數百次TIL輸注之臨床資料藉由細胞學未展示腫瘤細胞之存在。為了整理資料以最終設定規格，已併入測試以鑑別所有在原始IPC分析中非造血的活細胞材料且亦將測試癌症生物標記之出現頻率。
TIL細胞藥物產品係於含有8.5%人類血清白蛋白及10% DMSO之大約125至270 ml緩衝等張生理鹽水中之懸浮液。存在之細胞數目視培養物中待擴增的各個體之TIL細胞之能力以及培養條件及製造再現性而定。
表3 - 例示性藥物產品組成
組分 數量(每輸注袋) 功能
腫瘤來源之T細胞 5×10 9至5×10 10個CD45 +、CD3 +、磷脂結合蛋白-V -、DRAQ7 -細胞 活性成分
20%人類血清白蛋白 8.5% HSA W/V 吸收抑制劑
磷酸鹽緩衝鹽水 125至270 ml 等張稀釋劑
DMSO 10% V/V 冷凍保護劑
參考圖1，揭示裝置之解聚模組。在涉及酶消化之實施例中，裝置可包含用於解聚及消化之可撓性容器 1a。開放末端 1b准許將實體腫瘤組織材料轉移至容器 1a中。懸掛孔 1c允許容器 1a在運輸或使用期間懸掛且被支撐。為了維持裝置之無菌條件，目標熱熔接位置 1d使得容器 1a可使用熱熔接器 13c或其他類似方式密封。容器 1a可在容器 1a之內表面上具有圓化邊緣 1e以減少損耗，損耗可作為轉移至圖2A-C或圖3A或圖3B中所說明之實例之一部分出現。導管 1f使得培養基 3a能夠經由無菌過濾器 2a轉移至容器 1a中。無菌過濾器 2a包含准許在後續模組中穿刺密封口以促進培養基 3a之轉移的長釘。導管 1g使得能夠經由無菌過濾器 2b將消化酶 3b轉移至容器 1a中。無菌過濾器 2b包含准許穿刺密封口以促進消化酶 3b轉移至容器 1a中的長釘。在實體腫瘤組織解聚，尤其涉及酶消化之後，解聚混合物經由包含無菌過濾器 4b之過濾器單元 4a轉移離開導管 1h，隨後進入培育階段。過濾器單元 4a可為可撓性的，以准許扭曲而不影響過濾過程之效用。過濾器 4b移除未解聚組織。導管夾具 5a允許培養基 3a經由無菌過濾器 2a進入可撓性容器 1a。在涉及酶消化之實施例中，導管夾具 5b允許酶 3b經由無菌過濾器 2b進入可撓性容器 1a。導管夾具 5c允許可撓性容器 1a之內容物經由過濾器單元 4a進入圖2A-C或圖3A或圖3B中鑑別之一或多個實例。
根據圖2A，無菌過濾器 2c准許引入冷凍保存經解聚之腫瘤組織所需之培養基 3a及/或冷凍溶液 3c。過濾器 4d可為細胞/組織凝集物之額外大小分離所需。過濾器 4d圍封於過濾器單元 4c內，該過濾器單元可為可撓性的以准許扭曲而不影響過濾過程之效用。在一實施例中，可能需要過濾器 4e以保留細胞，但允許洗掉培養基及細胞片段。過濾器 4d以類似方式圍封於過濾器單元 4c內。在一實施例中，導管夾具 5d在適當位置以阻止來自容器 1a之已穿過過濾器單元 4a及 4c之材料返回至容器 1a。在一實施例中，導管夾具 5e在適當位置以允許來自容器 1a的已穿過過濾器單元 4a、 4c及 4e之廢料進入廢料容器 6a，但阻止培養基 3a或 3c經由無菌過濾器 2c進入。在廢料經由導管夾具 5e進入廢料容器 6a中之前，導管夾具 5f阻止來自容器 1a的已穿過過濾器單元 4a、 4c及 4e之材料返回至培養基 3a或 3c之來源或轉移至圖3A或圖3B中所說明之實例中之一者。一旦廢料耗盡，導管夾具 5e及 5d閉合，且導管夾具 5f允許培養基 3a或 3c將過濾器 4e內之細胞轉移至圖3A或圖3B中所說明之實例中之一者中。廢料容器 6a具有懸掛孔以在使用及/或運輸期間支撐廢料容器 6a。
圖2B說明裝置之富集模組。導管夾具 5g允許容器 1a之內容物經由過濾器單元 4a進入富集模組之可撓性容器 7a。導管夾具 5h允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 8a，保留及富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞經由開放導管夾具 5i返回容器 7a之前藉由閥 8c控制之壓力穿過過濾器 8b進入廢料容器 6a中。導管夾具 5i允許容器 7a之內容物經由開放導管夾具 5h穿過過濾器單元 8a，保留及富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞返回容器 7a之前藉由閥 8c控制之壓力穿過過濾器 8b。在發生細胞富集之後，導管夾具 5h閉合且導管夾具 5j開放以允許容器 7a之內容物傳遞至圖3A或圖3B中所說明之實例中之一者。廢料容器 6a具有懸掛孔 6b以在使用及/或運輸期間支撐廢料容器 6a。富集模組之容器 7a具有懸掛孔 7b以在使用及/或運輸期間支撐容器 7a。容器 7a可在容器 7a之內表面上具有圓化邊緣 7c以減少損耗，損耗可作為轉移至圖3A或圖3B中所說明之實例的一部分出現。導管 7d允許容器 7a經由過濾器單元 4a及過濾器單元 8a接收容器 1a之內容物。導管 7e允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 8a，保留且富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞經由開放導管夾具 5i返回容器 7a之前藉由閥 8c控制之壓力穿過過濾器 8b進入廢料容器 6a中。導管 7f允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 8a，保留且富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞返回至容器 7a之前藉由閥 8c控制之壓力穿過過濾器 8b進入廢料容器 6a中。
圖2C說明富集模組之另一實施例。導管夾具 5g允許容器 1a之內容物經由過濾器單元 4a進入可撓性容器 7a。導管夾具 5h允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 9a，保留及富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞經由開放導管夾具 5i返回容器 7a之前藉由閥 9c控制之壓力穿過過濾器 9b進入廢料容器 6a中。導管夾具 5i允許容器 7a之內容物經由開放導管夾具 5h穿過過濾器單元 9a，保留及富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞返回容器 7a之前藉由閥 9c控制之壓力穿過過濾器 9b。在發生細胞富集之後，導管夾具 5h閉合且導管夾具 5j開放以允許容器 7a之內容物傳遞至圖3A或圖3B中所說明之實例中之一者。廢料容器 6a具有懸掛孔 6b以在使用及/或運輸期間支撐廢料容器 6a。富集模組之容器 7a具有懸掛孔 7b以在使用及/或運輸期間支撐容器 7a。容器 7a可在容器 7a之內表面上具有圓化邊緣 7c以減少損耗，損耗可作為轉移至圖3A或圖3B中所說明之實例的一部分出現。導管 7d允許容器 7a經由過濾器單元 4a及過濾器單元 9a接收容器 1a之內容物。導管 7e允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 9a，保留且富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞經由開放導管夾具 5i返回容器 7a之前藉由閥 9c控制之壓力穿過過濾器 9b進入廢料容器 6a中。導管 7f允許容器 7a之內容物穿過過濾器單元 9a，保留且富集細胞，同時允許廢料及碎片在富集細胞返回至容器 7a之前藉由閥 9c控制之壓力穿過過濾器 9b進入廢料容器 6a中。過濾器單元 9a有助於過濾容器 7a之內容物以在富集細胞返回至容器 7a之前藉由閥 9c控制之壓力經由過濾器 9b移除廢料培養基及碎片至廢料容器 6a中。過濾器 9b可捲繞成線圈以增加廢料在達至廢料容器 6a之前必須溶離的距離以改良細胞培養基之純化，且有助於經改良過濾器 9b之輸送及儲存。
圖3A說明穩定化模組之實例。導管夾具 5k允許：如圖1中所說明經由過濾器單元 4a，或如圖2A中所說明經由過濾器單元 4c之容器 1a之內容物；或如圖2B中所說明經由過濾器單元 8a，或如圖2C中所說明經由過濾器單元 9a之容器 7a之內容物轉移至穩定化模組之容器 10a中。穩定化模組之容器 10a具有懸掛孔 10b以在使用及/或運輸期間支撐容器 10a。容器 10a可在容器 7a之內表面上具有圓化邊緣 10c以減少損耗，損耗可作為轉移離開導管 10e或 10f的一部分出現。導管 10e使得容器 10a之內容物能夠經由連接器 10h抽出。導管 10f含有可撓性膜以使得無菌長釘能夠經由無菌蓋板 10g引入，以使得容器 10a之內容物能夠被抽出。
圖3B說明穩定化模組之另一實施例。導管夾具 5l允許：如圖1中所說明經由過濾器單元 4a，或如圖2A中所說明經由過濾器單元 4c之容器 1a之內容物；或如圖2B中所說明經由過濾器單元 8a，或如圖2C中所說明經由過濾器單元 9a之容器 7a之內容物轉移至穩定化模組之容器 11a中。穩定化模組之容器 11a具有懸掛孔 11b以在使用及/或運輸期間支撐容器 10a。容器 10a可在容器 7a之內表面上具有圓化邊緣 10c以減少損耗，損耗可作為轉移離開導管 11f的一部分出現。導管夾具 5m允許培養基 3c經由無菌過濾器 2c進入可撓性容器 11a。導管夾具 5n允許容器 11a之內容物視導管夾具 5o、 5p、 5q、 5r、 5s及 5t之開放或閉合狀態而定，進入冷凍保存容器 12a中之一者。導管夾具 5o、 5p、 5q、 5r、 5s及 5t允許容器 11a之內容物進入冷凍保存容器 12a中之一者。導管 11d使得容器 11a能夠接收：如圖1中所說明經由過濾器單元 4a，或如圖2A中所說明經由過濾器單元 4c之容器 1a之內容物；或如圖2B中所說明經由過濾器單元 8a，或如圖2C中所說明經由過濾器單元 9a之容器 7a之內容物。導管 11e允許冷凍保存培養基 3c轉移至容器 11a中。導管 11f使得容器 11a之內容物能夠轉移至冷凍保存容器 12a，其中儲存作為單細胞懸浮液之最終解聚UTIL產物以供未來用於快速擴增過程。冷凍保存容器 12a具有固定件 12b以允許將TIL自冷凍保存容器 12a中無菌轉移。冷凍保存容器 12a具有適合於待儲存之UTIL細胞懸浮液之體積的空間 12c。冷凍保存容器 12a亦具有用於將導管 11f熔接至冷凍保存容器 12a之目標位置 12d。
圖4說明裝置及套組之另一實例。栓釘 13a允許懸掛培養基 3a、 3b及 3c。栓釘 13b連接至用於懸掛容器 1a之重量感測器且視所用實施例而定可包括容器 7a、 10a及/或 11a中之一或多者。重量感測器用以定義判斷階段以控制材料之自動化處理。熱熔接器 13c可用於在將切除之實體腫瘤組織引入容器 1a中之後在目標部位密封容器 1a。解聚模組 13d具有開口，其可閉合且鎖住以使得能夠解聚且可將溫度控制在0℃至40℃之間(至1℃之容許偏差)以使得能夠消化，其中消化酶用於解聚實體腫瘤組織。解聚模組 13d亦具有內建式感測器以藉由測定光分佈隨時間之不同以鑑別變化來評估固體組織解聚水準，且由此鑑別解聚過程之完成，其在數秒至數小時之時段內發生。解聚模組 13d亦可包含解聚表面 13f，其直接與容器 1a接觸且頂著解聚模組 13d罩殼之背面，該罩殼可在利用酶之解聚及消化期間閉合及鎖住。最終調配模組 13e具有允許視所利用之實施例而定控制容器 10a或 11a之溫度的罩殼，其能夠將溫度控制在0℃與周圍環境溫度之間(至1℃之容許偏差)。導管夾具 13g及 13j充當輸入及輸出端口，其安置在導管定位器 13i內，且視利用之實施例而定促進解聚腫瘤產物在容器 1a、 10a或 11a之間的傳輸。蠕動導管泵 13h控制培養基 3a或 3c在充當輸入及輸出端口之導管夾具 13g與 13j之間的轉移。導管閥 13k有助於經由富集模組中之閥 8c及 9c控制壓力，如圖2B及圖2C中所說明。取決於所利用之實施例，栓釘 13l允許懸掛廢料容器 6a及/或冷凍保存容器 12a。實施例亦可包括將如圖3B中所說明冷凍保存容器 12a連接至裝置所需的導管熔接器 13m。實施例亦可包括將如圖3B中所說明冷凍保存容器 12a與裝置斷開之導管切割器 13n。受控速率冷卻模組 13o能夠冷卻或維持在8℃與至少-80℃之間的任何溫度以幫助冷凍保存過程。
根據以下過程例示本發明之方法。清楚地陳述，除方法之基本特徵以外，可獨立地組合本文中所列出之各種可選步驟以達成與待達成之取樣及結果之類型相關聯的相關技術優勢。
半自動無菌組織處理方法包含：視情況根據本文所描述之套組，自無菌處理套組上之數位標籤識別符自動確定無菌解聚組織處理步驟及一或多個其他組織處理步驟及其相關條件；將組織樣品置放於無菌處理套組之可撓性塑膠容器中；及藉由與以下通信且控制以下自動執行一或多個組織處理步驟來處理組織樣品：解聚模組；視情況選用之富集模組；及穩定化模組。
基本上該過程可包含獲取將接收生檢/組織樣品、較佳切除腫瘤之末端開放袋(第一可撓性容器，其為解聚模組之一部分)，其已經經由一或多個管道連接至或可經由人工操作員控制之無菌連接件連接至
I. 具有消化培養基(第二可撓性容器，其為解聚模組之一部分)及具有或不具有穩定化溶液(相同第二可撓性容器亦為穩定化模組之一部分)之單一容器
II. 具有消化溶液的一個容器(第二可撓性容器，其為解聚模組之一部分)及具有穩定化溶液的另一容器(第四可撓性容器為穩定化模組之一部分)
當添加生檢及密封末端開放袋時，消化培養基可經由管道或無菌連接件(如技術方案1之管道/端口)添加且處理組織材料。
在消化完成時，在此時組織現係單一或少數聚集細胞懸浮液，細胞可視情況在步驟4之前經過濾(用於過濾之視情況選用之富集模組包含含有樣品之第一可撓性容器且過濾至用於接收富集之濾液的第三容器)。
在穩定化培養基不存在於相同可撓性容器中之情況下，藉由開放所連接管道或待競爭之人工操作員控制之無菌連接件且應開放該連接件以使得能夠在兩種情況下在過程繼續之前添加穩定化溶液，來向容器添加穩定化溶液。
原始可撓性容器中之單一或少數聚集細胞懸浮液或其可視情況再分入多個儲存穩定化容器，其後維持在裝置上之穩定狀態及/或將經歷冷凍保存，隨後移除以運輸、儲存及/或用於其最終效用。穩定化模組亦包含第一或第三容器，如儲存/冷凍/儲存中所用。
在過程之另一非限制性實例中：
a) 將藉由諸如用於收集所需組織材料之生檢或手術之單獨程序(並非本發明之一部分)收集的組織樣品置於初始可撓性塑膠容器中(參見例如圖1，容器1a)。
b) 在使用本發明之以下實例中之一或多者解聚之前，將培養基(參見例如圖1，培養基3a)轉移至解聚腔室中，或在一個實例中亦加入且收集酶(參見例如圖1，酶3b)，諸如重量感測器之機構(參見例如圖1，作為模組13d之一部分的13b)評估待添加培養基之所需量，其藉由以下確定：直接操作員輸入或固體組織之重量。
c) 單次使用可撓性解聚容器、固體組織、培養基及在一個實例中酶在物理解聚過程期間合併最少數秒至若干小時，其中需要在1與10分鐘之間的最佳時間，以分解固體組織直至不存在視覺改變為止(參見圖5及表1)。解聚裝置經設計以視解聚所花費的時間及經由解聚模組內之感測器(參見圖1，13d)的回饋而定，使用可變速度及時間壓縮組織。
d) 在其中存在酶之一個實施例中，此將需要在30與37℃之間的最佳溫度下，但可低至0℃至多40℃持續至少1分鐘至若干小時，但更佳15至45分鐘的培育期。
e) 步驟c及在酶實施例中步驟d)可重複直至組織停止改變，或見到實例已解聚為液體細胞懸浮液，無論哪個第1個出現，其藉由解聚模組解聚模組中之感測器(參見圖1，13d)監測。
f) 在一個實施例中，不完全解聚組織、相關材料及雜質經移除，使得能夠藉由使用以下實施例中之一或多者傳遞解聚組織及培養基來富集細胞懸浮液：
i. 直接穿過具有至少＞0.1 μm至1000 μm，但最佳在50 μm與250 μm之間且更佳為100 μm至200 μm的孔之一或多個機械過濾器(說明於圖2A中)。
ii. 在具有或不具有細胞對準密度滯留溶液(cell aligned density retention solution) (例如Ficoll-paque GE Healthcare)下使用離心及/或沈積的基於密度之分離。
iii. 流體動力學過濾，其中流體流動及流動阻礙材料增強基於大小與形狀的細胞及雜質之解析及分級
iv. 場流分級，其中施加場(例如流、電、重力、離心)在與選擇流垂直或逆向方向上起作用(例如切向流式過濾、中空纖維流式過濾、不對稱流式過濾、離心流式過濾)。在此情況下：對力反應最大之細胞或雜質驅動至壁，在此流動最小且因此滯留時間較長；而對力反應最小之細胞或雜質對於流動保持分層且快速溶離(圖2B及圖2C中所說明之切向流式過濾)。
v. 聲致離子運動(acoustophoresis)，其中與細胞或雜質之群體調諧或調和的一或多個聲頻用於以切線路徑驅動所需細胞或雜質至輸入流。
g) 在一個實施例中，經解聚富集之組織產物將再懸浮於新鮮培養基(圖2A，使用培養基3a)，諸如：
i. 細胞富集培養基，以便進行如先前所描述之獨立的靶向富集程序
ii. 直接細胞培養物或冷儲存培養基(諸如來自BioLife Solutions之HypoThermosol ®。
h) 在g)中採用之實施例中，將再懸浮之解聚固體組織來源產物轉移至實施例最終產物容器(圖3A中所說明)中之一者，以儲存數小時至數天，隨後用於其最終效用。
i) 另外在步驟f)之後，應用實施例(說明於圖3B中)將在以下情況中適用：解聚之固體組織來源產物再懸浮於冷凍保護劑(圖3B，培養基3c)，即用於儲存解聚之固體組織來源產物持續數天至數年的冷凍溶液，諸如來自BioLife Solution之CryoStor ®冷凍溶液。
j) 在此階段，解聚之固體組織來源產物再懸浮於冷凍溶液中(圖4，模組13e)且轉移至一或多個可撓性冷凍保存容器(圖3A中說明，容器12a)中，且在裝置之一個實施例中，存在受控速率冷凍過程(圖4，模組13o)。
k) 其後，袋可與裝置及無菌處理套組分開以用於獨立儲存或分發。
在其他實施例中，本發明之拋棄式套組可與用於組織樣品之半自動無菌處理的自動裝置一起使用。圖6及圖7描繪本發明之拋棄式套組。
圖6描述使用為用於解聚及穩定化之過程的模組之一部分的用於不同起始溶液之多個可撓性容器之半自動無菌組織處理方法。
過程步驟1 - 使用者可登入裝置且使用裝置掃描無菌套組上之標籤以傳送待使用之自動處理步驟。該裝置處理器識別標籤且經提供有進行與特定套組有關之特定處理指令所需的資訊。
過程步驟2 - 含有消化培養基之可撓性袋(解聚模組之一部分)及含有冷凍/穩定化溶液之可撓性袋(穩定化模組之一部分)各自懸掛或緊固至裝置。
過程步驟3 - 供處理之生檢或組織樣品可經由開放末端置於無菌套組之可撓性容器(兩個模組之一部分)中。
過程步驟4 - 可隨後使用熱熔接封閉開放末端(用以在初始處理期間添加樣品)來密封包含樣品之可撓性容器。
過程步驟5 - 使用者隨後可與處理器之使用者介面互動以確認組織樣品存在且在需要時輸入任何其他組織材料特定資訊。
過程步驟6 - 消化培養基及冷凍/穩定化溶液可撓性容器與容納樣品之可撓性容器連接，其後其可置於用於自動處理之裝置中。
過程步驟7 - 裝置根據套組資訊進行循環，執行樣品之解聚及所得細胞之穩定化/冷凍保存。
過程步驟8 - 當穩定化/冷凍時斷開且拋棄使用的套組之培養基及冷凍/穩定化容器。斷開組織在可撓性容器中成為單細胞或多細胞溶液之處理，隨後在其最終利用之前轉移至儲存或運輸容器中。
在另一實施例中，圖7描述包含用於過程之培養基的可撓性容器可在無菌處理套組及方法之模組之間共用。
過程步驟1 - 使用者可登入裝置且使用裝置掃描無菌套組上之標籤以傳送待使用之自動處理步驟。
過程步驟2 - 將包含培養基及冷凍/穩定化溶液兩者之可撓性袋(解聚/穩定化模組之一部分)懸掛或以其他方式緊固至裝置。
過程步驟3 - 供處理之生檢或組織樣品可經由開放末端置於無菌套組之另一可撓性容器(兩個模組之一部分)中。
過程步驟4 - 可隨後使用熱熔接封閉開放末端來密封包含樣品之可撓性容器。
過程步驟5 - 使用者隨後可與處理器之使用者介面互動以
確認組織樣品存在且在需要時輸入任何組織材料特定資訊。
過程步驟6 - 消化培養基及冷凍/穩定化溶液可撓性容器與容納樣品之可撓性容器連接，其後其可置於用於自動處理之裝置中。
過程步驟7 - 裝置循環以使得能夠解聚樣品及穩定化所得細胞，視情況經由冷凍保存。
過程步驟8 - 當冷凍/穩定化完成時，使用者斷開且丟棄套組之所用可撓性容器。斷開在剩餘可撓性容器中處理成單一或多細胞溶液之組織之連接，隨後在其最終利用之前轉移至儲存或運輸容器中。
舉例而言，在本發明方法之另一實施例中，在解聚過程補充有酶消化之情況下，用於酶消化之培養基調配物必須補充有幫助蛋白分解，使得細胞至細胞邊界分解之酶，如上文所描述。
細胞培養或細胞處理技術中已知的各種液體調配物可用作用於固體組織之細胞解聚及酶消化的液體調配物，包括但不限於以下培養基中之一或多者：器官保存溶液、選擇性溶解溶液、PBS、DM EM、HBSS、DPBS、PM I、伊氏培養基、XVIVO™、AIM-V™、乳酸化林格氏溶液、林格氏乙酸鹽溶液、生理鹽水、PLASMALYTE™溶液、晶體溶液及IV流體、膠體溶液及IV流體、5%右旋糖水溶液(D5W)、哈特曼溶液DM EM、HBSS、DPBS、RPMI、AIM-V™、伊氏培養基、XVIVO™，各者可視情況補充有額外細胞支援因子，例如胎牛血清、人類血清或血清替代物或其他養分或細胞介素以幫助細胞恢復及存活或特定細胞耗乏。培養基可為標準細胞培養基，如以上提及之培養基，或用於例如初級人類細胞培養(例如用於內皮細胞、肝細胞或角質細胞)或幹細胞(例如樹突狀細胞成熟、造血擴增、角質細胞、間葉幹細胞或T細胞)之特殊培養基。培養基可具有此項技術中熟知的補充劑或試劑，例如白蛋白及轉運蛋白、胺基酸及維生素、金屬離子、抗生素、連接因子、去連接因子、界面活性劑、生長因子及細胞介素、激素或增溶劑。各種培養基可商購自例如ThermoFisher、Lonza或Sigma-Aldrich或類似培養基製造商及供應商。
酶消化所需之液體調配物必須具有以至少0.1 mM至多50 mM，最佳範圍2至7 mM，理想地5 mM存在的足夠鈣離子。
待消化之固體組織可在解聚之後用含有螯合劑EGTA及EDTA之液體調配物洗滌，以移除黏附因子及抑制性蛋白質，隨後洗滌且移除EDTA及EGTA，隨後酶消化。
酶消化所需之液體調配物更佳具有最少螯合劑EGTA及EDTA，其可藉由移除酶穩定性及活性所需之鈣離子而嚴重抑制酶活性。另外，b-巰基乙醇、半胱胺酸及8-羥基喹啉-5-磺酸酯為其他已知抑制性物質。
如較佳實施例中所描述，用於冷凍保存之最終細胞容器為由彈性可變形材料製成之可撓性容器。在裝置之此實施例中，最終容器直接轉移至冷凍器-20至-190℃或更低，最佳地位於與裝置相關聯或分開供應的受控速率冷凍設備(由例如Planer Products或Asymptote有限公司製造)中，其中用於容納富集解聚之固體組織容器之冷凍腔室及可撓性儲存容器之溫度係藉由以下控制：注入冷氣(通常為氮氣，例如Planer products)；或藉由自受控冷卻表面移除熱。兩種方法使得能夠以小於1℃或更佳0.1℃之誤差精確地基於冷凍溶液及產物之所要存活率控制待冷凍特定細胞所需之速率的冷凍過程。此冷凍保存過程必須考慮冰長晶溫度，其理想地儘可能接近於冷凍溶液之熔融溫度。隨後在水性溶液中晶體生長，水作為冰自系統移除，且殘餘未冷凍溶液之濃度增加。隨著溫度降低，更多冰形成，減少殘餘未冷凍部分，其濃度進一步增加。在水性溶液中，存在較大溫度範圍，其中冰與濃縮之水性溶液共存。最終經由溫度降低，溶液達到玻璃轉移狀態，此時冷凍溶液及細胞自黏稠溶液變為固體樣狀態，低於此溫度細胞不會經歷進一步生物變化且因此在數年，可能數十年內穩定化，直至需要。
藉由本發明方法獲得之解聚細胞產物可根據熟習此項技術者已知之所有方法培養及/或分析(表徵)。
可藉由本文所揭示之方法獲得的TIL可用於後續步驟，諸如熟習此項技術者已知的研究、診斷、組織庫、生物庫、藥理學或臨床應用。TIL隨後可使用針對本申請案經最佳化之培養基進行培養，例如通常含有但不限於生長因子(諸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)或刺激條件之T細胞混合培養基(Cellular Therapeutics)，諸如塗佈有抗體之盤或聚苯乙烯珠粒。在本發明中，將經分離細胞接種至培養容器中且使用熟習此項技術者標準化使用之程序維持，諸如潮濕氛圍(1%至20%通常5% CO 2，80%至99%通常95%空氣)，溫度在1至40℃之間，通常37℃，持續數週，且可添加補充劑，補充有10% FBS及3000 IU/mL IL-2。
經富集之TIL可在細胞培養之前及/或之後用作療法，例如細胞療法或疾病之預防中之醫藥組合物。醫藥組合物可用於治療及/或預防哺乳動物、尤其人類之疾病，可能包括向哺乳動物投與醫藥學上有效量之醫藥組合物。
除調配為用於治療各種癌症之藥物產品以外，此類TIL培養物亦可用於研究例如細胞功能、腫瘤細胞殺滅、細胞信號傳導、生物標記、細胞路徑、核酸及可用於鑑別供體、組織、細胞或核酸狀態之其他細胞或組織相關因子。
疾病可為任何疾病，其可經由固體組織來源之細胞之存在及/或經由增加相關細胞在相關位置(亦即腫瘤或疾病部位)中/處之濃度來治療及/或預防。所治療及/或預防性地治療之疾病可為任何病症，例如癌症或退化性病症。治療可為經富集、工程改造或擴增之細胞或此等細胞之任何組合的移植，及投與至身體相關部分或全身供應。
本發明之醫藥組合物可以適合於待治療(或預防)之疾病的方式投與。投與之數量及頻率將由諸如患者之狀況以及患者疾病之類型及嚴重程度之因素來決定，儘管適當劑量可藉由臨床試驗來確定。
如本文所描述，本發明提供一種套組，其允許接收、處理、儲存及/或分離諸如組織、尤其哺乳動物組織之材料。此外，本發明提供套組之組件，諸如可撓性容器，例如袋、過濾器、閥、支架、夾具、連接器及/或管道，諸如導管。詳言之，袋可耦接於導管之一或多個管或區段，其經調適以使得組織材料能夠在冷凍保存套組之各種組件之間流動。
使用冷凍保存套組及/或收集袋的組織處理為細胞可包括自動化及/或半自動化裝置及方法。
此外，藉由利用本文所述之袋、套組、裝置及過程，結合此項技術中一般的技能，可容易地鑑別本發明之其他實施例。熟習此項技術者將容易地理解已知變化形式。
設計專利申請案序列號29/740,293提供適用於組織收集之組織收集袋。本發明之組織收集袋之頂部為開放的，用於接收組織，例如組織生檢，諸如動物(例如家畜，諸如狗或貓)或人類癌組織。組織收集袋應與其中所收集之組織一起密封，且對於如此密封其中以在其中處理之組織，例如處理可包括攪拌及/或壓縮，例如平緩攪拌及/或壓縮，及/或酶消化其中組織。有利地，其中的組織處理及所要材料(諸如腫瘤浸潤淋巴球(TIL))之提取可在封閉系統中。有利或較佳實施例可包括指示收集組織所來自之患者的標誌及/或展示在儀器中收集袋可夾持或貼附固定以施加攪拌之位置的標誌及/或展示收集袋可例如藉由熱密封(其可為用於處理之儀器之一部分)密封之位置的標誌。有利地，在施加處理之前，將收集袋夾持或貼附至儀器中以供處理及/或密封，例如熱密封。在某些說明中，導管可用虛線或網點展示以展示導管未必被視為本發明設計之一部分；但在某些實施例中可視為本發明設計之一部分。虛線或網點應解釋為導管可存在或不存在且可主張為任一者或兩者，亦即，在整個圖式中，導管可形成本發明設計之一部分(且亦可未必為本發明設計之一部分)。另外，儘管某些說明未展示標誌，可指示獲得樣品之患者的標誌，可指示獲得樣品之患者及組織收集袋可夾持或貼附於儀器中之位置的標誌，及可指示獲得樣品之患者及組織收集袋可夾持或貼附於儀器中之位置及組織收集袋可密封，例如熱密封之位置的標誌，應理解，本發明設計可包括其變化形式，例如本發明設計可包括可指示獲得樣品之患者及組織收集袋可熱密封之位置的標誌而無展示組織收集袋可夾持或貼附於儀器中之位置的標誌；且本發明設計可包括可指示組織收集袋可熱密封之位置的標誌及/或展示組織收集袋可夾持或貼附於儀器中之位置的標誌而無指示獲得樣品之患者的標誌(包括患者標誌可在正使用時壓印於組織收集袋上，而關於夾持或貼附或熱密封之標誌在使用之前可已在組織收集袋上)。包括任何相關聯導管之組織收集袋一般可為澄清或透明或半透明或任何所要顏色。包括任何相關聯導管之組織收集袋通常可以類似於以下之製造的方式製造：封閉或密封、血液收集、組織培養、生物處理或冷凍保存袋及相關聯導管。本發明中之相關聯導管可自任何所要材料與聚氯乙烯(PVC)或包括PVC之材料作為所要材料構築因為其有利於熔接及/或密封。用於接收組織的本發明之組織收集袋之部分可自任何所要材料與乙烯乙酸乙烯酯(EVA)或包括EVA之材料作為所要材料製成因為其有利於熱密封。
如圖11A中所示，用於處理組織，例如組織之解聚、富集及/或穩定化之套組2的實施例。待處理之組織可包括固體真核生物，尤其哺乳動物組織，諸如來自樣品及/或生檢之組織。套組2包括諸如袋4、6之組件，諸如收集袋4及冷凍保存袋6。如圖11A-圖11D中所描繪之套組可用於自動或半自動裝置以用於處理。
在一些實施例中，套組組件可包括指示符，諸如代碼、字母、字組、名稱、文數碼、數字、影像、條碼、快速回應(QR)碼、追蹤器(諸如智慧型追蹤器及/或藍芽追蹤器)、標籤(諸如射頻標籤及/或其他數位可識別之鑑別標籤)，使得其可在自動化及/或半自動化處理期間，諸如在本發明之實施例中在自動化裝置內被掃描及識別。舉例而言，標籤可提供關於需要自動處理之條件及/或步驟之資訊。舉例而言，掃描諸如袋之套組組件可允許與套組一起使用之自動化系統處理組織而無進一步干預及/或污染。特定言之，已將組織樣品置放於收集袋中以供在裝置之解聚元件中處理。收集袋可在處理開始之前密封。在一些實施例中，收集袋可在處理開始之前使用能量，諸如熱、射頻能量、高頻(HF)能量、介電質能量及/或此項技術中已知之任何其他方法人工及/或自動密封。
在一些實施例中，具有加熱棒的熱封機(例如，Van der Staehl MS-350，Uline H-190 Impulse密封機或此項技術中已知之類似密封機)，加熱棒可用以在袋上產生密封口。
在一特定實施例中，當使用熱封機時，在低於約100℃之溫度下且在約0.8巴至約2.8巴之範圍內的壓力下形成密封可為有利的。此高溫及壓力可施加約八秒，其後溫度可降低，但在一些實施例中，壓力持續施加約2至3秒。溫度、壓力及時間之值將基於形成袋之材料的配方且尤其形成密封口之材料而變化。舉例而言，另一材料可能需要密封機達到高於約210℉ (98.9℃)之溫度最少約3秒，之後可在移除加熱棒之前使加熱棒冷卻5秒。
待密封之材料的定位對於所形成密封之強度可為關鍵的。舉例而言，待密封材料中之不完全密封、褶皺、通道及/或間隙可降低密封之強度。
可使用密封剝離測試(亦即ASTM F88/F88M)及/或爆發測試(亦即ASTM F1140/F1140M或ASTM F2051/F2054M)來測試密封的強度。
在一些實施例中，袋或可撓性容器當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時可在使用期間耐受100牛頓之力。袋或可撓性容器實施例可經構築以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受75牛頓之力。
如圖11A中所示，套組2包括其中可處理收集袋5之解聚元件4、其中可定位有過濾器9之富集元件8及其中使用冷凍保存袋7以保存所要材料之穩定化元件6。在套組2之組件，諸如收集袋5中，處理組織。舉例而言，收集袋5可用於來源於真核細胞之固體組織的解聚。組織可以使得大部分所得組織在處理之後可為單個細胞及/或小細胞數目聚集體的方式處理。另外，特定言之，處理可在套組及/或尤其收集袋中進行。
經處理組織之富集可在過濾器9中之富集元件8處進行。過濾器9可經選擇以使得進入導管11之經過濾組合物(亦即，所要材料)可具有大小預定之組分。過濾器9可經選擇以使得進入導管11之所要材料組合物可具有諸如平均大小小於約200 µm之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的組分。特定言之，在一實施例中，所要材料可包括平均大小小於約170 µm的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
在一些實施例中，所要材料可包括介於約15 µm至約500 µm之範圍內的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。舉例而言，在一實施例中，過濾器9可經組態以使得進入導管11之組織組合物具有平均大小小於約200 µm之組分。特定言之，在過濾之後離開過濾器及進入導管11之所要材料可具有平均大小小於約170 µm之組分。
在一些實施例中，過濾器9經組態以使得進入導管11之經過濾組合物具有大小在約50 µm至約300 µm範圍內之組分。舉例而言，在一實施例中，過濾器9可經組態以使得進入導管11之組織組合物具有平均大小在約150 µm至約200 µm範圍內的組分。
如圖11A中所示，用於處理組織之系統的穩定化元件6中冷凍保存袋7可用於穩定化組織組合物以用於儲存及/或運輸。
圖11B描繪具有閥12、13之套組2。閥可為無針閥。閥12、13可用於提供酶培養基，諸如腫瘤消化培養基、冷凍保護劑及/或冷凍保存培養基。特定言之，閥12可用於向導管10提供酶培養基。酶培養基可移動至收集袋4以輔助處理置放於袋5中之組織。
閥13可用於向導管11提供諸如DMSO溶液之冷凍保護劑，以使得DMSO溶液可移動至冷凍保存袋7。在一些實施例中，諸如DMSO溶液之冷凍保護劑可與進入導管11之經過濾材料混合，使得DMSO溶液與經過濾材料之組合組合物進入冷凍保存袋7。進入導管11之經過濾材料可包括諸如具有預定平均大小之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的組分。舉例而言，在一些實施例中，經過濾組合物中之組分之平均大小可小於約200 µm。
在一些實施例中，如圖11C中所展示，套組2包括過濾器9周圍之夾具14以確保阻止及/或防止經由閥12、13提供之材料流入過濾器9中。閥13可用於向導管11提供冷凍保護劑以使得冷凍保護劑可與自過濾器9進入導管11之經過濾材料混合。舉例而言，夾具14可經定位以阻止及/或防止冷凍保護劑在過濾器9之方向上流動。在一些實施例中，在經過濾溶液開始自過濾器9流動之後，將釋放夾具14以使得冷凍保護劑與經過濾材料之組合組合物在穩定化元件6處進入冷凍保存袋7。進入導管11之經過濾材料可包括諸如具有預定平均大小之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的組分。舉例而言，在一些實施例中，經過濾組合物中之組分之平均大小可小於約200 µm。
套組2之實施例可包括如圖11D中所示之冷凍保存袋7上之端口16。可使用端口添加及/或自冷凍保存袋7移除材料。舉例而言，可自冷凍保存袋移除測試樣品。
圖12A展示用於套組之袋22之實施例的透視圖。袋22可包括連接器24、開放區段26、密封區段21以及定位器23。連接器24可用於將袋22耦接於導管25。定位器23可為袋22中之開口。
袋(諸如收集袋及/或冷凍保存袋)及任何相關聯導管可為大體上澄清、透明、半透明、任何所要顏色或其組合。袋(例如收集袋及/或冷凍保存袋)及/或導管通常可以類似於封閉及/或密封血液及/或冷凍保存袋及相關聯導管之製造的方式製造。
用於本文中所描述之本發明之袋包括收集袋及冷凍保存袋，可包括由預定材料製成之至少一部分，該預定材料諸如熱塑性、聚烯烴聚合物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、摻合物(諸如共聚物，例如乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物(亦即，OriGen Biomedical EVO膜))、包括EVA之材料及/或可密封塑膠之共擠層。
可針對特定特性及/或一系列特性選擇供用於袋之材料，例如密封性(諸如歸因於熱熔接或使用射頻能量之密封性)、透氣性、可撓性(例如低溫可撓性(例如在-150℃或-195℃下))、彈性(例如低溫彈性)、耐化學性、光學透明度、生物相容性(諸如細胞毒性)、溶血性活性、抗浸出性、具有低微粒、針對特定氣體(例如氧氣及/或二氧化碳)之高傳輸速率及/或遵從管理要求。舉例而言，當根據ASTM D-638中所概述之拉伸強度測試方法測試時，用於袋之材料可經選擇具有大於約2500 psi (172巴)之拉伸強度。特定言之，當根據ASTM D-638中所概述之拉伸強度測試方法測試時，可撓性容器(諸如袋)之實施例使用具有大於約2800 psi (193巴)之拉伸強度的材料。
在一些實施例中，可針對用於形成袋之至少一個層的共擠材料之特定特性選擇材料。層可經構築以使得當構築時，袋之內部層為相對生物相容的，亦即袋之內表面上的材料為穩定的且不浸濾至袋之內容物中。
舉例而言，可用以選擇用於諸如收集袋、冷凍保存袋及/或相關聯導管之套組組件的材料之相關特性可關於密封，例如熱密封。
可使用密封剝離測試(亦即ASTM F88/F88M)及/或爆發測試(亦即ASTM F1140/F1140M或ASTM F2051/F2054M)來測試密封的強度。
在一些實施例中，袋或可撓性容器當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時可在使用期間耐受100牛頓之力。袋或可撓性容器實施例可經構築以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受75牛頓之力。
袋，尤其收集袋及/或保存袋尺寸，可對用於進行處理及/或加工之裝置具有特異性。袋大小應基於用於進行處理之裝置的組態及/或大小進行調整。應特別注意延伸超過袋之邊界的任何組件(例如端口、連接器或其類似物)之置放及/或大小。諸如端口之組件可干擾用於進行處理及/或加工之裝置之操作。此外，應注意確保袋之厚度與機器之要求一致，尤其關於諸如所製造密封口之密封材料。
本發明中之導管可由任何所要材料構築，包括但不限於聚氯乙烯(PVC)。舉例而言，PVC可為所要材料，因為PVC有利於熔接及/或密封。
在一些實施例中，如圖12A-圖12E、圖13A-圖13E、圖14、圖20A-圖20E、圖21A-圖21E、圖22A-圖22D、圖27A、圖28、圖33及圖34中所描繪，收集袋之至少一個末端可以打開用於接收組織。特定言之，在一實施例中，例如來自生檢之組織樣品可經由開放末端(例如頂部末端)置於袋中。在一些情況下，生檢樣品可為來自動物(例如，家畜，諸如狗或貓)或人類的癌組織。
如圖12A中所示，袋22可用作組織收集袋。舉例而言，在組織定位於袋中之後，袋可經密封，且隨後可經處理。處理可包括組織在袋中攪拌，例如平緩攪拌、提取及/或酶消化。組織處理及自其提取所要材料(諸如腫瘤浸潤淋巴球(TIL))可在封閉系統中。有利或較佳實施例可包括指示收集組織所來自之患者的指示符及/或展示在儀器中收集袋可夾持、密封、受裝置作用及/或貼附固定位置的標記。
在一些實施例中，袋22可由可密封材料形成。舉例而言，袋22可由包括但不限於聚合物之材料形成，該等聚合物諸如包括脂族或半芳族聚醯胺(例如，耐綸)、乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)及其摻合物、乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物、熱塑性聚胺甲酸酯(TPU)、聚乙烯(PE)及/或聚合物組合之合成聚合物。袋之部分可使用能量，諸如熱、射頻能量、高頻(HF)能量、介電質能量及/或此項技術中已知之任何其他方法密封及/或熔接。
收集袋可用作處理及/或解聚袋。收集袋可具有在約4 cm至約12 cm範圍內之寬度及在約10 cm至約30 cm範圍內之寬度。
舉例而言，用於處理之收集袋可具有約7.8 cm之寬度及約20 cm之長度。特定言之，袋可為可熱密封的，例如使用EVA聚合物及其摻合物、乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物及/或一或多種聚醯胺(耐綸)。
如圖12A中所描繪，袋22可用作用於密封其中組織以供用於本發明之處理的組織收集袋。
圖12B展示用作組織收集袋之袋22之實施例的透視圖。組織可密封於袋中且隨後進行處理。如圖12B中所示之袋22可用指示符27、28標記，諸如可鑑別已獲取或獲得組織樣品或生檢之患者的患者識別符。
指示符可包括但不限於代碼、字母、字組、名稱、文數碼、數字、影像、條碼、快速回應(QR)碼、標籤、追蹤器(諸如智慧型追蹤器標籤或藍芽追蹤器)及/或此項技術中已知之任何指示符。在一些實施例中，指示符可印刷於、蝕刻於及/或黏附於套組之組件之表面上。舉例而言，指示符可直接印刷於套組之至少一個組件的表面上，如圖12B中所示。指示符亦可使用黏著劑定位於袋上，例如，貼紙或追蹤器可置放於一個袋上及/或多個袋上。舉例而言，如圖12B所展示，袋22包括多個指示符28 (數字碼)、27 (QR碼)。
圖12C展示用作組織收集袋之袋之透視圖。組織可插入至袋22中以供處理。指示符可用於鑑別已獲取或獲得組織樣品及/或生檢之患者。如圖12C中所展示，指示符27、28包括用於追蹤樣品、定位樣品及/或追蹤在過程中樣品之狀態的QR碼及鑑別數字。舉例而言，在一些實施例中，指示符可用於定位實驗室中任何給定位置之樣品。指示符可在使用之前及/或期間置於袋上，例如，在袋被取出以供與樣品一起使用時，患者指示符可壓印至袋上。此外，袋22可包括標記29。標記可用以展示應在何處定位密封、夾具及/或儀器。
指示符(例如QR碼、諸如智慧型標籤之標籤及/或追蹤器)可用於鑑別袋內之樣品以及發指令給裝置之處理器，以使得裝置根據在冷凍保存套組中進行之解聚、富集及/或穩定化過程類型運行特定程式。不同類型之培養基可用於此等過程中，例如可允許受控冷凍速率之酶培養基、腫瘤消化培養基及/或冷凍保存培養基。在一些實施例中，冷凍保存套組及/或其組件可包括可由自動化裝置讀取之指示符。裝置隨後可執行用於在插入至此類裝置時處理組織的特定全自動方法。本發明特別適用於樣品處理，特別是自動化處理。
在一些情況下，本文所述之冷凍保存套組及/或其組件可為單次使用的。冷凍保存套組及/或其組件可用於自動化及/或半自動化過程中以用於細胞或細胞聚集體之解聚、富集及/或穩定化。在一些實施例中，在一些實施例中，諸如收集袋之用於冷凍保存套組中之袋可用於多個過程。舉例而言，收集袋可在不同位置重複密封以產生用於處理組織樣品(諸如生檢樣品及/或固體組織)之單獨區室。
另外，標記可置放於袋，諸如組織收集袋上之各種位置處以指示袋可密封、夾持及/或貼附至物件之位置。在一些實施例中，展示袋可夾持、密封及/或貼附至物件(諸如儀器)之位置的標記可在使用之前安置於袋上。舉例而言，一或多個標記可在製造期間定位於袋上。
密封口可用能量(例如熱)在使用期間形成以產生熔接區。在使用期間形成之密封口可具有在約2.5 mm至約7.5 mm範圍內之寬度。一般而言，在將組織材料置放於袋140中之後形成密封口140且可具有約5 mm之寬度。
可使用密封剝離測試(亦即ASTM F88/F88M)及/或爆發測試(亦即ASTM F1140/F1140M或ASTM F2051/F2054M)來測試密封的強度。
在一些實施例中，袋或可撓性容器當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時可在使用期間耐受100牛頓之力。袋或可撓性容器實施例可經構築以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受75牛頓之力。
當在可撓性容器(諸如袋，例如收集袋及/或冷凍保存袋)上形成密封口或熔接口時，密封裝置可用於視用於袋之材料而定在預定溫度、壓力及時間量下施加熱及/或壓力。舉例而言，一些熱封機可能需要施加熱及壓力約八秒。在8秒之後，可關斷裝置之熱，然而，可施加壓力額外2至3秒。
圖12D展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的組織收集袋之實施例的透視圖。指示符27、28定位於袋22上，使得使用者可在使用期間容易地鑑別患者。此外，此等指示符可用於鑑別袋中之材料以及追蹤袋中之材料之特定處理方法期間的進展。在一些實施例中，袋在處理期間在袋中容納約0.1 ml至約25 ml範圍內之培養基體積及約0.1 ml至約10 ml範圍內之組織體積。在處理期間袋中培養基體積與組織體積之比率應在約1.0至約2.5範圍內。在一些實施例中，培養基體積與組織體積之比率在約1.7至約2.3範圍內。特定言之，培養基體積與組織體積之比率在約2.0至約2.2範圍內。
如圖12D中所示，標記29接近袋22之開放末端26定位。在使用期間，標記29可基於用於處理組織樣品及/或生檢樣品之方法安置於袋上。在使用期間，例如基於正使用或待使用之處理方法及/或待使用之設備，可將標記置放於袋上。在一些實施例中，可在製造期間將標記定位於袋上。舉例而言，關於密封及/或夾持位置之標記定位可基於處理方法及/或待處理組織之體積而變化。
圖12E展示組織收集袋之透視圖。組織可密封於袋22中處理。連接器24可提供對袋之進出口。如所展示，連接器24可使用導管25連接至其他裝置，諸如過濾器、袋等。端口20可用於在使用期間自袋22獲取樣品及/或提供來自袋22之材料。
圖13A展示用於組織收集之袋的正視圖。組織可在使用期間密封在袋內。袋30可製造成具有密封邊緣31。如圖13A中所展示，密封邊緣31可位於三個邊緣上，且第四邊緣可包括開放區段36。
袋30上之定位器33可用於定位袋。舉例而言，一或多個定位器可用以確保袋在使用期間可適當地處理，例如接近於儀器定位。在一些系統中，定位器可有助於本文中所描述之袋在自動化系統中之使用。特定言之，定位器可用於使袋移動穿過自動化系統。
如圖13B中所示，袋30可具有用於鑑別樣品之指示符36、37，例如鑑別已獲取或獲得組織樣品或生檢之患者的指示符。使用諸如QR碼之指示符37可允許追蹤特定樣品之過程步驟，使得有可能在給定過程中跟蹤樣品。
圖13C展示組織收集袋之正視圖。組織可密封在袋內且在其中加以處理及/或加工。袋30可具有用於鑑別樣品之指示符37、38，例如鑑別已獲取或獲得組織樣品或生檢之患者的指示符。使用諸如QR碼之指示符37可允許追蹤特定樣品之過程步驟，使得有可能在給定過程中跟蹤樣品。定位器33可用於定位袋30以供處理。連接器34可允許組織、經處理組織等經由導管35耦接於其他裝置。
圖13D描繪具有用以鑑別樣品之指示符37、38的組織收集袋之正視圖。使用諸如QR碼之指示符37可允許追蹤特定樣品之過程步驟，使得有可能在給定過程中跟蹤樣品。標記39及/或定位器33可用於在加工及/或處理期間控制袋之定位。接近於開放末端置放標記以指示在使用期間將袋定位、密封及/或夾持於何處。袋30可製造成具有密封邊緣31。如圖13D中所展示，密封邊緣31可位於三個邊緣上，且第四邊緣可包括開放區段36。
圖13E展示在組織置放於其中之後能夠密封的組織收集袋之正視圖。連接器34及端口32可提供對袋之進出口。一或多個端口可定位於收集袋上，使得端口允許輸入培養基及/或試劑及/或自袋提取樣品。
如所展示，連接器34可使用導管35耦接於諸如過濾器、袋等之其他裝置。視用途而定，可將標記及指示符置放於袋之一或多個側面。特定言之，如圖13E所示，定位器33、標記39及/或指示符37、38可用於定位袋30以供處理，諸如施加攪拌、例如藉由熱密封(其可為用於處理之儀器之一部分)密封、添加材料以供處理及/或提取。有利地，在施加處理之前，將收集袋夾持或貼附至儀器中以供處理及/或密封，例如熱密封。
圖14展示用於組織收集之袋的後視圖。特定言之，袋40能夠在組織安置於其中之情況下密封且加以處理。密封口可接近於開放末端46且實質上平行於其而定位。如所展示，連接器44可使用導管46連接至其他裝置，諸如過濾器、袋等。袋40可製造成具有密封邊緣41。如圖14中所展示，密封邊緣41可位於三個邊緣上，且第四邊緣可包括開放區段46。定位器43可由所製造密封邊緣41圍繞。
圖15描繪能夠在其中密封組織且允許在使用袋期間處理組織的用於組織收集之袋50之側視圖。袋50可藉由連接器52耦接於導管54。
圖16A展示未密封組織收集袋之俯視圖。袋60可包括密封部分66及開放部分64。連接器62經由袋60可見。在將組織置放於袋60之頂部的袋開放部分中之後，袋可密封。
圖16B展示具有用於密封其中組織以供處理的密封邊緣66之組織收集袋60之底視圖。連接器62在袋60上可見。
圖17A展示部分開放之袋之俯視圖。袋70可包括密封部分76及開放部分74。連接器72經由袋70可見。在將組織置放於袋70之頂部的袋開放部分中之後，袋可密封。
圖17B展示用於密封其中組織以供處理之組織收集袋之底視圖。連接器72在袋70上可見。
圖18A描繪部分開放之袋的俯視圖。組織可經由袋80之開放末端84插入。連接器82展示安置於袋80之底部。
圖18B展示用於收集及/或處理組織之完全開放袋之俯視圖。袋80之開放末端84可接收用於加工(諸如處理、分離及/或分開)之組織。可在製造期間產生密封邊緣86。
圖19A描繪在袋側面上具有密封邊緣96之部分開放之袋90的俯視圖。如所示，組織可經由袋90之開放末端94插入。連接器92展示安置於袋90之底部。
圖19B展示在袋側面上具有密封邊緣96之用於收集及/或處理組織的完全開放袋之俯視圖。袋90之開放末端94可接收用於加工(諸如處理、分離及/或分開)之組織。連接器92展示安置於袋94之底部。
圖20A-圖20E展示組織收集袋之實施例之正視圖。如圖20A中所展示，具有密封邊緣101及開放末端102之袋100可經由導管105及/或連接器104連接至裝置(未描繪)。舉例而言，連接器104安置於袋100中，而y型連接器106可沿著導管安置。圖20B展示包括指示符107、108以使得使用者可以鑑別已獲取或獲得組織樣品或生檢之患者之袋100的另一實施例。
另外，包括標記109及指示符107、108之袋100之實施例描繪於圖20C中。定位器103之使用可允許袋的恆定定位，其允許袋內之組織之恆定處理。指示符107、108以樣品及/或患者資訊鑑別樣品。在一些情況下，指示符可用於鑑別及/或追蹤樣品，諸如組織樣品及/或生檢樣品。圖20D描繪具有多個指示符107、108及標記109之袋100。標記可展示袋100應密封之位置。舉例而言，標記109可指示袋100應密封、夾持及/或耦接於另一裝置之位置。密封之標記可接近於袋之開放邊緣而定位，例如，此類標記可距開放邊緣預定距離而定位。在一些實施例中，密封的標記可實質上平行於開放邊緣。 如所展示，袋100可包括連接器104及導管105。
在一實施例中，如圖20E中所示，袋100包括端口110及連接器104。端口可允許材料之添加及/或材料自樣品之移除。舉例而言，在組織處理期間，可在整個處理中多次獲取樣品。另外，端口110可允許培養基及/或試劑無菌輸入至袋100中。
圖21A展示用於收集及/或處理組織之袋100的正視圖。組織可經由開放末端102置放於袋100中。連接器104可用於將袋100與導管105及夾具112耦接。
圖21B-圖21E展示袋100之額外實施例的正視圖。圖21B-圖11D展示包括指示符107、108及/或標記109之各種組態。袋可包括指示符，諸如代碼、字母、字組、名稱、文數碼、數字、影像、條碼、快速回應(QR)碼、標籤、追蹤器(諸如智慧型追蹤器標籤或藍芽追蹤器)及/或此項技術中已知之任何指示符。在一些實施例中，指示符可印刷於、蝕刻於及/或黏附於套組之組件之表面上。指示符亦可使用黏著劑定位於袋上，例如，貼紙或追蹤器可置放於一個袋上及/或多個袋上。收集袋及/或冷凍保存套組可包括多個指示符，諸如數字碼及/或QR碼。
指示符(例如QR碼、諸如智慧型標籤之標籤及/或追蹤器)可用於鑑別袋內之樣品以及發指令給裝置之處理器，以使得裝置根據在冷凍保存套組中進行之解聚、富集及/或穩定化過程類型運行特定程式。
圖21E描繪用於收集、加工、處理及/或分離材料之袋100之另一實施例的正視圖。待處理之組織可密封在袋100內。導管105可經由連接器104將袋100耦接於夾具112。端口114可允許輸入及/或自袋100移除。舉例而言，端口可允許取樣及/或允許將培養基及/或試劑無菌輸入至可撓性容器(諸如冷凍保存套組之袋)中。
圖22A展示具有密封邊緣121用於密封其中組織以供處理之組織收集袋120之另一實施例的正視圖。袋120包括耦接於導管125之定位器123及連接器124。
圖22B展示具有密封邊緣121及開放末端122之組織收集袋120的正視圖。指示符127、128可定位於袋120上以使得其可容易地由自動化系統獲取。界定定位器123之開口可由密封邊緣121環繞。指示符可以用於鑑別已獲得或獲得組織樣品或生檢的患者。
如圖22C中所示，袋120包括指示符127、128及標記129。圖22D描繪具有多個標記129之收集袋120。密封的標記可接近於袋的開放邊緣而定位。此類標記可距開放邊緣預定距離而定位。在一些實施例中，密封的標記可實質上平行於開放邊緣。
圖23描繪經安置以使得在頁面之頂部處展示袋130之底部的密封袋130之正視圖，其中導管135自連接器134延伸出來。袋130包括袋130之密封部分131上之指示符137。可在袋130之密封期間及/或之後安置密封部分上之指示符。一般而言，袋在提供組織之後密封。袋130之表面上的指示符138可為條碼。定位器133可接近於連接器134定位。
袋(諸如收集袋及/或冷凍保存袋)及任何相關聯導管可為大體上澄清、透明、半透明、任何所要顏色或其組合。組織收集袋及/或導管通常可以類似於封閉及/或密封血液及/或冷凍保存袋及相關聯導管之製造的方式製造。本發明中之導管可由任何所要材料構築，包括但不限於聚氯乙烯(PVC)。舉例而言，PVC可為所要材料，因為PVC有利於熔接及/或密封。
收集袋，諸如本發明之組織收集袋可包括由預定材料製成之用於接收組織之袋的至少一部分，該預定材料諸如聚烯烴聚合物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、共聚物(諸如乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物(亦即OriGen Biomedical EVO膜))及/或包括EVA之材料。可針對特定特性及/或一系列特性選擇供用於袋之材料，例如密封性(諸如熱密封性)、透氣性、可撓性(例如低溫可撓性)、彈性(例如低溫彈性)、耐化學性、光學透明度、生物相容性(諸如細胞毒性)、溶血性活性、抗浸出性、具有低微粒。
如圖24中所示，袋140可包括多個標記141、142，該等標記經置放以使得若包括標記之區域經密封，則區室143可形成於袋140中。袋140具有在袋製造期間形成之預熔接區段145，其可用於在使用期間形成樣品之區室。圖24描繪能夠形成以使得其具有多個區室之收集袋之實施例。各區室可藉由置放多個密封口及/或熔接口(例如熱密封)形成於袋中。舉例而言，在將腫瘤懸浮液置放於收集袋中之後，使用諸如熱量之能量，可熔接封閉開放末端，且可熔接諸如熔接線142之額外標記141以形成區室。
袋140上之定位器143確保袋相對於儀器(諸如密封裝置，如RF熱封機及/或注射器)恰當地定位。
密封口可用能量(例如熱)在使用期間形成以產生熔接區。在使用期間形成之密封口可具有在約2.5 mm至約7.5 mm範圍內之寬度。一般而言，在將組織材料置放於袋140中之後形成密封口140且可具有約5 mm之寬度。
可使用密封剝離測試(亦即ASTM F88/F88M)及/或爆發測試(亦即ASTM F1140/F1140M或ASTM F2051/F2054M)來測試密封的強度。
在一些實施例中，袋或可撓性容器當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時可在使用期間耐受100牛頓之力。袋或可撓性容器實施例可經構築以當適當密封且當定位於用於處理及/或加工之裝置內時進一步用夾具緊固時在使用期間耐受75牛頓之力。
當在可撓性容器(諸如袋，例如收集袋及/或冷凍保存袋)上形成密封口或熔接口時，密封裝置可用於視用於袋之材料而定在預定溫度、壓力及時間量下施加熱及/或壓力。舉例而言，一些熱封機可能需要施加熱及壓力約八秒。在8秒之後，可關斷裝置之熱，然而，可施加壓力額外2至3秒。
在一些系統中，定位器可有助於本文中所描述之袋在自動化系統中之使用。因此，已置放於袋140中之組織可分成單獨的區室144、146、147。如所示，各區室144、146、147分別包括端口148、149、150。各端口可允許直接進入區室。此可允許個別化添加、儲備及/或測試樣品。舉例而言，密封收集袋可有助於針對複雜樣品之適合性及/或微生物特性對TIL進行儲備及測試。因為此類型之測試可能需要將消化材料之較小等分試樣冷凍在收集袋中，使得可分開解凍消化材料之較小等分試樣。在一些實施例中，如圖24中所描繪之袋140可用作收集袋及/或冷凍保存袋。
圖25展示收集袋之實施例之正視圖。在此實施例中，收集袋152之長度為約150 mm (亦即15 cm)且寬度為約90 mm (亦即9 cm)。袋152包括充當定位器160之開口。一或多個定位器可用於控制袋之定向以確保袋經恰當地定位以供在使用期間進行加工及/或處理，例如接近於儀器定位。在一些系統中，定位器可有助於本文中所描述之袋在自動化系統中之使用。特定言之，定位器可用於使袋移動穿過自動化系統。密封口156為約5 mm。密封口可使用能量(例如熱)在使用期間形成以產生熔接區。密封口可具有在約2.5 mm至約7.5 mm範圍內之寬度。一般而言，在將組織材料置放於袋152中之後形成密封口156。如圖25中所示，袋152具有在袋製造期間形成之預熔接區段158。
如圖26中所示，收集袋可耦接於導管及閥。在一些實施例中，袋可具有在約10 cm至約50 cm範圍內之長度。特定言之，用於本文所述之本發明的袋可具有在約15 cm至約30 cm範圍內之長度。舉例而言，袋可具有在約18 cm至約22 cm範圍內之長度。如圖26中所示之袋162具有約20 cm之長度。如本文所描述使用之收集袋可具有在約6.8 cm至約8.8 cm範圍內之寬度。如圖26中所示，收集袋162之寬度為約7.8 cm。可在沿著導管之位置處使用包括但不限於無針閥之閥。舉例而言，無針閥164距藉由導管166耦接之袋162大約20 cm定位。在添加另一元件或組件之前，導管166自無針閥164延伸至少10 cm。
如圖27A中所描繪，開放袋170在使用之前耦接於導管172、174、176。袋170可由可密封材料構築。特定言之，袋可使用熱封機(諸如，台式熱密封裝置)密封。導管中之一些，例如導管174可為非可熔接的。可在沿著導管之位置處使用包括但不限於無針閥之閥。舉例而言，無針閥178定位於導管174、176之末端處。
在一些實施例中，袋可具有在約10 cm至約50 cm範圍內之長度。特定言之，用於本文所述之本發明的袋可具有在約15 cm至約30 cm範圍內之長度。舉例而言，袋可具有在約18 cm至約22 cm範圍內之長度。如圖27A中所示之袋170具有約20 cm之長度。
圖27B展示例如在材料沈積於袋內之後已經密封之收集袋之實施例的正視圖。袋180由可密封材料構築。特定言之，袋可使用熱封機(諸如，台式熱密封裝置)密封。密封口可接近於袋之開放邊緣而定位，在一些情況下，標記可距開放邊緣預定距離而定位。在一些實施例中，密封口可實質上平行於開放邊緣。
導管中之一些，例如導管182、184、186可為可熔接的。可熔接導管可由例如聚氯乙烯(PVC)之聚合物材料製成。
可在沿著導管之位置處使用包括但不限於無針閥之閥。舉例而言，無針閥188定位於導管184、186之末端處。在一些實施例中，袋可具有在約10 cm至約40 cm範圍內之長度。特定言之，用於本文所述之本發明的袋可具有在約15 cm至約30 cm範圍內之長度。舉例而言，袋可具有在約18 cm至約22 cm範圍內之長度。如圖27A中所示之袋180具有約20 cm之長度。
如圖28中所示，冷凍保存套組之實施例展示為面朝上且包括開放袋190及冷凍保存袋192。如所示，冷凍保存袋192可包括指示符193、194。冷凍保存袋可能需要適合於使用諸如二甲亞碸(「DMSO」)之冷凍保護劑的冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存袋可經構築以使得袋可容納在約5 ml至約45 ml範圍內之材料體積。詳言之，冷凍保存袋可包括容納在約10 ml至約35 ml範圍內之材料體積。舉例而言，一些實施例包括可容納在約15 ml至約30 ml範圍內之待儲存材料體積的冷凍保存袋。冷凍保存袋192可具有使得達成所要預定體積的大小。在一些實施例中，冷凍保存袋可具有在約4 cm至約11 cm範圍內之寬度及在約10 cm至約18 cm範圍內之長度。舉例而言，冷凍保存袋可具有在約5.8 cm至約9.8 cm範圍內之寬度及在約12 cm至約16 cm範圍內之長度。特定言之，如圖28中所描繪之冷凍保存袋之一實施例可具有約7.8 cm之寬度及約14 cm之長度。
在使用之前，冷凍保存套組及/或其特定組件可經滅菌。舉例而言，袋190、192可經滅菌。用於形成袋190、192之材料可為可熱密封的。用於袋之材料可包括但不限於聚合物，諸如EVA、聚醯胺(例如耐綸)及其組合。開放袋190可用於在使用密封口及/或夾具(未示出)封閉袋之後進行處理及/或解聚。
套組191進一步包括閥195、196、夾具197、198、導管199及過濾器200。過濾器200可為管線過濾器、血液過濾器(諸如血液投與過濾器)、生物過濾器及/或管線凝集物移除過濾器。過濾器可經組態以自經處理組織移除大於預定大小之材料以形成所要材料。舉例而言，組織之團塊可使用過濾器與解聚組織分離。特定言之，在過濾之後進入導管之組織組合物可具有平均大小小於約200 µm的組分，以使得形成所要材料。舉例而言，所要材料可包括平均大小小於約170 µm的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
過濾器可經選擇以使得自導管進入之經處理組織組合物可富集，使得在過濾器之後，在穩定化元件方向上流入導管中的所要材料具有大小在約15 µm至約500 µm範圍內的組分。在一些實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後在穩定化元件方向上進入導管之組織組合物具有大小在約50 µm至約300 µm範圍內的組分。舉例而言，在一實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後進入導管之組織組合物具有大小在約150 µm至約200 µm範圍內的組分。
在一些實施例中，富集元件之過濾器可自經處理組織移除超出約5 µm至約200 µm的預定大小範圍之外之材料，以形成所要材料。舉例而言，所要材料可包括平均大小在約5 µm至約200 µm之範圍內的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。可將閥195、196置放在距收集袋預定距離處。舉例而言，無針閥195可距收集袋190約20 cm定位。諸如無針閥之閥可用以將材料添加至收集袋190。舉例而言，可將酶培養基插入無針閥195中，以便添加培養基至收集袋190。
在一些實施例中，在此類閥之後，可存在預定量之導管以允許存在對冷凍保存套組熔接上額外組件的空間。舉例而言，在一些閥之後，至少十(10) cm導管可定位於下一元件之前。導管199可為可密封及/或可熔接的。舉例而言，用於導管之材料可包括但不限於聚氯乙烯(PVC)及/或此項技術中已知的其他材料。在一些實施例中，導管可經設定大小以適配連接器。舉例而言，導管可具有在約1.5 mm至約4.5 mm範圍內之內徑及在約2.1 mm至約6.1 mm範圍內之外徑。舉例而言，冷凍保存套組之實施例可包括內徑在約2.9 mm至約3.1 mm範圍內且外徑在約4.0 mm至約4.2 mm範圍內之導管。用於冷凍保存套組191中之導管的長度可變化，其中個別導管元件之長度在約1 cm至約30 cm範圍內。舉例而言，如圖28中所描繪，個別導管元件之長度可在約5 cm至約20 cm之範圍內變化。
如圖28中所描繪之夾具197、198可用於阻止及/或防止酶培養基及/或經消化組織移動至過濾器中。舉例而言，夾具197可用於阻止及/或防止酶培養基及/或經消化組織在所要過濾步驟之前移動至過濾器中。夾具198可阻止及/或防止冷凍保護劑不合需要地移動至過濾器中。
圖29展示與圖28中所示之套組191類似之冷凍保存套組之實施例之俯視圖，然而，套組201面朝下。圖29描繪收集袋202可封閉之位置。
圖30展示包括封閉收集袋206及冷凍保存袋208的面朝上之冷凍保存套組之實施例之俯視圖。在一些實施例中，冷凍保存袋208可包括端口215、216，其允許取樣，准許將培養基及/或試劑無菌輸入至冷凍保存袋中。冷凍保存套組205可包括過濾器214、閥209、210、夾具211、212及導管222。
過濾器214可為管線過濾器、生物過濾器、血液過濾器(諸如血液投與過濾器)及/或管線凝集物移除過濾器。過濾器可經組態以移除大於預定大小之材料。舉例而言，組織之團塊可使用過濾器與解聚組織分離。過濾器可經選擇以使得在過濾器之後進入導管之組織組合物可具有大小在約15 µm至約500 µm之範圍內的組分。在一些實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後進入導管之組織組合物具有大小在約50 µm至約300 µm之範圍內的組分。舉例而言，在一實施例中，過濾器可經組態以使得在過濾之後進入導管之組織組合物具有平均大小在約150 µm至約200 µm範圍內的組分。特定言之，在過濾之後進入導管之組織組合物可具有平均大小小於約170 µm的組分。
