MXPA02008144A

MXPA02008144A - Agentes de enlace selectivos antagonistas de la proteina de enlace de osteoprotegerina.

Info

Publication number: MXPA02008144A
Application number: MXPA02008144A
Authority: MX
Inventors: William J Boyle
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2002-11-29
Also published as: EP1257648A1; DK2105449T3; EP1257648B1; SI1257648T2; JP2003523772A; EP1257648B2; AU3868001A; WO2001062932A1; JP4401613B2; CA2400929C; DE60134459D1; CA2400929A1

Abstract

Se proporcionan por la invencion, agentes de enlace selectivos de la proteina de enlace de la osteoprotegerina (OPGbp). Mas particularmente, la invencion proporciona anticuerpos y dominios de enlace de antigenos que se enlazan selectivamente a una OPGbp, y se pueden usar para prevenir o tratar condiciones relacionadas con la perdida de masa osea. Se proporcionan tambien las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos y los dominios de enlace de antigenos, y los vectores de expresion y las celulas huesped para la produccion de los mismos.

Description

AGENTES DE ENLACE SELECTIVOS ANTAGONISTAS DE LA PROTEINA DE ENLACE DE OSTEOPROTEGERINA Campo de la Invención La invención se refiere a agentes de enlace selectivo para la proteína de enlace de la osteoprotegerina (OPGbp) . Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos y a dominios de enlace de antígenos que se enlazan selectivamente a OPGbp y se pueden usar para evitar o tratar condiciones relacionadas con la pérdida de masa ósea. También se suministran moléculas de ácido nucleico, vectores y células huésped para la producción de agentes de enlace selectivo de la invención. Antecedentes de la Invención El tejido vivo del hueso muestra un equilibrio dinámico entre la deposición y la resorción del hueso. Estos procesos están mediados principalmente por dos tipos de células: osteoblastos, que secretan moléculas que comprenden la matriz orgánica del hueso y osteoclastos, que promueven la disolución de la matriz del hueso y la solubilización de sales del hueso. En individuos jóvenes con huesos en crecimiento, la tasa de deposición del hueso excede la tasa de resorción de hueso, mientras que en el individuo más viejo la tasa de resorción puede superar la deposición. En la última situación, el rompimiento Ref: 141338 creciente de hueso conduce a una masa ósea reducida y resistencia, riesgo creciente de fractura y una reparación lenta o incompleta de huesos rotos. Los osteoclastos son células multinucleadas fagocíticas grandes que se forman de células precursoras hematopoyéticas en la médula ósea. Aunque el crecimiento y formación de osteoclastos funcionales maduros no está bien entendido, se piensa que los osteoclastos maduran junto con el linaje de células de monocitos/macrófagos en respuesta a la exposición a diversos factores promotores de crecimiento. El desarrollo temprano de células precursoras de médula ósea a los preosteoclastos, se cree que es mediado por factores solubles tales como el factor-ce de necrosis de tumor (TNF-a) , factor-ß de necrosis de tumor (TNF-ß) , interleucin-1 (IL-1) , interleucin-4 (IL-4) , interleucin-6 (IL-6) , y factor inhibidor de leucemia (LIF) . En cultivo, se forman los preosteoclastos en presencia de un factor estimulante de la colonia de macrófagos agregados (M-CSF) . Estos factores actúan principalmente en las etapas tempranas del desarrollo de osteoclastos . Se ha descrito un factor de polipéptidos, la proteína de enlace de la osteoprotegerina (OPGbp) , que estimula la formación de osteoclastos y la resorción del hueso, y parece actuar en una etapa final de desarrollo. Ver PCT WO » -, **..X .-,.:..j-.-->.»-HF£rárir.nt---?.c 98/46751. La OPGbp, estimula la formación de osteclastos de las células precursoras de médula ósea sin el requerimiento de un cocuitivo en presencia de una línea celular estromal . La estimulación de la resorción del hueso por OPGbp requiere la interacción con su receptor similar, el receptor de activación y diferenciación de la osteoprotegerina (ODAR) y la inhibición de la interacción de ODAR/OPGbp por la osteoprotegerina (OPG) también inhibe la resorción del hueso. Consecuentemente, la regulación del enlace OPGbp al ODAR afecta la formación de osteoclastos y la pérdida de hueso. Es un objeto de la invención, identificar agentes de enlace selectivos que regulen la interacción de OPGbp y ODAR, especialmente aquellos agentes que bloquean la interacción de OPGbp y ODAR y/o inhiben al menos una actividad de OPGbp, tal como la resorción de hueso. Es un objeto adicional de la invención, identificar aquellos agentes de enlace selectivo que se puedan usar para prevenir y tratar la pérdida de masa ósea. Es un objeto adicional de la invención, identificar un anticuerpo o un dominio de enlace de antígeno o un fragmento o variante del mismo, que regule la interacción de OPGbp y ODAR y neutralice al menos una actividad de OPGbp. Los anticuerpos se pueden usar para evitar y tratar la pérdida de masa ósea . ; - - i i Breve Descripción de la Invención La invención proporciona un agente de enlace selectivo de la proteína de enlace de la osteoprotegerina (OPGbp) . En una modalidad, el agente de enlace selectivo de la invención, inhibe parcial o completamente al menos una actividad de OPGbp; esto es, el agente de enlace selectivo es un antagonista de OPGbp. En otra modalidad, el agente de enlace selectivo se enlaza a OPBbp en una forma que inhibe parcial o completamente la interacción de OPGbp con su receptor similar, diferenciación de osteoclastos y receptor de la activación u ODAR, con lo cual se inhibe parcial o completamente la actividad de OPGbp. Los agentes de enlace selectivo de la invención, pueden ser proteínas en su naturaleza y se refieren en la presente como agentes de enlace selectivo proteináceos. La invención también proporciona un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno del mismo, o un fragmento, variante o derivado del mismo, que se enlaza a un epítope en OPGbp e inhibe parcial o completamente al menos una actividad de OPGbp. Esto es, el anticuerpo es un anticuerpo antagonista. Preferiblemente, OPGbp es un OPGbp mamífero. Más preferiblemente, OPGbp es un OPGbp humano que puede estar soluble o en formas asociadas a la superficie de la célula, o fragmentos derivados y variantes del mismo.