可將閥209、210置放在距收集袋預定距離處。舉例而言，無針閥209可距收集袋206約20 cm定位。諸如無針閥之閥可用以將材料添加至收集袋206。舉例而言，可將酶培養基插入無針閥209中，以便添加培養基至收集袋206。
在一些實施例中，在此類閥之後，可存在預定量之導管以允許存在對冷凍保存套組熔接上額外組件的空間。舉例而言，在一些閥之後，至少十(10) cm導管可定位於下一元件之前。導管222可為可密封及/或可熔接的。舉例而言，用於導管之材料可包括但不限於PVC及/或此項技術中已知的其他材料。在一些實施例中，導管可經設定大小以適配連接器。舉例而言，導管可具有在約1.5 mm至約4.5 mm範圍內之內徑及在約2.1 mm至約6.1 mm範圍內之外徑。舉例而言，冷凍保存套組之實施例可包括內徑在約2.9 mm至約3.1 mm範圍內且外徑在約4.0 mm至約4.2 mm範圍內之導管。用於冷凍保存套組205中之導管的長度可變化，其中個別導管元件之長度在約1 cm至約30 cm範圍內。舉例而言，如圖30中所描繪，個別導管元件之長度可在約5 cm至約20 cm之範圍內變化。
如圖30中所描繪之夾具211、212可用於阻止及/或防止酶培養基及/或經消化組織移動至過濾器中。舉例而言，夾具211可用於阻止及/或防止培養基酶溶液及/或經消化組織在所要過濾步驟之前移動至過濾器中。夾具212可阻止及/或防止冷凍保護劑不合需要地移動至過濾器中。
圖31展示包括封閉收集袋226及冷凍保存袋228的面朝上之冷凍保存套組之實施例之側視圖。冷凍保存袋228可包括端口242。端口242提供對冷凍保存袋228之出入口。閥232、238及夾具234、236可安置於過濾器230周圍且用以控制流體在冷凍保存套組224內之移動。
圖32展示冷凍保存套組之實施例之端視圖。密封袋226及過濾器230為可見的。密封袋226可使用導管、閥及/或夾具耦接於過濾器230。
圖33展示收集袋之實施例之俯視圖。袋232展示為開放的且包括指示符234、236及標記238、240。標記可用以展示袋之部分應密封及/或夾持之位置。密封的標記可接近於袋的開放邊緣而定位。此類標記可距開放邊緣預定距離而定位。在一些實施例中，密封的標記可實質上平行於開放邊緣。
袋232包括定位器244及連接器246。連接器246將袋232與導管248耦接。連接器246可允許導管248分成包括夾具254、256及/或端口258、260之導管250、252。
圖34展示包括收集袋264、夾具266、268、過濾器270、導管272、端口274、276、閥278、連接器280及冷凍保存袋282之冷凍保存套組之實施例之正視圖。收集袋及相關聯導管可使用至少一些EVA材料形成。在一些實施例中，收集袋及/或導管可由EVA形成。夾具266、268可為彈簧夾。連接器280為四通連接器且可用於將來自過濾器270之導管耦接於閥278，例如無針閥，以及將導管耦接於冷凍保存袋282。
圖35展示包括收集袋284、端口286、夾具288、296、閥290、292、過濾器298及冷凍保存袋294之冷凍保存套組之實施例的正視圖。如所描繪，閥290、292可為能夠在處理期間接收供用於套組中之材料的無針閥。舉例而言，待經由閥290、292提供之材料包括例如腫瘤消化培養基及/或冷凍保護劑或冷凍保存培養基，諸如二甲亞碸(「DMSO」)及/或其溶液，諸如55% DMSO及5%聚葡萄糖冷凍保存培養基(例如BloodStor 55-5)。注射器300、302可用於分別經由無針閥290、292提供腫瘤消化培養基及55% DMSO溶液，諸如55% DMSO及5%聚葡萄糖冷凍保存培養基。在處理期間，可在預定時間將材料選擇性地提供至冷凍保存套組。此外，夾具可用於控制諸如腫瘤消化培養基及/或冷凍保護劑之所提供材料的流動，諸如DMSO溶液可在預定時間提供至諸如收集袋、過濾器及/或冷凍保存袋之裝置。
圖36A展示能夠緊固在諸如消化器之裝置中之冷凍保存套組之實施例的正視圖。如所展示，收集袋304在使用期間至少部分地由支架306圍封。支架可定位收集袋304以使得處理可以高效方式發生。圖36A描繪具有熔接口310且在使用期間利用接近於熔接口310之夾具312以減小熔接口310上之壓力的收集袋304。在使用期間引入之組織可實質上均勻分佈於收集袋304中，使得組織可使用來自裝置之槳葉314、316處理。冷凍保存袋330具有各自具有其自身端口334之多個區段332。
圖36B中描繪使用支架緊固之收集袋之實施例的側視圖。支架336可用於緊固收集袋。支架336包括鉸鏈338、頂側340、底側342、夾具344、突起346及閂348。在使用期間，夾具344可接近收集袋上之熔接口定位(圖36A)。支架336上之突起346經構築以使得其將接近收集袋之表面定位且在使用期間向上突起至收集袋中。在一些實施例中，突起346可減少及/或阻止組織及/或培養基在使用期間的移動以確保組織之處理沿著收集袋之長度實質上類似。舉例而言，突起可經構築以使得其減少及/或阻止組織在槳葉之間的滑動(展示於圖36A中)。支架336亦可包括用以確保收集袋緊固之閂348。
圖36C展示供與收集袋一起使用之包括隆脊350之夾具344之分解視圖。詳言之，在使用期間，夾具344可接近收集袋上之熔接口定位以降低熔接口及/或密封口失效之風險。
圖37展示包括收集袋354、過濾器356、閥362、364、夾具358、360、導管368及冷凍保存袋366之冷凍保存套組之實施例之俯視圖。冷凍保存套組352之各種組件之間的導管長度可變化。
圖38展示面朝下安置之包括收集袋354、過濾器356、閥362、364、夾具358、360、導管368及冷凍保存袋366之冷凍保存套組之實施例之視圖。
在一特定實施例中，兩個或更多個袋可耦接在一起以確保可恰當地儲存解聚產物材料。
在一些實施例中，本發明可包括用於半自動化無菌解聚、富集及/或穩定化來自組織(例如固體哺乳動物組織)之細胞及/或細胞聚集體的自動化裝置。與本發明一起使用之自動化裝置可包括可程式化處理器及冷凍保存套組。在一些實施例中，冷凍保存套組可為單次使用的無菌套組。本發明進一步關於半自動無菌組織處理方法。
在一些實施例中，諸如收集袋之袋可用於收集套組中。具有開放末端的袋允許添加樣品，諸如組織樣品。收集套組中連接器可將袋耦接於導管。導管材料可為可密封及/或可熔接的。舉例而言，導管可使用能量(諸如熱、射頻等)密封。導管材料可由PVA製成。
在一些實施例中，導管可與閥耦接以允許添加一或多種培養基酶溶液，包括但不限於膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、Liberase HI、胃蛋白酶或其混合物。舉例而言，閥可為無針閥。
用於冷凍保存套組中之導管可包括外徑在約3.0 mm至約5.0 mm範圍內之導管，其中導管之內徑在約2.0 mm至約4 mm範圍內。特定言之，導管可具有4.1+/-0.1 mm之外徑及約3.0+/-0.1 mm之內徑。導管之長度可視收集套組之組態而定。舉例而言，收集套組之一實施例可包括長度在約10 cm至約20 cm範圍內之導管。
在收集套組之一些實施例中，原型可包括一或多個夾具以阻止及/或防止組織及/或酶培養基移動。特定言之，可阻止酶培養基及/或組織在過濾步驟之前移動至過濾器中
本發明藉由以下編號段落進一步描述：
1. 一種單次使用無菌套組，其包含：用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組；用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組，其中該等模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及其中該等模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中。
2. 如段落1之單次使用無菌套組，其中一或多個可撓性容器包含彈性可變形材料。
3. 如段落1或2之單次使用無菌套組，其中解聚模組之一或多個可撓性容器包含一或多個可密封開口。
4. 如段落3之單次使用無菌套組，其中解聚模組之可撓性容器包含可熱密封的熔接口。
5. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中一或多個可撓性容器包含內部圓化邊緣。
6. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中解聚模組之一或多個可撓性容器包含經調適以機械地擠壓及剪切其中的固體組織之解聚表面。
7. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中富集模組之一或多個可撓性容器包含保留細胞化解聚固體組織之保留物的過濾器。
8. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中穩定化模組之一或多個可撓性容器包含用於將活細胞儲存為溶液形式或冷凍保存狀態下之培養基調配物。
9. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中套組進一步包含數位、電子或電磁標籤指示符。
10. 如段落9之單次使用無菌套組，其中標籤指示符係關於一種特定程式，其定義：一種類型之解聚及/或富集及/或穩定化過程；在彼等過程中使用之一或多種類型之培養基；包括適合於受控速率冷凍之視情況選用之冷凍溶液。
11. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中相同可撓性容器可形成一或多個解聚模組、穩定化模組及視情況選用之富集模組之一部分。
12. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中解聚模組包含用於接收待處理之組織的第一可撓性容器。
13. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中解聚模組包含第二可撓性容器，其包含用於解聚之培養基。
14. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中視情況選用之富集模組包含第一可撓性容器及用於接收富集之濾液的第三可撓性容器。
15. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中解聚模組及穩定化模組均包含第二可撓性容器且其中第二容器包含消化培養基及穩定化培養基。
16. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中穩定化模組包含第四可撓性容器，其包含穩定化培養基。
17. 如任何前述段落之單次使用無菌套組，其中穩定化模組亦包含用於儲存及/或經歷冷凍保存之第一可撓性容器及/或第三可撓性容器。
18. 根據任何前述段落之單次使用無菌套組在半自動化過程中之用途，其用於哺乳動物細胞或細胞聚集體之無菌解聚、穩定化及視情況富集。
19. 一種用於來自哺乳動物固體組織之細胞或細胞聚集體之半自動化無菌解聚及/或富集及/或穩定化的自動化裝置，其包含：可程式化處理器；及如段落1至17中任一者之單次使用無菌套組。
20. 如段落19之自動化裝置，其進一步包含射頻鑑別標籤讀取器，其用以識別單次使用套組。
21. 如段落19或20之自動化裝置，其中可程式化處理器能夠經由標籤識別單次使用無菌套組且隨後執行定義解聚、富集及穩定化過程類型及彼等過程所需的各別培養基類型之套組程式。
22. 如任何前述段落之自動化裝置，其中可程式化處理器經調適以與以下中之一或多者通信且控制以下中之一或多者：解聚模組；富集模組；及穩定化模組。
23. 如段落22之自動化裝置，其中可程式化處理器控制解聚模組以使得能夠物理及/或生物分解固體組織材料。
24. 如段落23之自動化裝置，其中可程式化處理器控制解聚模組以使得能夠物理及酶分解固體組織材料。
25. 如段落24之自動化裝置，其中固體組織材料之酶分解係藉由一或多種選自以下之培養基酶溶液：膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、Liberase HI、胃蛋白酶或其混合物。
26. 如段落19-25中任一者之自動化裝置，其中可程式化處理器控制解聚可撓性容器內之解聚表面，其機械地擠壓及剪切固體組織，視情況其中解聚表面為機械活塞。
27. 如段落19-25中任一者之自動化裝置，其中可程式化處理器控制穩定化模組以視情況使用可程式化溫度冷凍保存容器中之富集解聚固體組織。
28. 如任何前述段落之自動化裝置，其中裝置進一步以任何組合包含以下額外組件中之一或多者：能夠在將解聚之固體組織轉移至視情況選用之富集模組之前識別解聚過程是否已在解聚模組中完成之感測器；測定解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者的容器中所需之培養基的量，且控制材料在各別容器之間的轉移的重量感測器；控制解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者之容器內的溫度之感測器；控制培養基在模組中之各容器之輸入與輸出端口之間的轉移的至少一個氣泡感測器；控制培養基在輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個泵，視情況蠕動泵；評估富集模組內之壓力的壓力感測器；控制富集模組內之切向流過濾過程之一或多個閥；及/或控制培養基在各模組之輸入與輸出端口之間的轉移之一或多個夾具。
29. 如任何前述段落之自動化裝置，其中可程式化處理器經調適以維持穩定化模組中之最佳儲存溫度範圍直至容器經移除；或執行受控冷凍步驟。
30. 如任何前述段落之自動化裝置，其進一步包含使用者介面。
31. 如段落23之自動化裝置，其中介面包含用以顯示指令之顯示幕，該等指令指導使用者輸入參數、確認預程式化之步驟、警告錯誤或其組合。
32. 如任何前述段落之自動化裝置，其中自動化裝置經調適成可移動的。
33. 一種半自動無菌組織處理方法，其包含：視情況根據段落1至17中任一者之套組，自與無菌處理套組相關之數位、電子或電磁標籤指示符自動確定無菌解聚組織處理步驟及其相關條件；將組織樣品置放於無菌處理套組之解聚模組之可撓性塑膠容器中；及藉由與以下通信且控制以下自動執行一或多個組織處理步驟來處理組織樣品：解聚模組；視情況選用之富集模組；及穩定化模組。
收集腫瘤材料、冷凍保存及TIL製造之程序
用於TIL製造之起始材料係解聚及冷凍保存之細胞懸浮液，其含有來自合格患者之自體TIL及腫瘤細胞。提供用於收集及處理腫瘤起始材料之例示性流程圖(圖65)。
以手術方式切除腫瘤且隨後修整以移除可見壞死組織、可見健康(非癌性)組織、脂肪組織及過量血液。經修整腫瘤重量應大於或等於2公克(≥2公克)。稱重超過7 g之腫瘤可分成較小部分且個別地解聚。
將各腫瘤片段放入含有培養基、膠原酶及DNA酶之個別無菌袋中。例示性試劑展示於下表中：
表4 - 解聚培養基
原材料 動物/人類來源 供應商 可用憑證
磷酸鹽緩衝鹽水 否 Life Technologies有限公司 CoA
2 mM氯化鈣 否 Sigma-Aldrich CoA
DNA酶1 (去氧核糖酶α) 美國經批准之醫學產品 Roche Products有限公司 CoA
IV型膠原酶 牛 Nordmark Arzneimittel股份兩合公司 CoA，CoO，TSE/BSE聲明
BloodStor 55-5 (55% DMSO) 否 BioLife Solutions CoA
隨後熱密封袋且解聚其內容物以產生含有腫瘤及TIL之均質細胞懸浮液。解聚係由裝置，諸如本文所述之Tiss-U-Stor裝置進行，該裝置運行的程式可以在界定之持續時間內使用界定之壓縮壓力，遞送界定數目之重複物理壓縮事件，以確保酶進入腫瘤組織，由此加速酶消化。記錄各個別腫瘤之循環數目、壓力、溫度及持續時間。
隨後使用200 μm過濾器(Baxter，RMC2159)無菌過濾均質化細胞懸浮液，且將濾液無菌傳遞至冷凍保存袋中。無菌添加BloodStor 55-5 (Biolife Solutions, Bothell, WA)以達成5% DMSO。隨後使用Tiss-U-Stor裝置用界定之冷卻程式冷凍保存細胞懸浮液，且記錄來源於各腫瘤部分之各個別細胞懸浮液之量測之溫度概況。冷凍保存之細胞懸浮液儲存於液氮之氣相中。
冷凍保存之細胞懸浮液建議儲存條件為≤-130℃。
細胞懸浮液封裝於容器中藉由合格快遞服務自臨床地點運輸至GMP細胞療法製造地點，該容器經驗證確保冷凍保存之細胞懸浮液維持在≤-130℃下。
(Tiss-u-Stor)
評估切除腫瘤的重量及狀況。對於各腫瘤片段，移除額外材料且對片段進行稱重。打開CS50N袋，添加高達約7 g腫瘤且隨後密封袋。藉由注射器經由無針端口將15 ml EDM消化培養基添加至具有2 μl慶大黴素/兩性黴素/ml EDM之袋中，隨後將空氣自袋移除至注射器中。
將解聚袋中之腫瘤組織及解聚培養基置放於控溫之組織解聚器中。溫度以1.5℃/min之速率自環境溫度升高至35℃，且維持在35℃下總共約45分鐘，在此期間解聚器每分鐘運作240次。
在解聚之後，腫瘤材料經由管線過濾器過濾至二級冷凍袋中。經由無針端口注射1.5 ml Blood stor (DMSO)且移除空氣。
抽取2 ml懸浮液用於測試。
對於視情況選用之冷凍保存，將冷凍袋裝載至冷凍卡匣(freezing cassette)中且將冷凍卡匣置放在Via freeze中。隨後將Via freeze冷卻至-80℃，較佳以-2℃/min之速率直接自35℃冷卻至-80℃。
隨後將冷凍冷凍袋轉移至液氮儲存。
TIL製造
用於在英國(UK)培養之自體組織應符合英國人類組織管理局(Human Tissue Authority)確立的HTA-GD-20，用於患者治療之人類組織及細胞的品質及安全性保障指南(Guide to Quality and Safety Assurance for Human Tissue and Cells for Patient Treatment)，並具有適合的同意書、身分鏈、監管鏈及篩選以確認供體為B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、HIV-1及2、HTLV-1及2及梅毒陰性。
製造涉及自含有來源於切除腫瘤之TIL及腫瘤細胞之冷凍保存細胞懸浮液突起生長及擴增。若腫瘤大於約7 g，則切除過程產生多個冷凍保存之細胞懸浮液，其中各細胞懸浮液來源於2至7 g腫瘤片段。通常，1次TIL突起生長僅需要將一個細胞懸浮液解凍，同時剩餘的冷凍保存之細胞懸浮液保持在GMP控制下且保持在建議儲存條件(液氮之氣相)下。
在某些實施例中，細胞懸浮液已在解聚之後、在冷凍保存之前過濾。例示性製造程序展示於圖66中。例示性製造原材料提供於下表中：
表5 - 原材料來源
原材料 人類/動物來源 供應商 可用憑證
T細胞培養基 人類及動物 ThermoFisher Scientific CoA，CoO
胎牛血清(FBS) 動物 Life Technologies CoA，CoO
慶大黴素/兩性黴素B，500× 否 Life Technologies CoA
IL-2 (阿地介白素) 不可用 Clinigen CoA
人類AB血清 人類 Valley Biomedical CoA以及Origin
MACS GMP CD3 OKT3抗體 否 Miltenyi Biotec CoA
經照射之白血球層 人類 SNBTS CoA
磷酸鹽緩衝鹽水 否 Life Technologies CoA
白蛋白(人類) 20% 人類 OctaPharma CoA以及Origin
CryoSure-DMSO 否 WAK - Chemie Medical股份有限公司 CoA，TSE
T細胞培養基(TCM)含有白蛋白(人類)、人類全運鐵蛋白(Holo Transferrin)及動物來源膽固醇。用於製造白蛋白及運鐵蛋白之源血漿來源於美國且針對偶然性物質(adventitious agent)測試供體。
膽固醇來源於源自澳大利亞/紐西蘭之綿羊羊毛脂，其符合禁止來自具有傳染性海綿狀腦病(TSE)之報導病例的國家的反芻原始材料的USDA規定。
胎牛血清 (FBS)來源於澳大利亞/紐西蘭，其符合禁止來自具有傳染性海綿狀腦病(TSE)之報導病例的國家的反芻原始材料的USDA規定。FBS按照21 CFR部分113.47測試，特定言之包括：藍舌病病毒、牛腺病毒、牛細小病毒、牛呼吸道融合病毒、牛病毒性腹瀉病毒、狂犬病病毒、里奧病毒(reovirus)、細胞病變因子、血球吸附因子(haemadsorbing agent)。FBS在56℃下熱不活化30分鐘且0.1 μm過濾三次以提供兩個正交病毒移除步驟。
人類AB血清來源於Valley Biomedical，一個FDA註冊機構(1121958)。藉由FDA批准之方法測試各供體單元之B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎病毒(HBV)核酸擴增測試(NAT)、1型及2型抗人類免疫缺乏病毒(HIV)、HIV-1 NAT、抗C型肝炎病毒(HCV)、HCV NAT及梅毒測試。在56℃下熱不活化血清30分鐘且0.1 μm過濾。
經照射白血球層來源、製備、裝運及儲存：蘇格蘭國家輸血服務中心(The Scottish National Blood Transfusion Service，SNBTS)篩選供體、收集血液組分、製備且照射白血球層。SNBTS由英國人類組織管理局(許可號11018)根據血液、安全性及品質規定(Blood, Safety and Quality Regulations) (2005)授權以取得、處理、測試、儲存及分配血液、血液組分及組織。
健康供體篩選滿足或超出美國聯邦法規(Code of Federal Regulations，CFR)標題21部分1271.75中所述的要求，不同之處在於供體生活在英國。雖然此呈現偶發性庫賈氏病(sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease，sCJD)或變異庫賈氏病(variant Creutzfeldt-Jakob Disease，vCJD)之理論風險，但英國具有穩健的國家監視方案。最近的年度報導(涵蓋1990年5月至2018年12月31日)(National CJD Research & Surveillance Unit, 2018)證實了sCJD在英國之發病率與在世界上別處(包括無牛海綿狀腦病(BSE)之國家)所觀測到的相當。2017年至2020年4月5月無報導之vCJD病例，且自2012年1月1日開始全國僅可鑑別出兩個病例(NCJDRSU Monthly Report, 2020)。自2007年開始無報導之情況下，此嚴格監視網路已排除輸注傳輸之vCJD感染(National CJD Research & Surveillance Unit, 2018)。例示性合格供體測試(表7)滿足21 CFR部分1271.85要求且添加不需要的E型肝炎測試。
表6 - 例示性供體篩檢(NHSBT)
病原體 說明 要求
B型肝炎、C型肝炎及E型肝炎病毒 未偵測到/陰性 每次供給
1型及2型人類免疫缺乏病毒(HIV) 未偵測到/陰性 每次供給
梅毒 未偵測到/陰性 每次供給
1型及2型親人類T淋巴病毒(Human T Lymphotrophic Virus，HTLV) 未偵測到/陰性 第1次供給及選定後續供給
瘧疾 未偵測到/陰性 視供體的個別情形而定進行測試
克氏錐蟲( T. cruzi) 未偵測到/陰性或IgG陽性
西尼羅河病毒(West Nile virus) 未偵測到/陰性
巨細胞病毒(CMV) 未偵測到/陰性或IgG陽性
授權血液機構製備適合於治療患有重度嗜中性白血球缺乏症之患者的臨床級經照射之白血球層。為了製備白血球層，將血液離心以形成三層：紅血球層、白血球層及血漿層。用25至50 Gy照射照射來自10個供體之白血球層，以遏制細胞生長。製備臨床級經照射之白血球層且使用包括溫度監測器之受控溫度運送器由隔夜快遞運送至GMP製造設施。運送在製造過程中使用前一天發生。
在接收後，白血球層保持在15至30℃下直至在製造中使用。
經照射之餵養細胞製備
混合來自多達十個獨特供體之白血球層，隨後藉由Ficoll梯度密度離心離心以收集外周血液單核細胞(PBMC)。大約4×10 9個活白血球再懸浮於封閉靜態細胞培養袋中補充有大約8%人類AB血清，3000 IU/mL IL-2及30 ng OKT-3之TCM中。根據規格放行PBMC。
表7 - 同種異體PBMC儲備液規格
特性 測試方法 允收標準
外觀 目視檢查 ID標籤
屬性 流式細胞量測術或其他基於筒匣之方法 ≥85%活CD45+細胞
存活率 流式細胞量測術或其他基於筒匣之方法 報導結果
總活白血球含量 流式細胞量測術或其他基於筒匣之方法 2至4 ×10 9
亦測試PBMC之無菌性及支原體。臨開始步驟3 (第12天，圖C)之前，移除經調配餵養細胞之樣品，其包括培養基、IL-2及OKT3。在第13天、第17天及第18天培育且分析此樣品以確認餵養細胞未擴增。
白蛋白(人類)，亦稱為人類血清白蛋白(HSA)，來源於美國供體。所有血漿供給個別地測試且對HBsAg、抗HIV 1、抗HIV 2及抗HCV抗體無反應。各血漿池藉由NAT測試且發現對HBsAg、抗HIV 1、抗HIV 2及HCV-RNA呈陰性。根據滿足美國及歐洲藥典之生產及測試標準的GMP規定製造HSA產物。
TIL突起生長
細胞懸浮液以大約0.25×10 6至0.75×10 6個活細胞/毫升接種至補充有10% FBS、0.25 μg/mL兩性黴素B以及10 μg/mL慶大黴素(Life Technologies, Grand Island, NY)及介白素-2 (IL-2；阿地介白素) 3000 IU/mL (Clinigen, Nürnberg, Germany)之TCM中且在標準細胞培養條件(37℃，5% CO 2)中培養。
在第5天，移除一半培養基且用補充有10% FBS、0.50 μg /mL兩性黴素B、20 μg /mL慶大黴素及6000 IU/mL IL-2之TCM更換。
在第7天，若細胞濃度＞1.5×10 6個活細胞/毫升，則將TIL突起生長培養物以三倍體積稀釋以維持大約0.1×10 6至2.0×10 6個活細胞/毫升。若細胞濃度≤1.5×10 6個活細胞/毫升，則更換一半培養基。在任一選項中，培養基為補充有10% FBS、0.50 μg /mL兩性黴素B、20 μg /mL慶大黴素及6000 IU/mL IL-2之TCM。
在第10天，若細胞濃度＞1.5×10 6個活細胞/毫升，則將TIL突起生長培養物以三倍體積稀釋以維持大約0.1×10 6至2.0×10 6個活細胞/毫升。若細胞濃度≤1.5×10 6個活細胞/毫升，則更換一半培養基。在任一選項中，添加的培養基為補充有10% FBS、0.50 μg/mL兩性黴素B、20 μg/mL慶大黴素及6000 IU/mL IL-2之TCM。
TIL活化
使用抗CD3抗體(OKT3)，以當結合於來自同種異體外周血液單核細胞(PBMC)之經照射餵養細胞之FC受體時提供CD3特異性刺激，來活化TIL。餵養細胞提供額外協同刺激之天然來源以支援所添加之抗CD3 (OKT-3)。
在第12天，使用大約30±10 ng/mL OKT3、大約8%人類AB血清及3000±1000 IU/mL IL-2將來自TIL突起生長步驟2之1至20×10 6個活T細胞添加至2.0至4.0×10 9個活經照射餵養細胞(部分8.1.4.4)。將TIL活化培養物在標準細胞培養條件下培育6天。
TIL擴增
在第18天，活化TIL藉由將活化TIL細胞懸浮液無菌添加至含有補充有大約8%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之T細胞培養基的生物反應器中來繼續擴增。
在第19天，向TIL擴增提供補充有3000 IU/mL IL-2之T細胞培養基的連續進料直至收集。
藉由使用SEFIATM洗滌細胞來收集TIL。藉由離心濃縮細胞，隨後使用補充有1%人類血清白蛋白(HSA)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌2至4次。細胞隨後再懸浮於PBS+1% HSA中至大約50 mL至60 mL。
將經洗滌及濃縮之細胞無菌轉移至冷凍袋中，且移除一部分用於批次放行測試及樣品保留。為了調配藥物產物(DP)，隨後使TIL冷卻至2-8℃且與含有16% HSA及20% DMSO之冷凍保護劑例如1:1調配，以獲得懸浮於含大約10% DMSO及8.5% HSA之PBS的≥5×10 9個活細胞的調配產物。移除一部分以用於批次放行測試及樣品保留。將冷凍袋冷卻至-80℃。
TIL製造過程
下表展示製程變化形式之實例。
表8 - 製造過程
製程版本 v1.0 v1.1 v1.2 ITIL-168
腫瘤解聚 人工解聚 人工解聚 Tiss-U-Stor解聚 Tiss-U-Stor解聚
起始材料 新鮮 冷凍保存 冷凍保存 冷凍保存
TIL突起生長 1-3週 1-3週 12天 12天
中間保持步驟 冷凍保存 冷凍保存 不適用 不適用
TIL恢復 3天 3天 不適用 不適用
快速擴增階段 12天 12天 12天 12天
培養延長 0-2天 0-2天 不適用 不適用
最終產物 新鮮 新鮮 冷凍保存 冷凍保存
下表展示藥物產品資料
表8 - 藥物產品資料
產物批次 製程版本 產量(×10 10) 存活率 CD3+細胞百分比
TIL001 1.0 1.1 82 N/A
TIL003 1.0 2.2 94 98
TIL005 1.0 2.0 96 N/A
TIL012 1.0 3.2 95 98
TIL013 1.0 2.1 80 92
TIL014 1.0 4.4 91 95
TIL015 1.0 6.4 91 97
TIL016 1.0 5.5 93 96
TIL027 1.0 3.8 95 97
TIL032 1.0 3.7 92 99
TIL035 1.0 6.4 96 90
TIL037 1.0 2.6 92 97
TIL038 1.0 1.3 83 98
TIL039 1.1 1.2 80 93
TIL040 1.0 5.3 93 97
TIL041 1.0 3.2 93 98
TIL043 1.0 4.8 93 98
TIL054 1.1 0.82 86 91
TIL065 1.1 3.4 94 97
TIL067 1.2 3.0 91 97
TIL073 1.0 5.4 92 98
TIL077 1.2 1.0 91 97
TIL078 1.2 3.4 99 98
E2 1.2 3.5 86 97
E3 1.2 1.8 80 96
E4 1.2 1.0 88 93
E5 1.2 4.1 98 100
比較冷凍保存與新鮮細胞懸浮液，代表性產率如藉由類似原料藥產率(圖67A)、存活率(圖67B)及T細胞百分比(圖67C)所表明為恆定的。
冷凍保存之最佳化-作為腫瘤材料之替代物，分離之PBMC使用Tiss-U-Stor過程及材料消化。在一系列條件下評估商業冷凍保存試劑(CPA)以確定何種試劑最大化解凍後存活率(圖68)。兩種CPA，Cryostor10及Stem Cell Banker無DMSO的解凍後存活率類似。隨後，將基於CryoStor之DMSO與Bloodstor 55-5 (一種基於冷凍保存之DMSO)比較，且選擇更高濃度的BloodStor產物，因為其更加濃縮，因此允許較小冷凍袋。隨後遵循將材料維持在4℃下10分鐘，隨後以-1℃/min之速率降低溫度或直接以-2℃/min之速率自35℃降低至-80℃之方案比較冷凍保存。所使用之兩個冷凍保存方案之間的解凍後存活率類似(圖69)。
在冷卻期間，冰長晶釋放熱量。過度冷卻，一種所釋放之熱量呈現使溶液升溫之現象，與較低解凍後恢復率相關。在使用兩種方案冷凍保存期間，自測試物品記錄溫度資料(圖70)。使用-1℃/min方案在兩個獨立運行中觀測到過度冷卻，而-2℃/min冷卻方案一次過度冷卻事件也沒有紀錄，且在第二獨立運行中，觀測到過度冷卻事件相對於替代方案釋放較少熱量(圖70)。
冷凍保存之DP轉移至氣相LN2以用於在≤-130℃下儲存及運輸。
測試樣品無菌性且保持之樣品在-80℃下使用Coolcell® (Biocision, Larkspur, CA)冷凍，隨後轉移至氣相LN2以用於儲存目的。
在一態樣中，本發明提供用於評估TIL組合物之方法。TIL效能分析包含評估TIL活化之分析物特徵，包括但不限於作用機制之指示。例示性非限制性作用機制包括腫瘤細胞殺滅、細胞介素分泌、增殖、持久性及指示機制之特性。分析可包含例如藉由流式細胞量測術對T細胞及目標細胞之計數，可藉由基於盤之螢光或發光或流式細胞量測術或其他方法，諸如基於筒匣之方法觀測之殺滅百分比，表徵個別細胞以測定標記物之表現，包括但不限於細胞介素、細胞表面標記物之表現，在活化T細胞中誘導之基因之表現量，包括但不限於經工程改造以在活化條件下表現之報導分子或T細胞活化之其他標誌。
TIL效能之度量包括TIL細胞組合物及表型，諸如但不限於CD8 +細胞之數目及比例；包括但不限於效應記憶及中央記憶之記憶表型；使用各種細胞株之細胞毒性、使用患者特異性腫瘤之細胞毒性的量測值；細胞介素或細胞介素小組之表現；及細胞增殖及持久性。
在某些實施例中，提供用於定量TIL效能之生物分析。在某些實施例中，生物分析包含多參數或多色細胞內流式細胞量測術。細胞內流式細胞量測術尤其有利於在個別細胞基礎上評估T細胞特異性參數，且確保甚至在異質細胞群體中之測定準確。多參數流式細胞量測術允許同時偵測或可包括兩種或更多種細胞介素的兩種或更多種組分以及高通量。亦考慮基於筒匣之分析技術，諸如但不限於由Chemometec https://chemometec.com/products/nucleocounter-nc-200-automated-cell-counter/或Accellix https://www.accellix.com/technology/)製造之筒匣。
不同於主體上清液上所用之ELISA及類似方法，本文所述之細胞內分析為細胞及細胞類型特異性的。有利地，必要時可鑑別及富集產生個別細胞介素之細胞。在某些實施例中，細胞內方法避免細胞毒性且方法對所分析細胞之影響為可逆的。
在某些實施例中，將TIL群體與經工程改造以經由CD3 (亦即T細胞受體(TCR)之信號傳導組分)活化T細胞之細胞共同培養。在某些實施例中，經修飾之TIL群體與經工程改造以活化T細胞以及接合及活化協同刺激受體之細胞共同培養。活化細胞之適宜實例包含經工程改造以表現結合且活化TCR之結合蛋白或抗體或其抗原結合片段之K562細胞。在某些實施例中，抗體包含OKT3。在某些實施例中，抗原結合片段包含來自OKT3之單鏈可變片段(scFv)。ITIL-168 DP與刺激K562-OKT3細胞之共同培養允許經由TCR之T細胞活化。在某些實施例中，提供陰性對照物，例如但不限於未轉導之純系K562細胞K562-NT。可視需要調整TIL相對於活化細胞的比率。在某些實施例中，TIL相對於活化細胞的比率為10:1至1:10。非限制性實例包括TIL與刺激K562-OKT3細胞以諸如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率的共同培養。
在某些實施例中，效能分析方法用於測定與「標準」細胞類型共同培養之TIL群體的效能。非限制性實例為經工程改造以表現結合至且活化TIL上之T細胞受體的配位體，諸如但不限於抗體或其抗原結合片段，諸如OKT3抗體或其抗原結合片段之K562細胞。在某些實施例中，效能分析方法用於測定與腫瘤細胞或經工程改造以表現腫瘤相關抗原之細胞共同培養之TIL群體的效能。在某些實施例中，效能分析方法用於測定與來自與TIL來源相同的患者之腫瘤細胞共同培養的TIL群體的效能。
效能可報導為：
Figure 02_image001
AVG指示藉由一式三份分析確定之平均效能。
效能可計算為對CD137、CD107a、TNF-α及IFN-γ，較佳CD107a及IFN-γ中之一或多者呈陽性的所有活CD2+細胞的出現頻率。
效能分析方法可應用於任何TIL製造階段。在某些實施例中，TIL製造包含監測自一個培養步驟至下一培養步驟製造之TIL的效能。在某些實施例中，TIL製造包含監測在整個TIL製造中之TIL效能。在一些實施例中，TIL製造可包含量測TIL效能以確認或調整用於後續培養步驟接種之來自培養步驟的細胞數目。TIL品質屬性包括效能、存活率、細胞計數及純度。在某些實施例中，TIL製造包含量測自腫瘤加工之TIL的效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測來自REP前擴增培養物之TIL的效能。在某些實施例中，TIL製造包含在預擴增REP期間量測TIL之效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測在REP結束時TIL之效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測在第二REP結束時TIL之效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測REP期間，例如REP中期之TIL效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測在冷凍保存之前及/或在解凍冷凍保存之細胞之後的TIL效能。在某些實施例中，TIL製造包含量測TIL藥物產物(TIL DP)之效能。TIL製造之任何階段之效能測試可進一步包含較強效TIL，例如前40%、或前50%、或前60%、或前70%、或前80%、或前90%之TIL之富集或分離。在某些實施例中，富集或分離包含自抑制性細胞分離TIL。
指示TIL活化及效能之分析物之非限制性實例包括IFN-γ、CD107a、CD137 (4-1BB)。指示TIL活化或有益抗腫瘤特徵之其他標記物包括但不限於IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、顆粒酶A/B、穿孔蛋白、凋亡蛋白酶3及其他趨化因子標記物。
CD107a (亦稱為溶酶體相關膜蛋白-1或LAMP-1)為NK細胞及CD8+ T細胞之去顆粒標記物。IFN-γ為具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節功能之多效性細胞介素。IFN-γ已展示可增加抗原特異性CD8+ T細胞對於表現抗原之(目標)細胞的運動性且增強目標細胞殺滅。腫瘤微環境中之IFN-γ濃度已與較佳免疫檢查點阻斷功效有關。包含T細胞活化之指示。在一實施例中，對IFN-γ及CD107a進行分析。CD137 (4-1BB)為TNFR家族之成員且充當協同刺激分子以促進活化T細胞之增殖及存活。CD137在T細胞上之表現見於最近由TCR接合活化的T細胞中。TNF為由活化T細胞產生之促炎性細胞介素且指示穩固抗腫瘤活性。
歸因於細胞介素引起之TIL之自分泌刺激的效能或歸因於由腫瘤微環境中之其他細胞介導之抗腫瘤作用的旁分泌刺激的效能可在申請人方法中偵測到，但若T細胞+K562非經腸中存在高背景，申請人尚未觀測到該效能。指示持久性之效能標記物可在細胞增殖分析中偵測。
在某些實施例中，檢測區分細胞子集之分析物。非限制性實例為CD62L及CD45RO，其不同組合可區分效應細胞(CD62L-，CD45RO-)、效應記憶細胞(CD62L-，CD45RO+)、中央記憶細胞(CD62L+，CD45RO+)及幹細胞記憶細胞(CD62L+，CD45RO-)。
指示所需子集、活化子集、較佳丟棄之細胞的其他實例包括清除子集，諸如B細胞、單核球、粒細胞、NK細胞、黑素瘤腫瘤細胞，及其他子集，包括但不限於CD3、CD4、CD8、CD95、CCR7及CD45RO，以區分初始、T記憶幹細胞(SCM)、效應、效應記憶及中央記憶子集。
提供冷凍保存細胞之分析概述(圖82)。如上所述，該分析適於測定任何製造階段之TIL效能，且包括來自任何製程、培養或擴增步驟之TIL及新鮮或冷凍保存之TIL。解凍冷凍保存之細胞，通常在效能測試前提供一段恢復期，如測試之前約1至2小時、2至4小時、4至6小時、6至8小時、8至10小時、10至12小時或隔夜(至多24小時)。在恢復期之後或在第2天(對於新鮮TIL，第1天)，解凍之TIL隨後與能夠經由TCR接合及刺激TIL之刺激細胞(例如經OKT3 scFV片段工程改造之K562或其他非T細胞株)之群體混合。進入分析之恢復後細胞，例如接種於分析中之經轉導及未經轉導之細胞之數目可為約1×10 5、2×10 5、3×10 5、4×10 5、5×10 5、6×10 5、7×10 5、8×10 5、9×10 5、1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 7、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9個細胞。混合細胞組合物可與蛋白質轉運抑制劑(例如布雷非德菌素A及孟寧素，其濃度可為約10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、200×、300×、400×、500×、600×、700×、800×、900×、1000×、200×、3000×、4000×、5000×、6000×、7000×、8000×、9000×或10,000×)，及視情況一或多種用於監測鑑別活化後之去顆粒細胞的相關標記物的試劑(例如抗CD107a)一起培育約8-10小時、10-12小時、12-14小時、14-16小時、16-18小時、18-20小時、20-22小時、22-24小時、24-26小時、26-28小時、28-30小時、30-32小時、32-34小時或34-36小時。可添加CD107a以標記T細胞去顆粒，隨後分析細胞計數、存活率及/或細胞純度，其可藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法測定。培育期可為約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.2、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5或36小時。在有效培育期之後，處理細胞培養物以區分活細胞與死細胞且滲透及固定細胞。固定劑之濃度及固定時間可經最佳化且在熟習此項技術者之技能內。處理可持續約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、30、31、32、33、34或35分鐘。經滲透細胞針對細胞內及細胞外標記物染色且藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法量測標記物。用於細胞效能標記物(例如CD2、TNFa、IFNg、CD137)染色之抗體混合液可以在不同螢光團(例如PE、PCP-eF710、APC、APC-Cy7、BV711、eFLOUR506、GFP等)濃度體積(0.5、1.0、1.2、1.25、1.3、1.5、1.75、1.8、1.9、2.0、2.5、3、3.5、4等)及培育時間(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60分鐘等)間變化。可利用染色劑來區分活細胞與死細胞。
在某些實施例中，對藉由自腫瘤製備TIL之任何已知方法製備的TIL進行效能分析。
在實施例中，本文所描述之主題係關於可用作TIL產物(諸如ITIL-306)之活體內生物活性之替代量測的基於活體外共同培養之效能分析。該方法為藉由用於定量ITIL-306效能的多色流式細胞量測術終點進行之生物分析。
T細胞活化及作用機制 - 活體內TIL療法之作用機制涉及在MHC之情況下在目標細胞上腫瘤源性肽之TCR識別。在TCR與其同源抗原接合後，T細胞可變得活化，經由CD3蛋白質複合物傳導信號，且取決於T細胞亞型產生細胞介素及/或溶胞分子。細胞毒性T細胞(CTL)可產生細胞介素及溶胞分子，而許多其他T細胞類型將主要產生細胞介素。由於腫瘤微環境可抑制免疫細胞，因此CoStAR信號提供對TCR刺激之額外增強且允許腫瘤反應性T細胞克服抑制性之腫瘤微環境。因此，TIL之作用機制可使用可偵測及定量多種細胞標記物(包括溶胞活性及細胞介素釋放之標記物)的方法來評估。
根據CD107a偵測之溶胞活性：活化CTL將分泌可殺死目標細胞之溶胞因子。CD107a為在分泌之前在溶酶體隔室中發現之含有溶胞因子的細胞內去顆粒標記物，且其在CTL活化及分泌期間表現於質膜上。因此，CD107a為偵測已分泌溶胞因子以殺死目標細胞的CTL的適合標記物。
根據干擾素-γ (IFN-γ)偵測的細胞介素釋放：CTL以及許多其他T細胞子集表現為有效抗腫瘤免疫反應之關鍵細胞介素的IFN-γ。因為IFN-γ由T輔助細胞以及CTL表現，所以包括此細胞介素提供關於重要T細胞子集之資訊，該等子集可超出直接腫瘤殺滅而有助於抗腫瘤反應。
ITIL-306最終產物中之CoStAR +及CoStAR -群體T細胞之效能-由於ITIL-306最終產物由CoStAR +及CoStAR -群體構成，使用多參數方法評估效能至關重要。單終點讀取方法具有侷限性，因為任一種方法均取決於T細胞子集且可在異質患者群體中報導不足。用於ITIL-306產物釋放之活體外效能分析模擬特定共同培養中之T細胞活化及信號傳導。CD107a及IFN-γ標記物之偵測證實，TIL產物細胞能夠進行TCR介導之刺激及下游信號傳導，包括共同T細胞效應分子之基因轉錄、轉譯及蛋白質表現。此等標記物覆蓋主要T細胞亞型，其提供捕捉異質T細胞群體之活化狀態的能力，且確認產物呈現指示靶向細胞毒性之多官能表型且TIL產物可產生抗腫瘤反應。因此，將活體外效能方法視為適合替代物。
本文所述之關於產物釋放之基於共同培養之效能方法在與經工程改造以表現單獨OKT3 scFv (抗CD3)或OKT3及FOLR1之多個目標細胞株共同培養時使用多個終點定量T細胞活化。此等目標細胞經由CD3之OKT3接合向所有T細胞提供TCR刺激，同時亦藉由FOLR1在經CoStAR轉導之細胞中之接合提供CoStAR刺激。在TIL及目標細胞之共同培養之後，各孔用允許鑑別總TIL及經CoStAR轉導之TIL的抗體混合液染色。T細胞功能性藉由利用流式細胞量測術偵測去顆粒標記物CD107a及細胞介素干擾素-γ (IFN-γ)來量測。效能分析亦包括出於表徵目的使用FOLR1-Fc蛋白之CoStAR染色。因為預期CoStAR轉導僅提供協同刺激信號，所以預期經轉導及未轉導之群體均有助於產物效能。ITIL-306劑量量測為活CoStAR+ T細胞數量，且考慮最終產物中之CoStAR%及T細胞%兩者。因此，最終報導之效能為在CD3之OKT3接合下產生CD107a及IFN-γ的總T細胞(CoStAR+及CoStAR-)之函數同時亦包括來自表現CoStAR之細胞之貢獻。
如本文所述，藉由流式細胞量測術進行細胞內細胞介素染色常用於評估T細胞免疫反應。其具有能夠同時評估與反應T細胞相關之多種表型及功能參數的特定優勢。不同於偵測來自主體群體之細胞介素表現的替代性方法，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)，細胞內流式細胞量測術使得能夠同時偵測單一細胞水準之特定類型之反應細胞(例如，T細胞)及其功能(例如，細胞介素產生、細胞毒性相關標記物)以及多種細胞介素/趨化因子或增殖標記物。
儘管已詳細地描述本發明及其優勢，但應理解，在不脫離如所附申請專利範圍中所定義的本發明之精神及範疇的情況下，可在本文中進行各種改變、替代及更改。
本發明將進一步說明於以下實例中，該等實例僅出於說明之目的而給出且不意欲以任何方式限制本發明。 實例 實例1
圖39展示在使用期間袋400之實施例。如所描繪，諸如托盤406之裝置404內袋400係由諸如夾具402的緊固元件緊固。組織408經由袋400之透明側面可見。導管410耦接於袋400。 實例2
圖40描繪用於如本文所描述之本發明之袋420的實施例。如所描繪，袋420藉由緊固元件422自裝置及托盤424緊固。組織材料424經由袋420之透明側面可見。導管426耦接於袋420。如所示，使用固定元件428 (特定言之膠帶)進一步緊固托盤406內之袋400的位置。組織424經由袋420之透明側面可見。如圖40中所示，袋可包括端口430以進出袋及/或組織424之內部。 實例 3 - 解聚及冷凍保存
TIL075係由轉移性黑素瘤腫瘤塊(樣品)製成。將腫瘤樣品稱重且如下處理。S1=1.4 g。S1藉由自動化程序解聚。S2=19.4 g。分開S2，一個部分(約7.7 g)藉由自動化程序解聚且第二部分(約12 g)人工解聚。
人工解聚：將腫瘤樣品切割成較小的2至4 mm 3塊且添加至含有抗生素之80 ml消化培養基的瓶子中。將瓶子置於振盪器上且在37℃下解聚隔夜(約14小時)。消化物隨後經由netwells及100 μM細胞過濾器過濾至法爾康(Falcon) 50管中。保留10%之過濾之消化物用於無菌性測試。將剩餘部分離心且再懸浮於12 ml CS10中且分成12個冷凍小瓶。
Tiss-U-Stor解聚：用無菌剪刀打開兩個CS50N袋，剪切無端口之末端。將S1 1.4 gm樣品及S2之7.7 gm部分置放於CS50N袋中，且密封袋。將15 ml解聚培養基與30 ül抗生素合併且使用注射器經由袋之無針端口添加至密封袋中之各者中。將袋轉移至裝載在ViaFreeze中的組織解聚器，且開始解聚方案。解聚方案需要在1.5℃/min之速率下自環境溫度提高至35℃，且溫度保持在35℃下，同時解聚器活動。解聚器速率設定成240個循環/分鐘。隨後ViaFreeze之溫度保持在35℃，直至冷凍保存步驟。
袋設置包括藉由導管經由管線過濾器直接連接至二級冷凍袋。將CS50袋中之解聚材料過濾至冷凍袋中且密封導管連接件。經由冷凍袋之無針端口緩慢添加1.5 ml Blood-stor (DMSO)，將袋置放於經設計用於最佳熱傳遞之卡匣中，且將卡匣置放回ViaFreeze中代替解聚器。
進行解聚後冷凍保存方案。冷凍循環將ViaFreeze溫度以-2℃/min自35℃逐漸變化至-80℃。將冷凍袋轉移至液氮儲存中。 實例 4 - 解聚及冷凍保存
TIL077係由轉移性黑素瘤腫瘤塊(樣品)製成。將腫瘤樣品稱重且如下處理。S1=4.6 g。S2=4.6 g。
Tiss-U-Stor解聚：用無菌剪刀打開兩個CS50N袋，剪切無端口之末端。將S1=4.6 gm樣品及S2=4.6 gm樣品置放於CS50N袋中，且密封袋。將15 ml解聚培養基與30 ül抗生素合併且使用注射器經由袋之無針端口添加至密封袋中之各者中。將袋轉移至裝載在ViaFreeze中的組織解聚器，且開始解聚方案。解聚方案需要在1.5℃/min之速率下自環境溫度提高至35℃，且溫度保持在35℃下，同時解聚器活動。解聚器速率設定成240個循環/分鐘。隨後ViaFreeze之溫度保持在35℃，直至冷凍保存步驟。圖71展示解聚紀錄。
袋設置包括藉由導管經由管線過濾器直接連接至二級冷凍袋。將CS50袋中之解聚材料過濾至冷凍袋中且密封導管連接件。經由冷凍袋之無針端口緩慢添加1.5 ml Blood-stor (DMSO)，將袋置放於經設計用於最佳熱傳遞之卡匣中，且將卡匣置放回ViaFreeze中代替解聚器。
進行解聚後冷凍保存方案。冷凍循環將ViaFreeze溫度以-2℃/min自35℃逐漸變化至-80℃。圖71展示冷凍保存紀錄。將冷凍袋轉移至液氮儲存中。 實例 5 - 解聚及冷凍保存
TIL078係由轉移性黑素瘤腫瘤塊(樣品)製成。將腫瘤樣品稱重且如下處理。S1=11 g。S2=2 g。
Tiss-U-Stor解聚：用無菌剪刀打開兩個CS50N袋，剪切無端口之末端。分開腫瘤材料且將6.4 gm樣品置放於兩個CS50N袋中之各者中且密封袋。將15 ml解聚培養基與30 μl抗生素合併且使用注射器經由袋之無針端口添加至密封袋中之各者中。將袋轉移至裝載在ViaFreeze中的組織解聚器，且開始解聚方案。解聚方案需要在1.5℃/min之速率下自環境溫度提高至35℃，且溫度保持在35℃下，同時解聚器活動。解聚器速率設定成240個循環/分鐘。隨後ViaFreeze之溫度保持在35℃，直至冷凍保存步驟。圖72展示冷凍保存紀錄。
袋設置包括藉由導管經由管線過濾器直接連接至二級冷凍袋。將CS50袋中之解聚材料過濾至冷凍袋中且密封導管連接件。經由冷凍袋之無針端口緩慢添加1.5 ml Blood-stor (DMSO)，將袋置放於經設計用於最佳熱傳遞之卡匣中，且將卡匣置放回ViaFreeze中代替解聚器。
進行解聚後冷凍保存方案。冷凍循環將ViaFreeze溫度以-2℃/min自35℃逐漸變化至-80℃。圖72展示冷凍保存紀錄。將冷凍袋轉移至液氮儲存中。 實例 6 - 解聚及冷凍保存
TIL081係由轉移性黑素瘤腫瘤塊(樣品)製成。更新軟體以在單一方案中包括解聚及冷凍保存。圖73展示解聚及冷凍保存紀錄。如同先前實例，解聚器活動約53分鐘。(圖73A、圖73B)。解聚組織自解聚袋經由過濾器轉移至冷凍袋中，且返回至ViaFreeze以在距解聚過程開始約90分鐘(此時開始低溫冷卻)內進行冷凍保存。 實例 7 - 自小瓶製造
表 9 - 細胞冷凍保存及解凍
試劑/ 材料
試劑 製造商 目錄號
視細胞類型而定之培養基 NA NA
DPBS Sigma D8537-500ML
15 mL離心管 VWR 339650
血清學移液管(Stripette) 10mL Corning CLS4101
血清學移液管25 mL Corning CLS4251
血清學移液管5 mL Corning CLS4051
過濾移液管頭1000 µL (Tips 1000 µL filtered) StarLabs S1182-1730
錐蟲藍(Trypan Blue) Sigma T8154-100ML
表 10 - 設備
描述 製造商 部件編號 序列號/ 資產號
Powerpette pro 1-100 mL VWR 452-8344 NA
移液管ErgoOne 100-1000 µL Star Labs S7110-1000 NA
Megafuge 40R離心機 Hereus 75004518 41536283
血球計 Hawksley HC002 NA
水浴12 L VWR 462-0557 BP1912001
IncuSafe CO 2培育器 PHCBI MCO-170AIC-PE NA
自液氮移出冷凍小瓶且置於37℃水浴中直至細胞懸浮液剛好熔融。將細胞懸浮液置放於15 mL法爾康管中且用PBS注滿至10 mL，且以400 g離心10分鐘。傾析上清液。
對於細胞培養，使細胞集結粒再懸浮於預溫熱培養基中，最初以小體積(亦即2至3 mL)。根據下表，將黏附細胞株(亦即腫瘤株，HEK 293)添加至具有培養基之組織燒瓶中。以0.5至1×10 6個細胞/毫升之密度塗鋪非黏附細胞株(亦即T細胞、TIL、Jurkat細胞)。將燒瓶置放於潮濕的37℃培育器中且每2至3天更換培養基。
表11 - 不同容器中之黏附細胞之細胞接種密度
容器/燒瓶類型 接種密度 培養基體積mL
24孔 0.1×10 6 0.5至1
6孔 0.5×10 6 2至4
T 25 0.7×10 6 4至6
T 75 2.1×10 6 12至15
T 150 4.4×10 6 25至30
實例 8 - 由冷凍保存解聚腫瘤製造 .
製造過程
解凍起始材料
VIAThaw CB1000解凍系統用於控制儲存於冷凍袋中之冷凍保存樣品之加熱。將冷凍保存之細胞懸浮液解凍，隨後稀釋於由Life Technologies (Paisley, United Kingdom)製造之T細胞培養基(TCM)中。TCM含有80%洛斯維·帕克紀念研究所(Rosewll Park Memorial Institute，RPMI) 1640培養基及20% AIM V。細胞懸浮液經由70至100 μm過濾器過濾且離心，且移除上清液。使細胞集結粒再懸浮於補充有10%經照射胎牛血清(FBS)之TCM (Life Technologies, Auckland, New Zealand)中。
將Origin CS50袋中之解聚冷凍保存腫瘤(約16.5 ml)置放於VIAThaw CB1000解凍系統之解凍托盤中。將冷凍袋升溫至約0℃。 實例 9 - 效能
基於共同培養之效能方法定量藉由表現OKT3之目標細胞株活化之T細胞的百分比。活體內之TIL產物作用機制涉及經由pMHC-HLA呈現TIL肽，其在活體內結合於TCR。效能分析定量有效T細胞的百分比，定義為當藉由與表現OCT3抗原結合域之K562細胞株共同培養來特異性活化時，CD137、IFN-γ、TNFα或CD107a陽性的活T細胞除以總活T細胞。用於定量T細胞效能之標記物包括DRAQ7、CD45、CD2、CD107a、CD137、TNF-α及IFN-γ。
為量測效能，ITIL-168 DS細胞使用以下3種細胞株中之1種共同培養大約5小時：條件1-無刺激-背景細胞活性；條件2-K562細胞株-背景TCR-獨立反應性；條件3-針對OKT-3表現ScFv的K562細胞株-TCR誘導之T細胞刺激。
藉由流式細胞量測術分析所培養細胞且圈選活白血球以定量表現4種活化標記物中之至少1種的T細胞。對於穩定性測試，冷凍保存之DP細胞解凍、洗滌且靜置隔夜。
ITIL-168 TCR效能如下計算：步驟1)歸因於非特異性刺激的效能%獲自條件2；步驟2)歸因於CD3特異性及非特異性刺激的效能%獲自條件3；步驟3)歸因於CD3特異性刺激的效能%計算為條件3-條件2。
對於條件2及條件3，效能%為100%減去CD137-/IFN-γ-/TNFα-/CD107a- (亦即背景)之所有T細胞的百分比。此群體不產生至少一種標記物。 實例 10 - TIL 突起生長 及快速擴增
TIL製造過程在腫瘤切除、解聚、冷凍保存及視情況選用之包裝及裝運之後開始。運送可係在受控條件下在合格運送器中自腫瘤處理中心運送至Instil之製造設施。冷凍保存之腫瘤及T細胞使用受控條件解凍，且稀釋於由補充有10% FBS、兩性黴素B、慶大黴素、萬古黴素及IL-2之80%洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI) 1640培養基及20% AIM V構成之T細胞培養基(TCM) (本文中稱為ICMT)中。
藉由在封閉袋中離心來洗滌細胞，再懸浮於ICMT中且獲取樣品以細胞計數。以0.25×10 6個活細胞/毫升為目標將細胞懸浮液接種至具有ICMT之培養袋中，且在受控條件下培育直至製程之第8天。在第8天，獲取用於細胞計數之樣品且將等體積之ICMT添加至培養袋且在受控條件下培育。在第11天，獲取細胞計數且將等體積之ICMT添加至培養袋且在受控條件下培育。在第13天，獲得細胞計數，且藉由在袋中離心來濃縮TIL以提供1×10 6至20×10 6個活T細胞。
亦在第13天，使用抗CD3及經照射餵養細胞(同種異體PBMC)以及含有8%人類AB血清及IL-2之TCM (本文中稱為WTCM)活化1×10 6至20×10 6個活突起生長TIL。在靜態培養袋中在受控條件下培育TIL活化培養物至多6天。在培育第19天，進行細胞計數且將活化TIL接種於含有WTCM之生物反應器中。細胞在受控條件下培育至多6天。在第20天，向TIL擴增提供補充有IL-2之TCM之連續進料，直至收集目標劑量在製程之第27天之前或當天達成。
一旦達成收集劑量，對細胞進行計數，洗滌且藉由在補充有1%人類血清白蛋白(HSA)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中離心來濃縮。藥物產品(DP)袋中之TIL隨後冷卻至2至8℃且用含有16% HSA及20% DMSO之冷凍保護劑1:1調配，得到含有8.5% HSA及10% DMSO之PBS中之DP最終調配物。移出樣品體積以用於批次放行測試、參考及備份樣品。
使用預定義程式將調配之DP冷凍保存在CRF中直至產物達到指定溫度。冷凍保存之DP隨後轉移至液氮儲存，隨後在≤-130℃下運輸至臨床以用於投與。
表12-設備
設備/供應產品 製造商 型號或目錄號
Leukosep ficoll管 Greiner Bio-One Lrd 227288
PermaLife細胞培養袋，325 ml Origen Biomeical公司 PL325-2G
細胞培養擴增袋 Charter Medical有限公司 EXP-1L
WAVE 10L袋 Cytiva 29-1084-43
CT800.1 Sefia套組 Cytiva 20001
表13-試劑
試劑 製造商 目錄號 批次號 過期日期
T細胞培養基 Life Technologies 04196658P 2021537 2020年8月31日
γ照射之FBS Life Technologies 01190005H-RESERVE 2-2YBT2DS 2225231RP 2024年5月31日
普留淨(Proleukin)製造商小瓶(IL-2) Clinigen Group PLC 普留淨 801313T 2020年12月31日
等分Il-2儲備液 N/A N/A CTU-IL2/02/09/2019 2020年8月31日
慶大黴素/兩性黴素溶液(500×) Life Technologies R01510 2217613 2021年3月30日
萬古黴素製造商小瓶 Bowmed Ibisqus N/A 90260 2021年2月28日
萬古黴素等分試樣(50 mg/ml) N/A N/A CTU-12-06-2020 2021年2月28日
γ照射之人類AB血清 Gemini Bio-Products責任有限公司 100-812G H12Y00K 2020年9月30日
OKT-3製造商小瓶(1 g/ml) Miltenyi Biotec有限公司 170-076-116 6200108211 2020年10月17日
等分OKT-3 N/A N/A CYU-OKT3/05/05/2020 2020年10月17日
20%人類血清白蛋白 Nova Biologics公司 68982-0633-02 M848B6661 2021年11月27日
CryoSure DMSO WAK-Chemie Medical股份有限公司 WAK-DMSO-50 USP8C1S 2022年2月28日
實例 11
全規模運行在GMP條件下進行。此等運行中所用之ITIL-168製程包括使用冷凍保存之腫瘤消化、TIL突起生長階段(階段1)之0.25×10 6個活細胞/毫升接種目標、自TIL突起生長至TIL快速擴增階段(REP)之連續處理及最終產物之自動化調配及最終藥物產品之冷凍保存。
ITIL-168為用於治療已自至少一種先前療法線復發或難以用至少一種先前療法線治療的患有晚期黑素瘤之成人患者的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)療法。ITIL-168由單一輸注自患者之癌症組織分離及離體擴增之自體T細胞及靜脈內投與組成。製程改良已經隨著時間推移予以鑑別及實施，改良製程被稱作ITIL-168。表概述製程變化形式及實施。
表14 - 製造過程發展之概述
製程步驟 單元操作 / 變化 MS v1.0 MS v1.1 UTIL-01 ITIL‑168 製程
腫瘤消化物製備 腫瘤解聚 人工解聚於瓶子中 人工解聚於瓶子中 在袋中自動化解聚( 使用 Tiss-U-Stor 裝置) 在袋中自動化解聚(使用Tiss-U-Stor裝置)
腫瘤消化物調配 非冷凍保存 非冷凍保存 冷凍保存 冷凍保存
TIL突起生長 用於腫瘤消化物之培養容器 盤中之開放製程 盤中之開放製程 盤中之開放製程 袋中之封閉製程
接種密度 1×10 6個活細胞/毫升之目標 1×10 6個活細胞/毫升之目標 0.5×10 6個活細胞/毫升之目標 0.25×10 6個活細胞/毫升之目標
細胞計數測試方法 血球計 流式細胞量測術 流式細胞量測術 流式細胞量測術
材料 健大黴素及兩性黴素B 健大黴素及兩性黴素B 健大黴素及兩性黴素B 健大黴素、兩性黴素B 及萬古黴素
材料 熱不活化，且0.1 µm過濾FBS 熱不活化，且0.1 µm過濾FBS 熱不活化，且0.1 µm過濾FBS 熱不活化，且 0.1 µm 過濾 經照射 FBS
TIL REP 材料 熱不活化，且0.1 µm過濾人類AB供體 熱不活化，且0.1 µm過濾人類AB供體 熱不活化，且0.1 µm過濾人類AB供體 熱不活化 ， 且 0.1 µm 過濾經照射人類 AB 供體
TIL突起生長至REP TIL突起生長後，冷凍保存、解凍/洗滌及恢復 冷凍保存保持步驟及解凍1-3天後恢復 冷凍保存保持步驟及解凍1-3天後恢復 在無冷凍保存下連續處理 在無冷凍保存下連續處理
收集至藥物產品調配 藥物產品 Haemonetics Cell Saver 5 (人工調配至270 mL) Haemonetics Cell Saver 5 (人工調配至270 mL) Haemonetics Cell Saver 5 (人工調配至270 mL) Cytiva Sefia S-2000(自動化調配至110 mL )
藥物產品調配 藥物產品 非冷凍保存 非冷凍保存 冷凍保存 冷凍保存
用於兩個製程發展運行中之ITIL-168製造過程之概述展示於表 15中。兩個製程發展運行，標記為運行1 (TIL065)及運行2 (Biopartners 9251)，分別在GMP條件下以全規模進行且使用自患者收集之過量腫瘤及來源於供應商Biopartners之腫瘤。
在此等兩個製程發展運行期間，不進行針對生物負荷及最終產物無菌性、內毒素、支原體及外觀測試之製程內測試，因為此等運行主要意欲評估在製程改良之後製造過程效能及產物品質，以及在製程驗證運行之前在GMP條件下充當製造操作員之訓練運行。
表15 -  ITIL-168 製造過程之製程流程圖
製程步驟 天 單元操作 製程控制 描述
                 