Cuando el agente de enlace selectivo es un anticuerpo, tal anticuerpo se puede preparar al inmunizar un animal con OPGbp tal como murina u OPGbp humano, preferiblemente OPGbp humano, o con un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. Además, se puede inmunizar un animal con células transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica OPGbp tal que el OPGbp se expresa y asocia con la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, los agentes de enlace selectivos que son anticuerpos, se pueden obtener por la separación por exclusión de una colección que comprende secuencias de dominio de enlace de antígenos o anticuerpos para enlazarse a OPGbp. Tal colección se prepara convenientemente en bacteriófagos como fusiones de proteína o de péptido, a una proteína de recubrimiento de bacteriófagos que se expresa en la superficie de partículas de fagos ensambladas, y la codificación de secuencias de ADN contenidas dentro de las partículas de fago (denominadas "colección de despliegue de fagos"). En un ejemplo, una colección de despliegue de fagos contiene secuencias de ADN que codifican anticuerpos humanos tales como cadenas variables ligera y pesada. Los agentes de enlace selectivo que son anticuerpos o dominios de enlace de antígenos pueden ser glicoproteínas tetraméricas similares a los anticuerpos naturales, o pueden ser anticuerpos de cadena simple; fragmentos Fv, Fab, Fab', o F(ab)', anticuerpos biespecíficos, heteroanticuerpos, u otros fragmentos, variantes o derivados de los mismos, que pueden enlazar a OPGbp y neutralizar parcial o completamente la actividad de OPGbp. Los anticuerpos o dominios de enlace de antígeno se pueden producir en líneas de células de hibridoma (células que producen anticuerpos tales como células de bazo fusionadas, células de mieloma de ratón, por ejemplo,) o se pueden producir en líneas celulares heterólogas transfectadas con moléculas de ácido nucleico que codifican al dominio de enlace del anticuerpo o del antígeno. Un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno de la invención comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada Fab como se muestra en la figura 9 (SEQ ID NO: 51) o figura 10 (SEQ ID NO: 53) ; (b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos de la secuencia en (a) ; (c) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos alrededor de 80% idéntica con la secuencia en (a) o (d) un fragmento o derivado de (a) , (b) o (c) ; en donde el dominio de enlace de anticuerpo o de antígeno se enlaza selectivamente a OPGbp. En otra modalidad, un dominio de enlace de anticuerpo o antígeno de la invención, reconoce un epítope de OPGbp humano reconocido por un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno que comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada Fab como se muestra en la figura 9 (SEQ ID NO: 51) o figura 10 (SEQ ID NO: 53) y una secuencia de aminoácido ligera Fab como se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO: 43) o figura 6 (SEQ ID NO: 45) . También se suministra un anticuerpo OPGbp o un dominio de enlace de antígeno que reconoce a un epítope DE sobre OPGbp. En otra modalidad, un dominio de enlace de anticuerpo o de antígeno de la invención comprende una cadena Vi y Vh: En donde cada cadena Vi comprende secuencias de aminoácidos CDR designadas CDR1 (Vi) , CDR2 (Vi) y CDR3 (V separadas por secuencias de aminoácidos de estructura CDR1 (Vi) que se seleccionan del grupo que consiste de: RASQSISRYLN (SEQ ID NO: 01) ; RASQSVGSYLA (SEQ ID NO: 02); RASQSVSSSSLA (SEQ ID NO: 03); Y SGDALPKGY (SEQ ID NO: 04); El CDR2 (Vi) se selecciona del grupo que consiste de: GASSLQS (SEQ ID NO: 05) ; .- - DATNRAT (SEQ ID NO: 06); GASSRAT (SEQ ID NO: 07); y EDSERPS (SEQ ID NO: 08) ; y el CDR3 (Vi) se selecciona del grupo que consiste de: QHTRA (SEQ ID NO: 09) ; QHRRT (SEQ ID NO: 10); QQYGA (SEQ ID NO: 11); y QSTDSSGTYW (SEQ ID NO: 12); en donde CDRl (Vx) , CDR2 (Vi) y CDR3 (Vx) se selecciona independientemente uno del otro; y en donde cada cadena Vh comprende secuencias de aminoácidos CDR designadas CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) y CDR3 (Vh) separadas por secuencias de aminoácidos de estructura CDRl (Vh) que se seleccionan del grupo que consiste de: NYAIH (SEQ ID NO: 13); NYPMH (SEQ ID NO: 14); y DYAMH (SEQ ID NO: 15) CDR2 (Vh) se selecciona del grupo que consiste de: WINAGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16) ; VISYDGNNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 17) ; y GISWNSGRIGYADSVKG (SEQ ID NO: 18) CDR3 (Vh) se selecciona del grupo que consiste de: DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19) ; GGGGFDY (SEQ ID NO: 20); y GGSTSARYSSGWYY (SEQ ID NO: 21) en donde CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) y CDR3 (Vh) se seleccionan independientemente uno del otro. En otra modalidad, un dominio de enlace de anticuerpo o antígeno de la invención comprende una cadena de Vi y una de Vh en donde : la cadena Vx comprende CDRl que tiene la secuencia RASQSISRYLN (SEQ ID NO: 01), CDR2 que tiene la secuencia GASSLQS (SEQ ID NO: 05) , y CDR3 que tiene la secuencia QHTRA (SEQ ID NO: 09); y la cadena Vh comprende la CDRl qe tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID NO: 13) , CDR2 que tiene la secuencia WINAGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y CDR3 que tiene la secuencias DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de estructura. Los anticuerpos y los dominios de enlace de antígenos de la invención, se derivan de las secuencias de ácido nucleicos de línea germinal presentes en el ADN genómico, que codifican secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada. Los anticuerpos se codifican por secuencias de ácido nucleico que son los productos de la distribución de secuencias de líneas germinales y de mutación somática. En una modalidad, un anticuerpo o un dominio de enlace de la invención comprende una cadena i y una Vh en donde la cadena Vx comprende de variante somática o redistribuida de genes de la línea germinal Vhl tal como en la figura 19 (SEQ ID NO: 66 ) ; y la cadena Vh comprende una variante somática o redistribuida de genes de la línea germinal Vhl tal como en la Figura 16 (SEQ ID NO: 59) ; y el anticuerpo se enlaza selectivamente a un polipéptido OPGb . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante somática o redistribuida de genes de la línea germinal Vk3 tales como Figura 20 (SEQ ID NO: 68) ; y la cadena Vh comprende una variante redistribuida o somática de un gen de línea germinal Vhl tal como en la Figura 16 (SEQ ID NO: 59) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redistribuida o somática de un gen de línea germinal Vk3 tal como en la fórmula 21 (SEQ ID NO: 70) , y la cadena Vh comprende una variante somática redistribuida de un gen de la línea germinal Vh3 tal como en la figura 17 (SEQ ID NO: 62) . En otra modalidad, la cadena Vx comprende una variante somática o redistribuida de un gen de la línea germinal VI3 tal como en la Figura 22 (SEQ ID NO: 72) , y la cadena Vh comprende una variante somática o redistribuida de un gen de línea germinal Vh3 tal como en la figura 18 (SEQ ID NO: 64) .

Los agentes de enlace selectivos de la invención (dominio de enlace de antígenos o de anticuerpos) inhiben parcial o completamente al menos una actividad de OPGbp, tal como el enlace de OPGbp a ODAR, formación o activación de osteoclastos, o resorción de huesos mediada por OPGbp y se usan para evitar y/o tratar enfermedades del hueso. En una modalidad, un antagonista OPGbp tal como un anticuerpo o dominios de enlace de antígeno, se administra a un animal que ha experimentado una pérdida de masa ósea, o está en riesgo de perder masa ósea, con objeto de evitar o tratar la pérdida de masa ósea. Un antagonista OPGbp se pueden usar para evitar y/o tratar la osteoporosis, la pérdida debido a la masa ósea debido a la metástasis de cáncer al hueso; la pérdida de masa ósea debido a la artritis reumatoide, hipercalcemia y osteoporosis inducida por esteroides y malignidades. También se proporcionan composiciones que comprenden los anticuerpos o dominios de enlace de antígeno de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Descripción de las Figuras La figura 1 muestra un ELISA de patrones predominantes Fab para la reactividad del OPGbp (143-317) humano. Las titulaciones se efectuaron usando un máximo de 50 µl de solución de fagos por pozo para dar un rango típico 1Q9- 101X fago/pozo en el ELISA. Las reservas de fagos para ELISA se prepararon como se describen en el ejemplo 1. Los valores fueron determinaciones de punto simple. Los patrones "AB" & "X" se sobrepusieron en la misma línea. La figura 2 muestra la inhibición de el enlace de OPGbp a ODAR por Fab "TA" y "Y" . Los Fab se purificaron como se describen en el ejemplo 4 y se agregaron a concentraciones finales de pozo como se muestran en la figura. Los detalles del ensayo de enlace OPGbp/ODAR se establecen en el ejemplo 1. Los valores fueron promedios de determinación por duplicado. La figura 3 muestras ensayos de médula ósea de Fab „AT« «y» y «p.. _ Se muestran los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 EU/ml o menos) para cada uno de los Fab "AT" "Y" y "P" . Se purificaron los Fab como se describe en el ejemplo 4 y se agregaron a diluciones finales de pozo como se muestran en la figura (soluciones de reserva Fab fueron 750 µg/ml hasta 1 mg/ml) . El formato de ensayo incluye una preincubación de 1 hora del anti-hu-OPGbp Fab con 10 ng/ml de concentración final de pozo de células de OPGbp [1443-317] humanos. Los valores son promedio de las determinaciones por triplicado. La figura 4 muestra ensayos de células crudas de "AT" "Y" y "P" . Se muestran los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 Eu/ml o menos) para cada uno de los Fab "AT" , "Y" y "P" . Los Fab se purificaron como se describe en el ejemplo 4. Los Fab se preincubaron con OPGbp [143-317] humano por 1 hora a temperatura ambiente antes de una dilución 1/20 hasta la concentración final de pozo de células mostrada en la gráfica. La concentración final de pozos de células de OPGbp fue 20 ng/ml. La concentración de células fue de 21 x 105 /ml . Los valores fueron determinaciones por triplicado con barras de error que designan dos desviaciones estándar (2 STD) . La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera Fab "AT" . La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera Fab "Y" . La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera Fab "P" . La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera Fab "S" . La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada Fab "AT" . La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada Fab "Y" . La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada Fab "P" .

La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada Fab "S" . La figura 13 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos Fab mostradas en la figura 5-12. Las secuencias predichas de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada Fab "AT" , "Y", y "P" se compararon para identidad y similitud. Las cadenas pesadas "AT" y "Y" difieren solamente en una posición de aminoácidos. Como se diseñan por colección, todos los cuatro Fab tienen regiones idénticas de cadena pesada CH1 que comprenden la mitad carboxi de la cadena pesada que se incluye en los cálculos de identidad y similitud. Las cadenas ligeras "AT" , "Y" y "P" comparten las mismas o similares familias kappa V y por lo tanto difieren solamente en 1 a 2 aminoácidos en la mitad carboxilo de la cadena, incluido en los cálculos. La figura 14 muestra una comparación de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera y pesada predicha (CDR) de los Fab "AT" , "Y", "P" y "S" para las comparaciones de cadena pesada, CRDl incluye residuos de aminoácidos 32-36 inclusive para todos los Fab; CDR2 incluye los residuos de aminoácidos 51-67 inclusive para todo los Fab; y CDR3 incluye los residuos de aminoácidos 100-116 inclusive para los Fab "AT" , y "Y" , 100-106 inclusiva para fab "P" , 100-113 inclusive para Fab "S" .