接收及放行 冷凍保存腫瘤消化物接收、檢查及放行          ●         冷凍保存腫瘤消化物之接收、檢查及放行
   ↓            
TIL 突起生長 1 冷凍保存腫瘤消化物解凍及洗滌             ●         在補充有FBS、IL-2及抗微生物試劑之培養基中的腫瘤消化物解凍、洗滌及稀釋
↓
1 TIL突起生長接種 → 細胞計數    ●         在補充有FBS、IL-2及抗微生物試劑之培養基中在培養袋中接種經洗滌細胞
   ↓            
1 TIL突起生長培育 ●在補充有FBS、IL-2及抗微生物試劑之培養基中在培養袋中培育經洗滌細胞至多12天
   ↓            
8 TIL突起生長培養基添加 → 細胞計數    ●         TIL在補充有FBS、IL-2及抗微生物試劑之培養基中持續擴增
   ↓            
11 TIL突起生長培養基添加 → 細胞計數    ●         TIL在補充有FBS、IL-2及抗微生物試劑之培養基中持續擴增
   ↓            
13 TIL突起生長濃縮 → 細胞計數    ●         藉由在袋中離心之TIL濃縮
   ↓            
TIL 快速擴增階段 13 TIL活化 → 細胞計數    ●         在培養袋中在含有人類AB血清及IL-2之培養基中用抗CD3及經照射餵養細胞進行TIL活化至多6天 ●         若可用，則冷凍保存過量TIL
   ↓            
19 生物反應器中之TIL接種 → 細胞計數    ●         補充有人類AB血清及IL-2之培養基中生物反應器中TIL接種至多8天
   ↓            
20-27 生物反應器中之TIL擴增 (灌注)    → 細胞計數    ●         具有補充有IL-2之培養基之連續進料的生物反應器袋中之TIL擴增
   ↓            
收集 X 1 收集洗滌及濃縮    細胞計數    ●         洗滌以減少雜質及濃縮TIL
   ↓            
藥物產品調配 X 1 調配藥物產品 → 細胞計數、劑量、存活率、屬性/純度、效能    ●         使用冷凍保護劑之TIL調配
   ↓            
冷凍保存 X 1 藥物產品冷凍保存 → 溫度    ●         藥物產品之受控速率冷凍
   ↓            
放行及運送 藥物產品儲存、包裝及運輸 → 溫度    ●         產物儲存在≤-130℃下且放行 ●         運送至臨床/輸注中心
TIL突起生長及REP使用表12及表13中所示之材料如實例10中進行。
對於兩個運行(運行1及運行2)，根據批次製造紀錄(BMR)，對於TIL突起生長階段或階段1在第1天、第8天、第11天及第13天，及對於TIL快速擴增階段(REP)或階段2在第13天、第19天、第22天及第25天量測總CD3+細胞計數。圖76A及圖76B分別展示在TIL突起生長階段(階段1)及TIL REP階段(階段2)中兩個運行的總CD3+細胞計數。圖76B中所示之資料表明，對於兩個運行，REP階段結束時實現＞1×10 10個CD3+細胞，得到符合5×10 9至5×10 10個CD3+細胞之劑量允收標準的兩個批次。
對於兩個運行在第1天、第8天、第11天、第13天及第25天，亦量測存活率(活CD3+細胞之百分比)。圖76C展示在製造過程期間及REP階段即將結束時提高的存活率且兩個運行均滿足＞70%之最終產物標準。
針對兩個運行，自細胞計數資料計算快速擴增階段(REP)之擴增倍數。另外，亦評估兩個製程發展運行之最終產物品質屬性，諸如劑量、存活率、效能、T細胞表型及T細胞子集。
表16中所呈現之資料表明，在製程改良之後，ITIL-168製造過程類似於歷史製程進行且產生符合規格要求之最終產物品質屬性。
表1 6 -  ITIL-168 製造過程效能及產物品質屬性
運行 REP 期間之擴增倍數( 絕對) 劑量 ( 總活CD3+ 細胞) 存活率 (%) 效能 1 (%)
允收標準/規格要求 NA 5×10 9至5×10 10 ≥ 70 ≥ 40
觀測到之歷史範圍 395 - 7526 (n=22) 7.90×10 9至6.25×10 10(n=23) 80 - 99 (n=23) 所測試的製程中的歷史保留
運行1 1350 3×10 10 90 63.2
運行2 1700 2×10 10 88 65.2
1效能計算為對CD137、CD107a、TNF-α及IFN-γ中之一或多者呈陽性的所有活CD2+細胞的出現頻率
評估兩種TIL製劑，TIL065及由Biopartners 9251製備之TIL，以確定T細胞子集之相對比例。TIL065 (圖79A)及Biopartners 9251 (圖79B) TIL製劑中之CD4+及CD8+細胞兩者中，細胞主要為中央記憶(CM；CD45+CD62+)及效應記憶(EM；CD45+CD62-)。圖79C展示大部分T細胞係定型之CD4+或CD8+ T細胞。
表17 -  ITIL-168最終產物T細胞表型
運行 子集 初始 (%) 中央記憶 (%) 效應記憶 (%) 效應 (%)
運行1 CD4 0.00 69.02 30.98 0.00
CD8 1.28 50.24 46.82 1.66
運行2 CD4 0.14 66.95 32.77 0.14
CD8 0.42 60.64 38.11 0.83
表18 - ITIL-168最終產物T細胞子集
運行 CD4-CD8- (%) CD8+ (%) CD4+ (%) CD4+CD8+ (%)
運行1 9.14 68.69 20.49 1.90
運行2 3.12 70.39 24.59 1.69
              
實例 12 - 投與
療法
個體接受環磷醯胺及氟達拉賓(fludarabine)之淋巴球耗乏化學療法方案。療法經設計以降低諸如調節T細胞之抑制細胞的影響且增加促淋巴球生長細胞介素(例如，IL-7及IL-15)的表現。在淋巴球耗乏化學療法之前及期間開始水合方案。抗微生物及抗真菌預防在開始淋巴球耗乏化學療法之前開始。評估及管理發熱及嗜中性白血球缺乏症。在淋巴球耗乏化學療法之前開始非類固醇止吐療法且視需要繼續。
淋巴球耗乏化學療法如下投與。環磷醯胺及氟達拉賓投與之劑量係基於在基線就診時獲取之體重評估來計算。在肥胖個體(身體質量指數＞35)中，使用實際體重。環磷醯胺之劑量係基於體重，且氟達拉賓之劑量係基於體表面積。劑量可根據劑量分組上之實踐捨入。下表展示建議劑量、投與途徑、輸注體積及持續時間：
表19-淋巴球耗乏化學療法方案
天 藥物 劑量 途徑 投與
-7 氟達拉賓 25 mg/m 2 IV 於10-100ml 0.9% NaCl中，經大約30分鐘
環磷醯胺 60 mg/kg IV 於500ml 0.9% NaCl中，經大約1小時
-6 氟達拉賓 25 mg/m 2 IV 於10-100ml 0.9% NaCl中，經大約30分鐘
環磷醯胺 60 mg/kg IV 於500ml 0.9% NaCl中，經大約1小時
-5 氟達拉賓 25 mg/m 2 IV 於10-100ml 0.9% NaCl中，經大約30分鐘
-4 氟達拉賓 25 mg/m 2 IV 於10-100ml 0.9% NaCl中，經大約30分鐘
-3 氟達拉賓 25 mg/m 2 IV 於10-100ml 0.9% NaCl中，經大約30分鐘
-2 停藥日
-1 停藥日
表20 - - 氟達拉賓劑量調節
肌酸酐廓清率(藉由科-高式(Cockcroft-Gault formula)量測) 氟達拉賓劑量
＞/= 70 mL/min 25 mg/m 2
51-69 mL/min 20 mg/m 2
在TIL輸注之前個體用抗組織胺及乙醯胺苯酚前驅給藥。輸注袋之內容物使用非白血球耗乏過濾器(例如＞/=170微米之管線/導管過濾器)輸注。個體接受至多8次劑量之靜脈內IL-2用於輸注後支援。在完成TIL輸注後投與IL-2，第0天開始且繼續至第4天。 實例 13 - 治療結果
總計44名患有轉移性皮膚黑素瘤之患者經歷腫瘤切除術及開始TIL突起生長製造(階段1)。在此等44名患者中，42名個別患者完成階段1，2名嘗試失敗。三十一名患者繼續進行REP製造(階段2)。一名TIL突起生長階段1製造失敗且實施經修訂階段1製造過程，其實現了成功階段2製造。隨後治療患者。出於以下原因，不選擇剩餘12名來開始REP：8名歸因於患者狀態之間發臨床惡化，從而使其不適合TIL療法；2名患者由於其他療法之臨床改良而不再需要TIL；1名患者不能確保治療之資金；且1名由於所切除樣本上缺乏腫瘤組織而製造失敗。四名患者製造成功，然而，認為該等患者對於TIL療法臨床上不適合且因此未治療。
在44個切除之腫瘤中，2個製造失敗，獲得95%製造成功率。用利用標準製造過程製得之TIL產物治療二十七名患者。在TIL製造完成時，認為此等患者中之6名對於完全治療方案臨床上不適合且接受明顯較低劑量之調節化學療法及輸注後IL-2，且因此自分析排除。一名患者進行腫瘤切除，其不滿足起始標準TIL突起生長製造步驟(階段1)之標準。因此，起始經修改階段1，其確實能夠實現快速擴增方案(階段2)及最終產物調配，儘管處於極低最終細胞劑量(1.7×10 9)下。因為此產物係使用經修改的製造過程產生且產生低細胞劑量，所以其不視為表示MS許可製程，且因此臨床資料自分析排除。
收集且分析剩餘21名患者之人口統計資料、基線患者特徵、治療細節及處置以及臨床功效及安全性結果。截至分析截止日期，此等患者具有距離TIL輸注日期52.2個月(範圍：4.6、98.8個月)之中值可能隨訪時間。
在此等21名患者中，大部分(71%)為男性，且TIL治療時的中值年齡為45歲(範圍：16、68)。在基線，所有患者均患有IV期轉移性皮膚黑素瘤，中值為自從原始診斷為黑素瘤39個月(範圍：8、177)。大部分(67%)患者具有超過3個疾病部位中報導之病變，包括7名(33%)在TIL治療時記錄有腦轉移。先前全身性療法之中值數目為2個(範圍：1、9)。百分之五十二(52%)之患者具有BRAF突變，其所有在存在或不存在MEK抑制劑之情況下已接受BRAF抑制劑且經歷BRAF抑制劑下進展。除兩名患者以外所有患者(90%)已接受至少一種先前檢查點抑制劑，其中12名(57%)已接受PD-1抑制劑(納武單抗(nivolumab)或派立珠單抗(pembrolizumab))。另外，8名(38%)接受按順序給與之伊匹單抗(ipilimumab)及納武單抗或派立珠單抗，且4名(19%)同時接受伊匹單抗及納武單抗。在切除腫瘤用於TIL產生之前，20名(95%)患有復發性或難治性進行性黑素瘤，且1名(5%)由於不耐受性而在TIL療法之前停止治療。
臨在接受TIL之前，10名(48%)患者具有升高之血清乳糖去氫酶(LDH)含量，其中7名(33%)在正常範圍上限(ULN)之1與2倍之間且3名(14%)高於ULN之2倍。20名患者如以目標病變之病變尺寸總和(SLD)所量測之基線腫瘤負荷可用；中值基線SLD為100 mm (範圍：13，281)。 TIL治療
所有21名患者在TIL輸注之前接受2次劑量之環磷醯胺及5次劑量之氟達拉賓作為調節化學療法。輸注之TIL細胞之中值總數目為31.9×10 9(範圍：7.9×10 9，62.5×10 9)。IL-2劑量之中值總數目為8 (範圍：4，11)。患者留院持續中值10天(範圍：7、15)。三名(14%)患者在治療階段期間收住入ICU。
報導在TIL治療階段期間臨床上顯著之AE。在調節化學療法階段期間報導之常見AE (≥10%)包括嗜中性白血球缺乏症(43%)及噁心(19%)，且大體上與此等化學療法劑之副作用概況一致。
TIL輸注後發作之常見AE包括血小板減少症(62%)、發熱(57%)、惡寒戰慄(rigors) (43%)、心搏過速(29%)、嗜中性白血球缺乏症(29%)、肺水腫(24%)、血管滲漏(24%)、皮疹(19%)、心房微顫(14%)、心血管不穩定性(14%)、胸腔感染(14%)及水腫(14%) ( 表 21)。此等AE與其他TIL試驗(Dafni等人，2019；Rohaan等人，2018)中報導之AE一致。
製造過程階段1失敗但用由經修改之製造過程產生之產物治療的患者在TIL療法後第6天死亡，此歸因於由腎衰竭、流體過載及可能敗血症加劇之大規模腫瘤負荷。 表 21. TIL 輸注後發作之 AE ( 所有經治療個體 )
AE 項 - n (%) 所有經治療個體 (N=21)
血小板減少症 13 (61.9)
發熱 12 (57.1)
惡寒戰慄 9 (42.9)
嗜中性白血球缺乏症 6 (28.6)
心搏過速 6 (28.6)
肺水腫 5 (23.8)
血管滲漏 5 (23.8)
皮疹 4 (19.0)
心房微顫 3 (14.3)
心血管不穩定性 3 (14.3)
胸腔感染 3 (14.3)
水腫 3 (14.3)
混亂 2 ( 9.5)
低血鉀症 2 ( 9.5)
低血壓 2 ( 9.5)
神經缺陷 2 ( 9.5)
腎損傷 2 ( 9.5)
呼吸道敗血症 2 ( 9.5)
癲癇 2 ( 9.5)
敗血症 2 ( 9.5)
白斑病 2 ( 9.5)
體重增加 2 ( 9.5)
喘鳴 2 ( 9.5)
咳嗽 1 ( 4.8)
腹瀉 1 ( 4.8)
語言障礙 1 ( 4.8)
植入症候群 1 ( 4.8)
幻覺 1 ( 4.8)
嗜睡 1 ( 4.8)
PICC管感染 1 ( 4.8)
肋膜積液 1 ( 4.8)
感染性肺炎(pneumonia) 1 ( 4.8)
非感染性肺炎(pneumonitis) 1 ( 4.8)
呼吸問題 1 ( 4.8)
呼吸速迫 1 ( 4.8)
在治療階段期間量測末梢血液計數。在開始調節化學療法時觀測到嗜中性白血球、血小板、淋巴球、白血球計數及血紅素減少之趨勢。血球計數及血紅素含量一般在TIL輸注之後1至4天達到其最低點。通常在TIL輸注日期之後大約7天觀測到血液計數恢復至基線水準。
實施製造過程中之近期變化以改良穩固性且實現利用集中式製造之多中心臨床試驗。在此更新中，將消化之腫瘤材料冷凍保存以延長穩定性。重要的是，在用預先冷凍保存下製得之產物治療之四名患者中，所觀測到之AE概況與在系列中治療之其他患者(表22)且與在其他TIL產物之臨床試驗中報導之AE概況大體上一致。 表22.  TIL輸注後發作之AE (用Cryo-in產物治療之個體)
AE項- n (%) 所有經治療個體 (N=4)
血小板減少症 4 (100)
發熱 2 (50.0)
皮疹 2 (50.0)
惡寒戰慄 2 (50.0)
低血壓 1 (25.0)
腎損傷 1 (25.0)
血管滲漏 1 (25.0)
白斑病 1 (25.0)
21名患者中有十五名藉由包括目標病變之放射學量測之連續CT及/或MRI掃描進行疾病評估。在此等患者當中，定量反應率(不需要反應確認)為53%，包括2名(13%)達成CR之患者及6名(40%)達成PR之患者(表23)。 表23. 最佳總體反應之概述(功效可評估分析集)
   功效可評估分析集 (N=15)
最佳總體反應   
完全反應(CR) 2 (13.3)
95% CI (克-皮法(Clopper-Pearson method)) 1.7，40.5
     