Para las comparaciones de cadena ligera, CDRl incluye los residuos de aminoácidos 29-39 inclusive para Fab "AT" y "Y", 28-39 inclusive para Fab "P" , y 27-35 inclusive para Fab "S" ; CDR2 incluye los residuos de aminoácidos 55-61 inclusive para Fab "AT" , "Y" y "P" , y 53-59 inclusive para Fab "S" ; y CDR3 incluye los residuos de aminoácidos 94-98 inclusive para Fab "AT" "Y" y "P" y 92-102 inclusive para Fab "S" . La figura 15 muestra una comparación de las clases Fab. La comparación de la clase Fab se obtiene de un análisis de gráfica de ADN de base V. El símbolo (*) indica la región de diversidad de correspondencia más cercana (D) , aunque con relación a las secuencias conocidas de línea germinal no se puede determinar. El símbolo (**) indica que la secuencia de la región variable (V) en la línea germinal de la correspondencia más cercana se ha identificado pero no se ha nombrado formalmente a la fecha, siendo de la familia lambda más rara. La figura 16 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada "AT" y "Y" predichas Fab (residuos 2-127 inclusive en las figuras 9 y 10, respectivamente con una secuencia de línea germinal de la familia Vhl. La secuencia de la línea germinal comprende la secuencia de la región V región de secuencia 1-03, D región de la secuencia 3-10, y secuencia de la región J Jh4 (SEQ ID NO: 44) . FR1, FR2 y FR3 designan las tres regiones de estructura, CDRl, CDR2 y CDR3 designan la estructura de determinantes de la complementariedad y Hl, H2 , y H3 designan la secuencia de unión correspondiente entre la regiones de estructura y los CDR. Las diferencias entre "AT" , "Y" y las secuencias de la línea germinal V, D ó J están en negritas. La numeración de los residuos de aminoácidos de la línea germinal en las figuras 16-22 es como se describe en Kabat et al . Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 4th ed. (1991) . La figura 17 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada Fab "P" predichas (residuos 2-117 inclusive en la figura 11) con una secuencia de línea germinal de la familia VH3. La secuencia comprende la secuencia de la región V 3-30 y la secuencia JH de la región J. La secuencia de la región D es desconocida. La figura 18 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada "S" predicha por Fab (residuos 2-124 inclusive en la figura 12) con una secuencia de línea germinal desde la familia VH3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3-09, secuencia de la región D 6-19 y secuencia de las regiones J JH4.

La figura 19 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera "AT" predicha Fab (residuos 6-108 inclusive en la figura 5) con una secuencia de línea germinal de la famlia Vkappal . La secuencia de la línea germinal comprende la secuencia de la región V 012 y la secuencia de la región J JK1. La figura 20 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera "Y" predichas Fab (residuos 6-108 inclusive en la figura 6) , con una secuencia de línea germinal de la familia Vkappa3. La secuencia de la línea germinal comprende la secuencia de la región V L6 y la secuencia de la región J JK2. La figura 21 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera "P" predicha Fab (residuos 5-108 inclusive en la figura 7) , con una secuencia de línea germinal de la familia Vkappa3. La secuencia de la línea germinal comprende la secuencia de región V A27 y la secuencia de región J JK4. La figura 22 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera "S" predicha Fab (residuos 5-112 inclusive en la figura 8) con una secuencia de línea germinal de la familia VL3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3m y la secuencia de la región J JL2.

La figura 23 muestra ensayos de células RAW de los aislados "AT" 405, "AT" 406 y "AT" 407. El Fab "AT2 que codifica el ADNc se fusiona al ADNc que codifica las regiones CH1, CH2, y CH3 del IgGl humano como se describe en el ejemplo 7. Se usaron diferentes secuencias líder para producir los aislados resultantes designados como "AT" 405, "AT" 406 y "AT" 407. "AT" 405-407 se preincubaron con OPGbp por 1 hora a temperatura ambiente antes de la dilución hasta una concentración final por pozo mostrada en la gráfica. La concentración final por pozo de células de OPGbp fue 40 ng/ml. Los valores fueron de determinación por triplicado con barras de error que designan 2 desviaciones estándar (2 STD) . La figura 24 muestra ensayos de médula ósea de "AT" 405 y "AT" 407. Los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 EU/ml o menos) de "AT" 405 y "AT" 407 se muestran. Se preincubaron muestras con OPGbp (143-317) humano por 1 hora a temperatura ambiente antes de la adición a la célula. La dilución final por pozo de célula para "AT" 405 y "AT" 407 de la reserva de muestras se índica en el eje X. La concentración final por pozo de célula OPGbp fue 20 ng/ml. La figura 25 muestra un ensayo de médula ósea de "AT" 406. Se muestran los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 EU/ml o menos) de "AT" 406. Se preincubaron muestras con OPGbp (143-317) humano por 1 hora a temperatura ambiente antes de la adición a la célula. La concentración final por pozo de célula de la muestra se indica en el eje X. La concentración final por pozo de célula de OPGbp fue 20 ng/ml. La figura 26 muestra un ensayo de médula ósea de "S" 435 y "Y" 429. La construcción de "S" 435 y "Y" 429 es como se describe en el ejemplo 7. Los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 EU/ml o menos) de cada uno de "S" 435 y "Y" 429 se muestran. Las muestras se preincubaron con OPGbp (143-317) humano a temperatura ambiente antes de la adición a la célula. La concentración final de pozo por célula de la muestra se índica en el eje X. La concentración final de pozo de célula de OPGbp fue 20 ng/ml. La figura 27 muestra un ensayo de médula ósea de "Y" 442 y "P" 444. La construcción de "Y" 442 y "P" 444 es como se describe en el ejemplo 7. Los resultados de una preparación libre de endotoxinas (0.5 EU/ml o menos) de cada uno de "Y" 442 y "P" 444 se muestran. Las muestras se preincubaron con OPGbp (143-317) humano por una hora a temperatura ambiente antes de la adición a la célula. La concentración final de pozo por célula de la muestra se índica en el eje X. La concentración final de pozo de célula de OPGbp fue 20 ng/ml.

La figura 28 muestra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácido del FLAG-murino (153-316) OPGbp/ DE. La figura 29 es una alineación de OPGbp (143-317) humano, OPGbp (158-316) murino, y secuencias de aminoácidos OPGbp (158-316) /DE FLAG-murino en la región del circuito DE. Están subrayados los residuos de aminoácidos del OPGbp humano introducido dentro del OPGbp de ratón para generar la molécula OPGbp/DE de FLAG-ratón.