部分反應(PR) 6 (40.0)
95% CI (克-皮法) 16.3，67.7
     
穩定疾病(SD) 3 (20.0)
95% CI (克-皮法) 4.3，48.1
     
進行性疾病(PD) 4 (26.7)
95% CI (克-皮法) 7.8，55.1
     
反應率(CR+PR) 8 (53.3)
95% CI (克-皮法) 26.6，78.7
     
疾病控制率(CR+PR+SD) 11 (73.3)
95% CI (克-皮法) 44.9，92.2
基於定量及定性反應兩者之包括所有患者之反應率為57%，包括3名(14%)達成CR之患者及9名(43%)達成PR之患者。兩名額外患者已對BRAF抑制劑達拉非尼(dabrafenib)產生抗性且在轉為TIL治療之前正在經歷療法下疾病進展。臨在TIL療法之前停達拉非尼，且在TIL之後大約1至2週重新開始，以預防通常伴隨達拉非尼中斷之快速腫瘤生長。此等2名患者中之各者在TIL之後達成定性反應(1名持久CR及1名PR)。兩名患者隨後一旦在TIL之後反應，中斷達拉非尼。因為此等患者均患有對達拉非尼變得難治之疾病，所以推斷其在TIL之後經歷之臨床益處係歸因於TIL而非達拉非尼之暫時恢復為合理的。因此，對反應進行敏感性分析，包括此等患者作為反應者。在此敏感性分析中，反應率為14/21 (67%)，其中4名(19%)完全反應者及10名(48%)部分反應者(表24)。 表24. 最佳總體反應、敏感性分析之概述(所有經治療個體)
   所有經治療個體 (N=21)
最佳總體反應   
完全反應(CR) 4 (19.0)
95% CI (克-皮法) 5.4，41.9
     
部分反應(PR) 10 (47.6)
95% CI (克-皮法) 25.7，70.2
     
穩定疾病(SD) 4 (19.0)
95% CI (克-皮法) 5.4，41.9
     
進行性疾病(PD) 3 (14.3)
95% CI (克-皮法) 3.0，36.3
     
反應率(CR+PR) 14 (66.7)
95% CI (克-皮法) 43.0，85.4
     
疾病控制率(CR+PR+SD) 18 (85.7)
95% CI (克-皮法) 63.7，97.0
反應一般根據重要基線及疾病特徵，包括年齡、疾病部位數目、先前療法線數目、先前BRAF抑制劑、先前PD-1抑制劑、基線腦轉移及基線腫瘤負荷在所有子群之間一致。值得注意地，在用最類似於ITIL-168之製造過程治療之4名患者中，總體反應率(75%)及CR率(25%)與更廣群體一致。在具有基於CT及/或MRI掃描之定量反應之15名患者中，14名具有詳細腫瘤量測值且相對於基線腫瘤減小之最大百分比呈現於瀑布圖中(圖74)。一名患者具有PD之最佳總體反應，但並未報導任何治療後目標病變量測值(藉由觀測新病變測定之進展)且因此未在圖中呈現。
根據定量反應資料(N=15)中值無進展存活期(PFS)時間為6.7個月，其中4名患者具有持續反應(2個CR及2個PR)，在分析截止時無任何後續療法。基於定量及定性反應資料(N=21)中值PFS時間為6.7個月，其中5名個體具有持續反應(3個CR及2個PR)而無任何後續療法。所有21名治療患者之中值總存活(OS)時間為21.3個月(圖75A)。具有定量反應資料之15名患者之中值OS時間為16個月(圖75B)。然而，未獲得反應者(僅根據定量反應，N=8)之中值OS時間，而無反應者(N=7)之中值OS時間為6.5個月(圖75C)。 實例 14- 來自冷凍保存腫瘤消化物之 TIL
自21名個體切除轉移性黑素瘤、解聚及製備TIL。將來自4名個體之經解聚之腫瘤組織冷凍保存，隨後在TIL製備之前解凍。輸注個體且評估反應結果。臨床反應描繪於圖77中。 表 25呈現對包括解聚之後的冷凍保存之TIL製劑與未經歷冷凍保存步驟之TIL製劑的治療反應。
表 25 - 按照製造過程之治療反應 ( 所有經治療之個體 ，N = 21)
最佳反應 - n (%) 新鮮加入(N = 17) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 21)
    完全反應(CR) 2 (12) 1 (25) 3 (14)
    部分反應(PR) 7 (41) 2 (50) 9 (43)
    穩定疾病(SD) 3 (18) 1 (25) 4 (19)
    進行性疾病(PD) 3 (18) 0 (0) 3 (14)
    不可評估(NE) 2 (12) 0 (0) 2 (9)
反應率(CR + PR) 9 (53) 3 (75) 12 (57)
疾病控制率(CR + PR + SD) 12 (71) 4 (100) 16 (76)
注意：反應係基於成像評估以及臨床評估。排除起始後續療法後之反應。
表 26展示 表 25中之反應之子集，代表在TIL製備及投與之前經歷PD-1抑制劑治療之個體。
表26 - 按照製造過程之治療反應 ( 利用先前PD-1 抑制劑之所有經治療個體 ，N = 12)
最佳反應 - n (%) 新鮮加入(N = 8) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 12)
    完全反應(CR) 0 (0) 1 (25) 1 (8)
    部分反應(PR) 3 (38) 2 (50) 5 (42)
    穩定疾病(SD) 1 (13) 1 (25) 2 (17)
    進行性疾病(PD) 3 (38) 0 (0) 3 (25)
    不可評估(NE) 1 (13) 0 (0) 1 (8)
反應率(CR + PR) 3 (38) 3 (75) 6 (50)
疾病控制率(CR + PR + SD) 4 (50) 4 (100) 8 (67)
注意：反應係基於成像評估以及臨床評估。排除起始後續療法後之反應。
表 27呈現用包括在解聚之後的冷凍保存(冷凍加入)的TIL製劑相對於在突起生長及擴增之前未經歷冷凍保存步驟(新鮮加入)的TIL製劑治療之個體的人口統計資料。
表 27 - 按照製造過程之人口統計資料及基線特徵 ( 所有經治療之個體 ，N = 21)
   新鮮加入(N = 17) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 21)
TIL治療時之年齡，中值(Min，Max) 43 (16, 68) 56 (36, 59) 45 (16, 68)
男性，n (%) 11 (65) 4 (100) 15 (71)
基線處之疾病部位數目，中值(Min，Max) 4 (2, 10) 4 (2, 5) 4 (2, 10)
先前全身性方案之數目，中值(Min，Max) 3 (1, 5) 2 (1, 9) 2 (1, 9)
自原始診斷至TIL治療的月數，中值(Min，Max) 39.8 (8.2, 116.6) 27.3 (11.0, 176.6) 38.7 (8.2, 176.6)
基線時之IV期疾病，n (%) 17 (100) 4 (100) 21 (100)
腦轉移病史，n (%) 6 (35) 2 (50) 8 (38)
基線處之腦轉移，n (%) 5 (29) 2 (50) 7 (33)
先前BRAF抑制劑，n (%) 9 (53) 2 (50) 11 (52)
先前檢查點抑制劑，n (%) 15 (88) 4 (100) 19 (90)
先前PD-1抑制劑，n (%) 8 (47) 4 (100) 12 (57)
先前派立珠單抗，n (%) 6 (35) 2 (50) 8 (38)
先前納武單抗，n (%) 3 (18) 2 (50) 5 (24)
先前放射線療法，n (%) 7 (41) 4 (100) 11 (52)
先前手術(不包括用於TIL生產的腫瘤切除)，n (%) 16 (94) 3 (75) 19 (90)
基線LDH含量升高，n (%) 8 (47) 2 (50) 10 (48)
           
a. 基於具有基線目標病變之所報導病變尺寸總和(SLD)之20名個體。未報導基線SLD之一名個體接受冷凍加入產物。
表 28呈現對於在TIL製備及投與前經歷用PD-1抑制劑治療之個體子集，用包括在解聚之後的冷凍保存的TIL製劑相對於未經歷冷凍保存步驟的TIL製劑治療之個體的人口統計資料。
表2 8 - 按照製造過程之人口統計資料及基線特徵 ( 利用先前PD-1 抑制劑之所有經治療個體 ，N = 12)
   新鮮加入(N = 8) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 12)
TIL治療時之年齡，中值(Min，Max) 50.5 (33, 64) 56 (36, 59) 55 (33, 64)
男性，n (%) 3 (38) 4 (100) 7 (58)
基線處之疾病部位數目，中值(Min，Max) 4 (3, 10) 4 (2, 5) 4 (2, 10)
先前全身性方案之數目，中值(Min，Max) 3.5 (2, 5) 2 (1, 9) 2.5 (1, 9)
自原始診斷至TIL治療的月數，中值(Min，Max) 58.4 (8.2, 116.6) 27.3 (11.0, 176.6) 36.4 (8.2, 176.6)
基線時之IV期疾病，n (%) 8 (100) 4 (100) 12 (100)
腦轉移病史，n (%) 2 (25) 2 (50) 4 (33)
基線處之腦轉移，n (%) 1 (13) 2 (50) 3 (25)
先前BRAF抑制劑，n (%) 4 (50) 2 (50) 6 (50)
先前檢查點抑制劑，n (%) 8 (100) 4 (100) 12 (100)
先前PD-1抑制劑，n (%) 8 (100) 4 (100) 12 (100)
先前派立珠單抗，n (%) 6 (75) 2 (50) 8 (67)
先前納武單抗，n (%) 3 (38) 2 (50) 5 (42)
先前放射線療法，n (%) 2 (25) 4 (100) 6 (50)
先前手術(不包括用於TIL生產的腫瘤切除)，n (%) 7 (88) 3 (75) 10 (83)
基線LDH含量升高，n (%) 4 (50) 2 (50) 6 (50)
           
a. 基於具有基線目標病變之所報導病變尺寸總和(SLD)之20名個體。未報導基線SLD之一名個體接受冷凍加入產物。
表 29呈現用包括在解聚之後的冷凍保存的TIL製劑相對於未經歷冷凍保存的TIL製劑治療之個體中IL-2投與之人口統計資料。
表 29 - 按照製造過程之TIL 及IL-2 給藥 ( 所有經治療之個體 ，N = 21)
   新鮮加入(N = 17) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 21)
輸注之TIL細胞之總數(×10 9個細胞)，中值(Min，Max) 36.9 (10.0, 62.5) 19.9 (7.9, 32.9) 31.9 (7.9, 62.5)
IL-2給藥之總數，中值(Min，Max) 8 (4, 11) 8.5 (6, 9) 8 (4, 11)
           
表 30呈現對於在TIL製備及投與前經歷用PD-1抑制劑治療之個體子集，用包括在解聚之後的冷凍保存的TIL製劑相對於未經歷冷凍保存的TIL製劑治療之個體中IL-2投與之人口統計資料。
表30 - 按照製造過程之TIL 及IL-2 給藥 ( 利用先前PD-1 抑制劑之所有經治療個體 ，N = 12)
   新鮮加入(N = 8) 冷凍加入(N = 4) 總計(N = 12)
輸注之TIL細胞之總數(×10 9個細胞)，中值(Min，Max) 37.2 (25.3, 53.0) 19.9 (7.9, 32.9) 32.4 (7.9, 53.0)
IL-2給藥之總數，中值(Min，Max) 7.5 (6, 9) 8.5 (6, 9) 8 (6, 9)
           