La figura 30 es un inmunoensayo de enzimas que examina el enlace y reactividad del anticuerpo AT a placas recubiertas de OPGbp humano (143-317) , murino OPGbp (158-316), o OPGbp (158-316) /DE FLAG-murino. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona agentes que se enlazan selectivamente a la proteína de enlace OPG (OPGbp) . Preferiblemente, los agentes son antagonistas de la OPGbp o inhibidores que inhiben parcial o completamente al menos una actividad OPGbp, tal como el enlace de OPGbp con su receptor similar, ODAR, formación y/o activación de osteoclastos o resorción de hueso. En una modalidad, el agente de enlace selectivo es un anticuerpo que se enlaza selectivamente a OPGbp tal que bloquea parcial o completamente el enlace de OPGbp con su receptor similar e inhibe parcial o completamente la formación de osteoclastos y/o la resorción de hueso.

El término "agente de enlace selectivo" se refiere a una molécula que se enlaza preferiblemente a OPGbp. El agente de enlace selectivo puede incluir una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, o compuesto de peso molecular pequeño. En una modalidad preferida, un agente de enlace selectivo es un anticuerpo tales como anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) hasta anticuerpos que se pueden etiquetar en una forma soluble o enlazada, así como fragmentos, regiones o derivados de los mismos, proporcionados por técnicas conocidas incluyendo pero no limitadas a desdoblamiento enzimático, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. Los agentes de enlace selectivo anti-OPGbp de la presente invención son capaces de porciones de enlace de OPGbp que inhiben el enlace de OPGbp a los receptores ODAR. Los anticuerpos y dominios de enlace de antígenos de la invención, se enlazan selectivamente a OPGbp, esto es se enlazan preferentemente a OPGbp con una mayor afinidad de enlace que con otros antígenos. Los anticuerpos pueden enlazarse selectivamente a OPGbp humana, pero también se enlazan detectablemente a OPGbp no humanas tal como OPGbp murina. Alternativamente, los anticuerpos se pueden enlazar selectivamente a OPG no humana per también detectablemente a OPG humana. Alternativamente, los anticuerpos se pueden enlazar exclusivamente a OPGbp humana, sin ningún enlace detectable a OPGbp no humana. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, en donde cada anticuerpo monoclonal reconocerá típicamente un epítope simple en el antígeno. El término "monoclonal" no se limita a ningún método particular para hacer el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden hacer por el método del hibridoma como se describe en Kohler et al. Nature 256, 495 (1975) o se pueden aislar de colecciones de fagos usando las técnicas como se describen en la presente, por ejemplo. El término "dominio de enlace de antígenos" o "región de enlace de antígenos" se refiere a aquella porción de un agente de enlace selectivo (tal como una molécula de anticuerpos) que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y le otorgan al agente de enlace su especificidad y afinidad para el antígeno. Preferiblemente, la región de enlace del antígeno será de origen humano. En otras modalidades, la región de enlace del antígeno se puede derivar de otras especies animales, en particular roedores como conejo, rata o hámster.

El término "epítope" se refiere a aquella porción de cualquier molécula capaz de reconocerse por y enlazarse por un agente de enlace selectivo (tal como un anticuerpo) en una o más de las regiones de enlace del antígeno del agente de enlace. Los epítopes consisten usualmente de agrupamientos químicamente activos de superficie de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales específicas tridimensionales, así como características específicas de carga. Por "inhibir y/o neutralizar un epítope" se pretende un epítope que cuando se enlaza por un agente de enlace selectivo, resulta en la pérdida de actividad biológica de la molécula u organismo que contiene el epítope, in vivo, in vitro o in situ más preferiblemente in vivo, incluyendo el enlace de OPGbp a su receptor. El término "cadena ligera" cuando se usa con referencia a un anticuerpo se refiere a dos tipos diferentes, denominados kappa (k) y lambda (?) basado en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. El término "cadena pesada" cuando se usa con referencia a un anticuerpo, se refiere a 5 tipos diferentes denominados alfa, delta, epsilon, gamma y mu, con base en la secuencia de aminoácido del dominio constante de cadena pesada. Estos tipos diferentes de cadenas pesadas dan lugar a 5 tipos de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, respectivamente, incluyendo 4 subclases de IgG, nominalmente IgGi, IgG2, IgG3 y IgG . El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y pesada, típicamente a alrededor de la terminal amino 120 a 130 de aminoácidos en la cadena pesada y alrededor de 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno en particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones de estructura (FR) . Los CDR de las cadenas ligera y pesada son responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. El término "región constante" o "dominio constante" se refiere a una porción terminal carboxi de la cadena ligera y pesada que no se involucra directamente en el enlace del anticuerpo al antígeno, pero que muestra diversas funciones de efector tal como la interacción con el receptor Fc . El término "OPGbp" o "polipéptido OPGbp" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido como se muestra en la figura 4 de la publicación PCT WO/46757, la descripción de la cual se incorpora como referencia y polipéptidos relacionados. Los polipéptidos incluyen variantes alélicas variantes de empalme, fragmentos derivados, variantes de sustitución, eliminación e inserción, polipéptidos de fusión y homólogos entre especies. También se abarcan las formas solubles de OPGbp tales como los residuos 69-317 inclusive del OPGbp humano (como se numera en WO 98/46757) , o un subconjunto de los mismos que es suficiente para generar una respuesta inmunológica. En una modalidad, la OPGbp humana soluble incluye los residuos 140-317 inclusive, 143-317 inclusive, o fragmentos inmunogénicos de los mismos. El OPGbp puede ser un polipéptido maduro como se define en la presente y puede o no tener un residuo de metionina en la terminal amino, dependiendo del método por el cual se prepare . El término "fragmento" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Tal fragmento se puede formular por ejemplo, de un truncamiento en la terminación amino, un truncamiento en la terminación carboxi y/o una eliminación interna de un residuo de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos pueden resultar de un empalme alternativo de ARN o de actividad de la proteasa in vivo. El término "variante" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones en la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o no modificada. Por ejemplo, una variante OPGbp puede resultar de uno o más cambios a una secuencia de aminoácidos de la OPGbp nativa. También a manera de ejemplo una variante del agente de enlace selectivo de OPGbp puede resultar de uno o más cambios a una secuencia de aminoácidos de un agente de enlace selectivo sin modificar previamente o nativo. Las variantes puede ser que se presenten naturalmente, tales como variantes alélicas o de empalme, o se pueden construir artificialmente. Las variantes de polipéptidos se pueden preparar de moléculas correspondientes de ácido nucleico que codifiquen a las variantes. El término "derivados" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp se refiere a un polipéptido o péptido, o una variante, derivado o fragmento del mismo que se ha modificado químicamente. Los ejemplos incluyen colocación covalente de uno o más polímeros tales como polímeros solubles en agua, ligados en N, o carbohidratos ligados en O, azúcares, fosfatos, y/o otras de tales moléculas. Los derivados se modifican en una forma que es diferente del péptido o polipéptidos que se presentan naturalmente o que comienzan, en el tipo o ubicación de las moléculas enlazadas. Los derivados incluyen además la eliminación de uno o más grupos químicos que están naturalmente presentes en el péptido o polipéptido. El término "fusión" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp, se refiere a la unión de un péptido o polipéptido o fragmento, variante y/o derivado del mismo, con un péptido o polipéptido heterólogo. El término "biológicamente activo" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo, se refiere a un péptido o polipéptido que tiene al menos una actividad característica de OPGbp o un agente de enlace selectivo. Un agente de enlace selectivo de OPGbp puede tener actividad agonista, antagonista o neutralizadora o de bloqueo, con respecto a al menos una actividad biológica de OPGbp. El término "que se presenta naturalmente" cuando se usa en conjunto con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huésped, y similares, se refiere a aquellos que se encuentran en la naturaleza y no se manipulan por el ser humano . El término "aislado" cuando se usa con relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp, se refiere a un péptido o polipéptido que está libre de al menos un polipéptido contaminante que se encuentra en su entorno natural, y preferiblemente substancialmente libre de cualesquiera otros polipéptidos mamíferos contaminantes que interferirían con su uso terapéutico o de diagnóstico. El término "maduro" cuando se usa en relación a OPGbp o a un agente de enlace selectivo proteináceo de OPGbp se refiere a un péptido o polipéptido que carece de una secuencia líder. El término puede también incluir otras modificaciones de un péptido o polipéptido tal como el procesamiento proteolítico de la terminación amino (con o sin una secuencia líder) y/o la terminación carboxi, desdoblamiento de un péptido más pequeño de un precursor más grande, glicosilación ligada en N y/o ligada en O y similares. Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" cuando se usan con relación a un agente de enlace selectivo de OPGbp se refiere a una cantidad de agente de enlace selectivo que es útil o necesaria para soportar un cambio observable en el nivel de una o más de las actividades biológicas de OPGbp. El cambio puede ser un incremento o disminución en el nivel de la actividad de OPGbp. El término "sustitución conservadora de aminoácido" se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de tal manera que no hay un efecto o es muy poco en la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esa posición. Por ejemplo, una substitución conservadora resulta del reemplazo de un residuo no polar en un polipéptido con cualquier otro residuo no polar. Adicionalmente, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para mutagénesis aleatoria de alanina. (Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1989) . Las reglas generales para elaborar substituciones de amino ácidos se colocan en la tabla I . Tabla I Sustituciones Conservadoras de Aminoácidos Residuos substituciones substituciones Originales ejemplares preferidas Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln, His, Lys, Arg Gln Asp Glu Glu Cys Ser Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg He Leu, Val, Met, Ala, Leu Phe, Norleucina Leu Norleucina, He He Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, Gln, Asn Arg Met Leu, Phe, He Leu Phe Leu, Val, He, Ala, Leu Tyr Pro Ala Ala Ser Thr Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val He, Met, Lúe, Phe Leu Ala, Norleucina Las substituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácidos que ocurren no naturalmente que son incorporadas típicamente por la síntesis química de péptidos en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Esto incluye peptidomiméticos y otras formas invertidas o de retroceso de porciones de aminoácidos . Las modificaciones conservadoras a la secuencia de aminoácidos (y las correspondientes modificaciones a los nucleótidos de codificación) producirán polipéptidos de OPGbp (y agentes de enlace proteináceos selectivos de los mismos) que tienen características funcionales y químicas similares a aquellos OPGbp que se presentan naturalmente o agentes de enlace selectivos. En contraste, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las OPGbp (y los agentes selectivos de enlace proteináceos de los mismos) pueden realizarse por sustituciones selectivas que difieren de manera importante en su efecto en mantener (a) la estructura de la columna molecular en el área de substitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente pueden dividirse en clases con base en sus propiedades de cadena lateral común: 1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr; 3) ácido: Asp, Glu; 4) básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; y 6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. La identidad y similitud de dos o más de las moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos proporciona una medida de la semejanza de dos o más secuencias distintas. El término "identidad" se refiere a aminoácidos que son idénticos en posiciones correspondientes en dos diferentes secuencias de aminoácidos. El término "similitud" se refiere a aminoácidos que son idénticos o que son substituciones conservadoras como se definen arriba en las posiciones correspondientes en dos secuencias de aminoácidos diferentes El grado de identidad o de similitud se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed. , Oxford University Press, New York, 1998; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. , y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo y colaboradores, SIAM J, Applied Math. , 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad y/o la similitud se diseñan para el apareado más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se describen en programas de cómputo públicamente disponibles. Los métodos de programa de cómputo preferidos para determinar la identidad y similitud entre las dos secuencias incluyen, pero no se limita a, el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 12: 387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , BLASTP, BLASTN Y FASTA (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)). El programa BLAST X está públicamente disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST, Manual, Altschul y colaboradores NCB/NLM/NIH Bethesda, MD) . El algoritmo Smith Waterman bien conocido, también puede usarse para determinar la identidad.