實例 15-T 細胞子集之表徵
使用可固定存活性染料 eF450 之活 / 死染色。TIL在2× PBS中洗滌且再懸浮於1 ml PBS中且添加1 μL可固定存活性染料eF450。將混合物脈衝渦旋且在4℃下培育20-30分鐘。添加10 ml PEF (PBS + 2 mM EDTA + 0.5% FCS)且將細胞離心500 g×3 min以集結。將上清液傾倒出，且將細胞再懸浮於750 μL PEF中。將40 μL細胞添加至15個孔中以染色。
用抗體對細胞進行表面染色。藉由在4℃下將2 µL抗人類FcR添加至各孔中來阻斷孔5分鐘。主混合物由以下抗體構成：i. CD45RO - FITC (2 μL/孔)；ii. CD8 - PE-Vio770 (0.5 μL/孔)；iii. CD62L - APC (2 μL/孔)；iv. CD4 - APC-Cy7 (2 μL/孔)。將6.5 μL混合物添加至孔中之各者中。將2 μL之以下抗體中之各者添加至適當孔中，如所指示：
表31 - 細胞表面標記物
樣品編號 抗體(PE) 抗體(eF710)
ISO mIgG1同型 mIgG1同型
1 SLAM GITR
2 CD49d CD2 (1 μL)
3 CD134 CD137
4 CD28 CD27
5 HVEM LIGHT
6 TIM-3 CTLA-4
7 CD160 PD-1
8 BTLA LAG-3
9 ILT-2 TIGIT
10 KIR ICOS
11 CX3CR1 CD95
12 LDL-R (1 μL) CD39
在4℃下培育20-30分鐘之後，添加150 μL PEF且將細胞離心(500 g，3分鐘，RT)以集結細胞。移除上清液，且將細胞再懸浮於100 μL PFA (4%)中且在4℃下培育10分鐘。移除PFA，且使細胞再懸浮於100 μL PEF中且儲存於4℃下直至分析。 實例 16
在解聚之後經歷冷凍保存之TIL製劑中的T細胞子集之相對比例與未冷凍保存之TIL製劑中的T細胞子集相比較。
相比於未冷凍保存之TIL製劑，在經歷冷凍保存之TIL製劑範圍內，效應細胞及幹細胞記憶亞群實質上減少。觀測到總T細胞(圖81A)、CD4+ T細胞(圖81B)及CD8+ T細胞之關係(圖81C)。 實例 17- 經基因修飾之 TIL
表32 - 試劑及設備
試劑 製造商 目錄號
15 mL聚丙烯離心管 Appleton Woods AB031
50 mL聚丙烯離心管 Appleton Woods AB028
杜爾貝寇氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Sigma-Aldrich D8537-24X500ML
胎牛血清(熱不活化) Sigma-Aldrich F9665-500ML
TCM- CT4834/GIBCO CUSTOM P158718 Gibco   
青黴素-鏈黴素 Sigma-Aldrich P0781-100ML
TC 6孔盤 StarLab CC7682-7506
無菌1.5 mL埃彭道夫管(Eppendorf) StarLab S1615-5510
非TC平底96孔盤 Falcon 353072
96孔U底盤 Falcon 351177
FACS管 SLS 352063
TC 24孔盤 StarLab CC7682-7524
用於懸浮培養物之微量盤，96孔，F底 Grenier, Bio-One 655185
T細胞TransACT (TM)，人類 Miltenyi 130-111-160
健大黴素兩性黴素 Invitrogen (ThermoFisher Scientific) 10184583
普留淨(Aldesleukin) IL-2 Novartis PL-00101/0936
Heraeus Megafuge 40R，冷藏離心 Thermo Scientific 75004518
IncuSafe CO2培育器 PHCBI MCO-170AIC-PE
NovoCyte 3005流式細胞儀系統(CE-IVD) Agilent Technologies 2010064D
NovoExpress軟體 Agilent Technologies   
自液氮儲存移出腫瘤消化物冷凍小瓶且在37℃水浴中解凍，直至細胞懸浮液剛好熔融(D1)。將細胞懸浮液移出至15 mL法爾康管，用PBS注滿至10 mL，以400 g離心5分鐘且傾析上清液。
將細胞集結粒再懸浮於預溫熱之適當T細胞培養基中，且使用錐蟲藍進行細胞計數以測定存活率。以1×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮細胞。
將待未活化培養之細胞以0.5×10 6個細胞/毫升再懸浮且將2 ml (1×10 6個細胞)置放於具有IL-2 (3000 IU/mL)之24孔組織培養盤之孔中。細胞在潮濕的37℃培育器中培養直至轉導，每2至3天添加IL-2 (3000 IU/mL)。
對於待在D3及D4轉導之細胞，細胞活化發生在D1。對於待在D7及D8轉導之細胞，細胞活化發生在D5。
對於TIL活化，將0.5×10 6個細胞/毫升置於具有3000 IU/mL IL-2之24孔組織培養盤中。每1×10 6個細胞之TIL懸浮液添加10 μL T細胞TransACT (TM) (1:1比率)且將細胞在37℃培育器中培育48小時
轉導第一天(D3或D7)
自24孔盤收集細胞至15 mL法爾康管中，用10 mL TCM注滿且以400 g旋轉5分鐘。使用錐蟲藍計數細胞且以1×10 6個細胞/毫升再懸浮。
使用1×10 5個細胞(100 µL)/96孔平底盤孔用於各轉導方法。若在24孔盤中轉導，則置放1×10 6個細胞/孔(500 µL)。若在6孔盤中轉導，則置放5×10 6個細胞/孔(2 mL)。
藉由再懸浮於TCM中至100 µl/10 5個細胞/條件之最終值(或24孔及6孔盤之適當密度及體積)製備豆狀病毒(MOI5)及IL-2 (3000 IU/mL)之主混合物。製備用於孔數目+1的主混合物體積以考慮移液損失。
對於NT細胞(偽處理(MOCK))，在96孔平底盤中製備TCM及IL-2 (3000 IU/mL)/100 µL的主混合物。對於24孔及6孔盤，分別使偽處理T細胞再懸浮於具有IL-2 (3000 IU/mL)之500 µL及2 mL中。
自埃彭道夫或15 mL法爾康管中之細胞移除上清液且取決於條件每1×10 5個細胞使細胞再懸浮於適當的100 µL主混合物中(或24孔及6孔盤之適當密度及體積)。
相應地，各條件適當地再懸浮且轉移細胞至非TC平底96孔、24孔或6孔盤上。
在96孔盤轉導中添加200 μL PBS至周圍孔以防止蒸發。
細胞在潮濕的37℃培育器中培育隔夜。
轉導第二天(D4或D8)
藉由自96孔平底盤上下再懸浮且轉移至96孔U底盤來收集細胞。(自24孔或6孔盤收集至15 mL法爾康管中)。以400 g旋轉盤5分鐘且用TCM洗滌細胞。
對於各轉導方法，在96孔平底盤中使用1×10 5個細胞(100 µL)/孔。若在24孔盤中轉導，則置放1×10 6個細胞/孔(500 µL)。若在6孔盤中轉導，則置放5×10 6個細胞/孔(2 mL)。
製備豆狀病毒(MOI5)及IL-2 (3000 IU/mL)之主混合物時，依條件而定，再懸浮於TCM中至100 µl/10 5個細胞之最終值(或24孔及6孔盤之適當密度及體積)。製備用於孔數目+1的主混合物體積以考慮移液損失。
對於NT細胞(偽處理)，對於96孔平底盤製備TCM及IL-2 (3000 IU/mL)/100 µL的主混合物。對於24孔及6孔盤，分別使偽處理T細胞再懸浮於具有IL-2 (3000 IU/mL)之500 µL及2 mL中。
自埃彭道夫或法爾康管中之細胞移除上清液且取決於條件，每1×10 5個細胞使細胞再懸浮於適當的100 µL主混合物中(或24孔及6孔盤之適當密度及體積)。
相應地，各條件適當地再懸浮且轉移細胞至非TC平底96孔、24孔或6孔盤上。在96孔盤轉導中添加200 μL PBS至周圍孔以防止蒸發。細胞在潮濕的37℃培育器中培育隔夜。
次日，將細胞轉移至新96孔圓底盤、24孔或6孔盤中的具有IL-2 (3000 IU/mL)之新鮮培養基中，且在潮濕的37℃培育器中培育72小時。
96孔盤之最終體積為200 μL/孔；24孔盤之最終體積為2 mL/孔；6孔盤之最終體積為5 mL/孔。每2至3天添加IL-2 (3000 IU/mL)。
針對轉導效率，D3+D4轉導在D8，且D7+D8轉導在D12染色細胞。
TIL突起生長
偽處理及轉導之細胞維持在96孔U底盤中直至將其置於REP中。
對於細胞維持，每2至3天移除一半培養基且以新鮮TCM及IL-2 (3000 IU/mL)替換。對於96孔盤，移除且替換100 μl培養基至200 μL之最終體積。對於24孔盤，移除且替換1 mL培養基至2 mL之最終體積。對於6孔盤，移除且替換1 mL培養基至2 mL之最終體積。
REP開始於D13 (突起生長12天)。 實例18：細胞內流式細胞量測術
開發效能分析之FDA指南理想地呈現產物之作用機制，諸如相關治療活性或預期生物作用。效能量測值應反映產物之相關生物特性。
圖82描繪使得能夠同時評估反應T細胞特有之多種相關功能參數的細胞內流式細胞量測術之分析概述。該分析係在單一細胞水準下以展示有效產物。該分析為三天分析。第1天涉及解凍及隔夜恢復以展現隔夜細胞之效能以及目標細胞之恢復。對照包括螢光減一(fluorescence minus one，FMO)引導圈選、用於系統適用性之TIL陽性對照物及用於技術一式三份之樣品驗收準則。第2天涉及5小時共同培養以捕捉細胞內部發生了什麼且展示產生效能標記物之T細胞。第3天涉及滲透細胞及細胞內染色標記物。測試分析物包括CD107a (T細胞之去顆粒指示活化細胞毒性T細胞)、IFN γ (由活化T細胞製造之促炎性細胞介素)、CD137 (4-1BB) (T細胞之協同刺激活化標記物)及TNF α (由活化T細胞製造之促炎性細胞介素)。
增加資料之穩固性及一致性的方法改良包括流式法小組(flow panel)最佳化、可報導效能、抗體滴定、固定後表面標記、阻斷步驟、每日補償、核計數器(nucleocounter)、圈選最佳化、圈選、樣品驗收準則及系統適合性對照。流式法小組最佳化涉及重新設計以最小化Novocyte平台之光譜重疊及T細胞自刺激細胞之較佳分離以及存活性染料自DRAQ7至eFlour506之變化及置於不同螢光團上之其他標記物。可報導效能涉及報導兩種標記物(CD107a及IFN γ)以展現多功能性。抗體滴定改良方法穩固性。固定後表面標記實現方法穩固性。阻斷步驟減少來自非特異性結合之假陽性。每天補償實施對於各運行之補償以得到較佳儀器控制。核計數器用核計數器置換血球計計數，以移除主觀性且提高穩固性。圈選最佳化較佳鑑別T細胞且減少來自刺激細胞的假陽性。圈選增加穩固圈選引導。樣品驗收準則添加在各技術複本中具有% CV之定量性樣品驗收準則。系統適合性對照添加具有規格準則之TIL陽性對照物以便確保方法效能且實現資料趨勢。
申請人方法涉及在單一細胞水準上探測之基於細胞內流式細胞量測術之平台，由個體產生之細胞介素及其他發炎介體之分析，表型鑑別細胞類型-T細胞特異性效能，細胞類型及反應之同時偵測，在分泌之前偵測到的細胞內部保留之細胞介素，及3天連續分析。釋放之其他細胞療法涉及ELISA、單一標記物流式細胞量測術或非商業細胞毒性。ELISA使用ELISA量測不為細胞類型特有之來自主體上清液之可溶性細胞介素，在分泌後偵測，因此細胞介素生產源不可在表型上鑑別，且廣泛用於CAR-T產物釋放。非商業細胞毒性基於盤，且不存在單一細胞水準之偵測。
圖83描繪方法狀態及規格。效能方法展現精確度特異性、線性度、準確度及穩固性；歷史保留使用新近合格之方法進行測試，轉移至用於產物釋放之臨床品質控制，且使用來自MS批次之資料來設定產品規格。
效能基質作用機制涉及殺滅腫瘤細胞、分泌細胞介素及增殖。殺滅腫瘤細胞效能藉由流式細胞量測術表徵，以計數T細胞及目標細胞以及基於盤之螢光或發光，以量測殺滅百分比。細胞介素分泌效能在單一細胞水準下藉由流式細胞量測術及ELISA/MSD表徵以表徵群體。增殖效能藉由流式細胞量測術測定以表徵群體。TIL效能可藉由額外分析物、記憶表型、使用細胞株之細胞毒性、使用患者特異性腫瘤之細胞毒性、細胞介素小組、細胞增殖及/或細胞組成來測定。 實例19：利用評估產物批次之效能之流式細胞量測術終點的例示性生物分析
此方法描述藉由用於定量ITIL-168效能之多色流式細胞量測術終點進行之生物分析。首先，ITIL-168 DP與經工程改造以經由CD3 (亦即T細胞受體(TCR)之信號傳導組分)活化T細胞之目標K562細胞共同培養。K562-OKT3為衍生自穩定轉導以表現來自CD3促效抗體OKT3之單鏈可變片段(ScFv)之K562細胞的純系目標細胞。ITIL-168 DP與刺激性K562-OKT3細胞或陰性對照未轉導純系K562細胞K562-NT以1:1之比率共同培養允許經由TCR進行T細胞活化。隨後，經由流式細胞量測術評估共同培養物之T細胞活化標記物。效能分析使用T細胞作用機制特有的分析物中之2者IFN-γ及CD107a來計算。為了計算效能，在各樣品組中定量表現此等分析物中之一者(或兩者)之細胞的總數目。隨後，藉由自ITIL-168:K562-OKT3減去ITIL-168:K562-NT之反應減去背景以產生最終可報導值。TNF-α及CD137僅用於Analytical Sciences內之資訊。此等資料提供ITIL-168 T細胞產物之功能性之單一細胞評估。
術語：
螢光異硫氰酸鹽(FITC)   激發最大值為494 nm且發射最大值為520 nm之螢光染料
綠色螢光蛋白(GFP)  當暴露於藍至紫外線範圍內之光時展現亮綠色螢光之蛋白質
別藻藍蛋白(APC)     激發最大值為635 nm且發射最大值為660 nm之螢光染料
PerCP-eFluor710 (PCP-ef710)  激發最大值為633 nm且發射最大值為710 nm之串聯螢光染料
R-藻紅素(PE) 激發最大值為496 nm且發射最大值為615 nm之螢光染料
APC-Cy7 組合APC及花青染料(Cy7)之串聯螢光染料。其具有650 nm之激發最大值及785 nm之發射最大值
亮紫711   激發最大值為405 nm且發射最大值為711 nm之螢光染料
eFluor506 (eF506)   激發最大值為405 nm且發射最大值為506 nm之螢光染料
正向散射(FSC)   沿與入射光束相同軸線收集之光信號，與細胞大小直接相關
側面散射(SSC)   藉由細胞折射之光以自入射光束90°收集且與細胞粒度相關
FBS   胎牛血清
Fc受體(FcR) 識別抗體之Fc片段的某些免疫細胞之表面上的受體
cRPMI     完全洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培養基(補充有10% FBS)
分析第1天：細胞解凍及隔夜培養：
1  設置櫃及台且用IPA清潔
2  檢查cRPMI培養基或R10+PS培養基(10% FBS及1% Pen/Strep於含GlutaMAX-I之RPMI 1640培養基中)為可用的且未過期
若是，則轉至步驟4
若否，則轉至步驟3
3  用以下製備cRPMI培養基：
450 mL RPMI
50 mL FBS
指定自製備一個月的到期時間且在2℃至8℃下儲存。
4  將cRPMI之4×50 mL等分試樣轉移至50 mL法爾康管(Falcon tube)中且置放於37℃下之水浴中，升溫15至30分鐘。
5  鑑別測試物品及小瓶位置。
6  收集且標記用於測試物品、陽性對照細胞、K562.OKT3.CL3及K562.NT細胞中之各者的法爾康管。
7  收集4×6孔盤(未經組織培養物處理)且針對以下中之各者標記1孔：
c測試物品
TIL陽性對照物；且針對以下中之各者標記8孔：
K562.NT
K562.OKT3.CL3
8  藉由自LN2移出且在不浸沒蓋下保持於水浴中直至僅留下較小冰柱來解凍樣品(大約1.5至2分鐘)。使用計時器記錄總解凍時間(min:sec)。
9  自水浴中移出，在轉移至II類櫃之前噴灑IPA
10 使用P1000移液管，藉由輕緩移液2至3次混合樣品且將K562.NT、K562.OKT3.CL3細胞、TIL陽性對照物及測試物品轉移至經適當標記之管中
11 使用P1000移液管收集1 mL cRPMI且在冷凍小瓶周圍沖洗以收集任何剩餘細胞。將沖洗液逐滴轉移至匹配細胞管，且旋渦法爾康管以混合
12 使用電動移液器(pipetboy)及10 mL血清學移液管(stripette)，將8 mL cRPMI緩慢轉移至各解凍細胞管，旋渦管以混合
13 離心管(300 g，5分鐘，RT)以集結細胞且小心地移除上清液而不干擾細胞集結粒
14 將K562.NT及K562.OKT3.CL3細胞之各小瓶分開再懸浮於10 mL cRPMI中，且隨後必要時彙集。將測試物品及TIL陽性對照物再懸浮於5 mL cRPMI中。計數使用NC200核計數器。記錄計數且計算用於塗鋪之細胞的體積
15 在塗鋪細胞之前，由第2操作員檢查且草簽計算
16 記錄任何註解/錯誤訊息
17 將2×10 7K562.NT或K562.OKT3.CL3轉移至經標記法爾康管中。
18 添加所需體積之cRPMI以達成40 mL，最終濃度為0.5×10 6/mL
19 將5×10 6個TIL陽性對照細胞或測試物品轉移至額外經標記之法爾康管中。
20 添加所需體積之cRPMI以達成5 mL，最終濃度為2×10 6/mL
21 在經標記之6孔盤中以5 mL/孔塗鋪細胞(步驟3.8)
22 在37℃、5% CO 2下培育細胞隔夜。記錄置放於培育器中之時間
分析第2天：生物分析設置
1  用IPA清潔工作台及櫃
2  標記50 mL法爾康管。藉由將cRPMI之1×50 mL等分試樣置放在37℃之水浴中15至30分鐘升溫。
3  於經標記的50 mL法爾康管中製備1×布雷非德菌素/孟寧素工作溶液且使用25 mL血清學移液管充分混合
22 µL布雷非德菌素-A (1000X)
22 µL孟寧素(1000X)
22 mL cRPMI
4  標記用於測試物品及TIL陽性對照物之2組15 mL法爾康管及用於K562.NT及K562.OKT3.CL3之2組50 mL法爾康管。標記96孔圓底盤。
5  自培育器收集6孔盤且轉移至櫃。對於TIL陽性對照物及測試物品，轉移至15 mL法爾康管中且使用血清學移液管充分混合以確保取樣之前的懸浮液均質性
6  對於K562.NT及K562.OKT3.CL3細胞，將8個孔彙集在一起至其經標記之50 mL法爾康管中。
7  使用NC200，進行測試物品及TIL陽性對照物之細胞計數。記錄細胞計數且計算各5×10 6等分試樣所需之細胞體積
8  將相應體積之TIL陽性對照物及測試物品轉移至新15 mL法爾康管中
9  計算用於分析之所需K562.NT及K562.OKT3.CL3細胞之數目：
對於1個測試物品 + TIL陽性對照物 = 5×10 6
對於2個測試物品 + TIL陽性對照物 = 8×10 6
對於3個測試物品 + TIL陽性對照物 = 10×10 6
10 使用NC200，進行K562.NT及K562.OKT3.CL3之細胞計數。記錄細胞計數且計算所需細胞之體積
11 將所需體積的K562.NT及K562.OKT3.CL3轉移至新的50 mL法爾康管
12 在300 g，5分鐘，RT下離心所有法爾康管。使用血清學移液管小心地移出上清液，注意不干擾集結粒
13 將測試物品及TIL陽性對照物再懸浮於2.5 mL之1×布雷非德菌素/孟寧素工作溶液中
14 將K562.NT及K562.OKT3.CL3細胞再懸浮於1×布雷非德菌素/孟寧素工作溶液中，如下：
對於1個測試物品 + TIL陽性對照物 = 2.5 mL
對於2個測試物品 + TIL陽性對照物 = 4 mL
對於3個測試物品 + TIL陽性對照物 = 5 mL
15 塗鋪100 µL K562.NT及K562.OKT3.CL3細胞
16 將100 µL TIL陽性對照物或測試物品添加至適當BV711 FMO孔
17 將46 µL CD107a-BV711添加至測試物品及TIL陽性對照物法爾康管，且藉由移液2至3次充分混合
18 將2 µL細胞染色緩衝液添加至各反應孔
19 適當添加100 µL測試物品及TIL陽性對照物
20 使用多注式移液管，移液樣品3-5次以混合且在37℃、5% CO 2下培育5小時。
21 在完成時間之前大約5分鐘，自-80℃冷凍器收集可固定eFluor506存活性染料之等分試樣且轉移至台以使其解凍
22 計算所需eFluor506存活性染料之體積
計算反應(孔)數目且向總量加5
所計算數目(Rxn+5)乘以每反應體積以計算添加至主混合物中各試劑之總體積
23 製備可固定存活性染料於PBS中之工作溶液。用箔覆蓋直至使用為止
24 在培育結束時，自培育器移出96孔盤且離心(300 g，2分鐘，RT)以集結細胞冷凍物，且轉移至台以使其解凍
25 拂去(flick off)上清液且在紙巾上輕觸
26 使用多注式移液管，使樣品再懸浮於200 µL PBS中，移液2至3次以充分混合
27 離心以集結細胞(300 g，2分鐘，RT)
28 拂去上清液且在紙巾上輕觸
29 使用多注式移液管，將100 µL可固定存活性染料eF506工作溶液添加至各孔中，且藉由移液2至3次再懸浮細胞
30 以箔覆蓋盤且在2℃至8℃下在冰箱中培育20分鐘。填開始及結束時間
31 自冰箱收集盤，移除箔。將100 µL RT PBS添加至各孔中且離心以集結細胞(300 g，2分鐘，RT)
32 拂去上清液且在紙巾上輕觸
33 使用多注式移液管，將200 µL PBS添加至各孔中且藉由移液2至3次使細胞再懸浮。離心細胞(300 g，2分鐘，RT)，拂去上清液且在紙巾上輕觸
34 使用多注式移液管，在100 µL BD Cytofix/Cytoperm緩衝液中再懸浮細胞。移液2-3次以再懸浮
35 將細胞在冰箱中在2至8℃下避光培育15分鐘，以固定樣品。記錄開始及結束時間
36 使用多注式移液管，將100 µL PBS添加至各孔
37 離心以集結細胞(300 g，2分鐘，RT)，拂去上清液且在紙巾上輕觸
38 使用多注式移液管，將200 µL染色緩衝液添加至各孔。移液細胞2-3次以再懸浮
39 以箔覆蓋盤且在2℃至8℃下在冰箱中儲存隔夜。
分析第3天：染色混合物、補償對照組及樣品管製備
1  標記50 mL法爾康管。在50 mL法爾康管中藉由在ddH2O中1:10稀釋來製備BD Perm/Wash之1×工作溶液
5 mL BD Perm/Wash
45 mL ddH2O
2  製備用於陽性對照細胞、測試物品及FMO之主混合物
i.  測試主混合物(表5)對於測試主混合物及BV711 FMO樣品
計算反應(孔)數目且向總量加5
所計算數目(Rxn+5)乘以每反應體積以計算添加至測試主混合物中各試劑之總體積
ii. FMO主混合物(表6至表9)對於FMO，反應數目+2，以構成主混合物
計算反應(孔)數目且向總量加2
所計算數目(Rxn+2)乘以每反應體積以計算添加至FMO主混合物中各試劑之總體積
3  在96孔盤中，塗鋪150 µL補償珠粒
4  添加1滴GFP珠粒至FITC單一顏色補償對照物中
5  在2至8℃下在暗處之冰箱中保存ALL螢光試劑(主混合物、FMO、單一色彩補償珠粒)
分析第3天：補償及Novocyte檔案設置
1  使用盤管理器，在實驗檔案上定位補償樣品
2  在保存之後，查看補償矩陣
3  對所有樣本應用補償
4  用批次細節更新樣本資訊
5  以樣品ID及複本數更新樣品名稱
6  驗證補償已應用於各樣本
7  確認儀器獲取參數
分析第3天：細胞內染色及獲取
1  用IPA清潔工作台且自冰箱收集盤
2  離心以集結細胞(300 g，2分鐘，RT)，拂去上清液且在紙巾上輕觸
3  使用多注式移液管，向各孔添加200 µL之Perm/Wash工作溶液，移液2至3次以使細胞再懸浮
4  離心以集結細胞(300 g，2分鐘，RT)，拂去上清液且在紙巾上輕觸
5  重複步驟3及4
6  製造阻斷溶液
計算反應(孔)數目且向總量加5
所計算數目(Rxn+5)乘以每反應體積以計算添加至主混合物中各試劑之總體積
7  添加25 µL/孔阻斷溶液且移液2至3次以再懸浮。在室溫下避光培育10分鐘。記錄培育開始及結束時間
8  將50 µL測試或FMO主混合物添加至適當孔
9  使用多注式移液管藉由移液2至3次充分混合
10 以箔覆蓋盤且在2℃至8℃下在冰箱中培育35分鐘。記錄培育開始及結束時間
11 向各孔中添加150 µL Perm/Wash，且藉由移液2至3次充分混合。離心(300 g，2分鐘，RT)以集結細胞。拂去上清液且在紙巾上輕觸
12 向各孔中添加200 µL Perm/Wash，移液2至3次以混合，且離心(300 g，2分鐘，RT)以集結。拂去上清液且在紙巾上輕觸
13 將細胞集結粒再懸浮於150 µL染色緩衝液中以用於分析
14 若立即分析，則進行至步驟11.15。若儲存以用於稍後分析，則將盤包覆於箔中且在暗處之冷藏機中儲存。記錄儲存及獲取之時間
15 在Novoexpress軟體上，打開含有補償樣本及測試物品之實驗檔案
16 將盤插入96孔盤固持器中，確保盤正確適配
17 在實驗管理器頂部打開工作清單且檢查各樣品之細胞計數器設定為如下：
停止圈選閘門：30K活細胞
最大體積：100 µL
快速(66 µL/min)
混合(1000 rpm，5秒，acc=0)及沖洗每孔
18 確認補償樣本已應用於所有樣品
19 檢查在Novocyte上存在足夠的緩衝劑以完成運行
20 自細胞計數器控制面板選擇「運行盤」且突顯盤上待運行之所有孔
21 運行盤，記錄獲取開始及結束時間
22 基於圈選策略而調整圈選
分析第3天：圈選策略
1  圈選分成7部分：
圖區1：FSC-H相對於SSC-H (細胞)
圖區2：SSC-A相對於SSC-H (單峰)，細胞子代
圖區3：FITC (GFP)-H相對於PerCP-eF710 CD2-H (CD2+ & K562+)，單峰子代
圖區4：FSC-H相對於AmCyan (eF506)存活-H (CD2+活)，CD2+子代
圖區5：SSC-H相對於PerCP-eFluor710 CD2-H (T細胞)，CD2+活子代
圖區6：Qdot 705 (BV711) CD107a-H相對於APC IFNγ-H (CD107a SP、IFNg SP、CD107a_IFNg DP & CD107a_IFNg DN)，T細胞子代
圖區7：FITC (GFP)-H相對於AmCyan (eF506)存活-H，單峰子代
2  在已獲取樣品且已將分析模板應用於樣品後，第一步驟係調節GFP-H與活/死eFluor 506-H之間的補償，以允許精確測定分析內TIL之存活率。在圖區7上，確保x軸顯示FITC (GFP)-H，且y軸顯示活/死eFluor506-H。確保所顯示之事件來自N1/細胞/單峰圈選閘門，且圖區類型為密度圖。自控制帶選擇快速補償按鈕。定位圖區上方的滾動條且進行調整直至所有死細胞在圖區上可見。應存在至少2個死細胞群體，其中頂部LH群體在左下方活群體正上方，如由紅色虛線指示。不調整y軸上之補償。一旦已適當地調整x軸補償，如由GFP-活死-及GFP-活死+群體之質心的對準所判定，則將該x軸補償應用於實驗中之所有樣品。
3  必須在進行分析之前審查GFP-H與活/死eFluor506-H之間的補償調整。
4  圖區1應為假色密度圖，其中2個細胞群體可見，亦即TIL (FSC-H =大約0.2-3；SSC-H =大約0-0.4)及K562細胞(SSC-H ≥ 0.3)。排除左下角中之事件，因為大小概況表明其為碎片。一旦設定了此圈選閘門，便可藉由拖放分析將其拷貝至所有匹配K562.NT、K562.OKT3.CL3及FMO。
5  圖區2應為等高線圖，其中單峰圈選閘門設定為等高線之外部邊緣。等高線(x軸, SSC-A)下方之所有離群事件(黑點)可視為二重峰且圈選應設定為儘可能自分析排除。一旦設定，則將分析拷貝至所有匹配樣品及FMO
6  圖區3應為假色圖，其中圈選閘門分別設定在CD2+細胞及K562細胞周圍。注意，NT樣品上之CD2+圈選閘門應設定成在CD2染色為陽性的K562細胞左側，以自進一步T細胞圈選排除K562細胞
兩個CD2-FMO樣品上的CD2+圈選閘門必須展示≤2%陽性事件
若FMO樣品展示＞2%，則諮詢以確定分析是否無效。
若在對樣品中之所有CD2+細胞進行圈選時難以滿足以上條件，則進行諮詢。注意：K562圈選閘門係FIO圈選閘門
7  圖區4應為假色密度圖，其中2至3個細胞群體清晰可見。在兩個圖區中，排除細胞之中間及頂部群體(存活+ve)，因為其對於僅可進入具有受損膜之細胞的可固定存活性染料eF506呈陽性。確保CD2+活圈選閘門捕獲活/死eFluor506陰性群體。一旦設定圈選閘門，則將分析拷貝至所有匹配樣品及FMO
8  圖區5應為展示來自圖區4之活CD2+細胞的等高線圖。此圖區作為T細胞圈選之確認。來自先前圈選之任何剩餘K562細胞可基於高SSC-H概況圈選出去。T細胞圈選閘門應設定為捕捉所有事件之＞99%。一旦設定圈選閘門，則應用於所有匹配樣品及FMO
9  圖區6應為具有象限圈選閘門之等高線圖。首先，在K562.NT樣品上調整正及負圈選閘門，直至符合以下規則為止：
CD107a：
NT樣品之第1個等高線
FMO ≤ 1% CD107a+事件
IFN-γ：
NT樣品≤ 2% IFN-γ+事件
FMO ≤ 1% IFN-γ+事件
隨後將此等圈選閘門應用於FMO樣品且(必要時)經調整以確保在兩個FMO上陽性群體≤1%。一旦在所有NT及FMO樣品上符合所有條件，則圈選閘門可應用於OKT3樣品。 實例 20 ： 利用評估 TIL 之效能之 流式細胞量測術終點的例示性生物分析
此方法描述藉由用於定量ITIL-168效能之多色流式細胞量測術終點進行之生物分析。首先，ITIL-168藥物產物與經工程改造以經由CD3 (亦即T細胞受體(TCR)之信號傳導組分)活化T細胞之目標K562細胞共同培養。K562-GFP-OKT3為衍生自穩定轉導以表現來自CD3促效抗體OKT3之單鏈可變片段(scFv)之K562細胞的純系目標細胞。ITIL-168與刺激K562-GFP-OKT3細胞或陰性對照物GFP轉導之純系K562細胞K562-GFP的共同培養允許經由TCR活化T細胞。接著，藉由對T細胞進行圈選(CD2+ GFP-)，接著對針對T細胞作用機制重要的兩種分析物IFN-γ及CD107a圈選，來評估共同培養物的T細胞活化。可報導之效能係表現IFN-γ及/或CD107a之任何組合之活T細胞的百分比。進行以下方法且產生用於計算TIL之效能的資料。本文中報導資料。
定義
術語/ 首字母縮寫 定義
%CV 計算變異係數：
Figure 02_image003
效能% 100 - CD107a及IFN-γ雙重陰性細胞%
別藻藍蛋白(APC) 激發最大值為633 nm且發射最大值為710 nm之串聯螢光染料
APC-Cy7 組合APC及花青染料(Cy7)之串聯螢光染料。其具有650 nm之激發最大值及785 nm之發射最大值
生物安全櫃(BSC) 其中將進行所有組織/細胞培養工作之櫃，有時亦被稱作組織培養(TC)室(hood)。
亮紫711 (BV711) 激發最大值為405 nm且發射最大值為711 nm之螢光染料
CD2 T細胞及NK細胞上發現之細胞黏附分子
CD3 充當T細胞抗原受體之信號傳導組分的蛋白質複合物。
CD107a T細胞去顆粒標記物
CD137 在T細胞活化之後上調之協同刺激分子
CSB 細胞染色緩衝液
  DN 對CD107a及IFN- γ雙重陰性
  eFluor506 (eF506) 激發最大值為405 nm且發射最大值為506 nm之螢光染料
  FBS 胎牛血清
  螢光減一(FMO) 具有所有染色試劑減去一種試劑之試劑的染色混合液且用於支持圈選閘門定位
  螢光異硫氰酸鹽(FITC) 激發最大值為494 nm且發射最大值為520nm之螢光染料
  Fc受體(FcR) 識別抗體之Fc片段的某些免疫細胞之表面上的受體
  正向散射(FSC) 沿與入射光束相同軸線收集之光信號，與細胞大小直接相關
  綠色螢光蛋白(GFP) 當暴露於藍至紫外線範圍內之光時展現亮綠色螢光之蛋白質
  IFN-ɣ K562-GFP K562-GFP-OKT3 干擾素γ 永生化之人類骨髓性白血病細胞株，用作陰性對照物。 永生化之人類骨髓性白血病細胞株，用於刺激主體T細胞。
  PerCP-eFluor710 (PCP-ef710) 激發最大值為633 nm且發射最大值為710 nm之串聯螢光染料
  室溫(RT) 常規實驗室空間溫度(通常19℃至24℃)
  R-藻紅素 激發最大值為496 nm且發射最大值為615 nm之螢光染料
  RPMI 哺乳動物細胞培養基
  側面散射(SSC) 藉由細胞折射之光以自入射光束90°收集且與細胞粒度相關
  TA 測試物品
  TIL 腫瘤浸潤淋巴球
  TNF-α 腫瘤壞死因子，一種由包括T細胞之許多細胞產生之促炎性細胞介素。
設備、材料及試劑
設備： 利用NovoExpress軟體之Agilent NovoCyte 3005 校準計時器 離心機 多通道(8通道或12通道) P-200 NC200核計數器 輔助移液管(Pipet-Aid) 冷藏機，2至8℃ 單注式移液管，混合容積(2 µL、20 µL、200 µL及1000 µL) 渦旋 水浴，37℃
材料 96孔盤，U形底 耐酒精永久馬克筆(Alcohol-Proof Permanent Marker) 錐形管，15 mL及50 mL 擦拭紙(Kimwipe)或等效物 微量離心管，混合大小(1.5 mL、2.0 mL及/或5 mL 移液管尖，混合大小(2 µL、20 µL、100 µL、200 µL及/或1000 µL) 試劑儲集器 血清學移液管，混合大小(5mL、10mL T-25及T-75燒瓶Via-2卡匣(Via-2 cassette)
試劑
表A1. 試劑
第1 天
試劑 供應商 目錄號 MMS 編號
R10+PS培養基 自製 N/A N/A
第2 天
試劑 供應商 目錄號 MMS 編號
R10+PS培養基 自製 N/A N/A
布雷非德菌素A  (1000X) Invitrogen 00-4506-51 MMS-00258
孟寧素(1000X) Invitrogen 00-4505-51 MMS-00145
CD107a BV711 Biolegend 328640 MMS-00281
細胞染色緩衝液(CSB) BD 5546456 MMS-00147
PBS Gibco 20012-027 MMS-00011
BD Cytofix/Cytoperm BD 554714 MMS-00094
eFluor506可固定存活性染料 Invitrogen 65-0866-14 MMS-00105
第3 天
試劑 供應商 目錄號 MMS 編號
BD Perm Wash BD 51-2091K MMS-00095
細胞培養級水 Hyclone SH30529.02 MMS-00185
細胞染色緩衝液(CSB) BD 5546456 MMS-00147
eFluor506可固定存活性染料 Invitrogen 65-0866-14 MMS-00105
CD107a BV711 Biolegend 328640 MMS-00281
CD2 PCP-Ef710 Invitrogen 46-0029-42 MMS-00213
IFNγ APC Biolegend 506510 MMS-00208
CD137 PE Biolegend 309804 MMS-00207
TNFα APC-Cy7 Biolegend 502944 MMS-00209
小鼠血清 Invitrogen 10410 MMS-00163
人類TruStain FcX阻斷劑 Biolegend 422302 MMS-00143
GFP珠粒 Invitrogen A10514 MMS-00184
UltraComp珠粒 Invitrogen 01-2222-24 MMS-00188
ArC胺反應性珠粒 Invitrogen A10346 MMS-00146
表A2. 標記物及螢光團
標記物 螢光團 NovoCyte 雷射線
GFP GFP B530
CD137 PE B572
CD2 PerCp-eFluor710 B725
IFN-γ APC R660
TNF-α APC-Cy7 R780
活/死 eFluor506 V530
CD107a BV711 V725
程序
在2-8℃下避光、在2-8℃冷藏機中或在CoolRackTM上保持所有試劑、抗體及所產生工作溶液，直至準備使用為止。
第1 天 - 細胞解凍及隔夜培養  
1 設置BSC且用IPA清潔。 注意：第1天之所有步驟將在BSC中進行且必須遵循無菌條件進行。
2 檢查R10+PS培養基仍可用且處於到期日期內。 若是，則轉至步驟4 若否，則轉至步驟3
3 製備R10+PS培養基。
4 在37℃下在水浴中升溫R10+PS培養基15至30分鐘。
5 收集及標記用於測試物品、TIL陽性對照物(TPC)、K562-GFP目標細胞及K562-GFP-OKT3目標細胞中之各者的50 mL錐形管。
6 藉由自LN2移出且在不浸沒蓋下保持於水浴中1.5至2分鐘直至僅留下較小冰柱來解凍樣品。 注意 ：確保冷凍小瓶蓋在解凍之前緊密封閉。
7 自水浴移出且噴灑IPA且用清潔紙巾擦拭，隨後轉移至BSC。
8 將各小瓶之內容物轉移至經適當標記之管。
9 用1 mL R10+PS培養基沖洗各冷凍小瓶以收集任何剩餘細胞且將沖洗液逐滴轉移至適當錐形管中。
10 使用輔助移液管及血清學移液管將8 mL R10+PS培養基緩慢轉移至各解凍細胞管，渦流管以混合。
11 在RT下在300×g下離心管5分鐘以集結細胞。管噴灑IPA，隨後轉移回至BSC中。
12 移除上清液而不干擾細胞集結粒。 注意 ：若可用，使用抽氣器。
13 根據下表計算再懸浮各目標細胞(K562-GFP及K562-GFP-OKT3)、TPC及測試物品所需的R10+PS培養基體積。
Figure 02_image005
  
14 收集且標記用於各TPC及測試物品之一個T-25燒瓶。 注意 ：T-25燒瓶容納12 mL之最大體積。若培養體積超過12 mL，則使用T-75燒瓶或將細胞培養體積分至額外T-25燒瓶中。
15 收集且標記用於目標細胞中之各者的一個T-75燒瓶。 注意 ：T-75燒瓶容納30 mL之最大體積。若培養體積超過30 mL，則將細胞培養體積分至額外T-75燒瓶中。
16 將各錐形管之內容物轉移至各別經適當標記之T-25或T-75燒瓶。
17 將燒瓶轉移至37℃、5% CO2培育器中且培育細胞隔夜。
18 根據SOP-0209清潔BSC。
第2 天 - 共同培養設置  
1 共同培養設置將在BSC中進行且必須遵循無菌條件進行。
2 對於第2天設置，收集試劑及消耗品。
3 記錄資產及試劑資訊。
4 設置BSC且用IPA清潔。
5 將20 mL R10+PS培養基標記且等分至50 mL錐形管中。在37℃下在水浴中升溫R10+PS培養基15至30分鐘。
6 使孟寧素(1000×)及布雷非德菌素A (1000×)升溫至室溫且置放於BSC中。
7 按照下表在50 mL錐形管中製備1×布雷非德菌素A/孟寧素工作溶液。
Figure 02_image007
  
8 收集且標記用於各目標細胞之兩個(2) 50 mL錐形管、用於各測試物品及TPC之兩個(2) 15 mL錐形管，及用於在第1天解凍之各細胞的一個(1)微量離心管。
9 自培育器移出細胞。將細胞輕緩地再懸浮且將各燒瓶之內容物轉移至經適當標記之錐形管中。
10 將500 µL之各細胞等分至經標記之微量離心管中用於細胞計數。
11 根據MM-0008進行NC-200細胞計數。 注意 ：僅需要兩個計數。
12 記錄平均細胞計數。
13 如下文所展示計算稀釋所有細胞所需之體積。    K562-GFP 及K562-GFP-OKT3
Figure 02_image009
  
14 將所需體積之各測試物品、TPC及目標細胞轉移至經適當標記之錐形管。
15 在RT下在300×g下離心所有管5分鐘以集結細胞。管噴灑IPA，隨後轉移回至BSC中。
16 移除上清液而不干擾細胞集結粒。 注意：若可用，使用抽氣器。
17 按下表再懸浮各目標細胞(K562-GFP及K562-GFP-OKT3)，最終濃度為2.00E6個細胞/毫升。
Figure 02_image011
  
18 將各測試物品及TPC再懸浮於1.25 mL 1×布雷非德菌素A/孟寧素工作溶液中，最終濃度為2.00E6個細胞/毫升。
19 將50 µL CD107a-BV711 (4µL/100µL)添加至測試物品及TPC之各管且藉由向上及向下移液3-4次充分混合。
20 根據圖86中之盤圖，標記96孔圓底盤
21 使用多注式移液管，按照盤圖按以下次序將100µL K562-GFP及K562-GFP-OKT3細胞添加至各別孔：第一K562-GFP及第二K562-GFP-OKT3。 注意 ：確保對於兩個FMO孔添加兩個額外K562-GFP-OKT3之孔。
22 使用多注式移液管，按照盤圖按以下次序將100µL各測試物品及TPC添加至各別孔：第一K562-GFP及第二K562-GFP-OKT3。移液管尖應為單次使用的。當添加TPC及TA時，藉由向上及向下輕緩移液混合。 注意 ：確保在兩個FMO孔中添加TPC或TA。
23 將盤轉移至37℃、5% CO2培育器中且培育5小時。
24 清潔BSC
第2 天 - 存活試劑製備  
1 在完成時間之前大約5分鐘，自-80℃獲得可固定eFluor506存活性染料之小瓶且轉移至台以使其解凍。保持避光。
2 按下表製備存活性染料。
Figure 02_image013
注意 ：向所需反應之總量添加5個額外反應。保持避光直至使用為止。
第2 天 - 固定  
1 培育5小時後，自培育器移出細胞。 注意 ：在五(5)小時培育之後，不再需要無菌條件，繼續進行台上之分析。
2 在RT下在300×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
3 使用多注式移液管，添加200µL PBS且藉由向上及向下移液而混合。
4 在RT下在300×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
5 使用多注式移液管，添加100µL存活性染料且藉由向上及向下移液而混合。
6 在2℃至8℃下在暗處培育盤20分鐘。
7 在培育之後，使用多注式移液管將100µL PBS添加至各孔中。
8 在RT下在300×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
9 使用多注式移液管，添加200µL PBS且藉由向上及向下移液而混合。
10 在RT下在300×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
11 使用多注式移液管，添加100µL Cytofix/Cytoperm緩衝液且藉由向上及向下移液而混合。
12 在2℃至8℃下在暗處培育盤15分鐘。
13 在培育之後，使用多注式移液管將100µL PBS添加至各孔中。
14 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。 注意 ：自此開始所有旋轉將在RT下在400×g下3分鐘。
15 使用多注式移液管，添加200µL細胞染色緩衝液且藉由向上及向下移液而混合。
16 在2℃至8℃下在暗處培育盤隔夜。
第3 天 - 1× 流式細胞儀啟動  
1 若補償尚未製備，完成以下補償實驗。 注意：補償對照盤或獲取之FCS檔案可在24小時時段內用於多次獲取。
第3 天 - 1× Perm/Wash 製備  
1 對於第3天設置，收集所有試劑及消耗品。
2 記錄資產及試劑資訊。
3 確定將需要多少反應。各測試物品及TPC需要以下反應： ●    完全染色：n=6個反應 ●    FMO：各FMO n=1個反應 ●    總計：n=8個反應
4 按照下表在50 mL錐形管中製備Perm/Wash之1×工作溶液(1×P/W)且在2℃至8℃下儲存，直至準備使用為止。
Figure 02_image015
  