Polipéptidos OPGbp Los polipéptidos OPGbp y fragmentos, variantes y derivados de los mismos se usan como moléculas objetivo para separar por exclusión e identificar los agentes de enlace selectivos de la invención. cuando se desean preparar anticuerpos como agentes de enlace selectivos, los polipéptidos OPGbp son preferiblemente inmunogénicos, esto es que tienen una respuesta inmune cuando se administran a un animal. Alternativamente, cuando se preparan los anticuerpos por técnicas in vitro, los polipéptidos OPGbp usados como moléculas objetivo son capaces de detectar el enlace a un dominio de enlace de antígeno o anticuerpo. Los polipéptidos OPG se preparan por métodos químicos o biológicos. Los métodos biológicos tales como la expresión de secuencias de ADN que codifican el OPGbp recombinante se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al. supra). Los métodos de síntesis química son aquellos establecidos por Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. Soc . , 85:2149 (1963), Houghten et al., Proc Nati acad. Sci. Usa, 82:5132 (1985), y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) , se pueden también usar para preparar polipéptidos OPGbp de la invención. Tales polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en la terminación amino. Los polipéptidos OPGbp químicamente sintetizados o fragmentos o variantes de los mismos se pueden oxidar usando los métodos establecidos en estas referencias para formar puentes de bisulfuro. Los polipéptidos OPGbp de la invención preparados por síntesis química, tendrán al menos una actividad biológica comparable con los polipéptidos correspondientes OPGbp producidos recombinantemente o purificados de fuentes naturales. Los polipéptidos OPGbp se pueden obtener por aislamiento de muestras biológicas tales como tejidos y/o fluidos fuente en los cuales se encuentran naturalmente los polipéptidos OPGbp. Las fuentes para los polipéptidos OPGbp pueden ser de origen humano o no humano . El aislamiento de los polipéptidos OPGbp que se presentan naturalmente, se puede lograr usando métodos conocidos en la técnica, tales como la separación por electroforesis seguida por electroelución, diversos tipos de cromatografía (de afinidad, inmunoafinidad, malla molecular y/o intercambio de iones) , y/o cromatografía líquida de alta presión. La presencia del polipéptidos OPGbp durante la purificación, se puede monitorear usando por ejemplo un anticuerpo preparado contra fragmentos de péptidos o polipéptidos de OPGbp producidos recombinantemente de los mismos.