第3 天 - 阻斷溶液製備  
1 若可獲得小鼠血清之現有等分試樣，則跳至步驟3。
2 製備小鼠血清之新等分試樣且在-20℃下儲存。
3 在室溫下解凍小鼠血清。 注意 ：解凍直至存在較小冰柱且儲存在2℃至8℃下直至準備使用為止。
4 按照下表製備阻斷溶液。
Figure 02_image017
第3 天 - 抗體主混合物及FMO 混合試劑製備  
1 收集抗體且確認試劑在到期日期內。
2 按下表製備用於測試物品及TPC之抗體主混合物。
Figure 02_image019
注意 ：向所需反應之總量添加10個額外反應。使所有螢光試劑避光保持在2℃至8℃下直至準備使用為止。
3 按下表製備CD2 PCP-eF710及IFNγ APC FMO。
Figure 02_image021
注意 ：向所需反應之總量添加5個額外反應。使所有螢光試劑避光保持在2℃至8℃下直至準備使用為止
第3 天 - 補償對照物製備  
1 若預先已製備補償，則繼續染色步驟，否則繼續步驟2。 注意 ：補償可在樣品獲取當天之任何時間設置。
2 收集UltraComp eBeadsTM、ArCTM胺反應性補償珠粒套組，及抗體。抗體必須為用於方法執行之相同批次。
3 在使用前使ArC胺反應性補償珠粒平衡至RT 5分鐘。
4 按照圖87中之補償對照盤圖標記96孔圓底盤之列A
5 渦旋UltraComp珠粒且添加1滴至孔A2-A6。
6 渦旋ArC陽性珠粒且添加1滴至孔A7。
7 按照補償盤圖及下表將以下體積添加至各別孔。
Figure 02_image023
8 在室溫下避光培育盤10分鐘。
9 在培育之後，使用多注式移液管將150µL CSB添加至所有孔。
10 在RT下以400×g離心盤3分鐘。拂去上清液。
11 渦旋ArC陰性珠粒且添加2滴至孔A7。
12 渦旋GFP珠粒且添加1滴至孔A1。
13 使用多注式移液管，添加150µL細胞染色緩衝液至所有孔且藉由向上及向下移液而混合。
14 若立即獲取，則將盤送至細胞計數器且運行。若在稍後獲取，則在2至8℃冰箱中儲存盤，避光直至使用。
第3 天 - 染色方法  
1 自2-8℃移出盤。
2 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
3 使用多注式管，添加200µL 1×Perm/Wash (P/W)工作溶液，且藉由向上及向下移液混合。
4 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
5 使用多注式管，添加200µL 1×Perm/Wash (P/W)工作溶液，且藉由向上及向下移液混合。
6 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
7 使用多注式移液管，添加25µL阻斷溶液且藉由向上及向下移液混合。
8 在室溫下在暗處培育盤10分鐘。
9 在培育之後，使用多注式移液管，按照盤圖添加50µL抗體主混合物或FMO主混合物至適當的孔，且藉由向上及向下移液而混合。
10 在2-8℃下避光培育盤35分鐘。
11 在培育之後，將100µL 1× P/W添加至所有孔且藉由向上及向下移液而混合。
12 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
13 使用多注式管，添加200µL 1×Perm/Wash (P/W)工作溶液，且藉由向上及向下移液混合。
14 在RT下在400×g下離心盤3分鐘以集結細胞。拂去上清液。
15 使用多注式管，添加200µL細胞染色緩衝液且藉由向上及向下移液而混合。
16 若立即獲取，則進行至實驗設置。若儲存盤用於後續獲取，則在2℃至8℃下儲存在暗處至多24小時。
實驗設置  
1 確保補償對照物已經獲取或導入至實驗檔案。
2 將盤插入盤固持器中。確保盤正確地置於固持器上且鎖定在適當位置。
3 確認存在足夠緩衝液以完成運行。
4 在實驗管理器頂部打開工作清單且檢查各樣品之細胞計數器設定為如下： ●    96孔盤(U形底) ●    停止圈選閘門：30,000個CD2+活細胞 ●    最大體積100 µL ●    快速(66 μL/min) 混合(1000 rpm，5秒，acc=0)且沖洗每孔。
5 確認補償樣本已應用於所有樣品。
6 自細胞計數器控制面板選擇「運行盤」。選擇待獲取之所有孔且選擇運行。
圈選策略  
1 圈選分成7個圖區，參見圖88： 圖區1：FSC-H相對於SSC-H (細胞) 圖區2：SSC-A相對於SSC-H (單峰)，細胞子代 圖區3：FITC (GFP)-H相對於PerCP-eF710 CD2-H (CD2+ & K562+)，單峰子代 圖區4：FSC-H相對於AmCyan (eF506)存活-H (CD2+活)，CD2+子代 圖區5：SSC-H相對於PerCP-eFluor710 CD2-H (T細胞)，CD2+活子代 圖區6：Qdot 705 (BV711) CD107a-H相對於APC IFNγ-H (CD107a SP、IFNγ SP、CD107a_IFNγ DP & CD107a_IFNγ DN)，T細胞子代 圖區7：FITC (GFP)-H相對於AmCyan (eF506)存活-H，單峰子代
2 調節GFP-H與活/死eFluor 506-H之間的補償，以允許精確測定分析內TIL之存活率，參見下文圖2。 在圖區7上，確保x軸顯示FITC (GFP)-H，且y軸顯示活/死eFluor506-H (圖89，影像A)。 確保所顯示之事件來自N1/細胞/單峰圈選閘門，且圖區類型為密度圖。 自控制帶選擇快速補償按鈕(在圖89，影像B中突出顯示)。 定位圖區上方的滾動條(圖89，影像C，頂部x軸)且進行調整直至所有死細胞在圖區上可見(圖89，影像D)。應存在至少2個死細胞群體，其中左上方群體(圖89，影像D：GFP-活死+)在左下方活群體(圖89，影像D：GFP-活死-)正上方，如由紅線指示。 注意：不調整y軸上之補償。 一旦已適當地調整x軸補償，如由GFP-活死-及GFP-活死+群體之質心的對準所判定(圖89，影像D：紅線)，則將該x軸補償應用於實驗中之所有樣品。 圖89，影像E及F展示2個通道之間的補償調整之前(圖89，影像E)及之後(圖89，影像F)來自相同樣品之TIL的存活率圖(圈選策略之圖區4)。死細胞群體(活/死eF506高之群體)在補償之後有變化。此取決於圖區D所需之人工補償的量，且對於所有樣品，可能不會如此誇張。
3 圖區1為2個可見細胞群體，亦即TIL (FSC-H為大約0.2至3；SSC-H為大約0至0.4)及K562細胞(SSC-H≥0.3)的密度圖，參見圖90。 調整SSC-H/FSC-H圖區上的圈選閘門以捕捉總細胞群體且最佳地排除碎片(FSC-H低，紅色箭頭)。一旦設定圈選閘門，則藉由拖放分析拷貝至特定ITIL-168批次之所有匹配K562-GFP 2F7、K562-GFP-OKT3 CL3及FMO。
4 圖區2為等高線圖。 調整SSC-H/SSC-A圖區上之圈選閘門，其中將單峰圈選閘門設定成等高線的外邊緣，參見圖91。等高線(x軸, SSC-A)下方之所有離群事件(黑點)可視為二重峰且圈選應設定為儘可能自分析排除。一旦設定，則將分析拷貝至所有匹配樣品及FMO。
5 圖區3係密度圖，其中圈選閘門分別設定在CD2+細胞及K562細胞周圍。 將GFP樣品上之CD2+圈選閘門調整為在CD2染色為陽性的K562 (GFP高之細胞群體)細胞，以及GFP中間及CD2+群體的左側，參見圖92。GFP中間群體為在GFP及PCP-eFluor710通道中自動發螢光之死亡/死亡中細胞。 CD2-FMO樣品上的CD2+圈選閘門必須展示≤2%陽性事件
6 圖區4為密度圖，其中2至3個細胞群體可見，參見圖93。 調整活死eFluor506-H/FSC-H圖區上之CD2+活圈選閘門，以排除中間及頂部細胞群體(存活+ve)，因為其對於可固定存活性染料eF506呈陽性。確保CD2+活圈選閘門捕獲活/死eFluor506陰性群體。一旦設定圈選閘門，則將分析拷貝至所有匹配樣品及FMO。
7 圖區5為展示來自圖區4之活CD2+細胞的等高線圖，參見下圖94。 調整CD2PerCP-eFluor710-H/SSC-H圖區上的T細胞圈選閘門以捕捉＞99%之所有事件。此圖區作為T細胞圈選之確認。來自先前圈選之任何剩餘K562細胞可基於高SSC-H概況圈選出去(參見圖94)。一旦設定圈選閘門，則應用於所有匹配樣品及FMO。
8 遵循以下準則針對K562-GFP樣品調整CD107aBV71-H/IFNy APC-H圖區上的象限圈選閘門。 CD107a： 調整K562-GFP目標細胞上之水平象限圈選閘門(CD107a圈選閘門)，使得圈選閘門剛好觸到陰性群體之第一等高線，參見圖8。檢查CD107a之所有一式三份孔且確保圈選閘門不在具有最高CD107a背景之陰性群體上。一旦設定圈選閘門，則應用於所有K562-GFP及K562-GFP-OKT3樣本。 IFN-γ： FMO ≤ 1% IFN-γ+事件 在不改變水平(CD107a)圈選閘門之置放的同時，調整在APC IFN-γ FMO樣品上之豎直圈選閘門，使得象限圈選閘門係在陽性圈選閘門中＜ 1% IFN-γ。將該新圈選閘門應用於樣本中之所有K562-GFP及K562-GFP-OKT3樣品。
結果  
1 記錄%CD107a_IFNγ DN (雙重陰性)
有效性及驗收準則  
   分析： 若滿足以下準則，則該分析為有效的，且可報導結果： TPC必須符合規格 TPC %CV之複本必須≤ 20%。
   樣品驗收： 複本之間的測試物品%CV必須≤20%。 1. 對於低於或等於(≤) LOQ (根據EPRO-00356確立為3%)之結果， %CV不適用。報導「效能」為「≤LOQ」。 2. 對於高於或等於(≥) ULOQ (根據EPRO-00356確立為82%)之結果，%CV不適用。報導「效能」為「≥ ULOQ」。 若%CV≥20%，則樣品視為無效。
實例 21 ： 腫瘤消化物之效能
圖84A及圖84B描繪自體效能分析：將自體腫瘤細胞與最終藥物產物(DP)一起培育且尋找CD107a及IFNγ之上調。
圖85描繪引起效應分子表現之T細胞活化。
試劑表
試劑 供應商 目錄號
RPMI-1640 Gibco 61870-036
FBS HyClone SH30071.3
IL-2 Miltenyi Biotech 130-097-7848
Via2-卡匣 Chemometec 941-0023
布雷非德菌素A BioLegend 420601
孟寧素 Invitrogen 00-4505-51
細胞刺激混合液(CSC) Fisher Scientific 50-112-9036
CSB BD Biosciences 554656
活/死近IR Invitrogen L34976A
Cytofix BD Biosciences 554655
Perm Wash緩衝液 BD Biosciences 51-2091KZ
CD107a BV421 BioLegend 328626
Perm Wash BD Biosciences 51-2091KZ
小鼠血清 R&D Systems S18110H
CD3 PE-Cy7 BioLegend 300420
抗IFNγ APC BioLegend 506510
CD19-PE (用於comp) BioLegend 302208
hFOLR1 Fc AcroBiosystems FO1-H5253
抗hIgG PE Fisher Scientific 12-4998-82
GFP珠粒 Invitrogen A10514
胺反應性珠粒 Invitrogen A10346
UltraComp珠粒 Invitrogen 01-2222-42
程序：除非明確陳述，否則在BSC中使用恰當無菌技術進行所有程序。
1.  TIL之隔夜恢復：
將R10培養基置放於37℃水浴中直至其達至37℃。
添加IL-2至培養基中，相對於培養基最終濃度為200 IU/ml。
解凍視需要數目之TIL之小瓶且將其各自轉移至15 ml管。
緩慢添加10 ml溫熱的R10。
用7 ml R10 + IL-2洗滌2次
使細胞在10 ml R10+IL-2中達至1E6 c/ml且置於T-25燒瓶中隔夜。
2.  TIL/腫瘤消化物共同培養物製備
製造BFA/孟寧素主混合物(BMMM)。
在室溫下完全解凍BFA及孟寧素。
計算完整分析設置所需之體積：
需要100 µl之2×主混合物/孔：
3個孔陽性對照，3個孔陰性對照，3個孔實驗，3個孔單獨腫瘤消化物對照。
12個孔/測試樣品+6個孔體積校正=18個孔。
將孟寧素及BFA 1:500 (2×)稀釋至1.8 ml R10中：
添加3.6 µl BFA及3.6 µl孟寧素至1.8 ml R10。
若存在多個樣品，則將上述乘以樣品數目。
添加45 μl抗CD107a BV421 (2.5 μL/孔)。最終名稱為MM
轉移500 µl主混合物至新的1.5 ml管且添加0.5 μl細胞刺激混合液(MMCSC)。
解凍來自LN2之腫瘤消化物樣品：
用腫瘤I.D標記15 ml管。
在37℃水浴中解凍TD小瓶，使得僅留下小片冰。
立即轉移至15 ml管且緩慢添加10 ml預溫熱之R10至管中。
在300×g下離心7分鐘且抽吸上清液。
使TD再懸浮於7 ml R10中。
將200 µl轉移至1.5 ml管進行計數。
在300×g下離心其餘部分7分鐘。
在NC200上計數細胞且使其達至3×或5×TIL濃度。
計算體積以使細胞達至12E6 c/ml (超過TIL 3×)。
活細胞濃度×7 ml (來自總體積)/12E6 c/ml
對於5×，使細胞達至20E6 c/ml
活細胞濃度×7 ml/20E6 c/ml
抽吸上清液且使細胞在R10中達到適當濃度。
計數恢復隔夜之TIL且使其達到4E6 c/ml。
將TIL燒瓶之內容物轉移至適當管。
將200 µl TIL轉移至1.5 ml管進行細胞計數。
在300×g下離心細胞7分鐘。
計數細胞且計算體積以使細胞達到4E6。
活細胞濃度×離心細胞之體積÷4E6 vc/ml
在離心之後，抽吸上清液且用7 ml R10再洗滌1次。
在適當體積中使TIL達至4E6 vc/ml。
向單獨TIL、單獨TD、TIL+TD孔、CoSTAR FMO塗鋪100 μl 2×BMMM (參見盤圖)。
向TIL+CSC孔及IFNγ FMO孔塗鋪100 µl MMCSC (參見盤圖)。
向單獨TD及TIL+TD孔塗鋪50 μl TD。
向適當孔(除了單獨TD之外的所有)塗鋪TIL。
在37℃下在5% CO2中培育4小時。
單獨TIL 單獨TIL 單獨TIL CoSTAR FMO   
單獨TD 單獨TD 單獨TD      
TIL + TD TIL + TD TIL + TD      
TIL + CSC TIL + CSC TIL + CSC IFNγ FMO   
培育後：自此所有程序可非無菌進行
若不存在冷凍於-80℃中之任何等分試樣，則製造活死N-IR。
為了製造儲備溶液：
將50 μl DMSO添加至活/死N-IR小瓶中且避光。
在PBS中1:1000稀釋L/D儲備溶液且避光。
製造2 ml/TIL批次，亦即2 µl活/死於2 ml PBS中。
自培育器移出盤且在300×g下離心3分鐘。
拂去上清液且用200 µl PBS洗滌。
重複洗滌。
拂去最終洗滌液後，添加100 μl活/死染色劑之工作溶液且在室溫下避光培育15分鐘。
添加100 µl PBS且在300×g下離心3分鐘。
拂去上清液且用200 µl PBS再洗滌一次。
在最終洗滌之後，拂去上清液且添加100 µl固定劑(Cytofix)至各孔。
在室溫下避光培育15分鐘。
添加100 µl PBS至各孔且在400×g下離心3分鐘。
自此，所有離心將在 400×g下進行3分鐘。
各孔添加200 μl CSB緩衝液且置放在4℃下避光隔夜或繼續染色步驟。
製備阻斷緩衝液(10%小鼠血清於Perm Wash緩衝液中)：
確定分析中之孔數目且製造足夠含10%小鼠血清之1×Perm/Wash。
需要50 µl 10% P/W小鼠血清/孔。
亦即，對於一個完整設置=12個孔+用於體積損失之3個孔。
15個孔×50 μl=750 μl總體積。
10%小鼠血清=0.10×750 μl=7.5 μl小鼠血清於742.5 μl Perm Wash緩衝液中。
若CoSTAR (ITIL-306)染色進行至以下步驟
在Perm/Wash緩衝液中製備CoSTAR配位體。
對於所有洗滌及染色製造足夠P/W緩衝液：
每測試物品製造25 ml。
1:1000稀釋CoSTAR配位體(AcroBiosystems)。
蛋白質應在0.6 mg/ml儲備溶液下復原，因此最終工作濃度應為0.6 ng/ml。
將1 µl CoSTAR配位體稀釋至1 ml P/W緩衝液中
向各孔中添加50 µl 10%小鼠血清阻斷劑，且在室溫下培育5分鐘。
在培育之後，添加50 µl CoSTAR配位體溶液且在4℃下培育30分鐘。
在培育期間，製造完全染色混合物及FMO染色混合物。
添加100 µl Perm/Wash緩衝液且離心3分鐘。
用200 μl Perm/Wash緩衝液洗滌且將上清液拂至生物危害袋中。
FMO染色混合物：
CoSTAR FMO混合物(CFM)：
5 µl抗CD3 PE-Cy7
5 µl抗IFNγ APC
190 μl P/W緩衝液。
IFNγ APC FMO混合物(IFM)：
5 μl抗CD3 PE-Cy7
2 µl抗hIgG PE
193 μl Perm / Wash緩衝液。
完全染色混合物(CSM)：
需要100 µl/孔之15孔的完全染色劑。
等於Perm Wash緩衝液中之1.5 ml
抗體係：
抗CD3-PE-Cy7 - 2.5 μl /孔
2.5 μl x 15孔 = 37.5 μl
抗IFNγ-APC - 2.5 μl /孔
2.5 μl x 15孔 = 37.5 μl
1:100稀釋抗CoStAR配位體-PE
1 µl x 15 = 15 μl
製造完全染色混合物(CSM)：
添加37.5 μl (X測試物品#)抗CD3 PE-Cy7
添加37.5 μl (X測試物品#)抗IFNγ APC
添加15 μl (X測試物品#)抗CoSTAR配位體-PE
添加1410 μl 1 x Perm/Wash緩衝液(X測試物品#)
最終洗滌及上清液移除後，添加100 μl CSM至各孔。
添加100 μl CoSTAR FMO及IFNγ FMO至適當孔中。
在4℃下避光培育盤20分鐘。
製造Comp盤：
添加一滴胺反應性珠粒至96孔盤之一個孔中。
添加一滴UltraComp珠粒至同一盤之四個孔中。
將1 μl之活死染料之儲備溶液添加至胺反應性珠粒孔。
將2 μl CD19-PE添加至具有UltraComp珠粒的一個孔中(抗CoSTAR配位體PE之替代物)
將3 μl抗CD107a BV421、3 μl IFNγ APC、3 μl抗CD3 PE-Cy7各自添加至Ultracomp珠粒之一個孔。
將comp盤在室溫下避光培育20分鐘。
向兩個盤所有孔中添加100 μl Perm/Wash緩衝液且在400×g下離心3分鐘。
用200 μl P/W緩衝液洗滌兩個盤2次。
向細胞添加200 µl CSB且在細胞計數器上運行。 實例 22- 例示性效能分析
此報導詳述用於測定ITIL-306產物之效能的多色流式細胞量測方法之開發及最佳化。開發集中於選擇流式法小組、試劑、染色程序及最佳CoStAR偵測之正確組合。分析隨後核檢其線性度、穩固性及特異性以展現ITIL306最終產物批次釋放之恆定效能讀取。
術語 定義
綠色螢光蛋白( Green Fluorescent Protein，GFP) 當暴露於藍至紫外線範圍內之光時展現亮綠色螢光之蛋白質
單鏈可變片段( Single Chain Fragment Variable，scFv) 抗體之重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區之融合蛋白
R-藻紅素( phyco erythrin，PE) 激發最大值為496 nm且發射最大值為615 nm之螢光染料
藻紅素-花青7 ( Phyco erythrin- Cyanine 7，PE-Cy7) 激發最大值為496 nm及566 nm且發射最大值為781 nm之串聯螢光染料
別藻藍蛋白( Allo phyco cyanin，APC) 激發最大值為635 nm且發射最大值為660 nm之螢光染料
近紅外存活性染料( Near Infra- Red，NIR) 用於偵測死細胞之胺反應性存活性染料，其中激發最大值為633 nm且發射最大值為750 nm
亮紫421 ( Brilliant Violet 421，BV421) 激發最大值為405 nm且發射最大值為421 nm之螢光染料
具有Fc標籤之重組人類葉酸受體1 ( Recombinant Human Folate Receptor 1with Fctag，rhFOLR1-Fc) 結合於CoStAR之重組人類蛋白質，其用Fc標記以供偵測
正向散射( Forward Scatter，FSC) 沿與入射光束相同軸線收集之光信號，與細胞大小直接相關
側面散射( Side Scatter，SSC) 藉由細胞折射之光以自入射光束90°收集且與細胞粒度相關
RPD 相對百分數差( Relative Percentage Difference)
FBS 胎牛血清( Fetal Bovine Serum)
TPC TIL陽性對照物
RPMI培養基 洛斯維·帕克紀念研究所培養基
MS 小鼠血清
雙重陽性( Double Positive，DP)針對兩種分析物呈陽性之細胞群體之流式細胞量測術中所用之術語。單一陽性( Single Positive，SP) 針對一種分析物呈陽性之細胞群體之流式細胞量測術中所用之術語
室溫( Room Temperature，RT) 常規實驗室空間溫度(通常19℃至24℃)
生物安全櫃( Bio Safety Cabinet，BSC) 其中將進行所有組織/細胞培養工作之櫃，有時亦被稱作組織培養(TC)室。
二甲亞碸( Di methyl Sulf oxide，DMSO) 用於溶解不可混溶於水中之試劑(粉末試劑)的溶劑。
CD107a T細胞去顆粒標記物
IFNg 干擾素γ
背景
TIL係在多種實體腫瘤內發現且主要包含具有抗腫瘤反應性之多株T細胞的淋巴球(Lin等人2020)。InstilBio正在開發被稱為ITIL168之未經修飾之研究性TIL產物。TIL之抗腫瘤活性係藉由對腫瘤抗原具有特異性之T細胞受體(TCR)介導。TIL需要藉由肽-主要組織相容複合體(pMHC)之TCR識別驅動的初級信號(信號1)。信號1藉由一般由目標細胞提供之二級協同刺激信號(信號2)增強。
FOLR1於若干實體腫瘤中過度表現(Ross等人，1994; Parker等人，2005; Assaraf等人，2014)。因此，為增強TIL之抗腫瘤活性，研發表現抗FOLR1 (CoStAR)以治療過度表現葉酸受體α (FOLR1)之晚期實體腫瘤的經工程改造之自體TIL細胞療法產物。在ITIL306中，CoStAR組分除信號1 (經由TCR)外提供信號2，從而產生穩固抗腫瘤活性。
分析設計
分析為用於測定ITIL-306最終藥物產物之效能的多色流式細胞量測方法。該方法為三天方法。在第1天，ITIL-306藥物產物及目標細胞經解凍且使其在CO2培育器中恢復隔夜。TIL與目標細胞之間的5小時共同培養在第2天進行，在共同培養之前添加抗CD107a、布雷非德菌素A及孟寧素。共同培養之後，細胞用細胞膜不透性的胺反應性LIVE/DEADTM-近IR染料染色以排除非活細胞，且固定隔夜。在第3天，將細胞與結合於經CoStAR轉導之TIL之表面上之抗FOLR1 scFv的可溶性C端Fc標記之重組FOLR1蛋白一起培育。隨後，將細胞與包括抗Fc-PE (用於偵測結合於CoStAR之rhFOLR1-Fc)、CD3 PE-Cy7 (用於偵測T細胞)及IFNγ APC之抗體混合液一起培育。效能藉由ITIL306藥物產物活化CD107a及/或IFNγ中任一者之表現之能力來確定。
5.1. 設備
設備 製造商 型號或目錄號
Agilent Novocyte流式細胞儀 Agilent systems 2010050
生物安全櫃II類 ThermoScientific 1377
單注式移液管，P-2 Biotix 63300160
單注式移液管，P-20 Biotix 63300162
單注式移液管，P-200 Biotix 63300164
單注式移液管，P-1000 Biotix 63300165
多注式移液管，P-200 Biotix 63305171
離心機 ThermoFisher Sorvall X4Pro-MD (75009506)
培育器(37℃，5% CO2) ThermoFisher Forma SteriCult (330722)
核計數器 ChemoMetec NC-200
冷藏機 Thermo Scientific TSX5005SA
水浴(37℃) Fisher Scientific FSGPD10
5.2. 材料及試劑
材料及試劑 製造商 型號或目錄號
FBS HyClone SH30071.03
青黴素/鏈黴素 Lonza 17-603E
RPMI-1640 Gibco 61870-036
FBS HyClone SH30071.03
RPMI-1640 Gibco 61870-036
青黴素/鏈黴素 Lonza 17-603E
布雷非德菌素A (1000X) Invitrogen 00-4506-51
孟寧素(1000X) Invitrogen 00-4505-51
CD107a BV421 Biolegend 328626
細胞染色緩衝液(CSB) BD 5546456
PBS Gibco 20012-027
BD Cytofix BD 554655
BD perm/wash BD 554723
細胞培養級水 Hyclone SH30529.02
材料及試劑 製造商 型號或目錄號
PBS Gibco 20012-027
細胞染色緩衝液-FBS (CSB) BD 5546456
活/死可固定近IR死細胞染色劑(NIR染料) Invitrogen L34976
CD107a BV421 Biolegend 328626
CD3 PE-Cy7 Biolegend 300420
IFNg APC Biolegend 506510
重組人類FOLR1蛋白，Fc標籤(rhFOLR1-Fc) Acro FO1-H5253
重組人類FOLR1蛋白，His標籤(rhFOLR1- His) Acro FO1-H52H1
抗人類-IgG-Fc-PE Invitrogen 12-4998-82
別藻藍蛋白結合之AffiniPure山羊抗人類IgG，Fcγ片段 Jackson 109-135-098
APC抗His標籤抗體 BioLegend 362605
抗人類-FOLR1-PE Biolegend 908304
小鼠血清 Invitrogen 10410
TruStain FcXTM BioLegend 422302
GFP珠粒 Invitrogen A10514
UltraComp珠粒 Invitrogen 01-2222-24
ArC胺反應性珠粒 Invitrogen A10346
Novocyte QC珠粒 Agilent 8000004
5.3. 標準物或對照物
標準物或對照物 供應商/ 來源 目錄或識別號
K562細胞 ATCC CCL-243
K562-GFP；K562-GFP-OKT3；K562-GFP-FOLR1；K562- GFP-OKT3-FOLR1 自製 N/A
最終產物TIL 自製 ITIL306-21-US19A ITIL306-21-US19B ITIL306-21-US23A ITIL168-21-US24A
健康供體(HD) CoStAR+ve細胞 自製 NBC308; NBC309
PBMC Stem Cell Technologies 70025.2
分析設置
分析設置類似於實例20且經三天之時段進行，如下詳述。
第1天，解凍
將ITIL306之冷凍保存小瓶解凍且在離心及移除上清液之前在R10 (10% FBS + 90% RPMI1640)中1:10稀釋。隨後使集結粒再懸浮於R10中且在T-75燒瓶中在37℃下恢復隔夜。
第2天，共同培養設置
ITIL306與由InstilBio工程改造以表現GFP (對照)、GFP-OKT3 (OKT3：TCR促效劑)及GFP-OKT3-FOLR1 (FORL1：CoStAR目標)之HLA-陰性細胞株(K562- ATCC ®CCL-243TM)共同培養5小時。
共同培養在布雷非德菌素A、孟寧素及抗人類CD107a-BV421存在下進行。共同培養比率(1:1)：2E5 TIL於100 μl中+2E5目標於100 μl中
條件1: ITIL306: K562-GFP
條件2: ITIL306: K562-GFP-OKT3
條件2: ITIL306: K562-GFP-OKT3-FOLR1。緊接著共同培養，細胞用L/D-NIR可固定存活性染料染色且用BD cytofix固定且儲存於冷藏機中隔夜。
第3天，染色
細胞使用BD perm/wash緩衝液短暫滲透，與rFOLR1-Fc (其結合至ITIL306上之CoStAR)一起培育，接著用含有抗人類IgG-Fc PE (用於偵測結合於CoStAR之rhFOLR1-Fc)、CD2 PE-Cy7 (用於偵測T細胞)及IFNγ APC之抗體主混合物染色。
效能讀取
隨後藉由流式細胞量測術分析細胞以定量對CD107a、IFNγ中任一者或兩者之表現染色呈陽性的活(NIR -ve)、CD2 +ve及GFP -ve細胞。
為開發用於ITIL306效能之流式細胞量測術小組，吾人使用測試13 (ITIL168效能)小組作為主幹且測試如表1中所示之各種流式細胞量測術小組。選擇V3小組以進一步開發，此係歸因於細胞群體之解析度較佳且無需人工補償(圖1)。
表. 所測試流式細胞量測術小組
通道 T13 + CoStAR V1 V2 V3 V4
GFP K562 K562 K562 K562 K562
PE CoStAR CoStAR CoStAR CoStAR CoStAR
PerCP-eFluor 710 CD2          CD2
PE-Cy7    CD2 CD2 CD2   
APC IFNγ IFNγ IFNγ IFNγ IFNγ
NIR       L/D L/D L/D
BV421    L/D    CD107a CD107a
eFlour 506 L/D            
BV711 CD107a CD107a CD107a      
圖97. 使用上表中所列之V3小組之ITIL306效能之流式細胞量測術讀數。
6.2. 最佳共同培養培育時間
為檢驗ITIL306效能分析之最佳共同培養培育時間，第2天共同培養設置為持續不同時段，隨後量測效能。結果展示於圖2中。選擇四(4)小時共同培養以使輸出及執行之操作容易度最大化。
圖98展示在各種共同培養培育時間之後的ITIL306效能。
6.3. 共同培養之E:T比率.
分析效應物:目標比率(E:T比率)。第2天共同培養以E:T比率(5:1、3:1、1:1、1:3及1:5)設置，接著量測效能。如圖99中所示，所觀測到之在各種E:T比率之間的效能讀數無顯著不同。
6.4. 在小鼠血清阻斷之後不需要洗滌
用於此分析中以偵測CoStAR之rhFOLR1具有人類Fc-標籤。由各種供應商商業上出售之Fc阻斷劑為人類IgG (具有Fc部分)，其不相容。因此，小鼠血清在此分析中用作阻斷劑。測試在添加rhFOLR1-Fc之前是否必須進行洗滌步驟以移除小鼠血清(方案1)或是否可在無洗滌步驟下在阻斷小鼠血清之上添加rhFOLR1-Fc (方案2)，關於實驗計劃，參見圖100。在無洗滌下在小鼠血清阻斷劑之上添加rhFOLR1-Fc引起CoStAR之偵測略微增加(圖5)。因此，展示了在全CoStAR染色中，可在阻斷小鼠血清之上添加rhFOLR1-Fc (方案2)。在一實施例中，本文所描述之方法可在無血清阻斷之情況下進行。
圖100. 測試是否需要洗滌步驟來移除用於阻斷之小鼠血清之實驗計劃。方案1及2兩者中rFOLR1-Fc之最終濃度恆定。
圖101. 針對CoStAR偵測，測試在存在及不存在洗滌步驟下小鼠血清阻斷之後rhFOLR1-Fc之添加。
6.5.  CoStAR-APC相對於CoStAR-PE染色之分析
為確保最佳小組設計，交換CoStAR及IFNγ螢光團(fluors)，如表3中所示。圖102中所示之結果展現改變針對CoStAR或IFNγ之偵測無顯著差異。
表. 流式細胞量測術小組
通道 V3.1 V3.2
GFP K562 K562
PE CoStAR IFNg
PE-Cy7 CD2 CD2
APC IFNg CoStAR
NIR L/D L/D
BV421 CD107a CD107a
圖102. 對APC及PE之CoStAR及IFNg偵測中之ITIL306效能讀數，分別(V3.1)或反過來(V3.2)。
6.7.  FOLR1抗體
CoStAR之單鏈可變片段(scFv)衍生自稱為「MOv19」之小鼠單株抗體(Miotti等人1987)。MOv19係藉由用分化不良卵巢癌(OvCa4343/83)對小鼠免疫接種而產生。發現MOv19對FOLR1具有特異性(Leslie等人1991)。對FOLR1具有特異性之經螢光團標記之單株抗體的市場可用性產生三種不同於MOv19之抗體。
表. 市場上可用的對FOLR1具有特異性之經螢光團標記之單株抗體的清單
   FOLR1 抗體純系 供應商 目錄號 螢光團 物種 所用免疫原
1 LK26 Biolegend 908303 PE 小鼠IgG2a 妊娠期絨毛膜癌細胞株
2 548908 (FAB5646) R&D systems FAB5646A (APC); FAB5646P (PE) APC & PE 小鼠IgG1 重組人類FOLR1肽(25-233 aa)
3 EPR23387- 276 Abcam Ab275200 PE RabMab (兔單株) 重組片段
6.7.1. 抗FOLR1 PE (純系LK26)之測試
實驗設置
為了測試抗FOLR1抗體是否可用於在ITIL306效能分析中偵測結合至CoStAR之內源性FOLR1，進行以下實驗。
第1天，解凍
針對ITIL306 (ITIL306-21-US19-ArmB-第21天-最終產物)之TPC之冷凍保存小瓶解凍且在離心及移除上清液之前在cRPMI (10% FBS + 90% RPMI1640)中1:10稀釋。集結粒隨後再懸浮於cRPMI中且在T75燒瓶中靜置隔夜。在培育器中保持培養物隔夜之決策係為了允許T細胞解凍後恢復。此亦與實例20中所描述之ITIL168效能方法一致。
第2天，培育
ITIL306與由InstilBio工程改造以表現GFP (對照)及GFP-OKT3-FOLR1 (OKT3：TCR促效劑；FORL1：CoStAR目標)之HLA-陰性細胞株(K562- ATCC ®CCL-243TM)共同培養5小時。
共同培養比率(1:1)：2E5 TIL於100 μl中+2E5目標於100 μl中
條件1: ITIL306: K562-GFP
條件2: ITIL306: K562-GFP-OKT3-FOLR1
緊接著共同培養，細胞用可固定存活性染料(NIR)染色，用BD cytofix固定，且儲存於冷藏機中隔夜。
第3天，染色
集合 1 ：阻斷細胞，接著針對CD2及 CoStAR進行全染色。
集合 2 ：阻斷細胞，接著針對CD2、CoStAR及 FOLR1(使用LK26純系)進行全染色。
資料分析
隨後藉由流式細胞量測術分析細胞以定量對CoStAR (集合1)及FOLR1 (集合1)染色呈陽性的活(NIR -ve)、CD2 +ve及GFP -ve細胞。參見下表之流式法小組及圖108之圈選策略。
流式法小組
通道 偵測
GFP 表現GFP之K562目標
PE CoStAR或FOLR1
PE-Cy7 CD2
APC-Cy7 L/D-NIR
圖108. 圈選策略，圖區1細胞針對總細胞進行圈選。圖區2，細胞針對總細胞中之單峰進行圈選。圖區3，L/D-NIR -ve單一細胞作為活細胞圈選。圖區4，CD2 +ve及FP -ve活細胞經圈選。
圖109.  A，ITIL306-21-US19B與表現GFP及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色(集合1)。B，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色(集合2)。
如圖109A中所示，當與K562-GFP細胞共同培養時，大約58% TIL (ITIL306-21-US19B)為CoStAR +ve。然而，當TIL與K562-GFP-OKT3-FOLR1目標細胞共同培養時，觀測到CoStAR +veTIL之百分比的顯著降低(僅24%)。為了測試CoStAR +veTIL被來自K562-GFP-OKT3-FOLR1細胞之內源性FOLR1隱匿的假設，用抗FOLR1-PE抗體染色來自類似實驗設置之孔(集合2)。驚人地，僅在與K562-GFP-OKT3-FOLR1共同培養之ITIL306-21-US19B中偵測到大約56% FOLR1陽性(圖13A，底部，右圖區)。抗FOLR1陽性應在兩個共同培養條件(K562-GFP及K562-GFP-OKT3-FOLR1)中類似，因為CoStAR +veITIL306與rFOLR1-Fc結合(圖13B，左及右圖區)。總體而言，以上結果表明以下可能性：1)抗FOLR1抗體將僅偵測內源性FOLR1而非重組FOLR1，2)在K562-GFP-OKT3-FOLR1共同培養物中觀測到之抗FOLR1抗體染色為非特異性的，因為未發現兩個不同群體(陽性及陰性群體)，僅細胞之整體偏移。
6.7.2. 測試針對CoStAR偵測之抗FOLR1 PE (LK26)及抗人類-IgG PE之組合染色
先前結果(圖109)指示組合偵測抗體(抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE)可解決當與K562-GFP-OKT3-FOLR1目標細胞共同培養時CoStAR +veITIL306之偵測下降的問題。為分析此情況，使用以下實驗共同培養條件，類似於先前部分6.7.1.中所描述之實驗設置：
條件1: 單獨ITIL306
條件2: ITIL306: K562-GFP
條件3: ITIL306: K562-GFP-OKT3-FOLR1
隨後吾人使用三種不同染色方案，各具有三種不同染色條件：
方案 1 ：細胞外染色
阻斷細胞，隨後與rFOLR1-Fc一起培育且針對 細胞外 (EC)表現染色。
集合1：CD2及 CoStAR(rFOLR1-Fc + 抗人類-IgG-Fc-PE)之EC染色
集合2：CD2及 FOLR1(抗FOLR1-PE)之EC染色
集合3：CD2及 CoStAR(rFOLR1-Fc + 抗人類-IgG-Fc-PE) + FOLR1(抗FOLR1-PE)組合之EC染色。
方案2：全染色
阻斷細胞，隨後與rFOLR1-Fc一起培育且針對 全 (IC)表現染色。
集合1：CD2及 CoStAR(rFOLR1-Fc + 抗人類-IgG-Fc-PE)之全染色
集合2：CD2及 FOLR1(抗FOLR1-PE)之全染色
集合3：CD2及 CoStAR(rFOLR1-Fc + 抗人類-IgG-Fc-PE) + FOLR1(抗FOLR1-PE)組合之全染色。
方案 3 ：抗FOLR1-PE之細胞外染色，接著用抗人類-IgG-Fc-PE之rFOLR1-Fc全染色(EC-全)。細胞用抗FOLR1-PE表面染色，接著進行抗人類-IgG-Fc-PE之細胞內染色。
集合1： FOLR1(抗FOLR1-PE)之EC染色，接著CD2及 CoStAR(rFOLR1-Fc+抗人類-IgG-Fc-PE)之全染色
資料分析
隨後藉由流式細胞量測術分析細胞以定量對CoStAR (集合1)及FOLR1 (集合1)染色呈陽性的活(L/D-NIR -)、CD2 +ve及GFP -ve細胞。親本圈選策略類似於圖12中所述之策略。
圖110. 方案1細胞外染色。 集合 1 ( 頂部列 ) ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)及GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色。 集合 2 ( 中間列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色。 集合 3 ( 底部列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞用抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE染色。
方案1：細胞外染色
如圖110中所示，當ITIL306-21-US19B與K562-GFP-OKT3-FOLR1目標細胞共同培養時，組合偵測抗體(抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE)引起CoStAR+ve細胞百分比顯著增加。然而，陽性百分比遠高於預期CoStAR陽性(底部列第3圖區相對於頂部列第1圖區)。
圖111. 方案 2 ， 全染色。 集合 1 ( 頂部列 ) ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)及GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色。 集合 2 ( 中間列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色。 集合 3 ( 底部列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞用抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE染色。
方案2：全染色
如圖111中所示，當ITIL306-21-US19B與K562-GFP-OKT3-FOLR1目標細胞共同培養時，組合偵測抗體(抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE)引起CoStAR+ve細胞百分比顯著增加。另外，+ve細胞之百分比在預期範圍內(底部列第3圖區相對於頂部列第1圖區)。
圖112. 方案 3 ， EC-全染色。 集合 1 ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)或GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，隨後用抗FOLR1-PE染色(細胞外染色)，接著用抗人類-IgG-Fc-PE進行全染色。 方案 3 ： 細胞外 FOLR1 染色 ， 隨後細胞內 CoStAR 染色 ：如圖16中所示，當比較與K562-GFP及K562-OKT3-FOLR1共同培養之TIL時，細胞外FOLR1染色繼而細胞內CoStAR染色亦偵測到類似百分比之CoStAR +ve細胞(第3圖區相對於第1圖區)。
基於以上結果，決定由於以下原因用細胞內染色(方案2)繼續進行進一步測試。1)在細胞外染色(方案1)中，組合染色之CoStAR +ve細胞百分比高於在僅表現GFP之目標中所見之預期CoStAR +ve細胞。2)儘管EC/IC染色(方案3)偵測到CoStAR +ve細胞之預期範圍，但由於用抗FOLR1預染色(細胞外)細胞，存在額外1小時工作。
6.7.3.  rFOLR1-His之測試
基於上文所獲得之結果，認為抗FOLR1抗體能夠偵測結合於CoStAR之內源性FOLR1，而非重組FOLR1。內源性FOLR1與重組FOLR1之間的主要差異為重組FOLR1中存在可在空間上抑制抗FOLR1與rFOLR1之結合的人類Fc標籤。為了檢查抗FOLR1抗體不能偵測與rFOLR1結合之CoStAR是否歸因於Fc標籤之存在，在ITIL306效能分析中用rFOLR1-His置換rFOLR1-Fc。
染色方案如同部分6.7.2. (方案2，全染色)中所述之方案，除了rFOLR1-His與rFOLR1-Fc分別藉由抗Fc-APC + 抗FOLR1-PE或抗His-APC + 抗FOLR1-PE之組合進行偵測來比較。
圖113. 細胞內染色。 A ，ITIL306-21-US19B經塗鋪且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-APC (頂部列)、抗FOLR1-PE (中間列)或抗人類-IgG-Fc-APC + 抗FOLR1-PE之組合(底部列)針對CoStAR染色。
圖114. 細胞內染色。 A ，ITIL306-21-US19B經塗鋪且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗His-APC (頂部列)、抗FOLR1-PE (中間列)及抗His-APC + 抗FOLR1-PE之組合(底部列)針對CoStAR染色。
如圖113-圖114中所示，抗FOLR1抗體不能夠偵測與rFOLR1-Fc或rFOLR1-His結合之CoStAR。此表明，可能不係空間阻礙使得抗FOLR1抗體不能結合在ITIL306表面上隱匿之FOLR1。
6.7.4. 內源性可溶性FOLR1與ITIL306之結合
隱匿ITIL306中之CoStAR之FOLR1的可能來源為1)在CoStAR +ve TIL結合至FOLR1 +ve目標時，FOLR1可藉由稱為胞啃作用之過程自目標細胞剝離(Joly及Hudrisier，2003)，參見部分6.6.1。2)亦已有充分記錄FOLR1自細胞脫落，且已在各種癌症患者之血清中觀測到升高含量之脫落FOLR1或可溶性FOLR1 (sFOLR1) (Holm及Hansen, 2020; Leung等人2013; Cheung等人2016)。3)上文所述1與2兩者之組合。
為了測試來自目標細胞之sFOLR1是否與CoStAR +ve TIL結合，將目標細胞以2E6、4E6及8E6個細胞/毫升之濃度塗鋪於6孔盤中且在TC培育器中培育隔夜。次日早晨，將細胞短暫離心且小心地收集上清液而不干擾集結粒，且將未經過濾之上清液用於與ITIL306-21-US19B一起培育5小時。
資料分析
隨後藉由流式細胞量測術分析細胞以定量對FOLR1-PE染色呈陽性的活(NIR -ve)、CD2 +ve及GFP -ve細胞。
圖115. 細胞內染色。塗鋪ITIL306-21-US19B且與表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞(第1列)或其各別上清液(S/N)共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。第2、第3及第4列對應於分別來自2E6、4E6及8E6之所指示目標細胞的上清液。
如圖115中所示，來自表現FOLR1之目標細胞的sFOLR1以劑量依賴性方式結合至ITIL306-21-US19B。以紅色突出顯示之流動圖區(圖19)表示來自表現FOLR1 (左行)及OKT3-FOLR1 (右行)之增加濃度之目標細胞(頂部至底部)之上清液。然而，當ITIL306-21-US19B與來自不表現FOLR1之目標的上清液(以藍色突出顯示之流動圖區，圖115)一起培育時，在其中未觀測到FOLR1染色。總體而言，以上結果指示來自目標細胞之sFOLR1結合至ITIL306-21-US19B，其可有助於阻斷rFOLR1-Fc結合。
6.7.5. 內源性可溶性FOLR1與T細胞之非特異性結合
為了測試sFOLR1對ITIL306產物之特異性，用ITIL168最終產物(其為未經修飾之TIL)以及健康供體PBMC重複以上部分6.8.5中所述之實驗。
圖116. 細胞內染色。塗鋪ITIL168-21-US24A細胞且與表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞(頂部圖區)或其各別上清液(底部圖區)共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。
圖117. 細胞內染色。塗鋪PBMC且與來自表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3- (S/N)之K562目標細胞的上清液共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。展示CD2陰性群體(頂部圖區)及CD2陽性群體(底部圖區)中之FOLR1陽性。
圖118. 細胞內染色。塗鋪PBMC且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。展示CD2陰性群體(頂部圖區)及CD2陽性群體(底部圖區)中之FOLR1陽性。
如圖116中所示，來自表現FOLR1之目標細胞的sFOLR1結合至ITIL168-21-US24A。然而，當ITIL168-21-US24A與來自不表現FOLR1之目標(K562-GFP及-OKT3)之上清液一起培育時，在其中未觀測到FOLR1染色。在PBMC中觀測到類似結果(圖117至圖118)。特定言之，sFOLR1僅結合至CD2陽性PBMC群體(T細胞)，指示sFOLR1與T細胞之特異性結合(圖117)。總體而言，以上結果指示來自目標細胞之FOLR1非特異性結合於T細胞且不需要在T細胞上之CoStAR表現。作為此等研究之結果，將不使用用於偵測CoStAR表現之抗FOLR1抗體，因為染色對表現CoStAR之TIL不具有特異性。
6.8.  CD2相對於CD3作為T細胞標記物
在ITIL306產生期間，發現一些非T細胞(尤其NK細胞)在製程結束時存在且其藉由CoStAR轉導。一些NK細胞表現CD2，而CD3僅為泛T細胞標記物(Tang等人2020; Liu等人2016; Hirata等人2021)。因此，CD3為306效能分析中T細胞之有效標記物。為了檢驗當使用CD3作為T細胞標記物時細胞計數不存在顯著差異，ITIL306 TPC解凍且與目標細胞共同培養且比較用CD2或CD3偵測到之T細胞的數目。如圖119中所示，當藉由CD2或CD3偵測時，T細胞數目未觀測到明顯差異。因此，CD3將用作ITIL306效能分析之T細胞標記物。
圖119. 比較CD2相對於CD3作為T細胞標記物。ITIL306 DP及K562目標共同培養五個小時作為標準。隨後將細胞用CD2 PE-Cy7或CD3 PE-Cy7染色且比較其間的絕對T細胞計數。
圖120. 存活性染料濃度滴定。活/死-NIR染料以指定濃度稀釋且培育10分鐘，接著在Novocyte流式細胞儀上獲取。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
6.9.2.  L/D-NIR培育時程
為檢驗L/D-NIR染料(100稀釋，0.1 μl於100 μl中)培育所需之最佳時間，ITIL306產物與指定目標細胞共同培養5小時且用染料染色5、10、20或30分鐘，隨後固定且藉由流式細胞量測術獲取。如圖121中所示，在各時間點之間活細胞之百分比中未觀測到明顯差異。
圖121. 存活性染料培育時程。將活/死-NIR染料培育指定時間，隨後在Novocyte流式細胞儀中獲取。在10分鐘相對於20及30分鐘之間進行統計比較。NS-非顯著；* p≤0.05。在K562-GFP-OKT3-FOLR1共同培養中，可見10與30分鐘NIR染料培育之間的統計學上顯著之差異。然而，陽性百分比已下降，表明NIR染料10分鐘培育將為最佳的。
6.9.3.  rhFOLR1-Fc滴定
為檢驗分析所需的rFOLR1-Fc之最佳濃度，ITIL306產物與指定目標細胞共同培養5小時且隨後用增加濃度之rFOLR1-Fc (0.125 μl至2 μl/ml)染色。rFOLR1-Fc之儲備濃度為600 ng/ml。如圖122中所示，CoStAR偵測在0.5 μl/ml達到飽和。因此，決定以1 μl/ml rFOLR-Fc進行，此係因為關於移液較小體積之精確性問題。
6.9.4.  IFNγ APC滴定
為檢驗分析所需之抗人類-IFNγ APC之最佳濃度，將ITIL306產物與表現GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養5小時且細胞用增加濃度之抗人類-IFNγ APC (.25×至2×之製造商建議濃度)染色。如圖123中所示，陽性及陰性群體即使在0.25×抗體濃度下仍為可區分的。然而，在增加濃度之抗體下，IFNγ陽性百分比中可見輕微上升趨勢(分別對於0.25×、0.5×、1×及2×抗體濃度，69.6%、72.0%、74.6%及76.7% IFNγ陽性)。染色/分離指數量測指示在抗體濃度增加時染色改良(圖124)。
染色指數=中值陽性-中值陰性/ [(84%陰性−中值陰性)/0.995]
然而，對IFNγ染色呈陽性之細胞之百分比在不同抗體濃度上不改變太多。(圖125)。因此，為節約成本，決定在分析中用0.5× (2.5 μl於100 μl反應體積中)濃度之抗體進行。
圖123. 抗人類-IFNγ APC抗體滴定。針對IFNγ染色呈陽性之ITIL306細胞之百分比展示於金色框中。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖124. 染色指數相對於抗人類-IFNγ APC之抗體濃度。
圖125. 各種濃度之抗人類-IFNγ APC之IFNγ陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
6.9.5.  CD107a BV421滴定
為了檢驗分析所需之抗人類-CD107a BV421之最佳濃度，使ITIL306產物與表現GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞在增加濃度之抗人類-CD107a BV421 (0.25×至2×之製造商建議濃度)存在下共同培養5小時。如圖126中所示，陽性及陰性群體在1×抗體濃度下開始可區分。染色指數量測指示染色在抗體濃度增加時持續改良(圖127)。然而，對CD107a染色呈陽性之細胞之百分比在1×濃度之抗體下開始進入平線區(圖128)。因此，為節省成本，已決定用1× (每反應5 μl)濃度之抗體進行。
圖126. 抗人類-CD107a BV421濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-CD107a-BV421來量測的ITIL306產物之CD107a-BV421陽性。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖127. 抗人類-CD107a BV421滴定之染色索引值。
圖128. 各種濃度之抗人類-CD107a BV421之CD107a陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
6.9.6. 抗人類IgG-Fc PE滴定
為了檢驗分析所需的抗人類-IgG-Fc PE之最佳濃度，使ITIL306產物與rFOLR1-Fc結合，接著用不同濃度之抗人類-IgG-Fc PE二級抗體(2×至0.25×之製造商建議濃度)染色。如圖129中所示，陽性及陰性群體在0.25×濃度之抗人類-IgG-Fc PE二級抗體下開始可區分。然而，對CoStAR染色呈陽性之TIL之百分比在0.5×濃度之抗體下開始進入平線區，使得選擇1×濃度(圖130)。
圖129. 抗人類-IgG-Fc PE濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-IgG-Fc PE來量測的ITIL306產物之CoStAR陽性。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖130. 各種濃度之抗人類-IgG-Fc PE的CoStAR陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
6.9.7. 抗人類CD3 PE-Cy7滴定
為了檢驗分析所需的抗人類-CD3 PE-Cy7之最佳濃度，ITIL306產物用增加濃度之抗人類-CD3 PE-Cy7 (.25×至2×之製造商建議濃度)染色。如圖131中所示，當以指定濃度使用時，未在T細胞染色中觀測到明顯差異，因此選擇0.5×作為分析中使用之濃度。
圖131. 抗人類-CD3 PE-Cy7濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-CD3 PE-Cy7來量測的ITIL306產物之CD3染色。
6.10. 隔夜及同一天恢復
目前，需要三天來完成ITIL306效能。為了檢查在設置用於ITIL306效能分析之共同培養之前是否需要隔夜恢復細胞，比較隔夜及同一天恢復之分析。為此目的，使用ITIL306-21-US23A，一種新近合格之TPC。實驗設置與SOP中所描述之完全相同，不同之處在於解凍後恢復時間。如圖132至圖133中所示，TIL之同一天恢復對於ITIL306效能使得效能百分比急劇降低。因此，隔夜恢復對於ITIL306效能分析更理想。在某些實施例中，本文所述之所有方法包含隔夜恢復期。
圖133. 隔夜恢復或同一天設置之ITIL306-21-US23A的效能百分比。
6.11. 線性度
藉由進行摻合實驗來評估ITIL306效能方法之線性度。藉由混合ITIL306產物與藉由用4%多聚甲醛固定來產生的非功能性ITIL306細胞，以產生具有已知活細胞%之測試樣品，來製備ITIL306產物之多個效能百分比。摻合百分比因此定義為非固定ITIL306作為總細胞(固定加非固定)之函數之分數。在摻合之後，隨後將細胞與活化K562-GFP-OKT3或K562-GFP-OKT3-FOLR1或非活化K562-GFP細胞共同培養，且隨後藉由流式細胞量測術分析。一式三份地測試各稀釋點。分析及定量T細胞後，效能百分比報導為表現CD107a及/或IFNg之T細胞。如圖38A-圖38B中所示，簡單線性回歸分析證明與任一目標細胞共同培養之ITIL306之R 2為0.99。
6.12. 穩固性
藉由培育rhFOLR1-Fc及抗體主混合物混合液常規培育時間±5分鐘來測試ITIL306效能方法之穩固性。
6.12.1.  rhFOLR1培育時間
為了測試ITIL306效能分析之穩固性，將rhFOLR1培育推薦30分鐘±5分鐘。如圖135A-圖135B中所示，當rhFOLR1-Fc培育25至35分鐘之間時，在效能讀數或CoStAR陽性百分比中未觀測到顯著差異(RPD≤5%)。
圖135.  rhFOLR1培育時間之穩固性。 A.與rhFOLR1-Fc一起培育指定時間之ITIL306產物的效能。 B.ITIL306產物之CoStAR陽性百分比(資料係自與A中相同的實驗導出)。
6.12.2. 抗體主混合物培育時間
為了測試ITIL306效能分析之穩固性，將抗體主混合物培育推薦30分鐘±5分鐘。如圖136A-圖136B中所示，當抗體主混合物培育25至35分鐘之間時，在效能讀數或CoStAR陽性百分比中未觀測到顯著差異(RPD≤5%)。
圖136. 抗體混合液培育時間之穩固性。 A.與抗體混合液一起培育指定時間之ITIL306產物的效能百分比。 B.ITIL306產物之CoStAR陽性百分比(資料係自與A中相同的實驗導出)。 實例 23-TIL 產物效能之資料讀取
實例20中所述之方法用於測定如本文所述製備之例示性TIL群體的效能。資料提供於下表中。
實驗 ID 效能(%) (2- 分析物)
T13_Eng_運行10 43
T13_CR_QC_SB_T0 63
T13_VR_BAGN1 53
T13_Eng_運行11 59
T13_VR_V1_05 57
T13_VR_V2_07 62
T13_VR_V1_05 76
T13_VR_V1_05 73
T13_VR_V1_05 72
T13_VR_V1_05 67
T13_VR_V1_05 55
T13_VR_V3_21 57
T13_VR_V3_21 80
T13_VR_V3_21 62
T13_VR_V3_21 62
T13_VR_V3_21 61
T13_PD_9251 54
T13_PD_9251 53
T13_PD_9251 49
T13_PD_9251 43
T13_PD_9251 46
T13_PD_TIL065 56
T13_PD_TIL065 60
T13_PD_TIL065 59
T13_PD_TIL065 55
T13_PD_TIL065 55
T13_VR_V3_21 59
T13_VR_V3_21 73
T13_VR_V3_21 68
T13_VR_V3_21 64
T13_VR_V3_21 54
T13_VR_V4_17 55
T13_VR_V4_17 28
T13_VR_V4_17 28
T13_VR_V1_05 61
T13_VR_V3_21 73
T13_VR_V4_17 29
T13_穩定性T0 50
T13_穩定性T0 47
T13_穩定性T0 52
T13_穩定性T0 49
T13_穩定性2週 66
T13_穩定性2週 56
T13_穩定性1個月_0小時 66
T13_穩定性1個月_1小時 63
T13_穩定性1個月_2小時 61
T13_穩定性1個月_3小時 57
T13_穩定性_C009118_2W 50
測試13穩定性T0 84
測試13穩定性T0 69
測試13穩定性T0 76
測試13穩定性2週0小時 66
測試13穩定性2週1小時 67
測試13穩定性2週2小時 65
測試13穩定性2週3小時 66
測試13穩定性1個月 68
測試13穩定性2週 69
測試13穩定性1個月T0 72
測試13穩定性1個月T=1小時 73
測試13穩定性1個月T=2小時 73
測試13穩定性1個月T=3小時 71
測試13穩定性3個月 71
測試13穩定性3個月 60
測試13 68
測試13 75
測試13 60
測試13 2M穩定性 72
測試13 2W穩定性 70
測試13 T0穩定性 50
測試13 T0穩定性 61
測試13 T0穩定性 65
測試13 T0穩定性 57
測試13穩定性2個月 71
測試13穩定性2週 61
測試13穩定性2週 47
測試13穩定性2週 55
測試13 0小時 70
測試13 1小時 67
測試13 2小時 71
測試13 3小時 72
測試13 T0 63
測試13 T0 33
測試13 T0穩定性 44
測試13 T=0 64
測試13 T=1個月0小時 50
測試13 T= 1個月1小時 50
測試13 T= 1個月2小時 51
測試13 T= 1個月3小時 52
測試13=1個月0小時 62
測試13=1個月1小時 66
測試13=1個月2小時 64
測試13=1個月3小時 66
測試13 T=0 59
測試13 T=0 41
測試13 T=0 47
測試13 T=0 44
測試13 T=0 75
測試13 T=0 76
測試13 T= 3個月 76
測試13 T=1個月 66
測試13 T=1個月 49
測試13 T=1個月0小時 62
測試13 T=1個月1小時 66
測試13 T=1個月2小時 65
測試13 T=1個月3小時 62
測試13 T=1個月0小時 42
測試13 T=1個月1小時 43
測試13 T=1個月2小時 43
測試13 T=1個月3小時 44
測試13 T=2個月 59
測試13 T=0 81
測試13 T=0 76
測試13 T=0 79
測試13 T=2週0小時 47
測試13 T=2週1小時 48
測試13 T=2週2小時 47
測試13 T=2週3小時 50
測試13腫瘤保持 78
批次1 T0m 43
批次1 T0h 49
批次1 T1h 46
批次1 T2h 45
批次1 T3h 51
批次1 T1m 50
批次1 T3m 45
批次1 T6m 48
批次2 T0m 53
批次2 T0h 49
批次2 T1h 46
批次2 T2h 45
批次2 T3h 51
批次2 T1m 60
批次2 T3m 58
批次2 T6m 59
實例 24-TIL 產物效能之資料讀取
實例22中所述之方法用於測定如本文所述製備之例示性TIL群體的效能。資料提供於下表中。
306效能運行 效能%
批次1 41
批次2 34
批次3 47
批次4 79
批次5 62
本發明藉由以下編號段落進一步描述：
1. 一種分離冷凍保存未經修飾腫瘤浸潤淋巴球(UTIL)之治療群體的方法，其包含：(a)無菌解聚自個體切除之腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中腫瘤充分解聚，使得細胞懸浮液可冷凍保存；(b)與步驟(a)同一天藉由冷卻或維持在低溫下冷凍保存解聚腫瘤；(c)視情況儲存冷凍保存之解聚腫瘤；(d)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體；(e)藉由與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養UTIL之第一群體來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及(f)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
2. 如段落1之方法，其中解聚包含物理解聚、酶解聚或物理及酶解聚。
3. 如段落1或2之方法，其中冷卻係以受控速率進行。
4. 如段落3之方法，其中受控速率冷凍為約-2℃/min至約-60℃。
5. 如段落1-5中任一者之方法，其中解聚腫瘤經細胞化。
6. 如段落1-5中任一者之方法，其中解聚腫瘤經純化。
7. 如段落1-6中任一者之方法，其中在步驟(a)之後提供單細胞懸浮液。
8. 如段落1-7中任一者之方法，其中UTIL之第一群體為約100至2000萬個UTIL。
9. 如段落1-8中任一者之方法，其中步驟(d)進一步包含自腫瘤起始材料生長出UTIL隨後在步驟(e)中快速擴增。
10. 如段落9之方法，其中步驟(d)進行約兩週且步驟(e)進行約兩週。
11. 如段落1-10中任一者之方法，其中步驟(d)及/或步驟(e)進一步包含添加IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其組合。
12. 如段落1-11中任一者之方法，其進一步包含步驟(g)懸浮UTIL之第二群體。
13. 如段落12之方法，其中懸浮係在緩衝鹽水、人類血清白蛋白及二甲亞碸(DMSO)中。
14. 如段落1-13中任一者之方法，其中步驟(f)為冷凍保存且進一步包含解凍UTIL之最終步驟。
15. 如段落14之方法，其中解凍之UTIL準備以單次劑量形式輸注而無進一步修飾。
16. 一種藉由如段落1至15中任一者之方法獲得的冷凍保存未經修飾腫瘤浸潤淋巴球(UTIL)之治療群體。
17. 如段落16之治療群體，其中群體包含約5×10 9個至5×10 10個T細胞。
18. 一種如段落16或17之治療群體之冷凍保存袋。
19. 如段落18之冷凍保存袋，其用於靜脈內輸注。
20. 一種治療癌症之方法，其包含投與如段落14或15之治療群體或如段落18或19之冷凍保存袋。
21. 如段落20之方法，其中該癌症為膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、子宮頸癌、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌或腎細胞癌。
本發明藉由以下編號段落進一步描述：
1. 一種分離冷凍保存未經修飾腫瘤浸潤淋巴球(UTIL)之治療群體的方法，其包含：(a)自個體切除腫瘤；(b)將切除腫瘤儲存於單次使用無菌套組中，其中無菌套組包含：用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組；用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組，其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中；(c)在解聚模組中無菌解聚切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚；(d)在穩定化模組中冷凍保存解聚腫瘤；(e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體；(f)藉由與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養UTIL之第一群體來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；(g)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
2. 如段落1之方法，其中解聚包含物理解聚、酶解聚或物理及酶解聚。
3. 如段落1或2之方法，其中解聚腫瘤經細胞化。
4. 如段落1-3中任一者之方法，其中在步驟(c)之後提供單細胞懸浮液。
5. 如段落1-4中任一者之方法，其中UTIL之第一群體為約100至2000萬個UTIL。
6. 如段落1-5中任一者之方法，其中步驟(e)進一步包含自切除腫瘤起始材料生長出UTIL繼之以步驟(f)之快速擴增。
7. 如段落6之方法，其中步驟(e)進行約兩週且步驟(f)進行約兩週。
8. 如段落1-7中任一者之方法，其中步驟(e)及/或步驟(f)進一步包含添加IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其組合。
9. 如段落1-7中任一者之方法，其進一步包含步驟(h)懸浮UTIL之第二群體。
10. 如段落9之方法，其中懸浮係在緩衝鹽水、人類血清白蛋白及二甲亞碸(DMSO)中。
11. 如段落1-9中任一者之方法，其中步驟(g)為冷凍保存且進一步包含解凍UTIL之最終步驟。
12. 如段落10之方法，其中解凍之UTIL準備以單次劑量形式輸注而無進一步修飾。
13. 一種藉由如段落1至11中任一者之方法獲得的冷凍保存之UTIL之治療群體。
14. 如段落13之治療群體，其中群體包含約5×10 9個至5×10 10個T細胞。
15. 一種如段落13或14之治療群體之冷凍保存袋。
16. 如段落15之冷凍保存袋，其用於靜脈內輸注。
17. 一種治療癌症之方法，其包含投與如段落13或14之治療群體或如段落15或16之冷凍保存袋。
18. 如段落17之方法，其中該癌症為膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、子宮頸癌、頭頸癌(包括頭頸部鱗狀細胞癌[HNSCC])、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌或腎細胞癌。
19. 如段落1之方法，其中無菌套組之一或多個可撓性容器包含彈性可變形材料。
20. 如段落1之方法，其中無菌套組之解聚模組之一或多個可撓性容器包含一或多個可密封開口。
21. 如段落20之方法，其中無菌套組之解聚模組之可撓性容器包含可熱密封的熔接口。
22. 如段落1之方法，其中無菌套組之一或多個可撓性容器包含內部圓化邊緣。
23. 如段落1之方法，其中無菌套組之解聚模組之一或多個可撓性容器包含經調適以機械地擠壓及剪切其中的固體組織之解聚表面。
24. 如段落1之方法，其中無菌套組之富集模組之一或多個可撓性容器包含保留細胞化解聚固體組織之保留物的過濾器。
25. 如段落1之方法，其中無菌套組之穩定化模組之一或多個可撓性容器包含用於將活細胞儲存為溶液形式或冷凍保存狀態下之培養基調配物。
26. 如段落1之方法，其中無菌套組進一步包含數位、電子或電磁標籤識別符。
27. 如段落26之方法，其中無菌套組之標籤識別符係關於一種特定程式，其定義：一種類型之解聚及/或富集及/或穩定化過程；在該等過程中使用之一或多種類型之培養基；包括適合於受控速率冷凍之視情況選用之冷凍溶液。
28. 如段落1之方法，其中相同可撓性容器可形成解聚模組、穩定化模組及視情況選用之富集模組中之一或多者之一部分。
29. 如段落1之方法，其中無菌套組之解聚模組包含用於接收待處理之組織的第一可撓性容器。
30. 如段落1之方法，其中無菌套組之解聚模組包含第二可撓性容器，其包含用於解聚之培養基。
31. 如段落1之方法，其中無菌套組之視情況選用之富集模組包含第一可撓性容器及用於接收富集之濾液的第三可撓性容器。
32. 如段落1之方法，其中無菌套組之解聚模組及穩定化模組均包含第二可撓性容器且其中第二容器包含消化培養基及穩定化培養基。
33. 如段落1之方法，其中無菌套組之穩定化模組包含第四可撓性容器，其包含穩定化培養基。
34. 如段落1之方法，其中無菌套組之穩定化模組亦包含用於儲存及/或經歷冷凍保存之第一可撓性容器及/或第三可撓性容器。
35. 一種分離冷凍保存未經修飾腫瘤浸潤淋巴球(UTIL)之治療群體的方法，其包含：(a)自個體切除腫瘤；(b)在用於來自哺乳動物固體組織之細胞或細胞聚集體之半自動化無菌解聚及/或富集及/或穩定化的自動化裝置中儲存切除腫瘤，該自動化裝置包含可程式化處理器及單次使用無菌套組，其中無菌套組包含：用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組；用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組，其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中；(c)無菌解聚切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚；(d)在穩定化模組中冷凍保存解聚腫瘤；(e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體；(f)藉由與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養UTIL之第一群體來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；(g)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
36. 如段落35之方法，其中自動化裝置進一步包含用於識別無菌套組之射頻鑑別標籤讀取器。
37. 如段落36之方法，其中自動化裝置之可程式化處理器能夠經由標籤識別無菌套組且隨後執行定義解聚、富集及穩定化過程類型及該等過程所需的各別培養基類型之套組程式。
38. 如段落35之方法，其中自動化裝置之可程式化處理器經調適以與以下中之一或多者通信且控制以下中之一或多者：解聚模組；富集模組；及穩定化模組。
39. 如段落38之方法，其中自動化裝置之可程式化處理器控制解聚模組以使得能夠物理及/或生物分解固體組織材料。
40. 如段落39之方法，其中可程式化處理器控制解聚模組以使得能夠物理及酶分解固體組織材料。
41. 如段落40之方法，其中固體組織材料之酶分解係藉由一或多種選自由以下組成之群之培養基酶溶液：膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、Liberase HI、胃蛋白酶及其混合物。
42. 如段落35之方法，其中可程式化處理器控制解聚可撓性容器內之解聚表面，其機械地擠壓及剪切固體組織，視情況其中解聚表面為機械活塞。
43. 如段落35之方法，其中可程式化處理器控制穩定化模組以視情況使用可程式化溫度冷凍保存容器中之富集解聚固體組織。
44. 如段落35之方法，其中自動化裝置進一步以任何組合包含以下中之一或多者：能夠在將解聚之固體組織轉移至視情況選用之富集模組之前識別解聚過程是否已在解聚模組中完成之感測器；測定解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者的容器中所需之培養基的量，且控制材料在各別容器之間的轉移的重量感測器；控制解聚模組、富集模組及/或穩定化模組中之一或多者之容器內的溫度之感測器；控制培養基在模組中之各容器之輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個氣泡感測器；控制培養基在輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個泵，視情況蠕動泵；評估富集模組內之壓力的壓力感測器；控制富集模組內之切向流過濾過程之一或多個閥；及/或控制培養基在各模組之輸入與輸出端口之間的轉移之一或多個夾具。
45. 如段落35之方法，其中自動化裝置之可程式化處理器經調適以維持穩定化模組中之最佳儲存溫度範圍直至容器經移除；或執行受控冷凍步驟。
46. 如段落35之方法，其中自動化裝置進一步包含使用者介面。
47. 如段落46之方法，其中介面包含用以顯示指令之顯示幕，該等指令指導使用者輸入參數、確認預程式化之步驟、警告錯誤或其組合。
48. 如段落35之方法，其中自動化裝置經調適成可移動的。
49. 一種用於分離UTIL之治療群體的半自動無菌組織處理方法，其包含以下步驟：(a)自與無菌處理套組相關之數位、電子或電磁標籤識別符自動確定無菌解聚組織處理步驟及其相關條件，其中無菌套組包含：用於接收及處理包含固體哺乳動物組織之材料的解聚模組；用於過濾解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液的視情況選用之富集模組；及用於視情況進一步處理及/或儲存解聚之產物材料之穩定化模組，其中模組中之各者包含一或多個可撓性容器，該一或多個可撓性容器藉由經調適以使得組織材料能夠在其間流動的一或多個管道連接；及其中模組中之各者包含一或多個端口以准許將培養基及/或試劑無菌輸入至一或多個可撓性容器中；(b)自個體切除腫瘤；(c)將腫瘤置放於無菌套組之解聚模組之可撓性塑膠容器中；(d)藉由與以下通信且控制以下自動執行一或多個組織處理步驟來處理腫瘤：解聚模組；其中無菌解聚切除腫瘤，從而產生解聚腫瘤，其中若切除腫瘤可在無細胞損傷下冷凍保存，則充分解聚；視情況選用之富集模組，其中過濾解聚腫瘤以移除解聚之固體組織材料及分離未解聚組織及濾液；穩定化模組，其中冷凍保存解聚腫瘤；(e)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養解聚腫瘤來進行第一次擴增，以產生UTIL之第一群體；(f)藉由與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養UTIL之第一群體來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及(g)收集及/或冷凍保存UTIL之第二群體。
本發明藉由以下編號段落進一步描述：
1. 一種用於處理組織之可撓性容器，其包含：一或多個由可密封聚合物製成之層，其中可撓性容器之至少三個邊緣在製造期間密封；可撓性容器上之開放邊緣，在使用期間組織材料經由其插入；及一或多個連接器，其經組態以經由導管將可撓性容器耦接於至少一個元件；其中接近開放邊緣之區段在組織材料置於可撓性容器中之後密封以形成密封口。
2. 如段落1之可撓性容器，其中密封口包含至少3 mm寬之區域，其平行於開放邊緣且與可撓性容器之開放邊緣間隔開。
3. 如段落1之可撓性容器，其進一步包含夾具，其具有突起且接近密封口安置且相較於密封口進一步與可撓性容器之開放邊緣間隔開。
4. 如段落3之可撓性容器，其中在使用期間，密封口與夾具之組合經組態以承受施加至可撓性容器之100 N力。
5. 如段落3之可撓性容器，其中在使用期間，密封口與夾具之組合經組態以承受施加至可撓性容器之75 N力。
6. 如段落1之可撓性容器，其中密封口包含至少5 mm寬之區域，其平行於開放邊緣且與可撓性容器之開放邊緣間隔開。
7. 如段落1之可撓性容器，其中可撓性容器用於解聚組織材料。
8. 如段落1之可撓性容器，其中可撓性容器用於解聚組織材料、過濾解聚組織材料及分離未解聚組織及濾液。
9. 如段落1之可撓性容器，其進一步包含彈性可變形材料。
10. 如段落1之可撓性容器，其進一步包含一或多個指示符。
11. 如段落1之可撓性容器，其進一步包含一或多個標記。
12. 如段落1之可撓性容器，其中密封口係使用在預定壓力、預定溫度及預定時間範圍下操作之熱封機形成。
13. 如段落1之可撓性容器，其中可撓性容器經組態以與機械地擠壓置放於可撓性容器中之組織材料的裝置一起使用。
14. 如段落1之可撓性容器，其中可撓性容器經組態以剪切組織材料。
15. 根據段落1之可撓性容器在半自動化或自動化過程中之用途，其用於哺乳動物細胞或細胞聚集體之無菌解聚、穩定化及視情況富集。
16. 一種用於自組織提取所要材料之系統，其包含：套組，其包含：解聚可撓性容器；穩定化可撓性容器；及位於解聚可撓性容器或穩定化可撓性容器中之至少一者上的至少一個指示標籤，其能夠提供組織來源、組織狀態或識別符中之至少一者；能夠在解聚可撓性容器中處理至少一些組織以形成經處理流體之解聚元件；能夠富集經處理流體中之至少一些以形成所要材料的富集元件；能夠將所要材料之一部分儲存於穩定化可撓性容器中的穩定化元件；及位於解聚元件或穩定化元件中之至少一者上的至少一個指示標籤讀取器，其能夠提供組織來源或穩定化元件處組織狀態中之至少一者。
17. 如段落15之系統，其中所要材料包含腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
18. 如段落15之系統，其中一或多種類型之培養基藉由解聚元件及穩定化元件用於過程中。
19. 如段落15之系統，其進一步包含冷凍保存培養基，其供用於能夠受控速率冷凍之穩定化元件中。
20. 如段落15之系統，其中解聚可撓性容器包含具有在使用期間密封之開放邊緣之解聚袋，且穩定化可撓性容器為穩定化袋。
21. 一種用於來自哺乳動物固體組織之細胞或細胞聚集體之半自動化無菌解聚及/或富集及/或穩定化的自動化裝置，其包含：可程式化處理器；及包含如段落1至15中任一者之可撓性容器中之至少一者作為解聚可撓性容器的套組。
22. 如段落21之自動化裝置，其進一步包含指示標籤讀取器。
23. 如段落21之自動化裝置，其進一步包含射頻鑑別標籤讀取器，其用以識別套組組件。
24. 如段落21之自動化裝置，其中可程式化處理器能夠經由標籤識別套組組件且隨後執行定義解聚、富集及穩定化過程類型及彼等過程所需的各別培養基類型之程式。
25. 如段落21之自動化裝置，其中可程式化處理器控制自動化裝置之解聚元件，以使得能夠在解聚可撓性容器中物理及/或生物分解固體組織。
26. 如段落25之自動化裝置，其中可程式化處理器控制接近解聚可撓性容器之解聚表面，其機械地擠壓及剪切安置於解聚可撓性容器中之固體組織，視情況其中解聚表面為機械活塞。
27. 如段落21之自動化裝置，其中可程式化處理器控制自動化裝置之解聚元件以使得能夠在解聚可撓性容器中物理及酶分解固體組織。
28. 如段落27之自動化裝置，其中固體組織之酶分解係藉由一或多種選自以下之培養基酶溶液：膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、玻尿酸酶、去氧核糖核酸酶、Liberase HI、胃蛋白酶或其混合物。
29. 如段落21之自動化裝置，其中裝置包含以下中之至少兩者：解聚元件；富集元件；及穩定化元件；且其中可程式化處理器經調適以與以下中之一或多者通信且控制以下中之一或多者：解聚元件；富集元件；及穩定化元件。
30. 如段落29中任一者之自動化裝置，其中可程式化處理器控制穩定化元件以視情況使用可程式化溫度冷凍保存冷凍保存容器中之富集解聚固體組織。
31. 如段落29中任一者之自動化裝置，其中裝置進一步以任何組合包含以下額外組件中之一或多者：能夠在將解聚之固體組織轉移至視情況存在之富集元件之前識別解聚過程是否已在解聚元件中完成之感測器；測定解聚元件、富集元件及/或穩定化元件中之一或多者的容器中所需之培養基的量，且控制材料在各別容器之間的轉移的重量感測器；控制解聚元件、富集元件及/或穩定化元件中之一或多者之容器內的溫度之感測器；控制培養基在元件中之各容器之輸入與輸出端口之間的轉移的至少一個氣泡感測器；控制培養基在輸入與輸出端口之間的轉移之至少一個泵，視情況蠕動泵；評估富集元件內之壓力的壓力感測器；控制富集元件內之切向流過濾過程的一或多個閥；及/或控制培養基在各元件之輸入與輸出端口之間的轉移之一或多個夾具。
32. 如段落29之自動化裝置，其中可程式化處理器經調適以維持穩定化元件中之最佳儲存溫度範圍直至容器經移除；或執行受控冷凍步驟。
33. 如任何前述段落之自動化裝置，其進一步包含使用者介面。
34. 如段落26之自動化裝置，其中介面包含用以顯示指令之顯示幕，該等指令指導使用者輸入參數、確認預程式化之步驟、警告錯誤或其組合。
35. 如段落21之自動化裝置，其中自動化裝置經調適成可移動的。
36. 一種自動組織處理方法，其包含：自與套組相關之數位、電子或電磁標籤指示符自動確定用於處理步驟之條件及其相關條件；將組織樣品置放於套組之可撓性容器中；及
密封可撓性容器之至少一個邊緣；藉由與指示符通信及控制可撓性容器自動執行一或多個組織處理步驟來處理組織樣品；及過濾經處理組織樣品的至少一部分以產生經過濾流體；及提供經過濾流體中之至少一些至冷凍保存可撓性容器。
37. 如段落31之方法，其中處理包含攪拌、提取及酶消化可撓性容器中組織樣品之至少一部分。
38. 如段落31之方法，其中處理包含攪拌、提取及酶消化可撓性容器中組織樣品之至少一部分且引起所要材料之提取。
39. 如段落31之方法，其中處理包含攪拌、提取及酶消化可撓性容器中組織樣品之至少一部分且引起腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之提取。
40. 如段落31之方法，其中可撓性容器包含可熱密封材料。
41. 如段落31之方法，其中可撓性容器包含EVA、乙酸乙烯酯及聚烯烴聚合物摻合物或聚醯胺中之至少一者。
本發明藉由以下編號段落進一步描述：
1. 一種用於分離冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： (a)    (i)冷凍保存所切除腫瘤且解聚冷凍保存之腫瘤，或 (ii)解聚所切除腫瘤且冷凍保存所解聚腫瘤，或 (iii)冷凍保存所切除腫瘤且將該腫瘤處理成多個腫瘤片段，或 (iv)將所切除腫瘤處理成多個腫瘤片段且冷凍保存該等腫瘤片段以獲得精細切除腫瘤產物； (b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該精細切除腫瘤產物來進行第一次擴增以產生TIL之第一群體； (c)藉由將該TIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 (d)收集及/或冷凍保存該TIL之第二群體， 其中該方法包含藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法量測TIL之效能。
2. 如段落1之方法，其包含量測精細切除腫瘤產物之效能。
3. 如段落1之方法，其包含量測TIL之第一群體之效能。
4. 如段落1之方法，其包含量測TIL之所收集第二群體之效能。
5. 如任何前述段落之方法，其中量測效能包含效能標記物之細胞特異性量測。
6. 如段落5之方法，其包含量測兩種或更多種細胞特異性效能標記物。
7. 如段落5至6之方法，其包含量測細胞介素之細胞內含量。
8. 如段落7之方法，其包含量測TNFα及/或IFNγ之細胞內含量。
9. 如段落5至8之方法，其包含量測或偵測細胞表面標記物。
10.     如段落9之方法，其包含量測或偵測CD2及/或CD137。
11.     如段落1至10之方法，其包含量測CD3 +細胞中之效能。
12.     一種藉由如段落1至12之方法獲得之TIL的治療群體。
13.     一種治療個體之方法，其包含投與藉由如段落1至12之方法獲得之TIL的治療群體。
14.     一種選擇或富集冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： (a)    (i)冷凍保存所切除腫瘤且解聚該冷凍保存之腫瘤，或 (ii)解聚所切除腫瘤且冷凍保存所解聚腫瘤，或 (iii)冷凍保存所切除腫瘤且將該腫瘤處理成多個腫瘤片段，或 (iv)將所切除腫瘤處理成多個腫瘤片段且冷凍保存該等腫瘤片段以獲得精細切除腫瘤產物； (b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該精細切除腫瘤產物來進行第一次擴增以產生TIL之第一群體； (c)藉由將該TIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 (d)收集及/或冷凍保存該TIL之第二群體， 其中該方法包含量測TIL之效能，及選擇展現效能之彼等TIL。
15.     如段落14之方法，其中量測效能包含藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法對效能標記物進行細胞特異性量測。
16.     如段落14之方法，其包含量測兩種或更多種細胞特異性效能標記物。
17.     如段落14至16之方法，其包含量測細胞介素之細胞內含量。
18.     如段落14至17之方法，其包含量測TNFα及/或IFNγ之細胞內含量。
19.     如段落14至18之方法，其包含量測或偵測細胞表面標記物。
20.     如段落14至19之方法，其包含量測或偵測CD2及/或CD137。
21.     如段落14至20之方法，其包含量測CD3 +細胞中之效能。
22.     一種藉由如段落14至21之方法獲得之TIL的治療群體。
23.     一種治療個體之方法，其包含投與藉由如段落14至21之方法獲得之TIL的治療群體。
24.     一種用於評估冷凍保存之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體之效能的方法，其包含： (a)    (i)冷凍保存切除腫瘤且解聚冷凍保存之腫瘤，或 (ii)解聚所切除腫瘤且冷凍保存所解聚腫瘤，或 (iii)冷凍保存所切除腫瘤且將該腫瘤處理成多個腫瘤片段，或 (iv)將所切除腫瘤處理成多個腫瘤片段且冷凍保存該等腫瘤片段， 獲得精細切除腫瘤產物， (b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該精細切除腫瘤產物來進行第一次擴增以產生TIL之第一群體； (c)藉由將該TIL之第一群體與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 (d)收集及/或冷凍保存該TIL之第二群體， 其中該方法包含量測第二群體之TIL的效能，及自第二群體選擇具有如藉由量測樣品之效能所示之所要效能的彼等TIL，或調整來自第二群體之TIL的量以得到具有所要效能之製劑。
25.     如段落24之方法，其中量測效能包含藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法對效能標記物進行細胞特異性量測。
26.     如段落24之方法，其包含量測兩種或更多種細胞特異性效能標記物。
27.     如段落24至26之方法，其包含量測細胞介素之細胞內含量。
28.     如段落24至27之方法，其包含量測TNFα及/或IFNγ之細胞內含量。
29.     如段落24至28之方法，其包含量測或偵測細胞表面標記物。
30.     如段落24至29之方法，其包含量測或偵測CD2及/或CD137。
31.     如段落24至30之方法，其包含量測CD3 +細胞中之效能。
32.     一種藉由如段落24至31之方法獲得之TIL的製劑。
33.     一種治療個體之方法，其包含投與藉由段落24至31之方法獲得之TIL的製劑。
34.     一種用於測定腫瘤浸潤淋巴球(TIL)或TIL群體之效能的方法，其包含：藉由流式細胞量測術或基於筒匣之方法測定TIL或TIL群體中之複數個TIL之細胞特異性效能標記物的含量。
35.     如段落34之方法，其包含測定兩種或更多種細胞特異性效能標記物之含量。
36.     如段落34至35之方法，其包含量測細胞介素之細胞內含量。
37.     如段落36之方法，其包含量測TNFα及/或IFNγ之細胞內含量。
38.     如段落34至37之方法，其包含量測或偵測細胞表面標記物。
39.     如段落38之方法，其包含量測或偵測CD2及/或CD137。
40.     如段落34至39之方法，其包含量測CD3+細胞中之效能。
41.     如段落1、15、25或34中任一者之方法，其中基於筒匣之方法係由Chemometec或Accellix產生。
本文所描述之主題包括但不限於以下實施例：
1. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段；經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及/或經螢光標記之抗CD3抗體或其抗原結合片段；及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞或CD3+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
2. 如段落1之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術。
3. 如段落1-2中任一者之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
4. 如段落1-3中任一者之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由在如本文所述之等高線下設定圈選閘門來測定，或其中小於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
5. 如段落1-4中任一者之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之該活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
6. 如段落1-5中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
7. 如段落1-6中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
8. 如段落1-7中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
9. 如段落1-8中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
10.     如段落1-9中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
11.     如段落1-10中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
12.     如段落1-11中任一者之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
13.     如段落1-12中任一者之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
14.     如段落1-13中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
15.     如段落1-14中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
16.     如段落1-15中任一者之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
17.     如段落1-16中任一者之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
18.     如段落1-17中任一者之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
19.     如段落1-18中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
20.     如段落1-19中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
21.     如段落20中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
22.     如段落1-21中任一者之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
23.     如段落1-22中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，並且冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
24.     如段落1-23中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如段落1之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如段落23之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
25.     如段落1-24中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之該經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之該經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
26.     如段落1-25中任一者之方法，其中該添加按任何次序。
27.     如段落1-26中任一者之方法，其中該添加為依序的。
28.     如段落1-26中任一者之方法，其中該添加為同時的。
29.     如段落1-28中任一者之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
30.     如段落1-29中任一者之方法，其中該等癌細胞為惡性的。
31.     如段落1-30中任一者之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌及黑素瘤。
32.     一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 在經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段存在下將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體，其中該共同培養在約34至約40℃之溫度下持續約4至約6小時； b-a)  向該TIL活化群體添加存活性染料，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘； b-b)  向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘 c) 向TIL之該活化染色群體添加經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。 其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
33.     一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之該群體與該等癌細胞之樣品共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段或其任何組合； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
34.     如段落33之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術。
35.     如段落33-34中任一者之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
36.     如段落33-35中任一者之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體，其中用於實驗之TIL將尚未暴露於活化細胞；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由在如本文所述之等高線下設定圈選閘門來測定，或其中小於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
37.     如段落33-36中任一者之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之該活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
38.     如段落33-37中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
39.     如段落33-38中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
40.     如段落33-39中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
41.     如段落33-40中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
42.     如段落33-41中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
43.     如段落33-42中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
44.     如段落33-43中任一者之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
45.     如段落33-44中任一者之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
46.     如段落33-45中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
47.     如段落33-46中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
48.     如段落33-47中任一者之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
49.     如段落33-48中任一者之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
50.     如段落33-49中任一者之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
51.     如段落33-50中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
52.     如段落33-51中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
53.     如段落33-52中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
54.     如段落33-53中任一者之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
55.     如段落33-54中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
56.     如段落33-55中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如段落33之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如段落55之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
57.     如段落33-56中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之該經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之該經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
58.     如段落33-57中任一者之方法，其中該添加按任何次序。
59.     如段落33-58中任一者之方法，其中該添加為依序的。
60.     如段落33-58中任一者之方法，其中該添加為同時的。
61.     如段落33-60中任一者之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
62.     如段落33-61中任一者之方法，其中該等癌細胞為惡性的。
63.     如段落33-62中任一者之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌及黑素瘤。
64.     一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 在經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段存在下將該等TIL之該群體與該等癌細胞之樣品共同培養以製備TIL活化群體，其中該共同培養在約34至約40℃之溫度下持續約4至約6小時； b-a)  向該TIL活化群體添加存活性染料，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘； b-b)  向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘 c) 向TIL之該活化染色群體添加經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。 其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
65.     一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a)         獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體，其包含表現抗FOLR1 scFv之TIL亞群； b)         將該等TIL之該群體與表現FOLR1且經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； b-i)      在rhFOLR1或連接至標籤之rhFOLR1存在下培育該TIL活化群體； c)         向步驟b-i)之該TIL活化群體添加經螢光標記之抗標籤抗體或其抗原結合片段及/或經螢光標記之抗FOLR1抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD3或抗CD2抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d)         偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD3+或CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e)         測定該TIL活化群體之該效能百分比。
66.     如段落65之方法，其中該連接至標籤之rhFOLR1係rhFOLR1-Fc。
67.     如段落65-66中任一者之方法，其中該經螢光標記之抗標籤抗體為經螢光標記之抗人類IgG Fc抗體或其抗原結合片段。
68.     如段落65-67中任一者之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術。
69.     如段落65-68中任一者之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
70.     如段落65-69中任一者之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體，其中用於實驗之TIL將尚未暴露於活化細胞；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由在如本文所述之等高線下設定圈選閘門來測定，或其中小於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
71.     如段落65-70中任一者之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之該活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
72.     如段落65-71中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
73.     如段落65-72中任一者之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
74.     如段落65-73中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
75.     如段落65-74中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
76.     如段落65-75中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
77.     如段落65-76中任一者之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
78.     如段落65-77中任一者之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
79.     如段落65-78中任一者之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
80.     如段落65-79中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
81.     如段落65-80中任一者之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
82.     如段落65-81中任一者之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
83.     如段落65-82中任一者之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
84.     如段落65-83中任一者之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
85.     如段落65-84中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
86.     如段落65-85中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
87.     如段落65-86中任一者之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
88.     如段落65-87中任一者之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
89.     如段落65-88中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
90.     如段落65-89中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如段落65之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如段落89之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
91.     如段落65-90中任一者之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之該經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之該經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
92.     如段落65-91中任一者之方法，其中該添加按任何次序。
93.     如段落65-92中任一者之方法，其中該添加為依序的。
94.     如段落65-92中任一者之方法，其中該添加為同時的。
95.     如段落65-94中任一者之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
96.     如段落65-95中任一者之方法，其中該等癌細胞為惡性的。
97.     如段落65-96中任一者之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌及黑素瘤。
98.     一種用於製備腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： a) 將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此製備解聚腫瘤產物，其中該解聚包含在高達6 N/cm 2下在培養基酶溶液存在下施加120至360次/分鐘之重複物理壓力，其中該腫瘤充分解聚為細胞懸浮液，使得可冷凍保存該解聚腫瘤產物； b) 在製備該解聚腫瘤產物之24小時內，將該解聚腫瘤產物冷卻至適合的冷凍保存溫度以製備冷凍保存之解聚腫瘤產物； c) 將該冷凍保存之解聚腫瘤產物儲存在冷凍狀態下； d) 解凍該冷凍保存之解聚腫瘤產物； e) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養冷凍保存之解聚腫瘤產物來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； f) 由該TIL之第一群體在細胞培養基中與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 g) 冷凍保存該TIL之第二群體以製備TIL之冷凍保存治療群體； 其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)在封閉系統中進行； h) 獲得步驟f)之該TIL之第二群體之樣品或步驟g)之TIL之該冷凍保存治療群體之樣品； i) 將來自步驟h)之該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； j) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； k) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， l) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
99.     一種用於製備腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： a) 將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此製備解聚腫瘤產物，其中該解聚包含在高達6 N/cm 2下在培養基酶溶液存在下施加120至360次/分鐘之重複物理壓力，其中該腫瘤充分解聚為細胞懸浮液，使得可冷凍保存該解聚腫瘤產物； b) 在製備該解聚腫瘤產物之24小時內，將該解聚腫瘤產物冷卻至適合的冷凍保存溫度以製備冷凍保存之解聚腫瘤產物； c) 將該冷凍保存之解聚腫瘤產物儲存在冷凍狀態下； d) 解凍該冷凍保存之解聚腫瘤產物； e) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養冷凍保存之解聚腫瘤產物來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； f) 由該TIL之第一群體在細胞培養基中與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 g) 冷凍保存該TIL之第二群體以製備TIL之冷凍保存治療群體； 其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)在封閉系統中進行； h) 獲得步驟f)之該TIL之第二群體之樣品或步驟g)之TIL之該冷凍保存治療群體之樣品； i) 將來自步驟h)之該等TIL之該群體與來自該腫瘤之細胞共同培養以製備TIL活化群體； j) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； k) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， l) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。 * * *
在由此詳細描述本發明之較佳實施例的情況下，應理解，由上文段落定義之本發明不限於上文描述中所闡述之特定細節，因為其許多明顯變化可在不偏離本發明之精神或範疇的情況下進行。
2:套組 4:袋/元件 5:袋/注射器 6:袋/元件 7:袋 8:條帶/密封口/元件 9:密封口/過濾器 10:袋/導管 11:開口/導管 12:閥/腔體 13:閥/導管 14:周邊/夾具 15:連接器 16:端口 17:分流連接件/分流器 18:角孔 19:閥 20:框架/端口 20':框架 21:區段 22:孔/袋 23:邊緣/定位器 24:栓釘/連接器 25:導管 26:窗/區段/末端 27:指示符 28:指示符 29:標記 30:殼/蓋板/袋 31:邊緣 32:端口 33:定位器 34:連接器 35:導管 36:區段/指示符 37:指示符 38:指示符 39:標記 40:冷凍器/袋 41:邊緣 43:定位器 44:連接器 46:末端/導管 50:熱密封機器/袋 52:連接器 54:導管 55:熱密封機 60:夾具/袋 61:楔形形成物 62:桿/連接器 63:突起 64:桿/部分 65:頂點 66:螺釘/部分/邊緣 67:通道 68:凹槽 69:脊形形成物 70:袋 72:連接器 74:部分 76:部分 80:袋 82:連接器 84:末端 86:邊緣 90:袋 92:連接器 94:末端/袋 96:邊緣 100:裝置/袋 100':裝置 101:邊緣 102:末端 103:定位器 104:連接器 105:導管 106:連接器 107:指示符 108:指示符 109:標記 110:外殼/端口 111:背壁 112:底盤/夾具 113:馬達 114:馬達單元/馬達及變速箱/端口 115:變速器 116:曲柄 118:連接桿 120:機構/袋 121:邊緣 122:樞軸/末端 123:定位器 124:樞軸/連接器 125:導管 126:桿 127:指示符 128:桿/指示符 129:標記 130:桿/袋 131:部分 132:桿 133:定位器 134:腳/總成/連接器 135:導管 136:腳/總成 137:指示符 138:底板/指示符 140:袋/密封口/底板 141:標記 142:框架/標記/線 143:區室/定位器 144:框架/區室 145:區段 146:彈簧/區室 147:區室 148:區域/端口 149:端口 150:板/基底/端口 151:表面 152:表面/袋 156:密封口 158:區段 160:定位器 162:袋 164:閥 166:導管 170:袋 172:導管 174:導管 176:導管 178:閥 180:袋 182:導管 184:導管 186:導管 188:閥 190:袋 191:套組 192:袋 193:指示符 194:指示符 195:閥 196:閥 197:夾具 198:夾具 199:導管 200:裝置/過濾器 201:套組 202:袋 205:套組 206:袋 208:袋 209:閥 210:外殼/閥 211:夾具 212:夾具 213:馬達 214:馬達單元/過濾器 215:端口 216:端口 220:機構 221:控制器/軸 222:齒形帶/導管 223:軸 224:凸輪軸/套組 225:從動輪 226:托架/袋 227:從動輪 228:托架/袋 229:引導件 230:凸輪/過濾器 231:彈簧 232:凸輪/閥/袋 234:腳/夾具/指示符 236:腳/夾具/指示符 238:閥/標記 240:標記 241:膜 242:端口 244:定位器 246:連接器 248:區域/導管 250:板/導管 251:表面 252:表面/導管 254:夾具 255:鉸鏈 256:感測器/夾具 258:端口 260:端口 264:袋 266:夾具 268:夾具 270:過濾器 272:導管 274:端口 276:端口 278:閥 280:連接器 282:袋 284:袋 286:端口 288:夾具 290:閥 292:閥 294:袋 296:夾具 298:過濾器 300:注射器 302:注射器 304:袋 306:支架 310:熔接口 312:夾具 314:槳葉 316:槳葉 330:袋 332:區段 334:夾具 336:支架 338:鉸鏈 340:側 342:側 344:夾具 346:突起 348:閂 350:隆脊 352:套組 354:袋 356:過濾器 358:夾具 360:夾具 362:閥 364:閥 366:袋 368:導管 400:袋 402:夾具 408:組織 410:導管 420:袋 422:元件 424:托盤/材料/組織 426:導管 428:元件 430:端口 1a:容器 1b:末端 1c:孔 1d:位置 1e:邊緣 1f:導管 1g:導管 1h:導管 2a:過濾器 2b:過濾器 2c:過濾器 3a:培養基 3b:酶/培養基 3c:溶液/培養基 4a:過濾器單元 4b:過濾器 4c:過濾器單元 4d:過濾器 4e:過濾器 5a:夾具 5b:夾具 5c:夾具 5d:夾具 5e:夾具 5f:夾具 5g:夾具 5h:夾具 5i:夾具 5j:夾具 5k:夾具 5l:夾具 5m:夾具 5n:夾具 5o:夾具 5p:夾具 5q:夾具 5r:夾具 5s:夾具 5t:夾具 6a:容器 6b:孔 7a:容器 7b:孔 7c:邊緣 7d:導管 7e:導管 7f:導管 8a:過濾器單元 8b:過濾器 8c:閥 9a:過濾器單元 9b:過濾器 9c:閥 10a:容器 10b:孔 10c:邊緣 10e:導管 10f:導管 10g:蓋板 10h:連接器 11a:容器 11b:孔 11d:導管 11e:導管 11f:導管 12a:容器 12b:固定件 12c:空間 12d:位置 13a:栓釘 13b:栓釘 13c:熔接器 13d:模組 13e:模組 13f:表面 13g:夾具 13h:泵 13i:定位器 13j:夾具 13k:閥 13l:栓釘 13m:熔接器 13n:切割器 13o:模組 19a:閥 19b:閥 19c:閥 C:箭頭 D:箭頭 E:酶 F:箭頭 T:樣品/組織 U:箭頭
專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之拷貝。
以舉例方式給出，但並不意欲將本發明僅限制於描述之特定實施例之以下實施方式可與隨附圖式結合而最佳地理解。
圖1為用於解聚及消化固體組織材料之可撓性容器之示意圖。
圖2A為將消化之固體組織材料引導至後續模組或廢料容器之一系列過濾模組之示意圖。
圖2B為在廢料之消化及移除之後富集細胞之可撓性容器的示意圖。
圖2C為在廢料之消化及移除之後富集細胞之可撓性容器之另一實施例的示意圖。
圖3A為在解聚固體組織材料及/或富集細胞之後用於穩定化細胞之可撓性容器的示意圖。
圖3B為用於在解聚固體組織材料及/或富集細胞之後經由冷凍保存穩定化細胞的含有與額外可撓性容器之連接的可撓性容器之另一實施例的示意圖。
圖4為無菌套組之示意圖。
圖5為指示在幾秒至若干小時範圍內之各種解聚時間，自解聚過程獲得之細胞群體之所觀測倍數變化的條形圖。
圖6為描述使用為用於解聚及穩定化之過程的模組之一部分的用於不同起始溶液之多個可撓性容器之半自動無菌組織處理方法的圖。
圖7為描述包含用於過程之培養基的可撓性容器可如何在無菌處理套組及方法之模組之間共用的圖。
圖8描繪用於產生TIL之方法的一般概述。
圖9描繪腫瘤起始材料之收集及處理之概述。
圖10描繪TIL製造過程之概述。
圖11A展示用於處理及儲存組織材料之套組之實施例的視圖。
圖11B展示用於處理及儲存組織材料之套組之實施例的視圖。
圖11C展示用於處理及儲存組織材料之套組之實施例的視圖。
圖11D展示用於處理及儲存組織材料之套組之實施例的視圖。
圖12A展示收集袋之實施例之透視圖。
圖12B展示收集袋之實施例之透視圖。
圖12C展示收集袋之實施例之透視圖。
圖12D展示收集袋之實施例之透視圖。
圖12E展示收集袋之實施例之透視圖。
圖13A展示收集袋之實施例之正視圖。
圖13B展示收集袋之實施例之正視圖。
圖13C展示收集袋之實施例之正視圖。
圖13D展示收集袋之實施例之正視圖。
圖13E展示收集袋之實施例之正視圖。
圖14展示收集袋之實施例之後視圖。
圖15展示收集袋之實施例之側視圖。
圖16A展示收集袋之實施例之俯視圖。
圖16B展示收集袋之實施例之仰視圖。
圖17A展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的部分開放組織收集袋之實施例之俯視圖，其中袋具有密封邊緣。
圖17B展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的開放組織收集袋之實施例之仰視圖，其中袋具有密封邊緣。
圖18A展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的部分開放組織收集袋之實施例之俯視圖。
圖18B展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的完全開放組織收集袋之實施例之俯視圖。
圖19A展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的部分開放組織收集袋之實施例之俯視圖，其中袋具有預定寬度之密封邊緣。
圖19B展示用於密封其中組織以供用於本發明之處理的完全開放組織收集袋之實施例之俯視圖，其中袋具有預定寬度之密封邊緣。
圖20A展示收集袋之實施例之正視圖。
圖20B展示收集袋之實施例之正視圖。
圖20C展示收集袋之實施例之正視圖。
圖20D展示收集袋之實施例之正視圖。
圖20E展示收集袋之實施例之正視圖。
圖21A展示收集袋之實施例之正視圖。
圖21B展示收集袋之實施例之正視圖。
圖21C展示收集袋之實施例之正視圖。
圖21D展示收集袋之實施例之正視圖。
圖21E展示收集袋之實施例之正視圖。
圖22A展示收集袋之實施例之正視圖。
圖22B展示收集袋之實施例之正視圖。
圖22C展示收集袋之實施例之正視圖。
圖22D展示收集袋之實施例之正視圖。
圖23展示收集袋之實施例之正視圖。
圖24展示收集袋之實施例之正視圖。
圖25展示收集袋之實施例之正視圖。
圖26展示耦接於導管及端口之收集袋之實施例之正視圖。
圖27A展示使用前之收集袋之實施例之正視圖。
圖27B展示例如在材料沈積於袋內之後已經密封之收集袋之實施例的正視圖。
圖28展示包括開放收集袋及冷凍保存袋的面朝上之冷凍保存套組之實施例之俯視圖。
圖29展示包括指示其應在何處封閉之收集袋及冷凍保存袋的面朝下之冷凍保存套組之實施例之俯視圖。
圖30展示包括封閉收集袋及冷凍保存袋的面朝上之冷凍保存套組之實施例之俯視圖。
圖31展示包括封閉收集袋及冷凍保存袋的面朝上之冷凍保存套組之實施例之側視圖。
圖32展示冷凍保存套組之實施例之端視圖。
圖33展示包括耦接於導管之標誌之收集袋之實施例之俯視圖。
圖34展示包括收集袋、過濾器及冷凍保存袋之冷凍保存套組之實施例之正視圖。
圖35展示包括收集袋、過濾器及冷凍保存袋之冷凍保存套組之實施例之正視圖。
圖36A展示包括收集袋、過濾器及冷凍保存袋之冷凍保存套組之實施例之正視圖。
圖36B展示使用在使用期間位置接近於收集袋之表面的夾具、鉸鏈及閂鎖以及桿緊固之收集袋之實施例的側視圖。
圖36C展示位於收集袋上之夾具的分解視圖。
圖37展示包括收集袋、過濾器及冷凍保存袋之冷凍保存套組之實施例之正視圖。
圖38展示包括收集袋、過濾器及冷凍保存袋之冷凍保存套組之實施例之正視圖。
圖39展示藉由夾具緊固之收集袋之實施例的正視圖。
圖40展示收集袋之實施例之正視圖。
圖41展示用於在封閉樣品容器內將組織解聚成個別細胞或細胞凝集物之踏綜裝置(treading device)的正視圖。
圖42及圖43展示處於兩個不同各別操作位置的圖41之裝置；圖44展示先前圖式中所展示之裝置的平面視圖。
圖45展示裝置之替代性構造之另一平面視圖。
圖46、圖47及圖48展示適合與圖41至圖45之裝置一起使用的樣品容器之三個不同構造。
圖49展示製備供使用之樣品袋。
圖50、圖51a、圖51b及圖51c展示密封樣品袋之替代性方式。
圖52、圖53及圖54展示用於製備供使用之袋的設備及技術。
圖55展示樣品袋或容器裝載至踏綜裝置中。
圖56、圖57及圖58展示用於劃分解聚樣品之設備。
圖59、圖60及圖61展示用於控制樣品或經劃分樣品之溫度的設備。
圖62至圖64展示踏綜裝置之另一實施例。
圖65為用於收集、處理及冷凍保存腫瘤組織之例示性流程圖。
圖66為由經處理及冷凍保存之腫瘤組織製造TIL的例示性流程圖。
圖67比較冷凍保存及新鮮解聚細胞懸浮液之產量(圖67A)、存活百分比(圖67B)及CD3+ T細胞百分比(圖67C)。
圖68A及圖68B比較經市售冷凍保存劑冷凍保存之PBMC的存活率。
圖69比較經消化，隨後遵循將材料維持在4℃下10分鐘，隨後以-1℃/min之速率降低溫度或直接以-2℃/min之速率自35℃降低至-80℃之方案冷凍保存的PBMC之存活率。
圖70比較按照將材料在4℃下保持10分鐘，然後以-1℃/min之速率降低溫度或直接以-2℃/min之速率自35℃降低至-80℃的方案自樣品袋記錄之溫度。
圖71描繪TIL077之解聚及冷凍保存：(A)解聚器速度設定點；(B)解聚器速度紀錄；(C)溫度設定點(解聚)；(D)冷凍盤溫度紀錄(解聚)；(E)溫度設定點(冷凍保存)；(F)溫度紀錄(冷凍保存)；(G)設定點冷卻速率；(H)冷凍盤冷卻速率紀錄。
圖72描繪TIL078之Tiss-U-Stor解聚及冷凍保存(2個袋中之1個)：(A)解聚器速度設定點；(B)解聚器速度紀錄；(C)溫度設定點(解聚)；(D)冷凍盤溫度紀錄(解聚)；(E)溫度設定點(冷凍保存)；(F)溫度紀錄(冷凍保存)；(G)設定點冷卻速率；(H)冷凍盤冷卻速率紀錄。
圖73描繪連續過程中之TIL078之Tiss-U-Stor解聚及冷凍保存：(A)解聚器速度設定點；(B)解聚器速度紀錄；(C)溫度設定點(解聚及冷凍保存)；(D)冷凍盤溫度紀錄(解聚及冷凍保存)；(E)冷卻速率設定點(解聚及(冷凍保存)；(F)冷凍盤冷卻速率紀錄(解聚及(冷凍保存)。
圖74描繪展示最佳總體反應及腫瘤負荷變化百分比之瀑布圖。CR，完全反應；PD，進行性疾病；PR，部分反應；SD，穩定疾病。腫瘤負荷定義為目標病變之直徑總和；腫瘤負荷之變化定義為自基線至基線後最低點之變化。在兩個CR患者中均使用0之最小基線後SLD，該等患者在評估CR的問診時並未報導目標病變量測值(未經由CT/MRI掃描觀測到疾病或轉移)。一名具有PD之最佳總體反應之個體並未報導任何治療後目標病灶量測值(藉由觀測新病灶測定之進展)且因此未在圖中呈現。
圖75描繪總存活時間。(A)所有21名經治療之患者的中值總存活(OS)時間為21.3個月。(B)具有定量反應資料之15名患者之中值OS時間為16個月。(C)無反應者(N=7)之中值OS時間為6.5個月。未達成反應者(僅根據定量反應，N=8)之中值OS時間。
圖76描繪所製造TIL之特徵。(A)在全規模ITIL-168 GMP運行之TIL突起生長(outgrowth)階段(階段1)期間的細胞計數。(B)在全規模ITIL-168 GMP運行之TIL REP階段(階段2)期間的細胞計數。(C)在全規模ITIL-168 GMP運行期間的存活百分比(活CD3+細胞%)。
圖77描繪用本發明之TIL治療之個體的臨床反應。在突起生長及擴增之前，用(左)或不用(右)冷凍保存所解聚腫瘤製備TIL。亦在快速擴增之後冷凍保存包括解聚腫瘤之冷凍保存的某些製劑(藍點)。CR：完全反應；PR：部分反應；SD：穩定疾病；PD：進展性疾病。
圖78描繪藉由表現CD3配位體之K562細胞活化TIL。關於TIL065及Biopartners 9251之製劑，展示基線活性(TIL)、未經轉染之K562細胞(K562-NT)的活化及藉由表現CD3配位體OKT3之經轉染之K562細胞的活化。
圖79描繪TIL065 (79A)及Biopartners 9251 (79B)之TIL子集。CD45-CD62+：初始細胞；CD45-CD62-：效應(EFF)；CD45+CD62+：中央記憶(CM)；CD45+CD62+：效應記憶(EM)。圖79C描繪CD4-CD8-、CD4+、CD8+及CD4+CD8+亞群且展示大部分TIL為單一陽性CD4+或CD8+細胞。
圖80描繪自非冷凍保存(新鮮加入)或冷凍保存(冷凍加入)腫瘤消化物擴增之TIL製劑中CD4或CD8細胞之比例。
圖81在各圖區中自上而下描繪非冷凍保存(新鮮加入)及冷凍保存(冷凍加入) TIL製劑中之效應(EFF；CD62L-、CD45RO-)、效應記憶(EM；CD62L-、CD45RO+)、中央記憶(CM；CD62L+、CD45RO+)及幹細胞記憶(SCM；CD62L+、CD45RO-)子集。全TIL (78A)，CD4+ TIL (78B)，CD8+ TIL (78C)。
圖82描繪例示性細胞內流式細胞量測術概述。第1天：將TIL藥物產物解凍且在具有10% FBS之RPMI中恢復；第2天：將TIL藥物產物與經工程改造以表現OKT3scFv之K562細胞以及布雷非德菌素(Brefeldin) A、孟寧素(Monesin)及CD107a抗體共同培養5小時，接著用活/死(live/dead，L/D)可固定染色劑處理20分鐘，且用Cytofix處理15分鐘。第3天：在Cytoperm緩衝液中洗滌TIL且藉由流式細胞量測術測定CD137、CD107a、TNFα及IFN-γ TIL效能標記物的表面染色。
圖83描繪TIL藥物產物之規格。藉由CD107a+IFNγ+ TIL之恆定比例說明TIL製造之穩固性。來自所測試批次子集之資料展示最終產物之效能%在17至79範圍內。
圖84A及圖84B描繪自體效能分析：將自體腫瘤細胞與最終藥物產物(DP)一起培育且尋找CD107a及IFNγ之上調。
圖85描繪引起效應細胞表現之T細胞活化。
圖86描繪樣品盤圖。
圖87描繪樣品補償對照盤圖。
圖88A至圖88G描繪實例20中之圈選策略的概述。
圖89A、圖89C-圖89F為描繪如實例20中所述之圈選策略的圖。
圖90為2個可見細胞群體，亦即TIL (FSC-H為大約0.2至3；SSC-H為大約0至0.4)及K562細胞(SSC-H≥0.3)的密度圖。
圖91為如實例20中所描述之等高線圖。
圖92係密度圖，其中圈選閘門分別設定在CD2+細胞及K562細胞周圍。
圖93為密度圖，其中2至3個細胞群體可見。
圖94為展示來自圖區4之活CD2+細胞的等高線圖。
圖95描繪對CD107a及IFN-γ之圈選。
圖96描繪本文中所描述之實施例之方法設計。
圖97描繪使用V3小組之ITIL306效能之流式細胞量測術讀數。
圖98係在各種共同培養培育時間之後的ITIL306效能
圖99描繪E:T比率效能讀數
圖100. 測試是否需要洗滌步驟來移除用於阻斷之小鼠血清之實驗計劃。方案1及2兩者中rFOLR1-Fc之最終濃度恆定。
圖101. 針對CoStAR偵測，測試在存在及不存在洗滌步驟下小鼠血清阻斷之後rhFOLR1-Fc之添加。
圖102. 對APC及PE之CoStAR及IFNg偵測中之ITIL306效能讀數，分別(V3.1)或反過來(V3.2)。
圖103係ITIL306效能方法中之CoStar隱匿的圖形表示
圖104描繪表現GFP-FOLR1 (3E3、3F11及3G4)及GFP-OKT3-FOLR1 (1E4及1G5)之K562目標之各種純系的FOLR1表現量。
圖105係測試FOLR1自表現FOLR1之目標細胞轉移至TIL之不同方案的示意性表示。NBC308係經CoStar轉導之健康供體PBMC。
圖106為描繪在共同培養下FOLR1自目標轉移至TIL之圖。
圖107描繪TIL中FOLR1之陽性百分比與K562目標細胞中FOLR1之表現量成正比。
圖108. 圈選策略，圖區1細胞針對總細胞進行圈選。圖區2，細胞針對總細胞中之單峰進行圈選。圖區3，L/D-NIR -ve單一細胞作為活細胞圈選。圖區4，圈選CD2 +ve及FP -ve活細胞。
圖109.  A，ITIL306-21-US19B與表現GFP及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色(集合1)。B，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色(集合2)。
圖110. 方案1細胞外染色。 集合 1 ( 頂部列 ) ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)及GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色。 集合 2 ( 中間列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色。 集合 3 ( 底部列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞用抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE染色。
圖111. 方案 2 ， 全染色。 集合 1 ( 頂部列 ) ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)及GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-PE針對CoStAR染色。 集合 2 ( 中間列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞抗FOLR1-PE染色。 集合 3 ( 底部列 ) ，實驗設置類似於A，除了其中細胞用抗人類-IgG-Fc-PE及抗FOLR1-PE染色。
圖112. 方案 3 ， EC-全染色。 集合 1 ，ITIL306-21-US19B單獨塗鋪(左圖區)，與表現GFP (中間圖區)或GFP-OKT3-FOLR1 (右圖區)之K562目標細胞共同培養，隨後用抗FOLR1-PE染色(細胞外染色)，接著用抗人類-IgG-Fc-PE進行全染色。 方案 3 ： 細胞外 FOLR1 染色 ， 隨後細胞內 CoStAR 染色 ：如圖16中所示，當比較與K562-GFP及K562-OKT3-FOLR1共同培養之TIL時，細胞外FOLR1染色繼而細胞內CoStAR染色亦偵測到類似百分比之CoStAR +ve細胞(第3圖區相對於第1圖區)。
圖113. 細胞內染色。 A ，ITIL306-21-US19B經塗鋪且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗人類-IgG-Fc-APC (頂部列)、抗FOLR1-PE (中間列)或抗人類-IgG-Fc-APC + 抗FOLR1-PE之組合(底部列)針對CoStAR染色。
圖114. 細胞內染色。 A ，ITIL306-21-US19B經塗鋪且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著使用抗His-APC (頂部列)、抗FOLR1-PE (中間列)及抗His-APC + 抗FOLR1-PE之組合(底部列)針對CoStAR染色。
圖115. 細胞內染色。塗鋪ITIL306-21-US19B且與表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞(第1列)或其各別上清液(S/N)共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。第2、第3及第4列對應於分別來自2E6、4E6及8E6之所指示目標細胞的上清液。
圖116. 細胞內染色。塗鋪ITIL168-21-US24A細胞且與表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞(頂部圖區)或其各別上清液(底部圖區)共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。
圖117. 細胞內染色。塗鋪PBMC且與來自表現GFP、GFP-OKT3、GFP-FOLR1及GFP-OKT3- (S/N)之K562目標細胞的上清液共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。展示CD2陰性群體(頂部圖區)及CD2陽性群體(底部圖區)中之FOLR1陽性。
圖118. 細胞內染色。塗鋪PBMC且與表現GFP、GFP-OKT3及GFP-OKT3-FOLR1之K562目標細胞共同培養，接著抗FOLR1-PE染色。展示CD2陰性群體(頂部圖區)及CD2陽性群體(底部圖區)中之FOLR1陽性。
圖119. 比較CD2相對於CD3作為T細胞標記物。ITIL306 DP及K562目標共同培養五個小時作為標準(normal)。隨後將細胞用CD2 PE-Cy7或CD3 PE-Cy7染色且比較其間的絕對T細胞計數。
圖120. 存活性染料濃度滴定。活/死-NIR染料以指定濃度稀釋且培育10分鐘，接著在Novocyte流式細胞儀上獲取。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖121. 存活性染料培育時程。將活/死-NIR染料培育指定時間，隨後在Novocyte流式細胞儀中獲取。在10分鐘相對於20及30分鐘之間進行統計比較。NS-非顯著；* p≤0.05。在K562-GFP-OKT3-FOLR1共同培養中，可見10與30分鐘NIR染料培育之間的統計學上顯著之差異。然而，陽性百分比已下降，表明NIR染料10分鐘培育將為最佳的。
圖122描繪rFOLR1-Fc濃度滴定。展示使用指示濃度之rFOLR1-Fc來量測的ITIL306產物之CoStar陽性。
圖123. 抗人類-IFNγ APC抗體滴定。針對IFNγ染色呈陽性之ITIL306細胞之百分比展示於金色框中。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖124. 染色指數相對於抗人類-IFNγ APC之抗體濃度。
圖125. 各種濃度之抗人類-IFNγ APC之IFNγ陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖126. 抗人類-CD107a BV421濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-CD107a-BV421來量測的ITIL306產物之CD107a-BV421陽性。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖127. 抗人類-CD107a BV421滴定之染色索引值。
圖128. 各種濃度之抗人類-CD107a BV421之CD107a陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖129. 抗人類-IgG-Fc PE濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-IgG-Fc PE來量測的ITIL306產物之CoStAR陽性。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖130. 各種濃度之抗人類-IgG-Fc PE的CoStAR陽性百分比值。紅框指示選擇用於進一步研究之濃度。
圖131. 抗人類-CD3 PE-Cy7濃度滴定。展示使用指示濃度之抗人類-CD3 PE-Cy7來量測的ITIL306產物之CD3染色。
圖132描繪對隔夜或同一天恢復之TIL的ITIL306效能分析。
圖133. 隔夜恢復或同一天設置之ITIL306-21-US23A的效能百分比。
圖134描繪如實例22中所描述之ITIL306效能分析之線性度。
圖135.  rhFOLR1培育時間之穩固性。 A.與rhFOLR1-Fc一起培育指定時間之ITIL306產物的效能。 B.ITIL306產物之CoStAR陽性百分比(資料係自與A中相同的實驗導出)。
圖136. 抗體混合液培育時間之穩固性。 A.與抗體混合液一起培育指定時間之ITIL306產物的效能百分比。 B.ITIL306產物之CoStAR陽性百分比(資料係自與A中相同的實驗導出)。
1a:容器
1b:末端
1c:孔
1d:位置
1e:邊緣
1f:導管
1g:導管
1h:導管
2a:過濾器
2b:過濾器
3a:培養基
3b:酶/培養基
4a:過濾器單元
4b:過濾器
5a:夾具
5b:夾具
5c:夾具

Claims (99)

  1. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之效能百分比。
  2. 如請求項1之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術。
  3. 如請求項2之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL，以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
  4. 如請求項2或3之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由設定圈選閘門來測定，其中小於15%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
  5. 如請求項2至4中任一項之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用針對1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門(fluorescence minus one gate)及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
  6. 如請求項1之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  7. 如請求項6之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之活化染色群體添加固定劑，且培育。
  8. 如請求項4之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  9. 如請求項8之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
  10. 如請求項4之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  11. 如請求項8之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
  12. 如請求項6、8及10中任一項之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
  13. 如請求項12之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
  14. 如請求項7、9及11中任一項之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
  15. 如請求項14之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
  17. 如請求項16之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
  18. 如請求項1之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
  19. 如請求項1之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
  20. 如請求項1或19之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
  21. 如請求項20之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
  22. 如請求項1、4或5之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
  23. 如請求項1之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
  24. 如請求項1或23之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如請求項1之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如請求項23之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  25. 如請求項1之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之該經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之該經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  26. 如請求項1、4或5之方法，其中該添加係按任何次序。
  27. 如請求項26之方法，其中該添加為依序的。
  28. 如請求項26之方法，其中該添加為同時的。
  29. 如請求項1之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
  30. 如請求項1之方法，其中該等癌細胞為惡性。
  31. 如請求項1之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌及黑素瘤。
  32. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a)     獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b)     在經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段存在下將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體，其中該共同培養在約34至約40℃之溫度下持續約4至約6小時； b-a)  向該TIL活化群體添加存活性染料，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘； b-b)  向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘 c)     向TIL之該活化染色群體添加經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d)     偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e)     測定該TIL活化群體之該效能百分比； 其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
  33. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a) 獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b) 將該等TIL之該群體與該等癌細胞之樣品共同培養以製備TIL活化群體； c) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段或其任何組合； d) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
  34. 如請求項33之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術。
  35. 如請求項34之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
  36. 如請求項34或35之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在該樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由設定圈選閘門來測定，其中小於15%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
  38. 如請求項33之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  39. 如請求項38之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
  40. 如請求項36之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  41. 如請求項40之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
  42. 如請求項36之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  43. 如請求項40之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且培育。
  44. 如請求項38、40及42中任一項之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
  45. 如請求項44之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
  46. 如請求項39、41及43中任一項之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
  47. 如請求項36之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
  48. 如請求項33至47中任一項之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
  49. 如請求項48之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
  50. 如請求項33之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
  51. 如請求項33之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
  52. 如請求項33或51之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
  53. 如請求項52之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
  54. 如請求項33、36或37之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
  55. 如請求項33之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
  56. 如請求項33或55之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如請求項33之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如請求項55之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  57. 如請求項33之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之該經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之該經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  58. 如請求項33、36或37之方法，其中該添加係按任何次序。
  59. 如請求項58之方法，其中該添加為依序的。
  60. 如請求項58之方法，其中該添加為同時的。
  61. 如請求項33之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
  62. 如請求項33之方法，其中該等癌細胞為惡性的。
  63. 如請求項33之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌及黑素瘤。
  64. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a)     獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體； b)     在經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段存在下，將該等TIL之該群體與該等癌細胞之樣品共同培養以製備TIL活化群體，其中該共同培養在約34至約40℃之溫度下持續約4至約6小時； b-a)  向該TIL活化群體添加存活性染料，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘； b-b)  向該等TIL之該活化染色群體添加固定劑，且在約2至約8℃之溫度下培育約10至約30分鐘 c)     向TIL之該活化染色群體添加經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d)     偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e)     測定該TIL活化群體之該效能百分比； 其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之該群體經歷流式細胞量測術，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
  65. 一種用於評估腫瘤浸潤淋巴球(TIL)對抗癌細胞之效能的方法，其包含： a)     獲得該等TIL之經分離且離體擴增之群體，其包含表現抗FOLR1 scFv之TIL亞群； b)     將該等TIL之該群體與表現FOLR1且經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； b-i)   在rhFOLR1或連接至標籤之rhFOLR1存在下培育該TIL活化群體； c)     向步驟b-i)之該TIL活化群體添加經螢光標記之抗標籤抗體或其抗原結合片段及/或經螢光標記之抗FOLR1抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD3或抗CD2抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； d)     偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD3+或CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， e)     測定該TIL活化群體之該效能百分比。
  66. 如請求項65之方法，其中該連接至標籤之rhFOLR1係rhFOLR1-Fc。
  67. 如請求項65之方法，其中該經螢光標記之抗標籤抗體為經螢光標記之抗人類IgG Fc抗體或其抗原結合片段。
  68. 如請求項65之方法，其中該偵測包含使步驟c)之該等TIL之群體經歷流式細胞量測術。
  69. 如請求項68之方法，其中圈選該群體之活CD2+ TIL以量測IFN-γ及CD107a中之一或兩者的表現頻率。
  70. 如請求項68或69之方法，其進一步包含： (b-a) 藉由以下製備該等TIL之非活化群體： 不在活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體；或， 在非活化細胞存在下共同培養該等TIL之該群體； (c-a) 向該等TIL之該非活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-a) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，CD107a在該樣品TIL群體中之表現或不表現係藉由設定圈選閘門來測定，其中小於15%之TIL之該非活化群體為CD107a表現陽性。
  71. 如請求項68至70中任一項之方法，其進一步包含： (b-b) 藉由以下製備該等TIL活化群體： 將該等TIL之該群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； (c-b) 向該等TIL之該活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段，但不添加經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； 及， (d-b) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 其中，IFN-γ在該樣品TIL群體中之表現或不表現係使用1%之IFN-γ螢光減一圈選閘門及針對該等目標細胞之圈選閘門來測定。
  72. 如請求項65之方法，其進一步包含在步驟b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  73. 如請求項72之方法，其進一步包含在步驟b)中向該等TIL之活化染色群體添加固定劑，且培育。
  74. 如請求項70之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  75. 如請求項74之方法，其進一步包含在步驟b-a)中向該等TIL之活化染色群體添加固定劑，且培育。
  76. 如請求項70之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該TIL活化群體添加存活性染料，且培育。
  77. 如請求項74之方法，其進一步包含在步驟b-b)中向該等TIL之活化染色群體添加固定劑，且培育。
  78. 如請求項72、74及76中任一項之方法，其中該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約10分鐘至約30分鐘之時段。
  79. 如請求項78之方法，其中該培育在約8℃之溫度下持續約20分鐘之時段。
  80. 如請求項73、75及77中任一項之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約0℃至約15℃之溫度下持續約5分鐘至約30分鐘之時段。
  81. 如請求項80之方法，其中在固定劑存在下之該培育在約8℃之溫度下持續約15分鐘之時段。
  82. 如請求項65至81中任一項之方法，其中該共同培養在約30℃至約40℃之溫度下持續約3小時至約24小時之時段。
  83. 如請求項82之方法，其中該共同培養在約37℃之溫度下持續約5小時之時段。
  84. 如請求項65之方法，其中該測定之計算法為：100減去雙陰性IFN-γ及CD107a細胞的%。
  85. 如請求項65之方法，其中該等經工程改造之目標細胞經標記。
  86. 如請求項65或85之方法，其中該等經工程改造之目標細胞表現來自OKT3之ScFv。
  87. 如請求項86之方法，其中該等經工程改造之目標細胞係K562細胞。
  88. 如請求項65、70或71之方法，其中該添加進一步包含添加經螢光標記之抗CD137抗體或其抗原結合片段及經螢光標記之抗TNF-α抗體或其抗原結合片段中之一或多者。
  89. 如請求項65之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，冷凍保存該等TIL之該經分離且離體擴增之群體。
  90. 如請求項65或89之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，製備包含如請求項65之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物，或製備包含如請求項89之TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  91. 如請求項65之方法，其進一步包含在測定該效能百分比之後，向個體投與該等TIL之經分離且離體擴增之群體，或向個體投與包含該等TIL之經分離且離體擴增之群體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。
  92. 如請求項65、70或71之方法，其中該添加係按任何次序。
  93. 如請求項92之方法，其中該添加為依序的。
  94. 如請求項92之方法，其中該添加為同時的。
  95. 如請求項65之方法，其中該等癌細胞為上皮實體腫瘤細胞。
  96. 如請求項65之方法，其中該等癌細胞為惡性的。
  97. 如請求項65之方法，其中該等癌細胞係來自鱗狀細胞癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌及黑素瘤。
  98. 一種用於製備腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： a) 將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此製備解聚腫瘤產物，其中該解聚包含在高達6 N/cm 2下在培養基酶溶液存在下施加120至360次/分鐘之重複物理壓力，其中該腫瘤充分解聚為細胞懸浮液，使得可冷凍保存該解聚腫瘤產物； b) 在製備該解聚腫瘤產物之24小時內，將該解聚腫瘤產物冷卻至適合的冷凍保存溫度以製備冷凍保存之解聚腫瘤產物； c) 將該冷凍保存之解聚腫瘤產物儲存在冷凍狀態下； d) 解凍該冷凍保存之解聚腫瘤產物； e) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該冷凍保存之解聚腫瘤產物來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； f) 由該TIL之第一群體在細胞培養基中與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 g) 冷凍保存該TIL之第二群體以製備TIL之冷凍保存治療群體； 其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)在封閉系統中進行； h) 獲得步驟f)之該TIL之第二群體之樣品或步驟g)之TIL之該冷凍保存治療群體之樣品； i) 將來自步驟h)之該等TIL之群體與經由CD3活化T細胞之經工程改造之目標細胞一起共同培養以製備TIL活化群體； j) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； k) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， l) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
  99. 一種用於製備腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之治療群體的方法，其包含： a) 將自個體切除之腫瘤無菌解聚，由此製備解聚腫瘤產物，其中該解聚包含在高達6 N/cm 2下在培養基酶溶液存在下施加120至360次/分鐘之重複物理壓力，其中該腫瘤充分解聚為細胞懸浮液，使得可冷凍保存該解聚腫瘤產物； b) 在製備該解聚腫瘤產物之24小時內，將該解聚腫瘤產物冷卻至適合的冷凍保存溫度以製備冷凍保存之解聚腫瘤產物； c) 將該冷凍保存之解聚腫瘤產物儲存在冷凍狀態下； d) 解凍該冷凍保存之解聚腫瘤產物； e) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該冷凍保存之解聚腫瘤產物來進行第一次擴增，以產生TIL之第一群體； f) 由該TIL之第一群體在細胞培養基中與額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)一起培養來進行第二次擴增，以產生TIL之第二群體；及 g) 冷凍保存該TIL之第二群體以製備TIL之冷凍保存治療群體； 其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)在封閉系統中進行； h) 獲得步驟f)之該TIL之第二群體之樣品或步驟g)之TIL之該冷凍保存治療群體之樣品； i) 將來自步驟h)之該等TIL之該群體與來自該腫瘤之細胞共同培養以製備TIL活化群體； j) 向該TIL活化群體添加經螢光標記之抗CD107a抗體或其抗原結合片段、經螢光標記之抗CD2抗體或其抗原結合片段、及經螢光標記之抗IFN-γ抗體或其抗原結合片段； k) 偵測存在或不存在表現以下中之一或兩者之活CD2+ T細胞： a. IFN-γ，及 b. CD107a； 及， l) 測定該TIL活化群體之該效能百分比。
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