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos aislados OPGbp, y polipéptidos relacionados con los mismos incluyendo fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión y derivados como se definen hasta aquí. Los fragmentos OPGbp de la invención pueden resultar de truncamientos en la terminación amino (con o sin una secuencia líder) , truncamientos en la terminación carboxi, y/o eliminaciones internas al polipéptido. Tales fragmentos de polipéptidos OPGbp pueden comprender opcionalmente un residuo de metionina en la terminal amino. Los polipéptidos de la invención serán inmunogénicos en que pueden obtener una respuesta a anticuerpos . Las variantes de polipéptidos OPGbp de la invención, incluyen una o más sustituciones de aminoácidos, adiciones y/o eliminaciones en comparación con la secuencia de aminoácidos nativa de OPGbp. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras como se definen arriba, o no conservadoras o cualquier combinación de las mismas. Las variantes pueden tener adiciones de residuos de aminoácidos en la terminal carboxi o en la terminal amino (en donde la terminal amino puede o no comprender una secuencia líder) . Las modalidades de la invención incluyen variantes de cisteína y variantes de glicosilación de OPGbp. Las variantes de glicosilación de OPGbp incluyen variantes en donde el número y/o tipos de sitios de glicosilación se ha alterado en comparación con el polipéptido nativo OPGbp. En una modalidad, las variantes de glicosilación OPGbp comprenden una número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados en N en comparación con el OPGbp nativo. También se proporcionan variantes de glicosilación de OPGbp que comprenden una redistribución de las cadenas de carbohidrato ligadas en N, en donde uno o más sitios de glicosilación ligados en N (típicamente aquellos que se presentan naturalmente) se eliminan, o uno o más sitios nuevos ligados en N se crean. Las variantes de cisteína de OPGbp comprende un número superior o alternativamente un número inferior de residuos de cisteína en comparación con OPGbp nativo. En una modalidad, se eliminan o sustituyen uno o más residuos de cisteína con otros aminoácidos (por ejemplo, serina) . Las variantes de cisteína de OPGbp pueden mejorar la recuperación del OPGbp biológicamente activo, al ayudar al repliegue de OPGbp en una conformación biológicamente activa después del aislamiento de un estado desnaturalizado. La preparación de las variantes de polipéptidos OPGbp está dentro del nivel de experiencia en la técnica. En un enfoque, se pueden introducir una o más sustituciones, eliminaciones y o adiciones de aminoácidos en OPGbp nativos en donde la variante de OPGbp retiene la estructura nativa de OPGbp y/o al menos una de las actividades biológicas. Un enfoque es comparar frecuencias de polipéptidos OPG de una variedad de especies diferentes, con objeto de identificar regiones de identidad y/o similitud relativamente alta y baja. Se aprecia que aquellas regiones de un polipéptido OPGbp que tienen una identidad y o similitud relativamente baja, son menos probables de ser esenciales para la estructura y actividad y por lo tanto, pueden ser más tolerantes de las alteraciones de aminoácidos, especialmente aquellas que no son conservadoras. También se aprecia que aun en regiones relativamente conservadas, se pueden introducir substituciones conservadoras de aminoácidos mientras se conserva la actividad. En otro enfoque, se pueden usar relaciones de función-estructura para identificar residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. Por ejemplo, se puede comparar el residuo de aminoácidos conservado entre OPGbp y otros miembros de la familia del factor de necrosis de tumor, para los cuales están disponibles análisis de estructura-función, y con base en tal comparación, predecir cuales residuos de aminoácidos en OPGbp son importantes para la actividad o estructura. Alguien experto en la técnica puede escoger sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos importantes de aminoácidos predichos de OPGbp. Todavía en otro enfoque, se puede llevar a cabo un análisis de la estructura secundaria o terciaria de OPGbp (ya sea determinado por difracción de rayos X de cristales de OPGbp o por métodos de predicción de la estructura) para determinar la ubicación de residuos específicos de aminoácidos de aminoácidos con relación a las actuales o predichas dentro de un polipéptidos OPGbp. Al usar esta información, se pueden introducir cambios de aminoácidos en una forma que busque conservar la estructura terciaria y/o secundaria de un polipéptido OPGbp tanto como sea posible. Todavía en otro enfoque, los efectos de la alteración de los aminoácidos en posiciones específicas, se pueden probar experimentalmente al introducir sustituciones de aminoácidos y probar los polipéptidos alterados, OPGbp para su actividad biológica usando los ensayos descritos en la presente. Las técnicas tales como la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham et al., supra) son particularmente adecuadas para este enfoque. Muchas secuencias alteradas pueden probarse convenientemente al introducir muchas sustituciones en diversas posiciones de aminoácidos en OPGbp y separar la población de polipéptidos alterados como parte de una colección de despliegue de fagos. Al usar este enfoque, se pueden determinar fácilmente aquellas regiones de un polipéptido OPGbp que sean esenciales para la actividad. Los métodos anteriores son útiles para generar variantes de OPGbp que conservan la estructura nativa. Así, anticuerpos formulados contra cada variante es probable que reconozcan un determinante estructural nativo o epítope, de OPGbp y también probablemente se enlacen al OPGbp nativo. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable producir variantes de OPGbp que no conserven la estructura nativa de OPGbp o que estén parcial o completamente sin llenar. Los anticuerpos formulados contra tales proteínas reconocerán los epítopes ocultos sobre OPGbp. La invención también proporciona polipéptidos de fusión de OPGbp que comprenden polipéptidos OPGbp y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, fusionados a un péptido o proteína heterólogos. Los péptidos y proteínas heterólogos incluyen, pero no se limitan a: un epítope para permitir la detección y/o aislamiento de un polipéptido de fusión OPGbp ; una proteína del receptor de transmembrana o una porción del mismos, tal como un dominio extracelular, o un dominio de transmembrana e intracelular; un ligando o una porción del mismo que se enlaza a una proteína receptora de la transmembrana; una enzima o porción de la misma que es catalíticamente activa; una proteína o péptido que promueve la oligomerización tal como el dominio de cremallera de leucina; y una proteína o péptido que incrementa la estabilidad tal como una región constante de inmunoglobulina. Un polipéptido OPGbp se puede fusionar así mismo o a un fragmento variante derivado del mismo. Las fusiones se pueden hacer en la terminación amino o en la terminación carboxi de un polipéptido OPGbp y pueden dirigirse sin molécula de unión o adaptadóra o pueden ser a través de una molécula de unión o adaptadora. Una molécula de unión o adaptadora, también se puede diseñar con un sitio de desdoblamiento para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa para permitir la separación de las porciones fusionadas. En una modalidad adicional de la invención, un polipéptido, fragmento, variante y/o derivado de OPGbp se fusiona a una región Fc de un IgG humano. En un ejemplo, una articulación IgG humana, región CH2 y CH3 se puede fusionar en la terminación N o en la terminación C de los polipéptidos OPGbp usando métodos conocidos por el técnico experto. En otro ejemplo, se puede fusionar una porción de las regiones de articulación y las regiones CH2 y CH3. El polipéptido de fusión OPGbp Fc así producido, se puede purificar por el uso de una columna de afinidad con la proteína A. Además, los péptidos y polipéptidos fusionados a una región Fc, se ha encontrado que muestran una vida media substancialmente superior in vivo que su contraparte sin fusionar. También, una fusión a una región Fc permite la dimerización/multimerización de un polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc que se presenta naturalmente, o se pueden alterar para mejorar ciertas calidades, tales como calidades terapéuticas, tiempo de circulación, reducir agregación, etc. Los derivados de los polipéptidos OPGbp se incluyen en el alcance de la presente invención, tales derivados son composiciones de polipéptidos OPGbp químicamente modificadas, en las cuales el polipéptido OPGbp se liga a un polímero. El polímero seleccionado es típicamente soluble en agua, de manera que la proteína a la cual se coloca no se precipita en un medio acuoso tal como un medio fisiológico. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Se incluyen dentro del alcance los polímeros de polipéptidos OPGbp, una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. El polímero soluble en agua o una mezcla del mismo puede ser por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , monometoxi-políetineglicol, dextrano (tal como dextrano de bajo peso molecular de por ejemplo, alrededor de 6 kD) , celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli (N-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de etileno/óxido de polipropileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol de polivinilo. Un polímero soluble en agua preferido es el polietilenglicol. Como se usa en la presente, el polietilenglicol significa que abarca cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar a otras proteínas tal como mono- (C?-C?0) alcoxi- , o ariloxi-polietilen glicol. También se abarcan por la invención, las moléculas de reticulado de PEG bifuncional, que se puede usar para preparar multímeros de OPGbp colocados de forma covalente. Los métodos para preparar polipéptidos de OPGbp derivados químicamente se conocen en la técnica. A manera de ejemplo, la derivación de los polipéptidos OPGbp con PEG se puede llevar a cabo usando los procedimientos descritos en Francis et al., Focus on Growth Factors, 3, 4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384, y patente E.U.A. No. 4,179,337. En una modalidad preferida, un derivado de OPGbp tendrá una porción simple PEG en la terminación amino. Ver la patente de E.U.A. No. 5,234,784 que se incorpora en la presente como referencia. El polipéptidos OPGbp derivado descrito en la presente, puede mostrar un enriquecimiento o reducción de al menos una actividad biológica de OPGbp en comparación con el polipéptido no modificado, o puede mostrar una vida media creciente o disminuida o estabilidad. Agentes de enlace selectivos de OPGbp Los polipéptidos OPGbp y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, se pueden usar para identificar agentes de enlace selectivos de OPGbp. Como se define arriba, un agente de enlace selectivo OPGbp abarca agentes de enlace proteináceo y no proteináceos y en una modalidad preferida de la invención, el agente de enlace selectivo es proteináceo. Todavía en otra modalidad preferida, el agente de enlace selectivo es un anticuerpo o fragmento del mismo que enlaza a OPGbp, preferiblemente OPGbp humano. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos agonistas, que aumentan el nivel de al menos una actividad biológica de OPGbp; o anticuerpos antagonistas, que disminuyen el nivel de al menos una actividad biológica de OPGbp. Los anticuerpos antagonistas de OPGbp se pueden también referir como anticuerpos neutralizantes o inhibidores de OPGbp. Aunque tales anticuerpos son modalidades preferidas de la invención, se entiende que otros agentes de enlace selectivos proteináceos que son agonistas o antagonistas de la actividad OPGbp también se abarcan por la invención. Como se describe en los ejemplos a continuación, los anticuerpos OPGbp y los dominios de enlace de antígenos que inhiben al menos una actividad de OPGbp se han identificado. Las modalidades de la invención, incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia Fab de cadena pesada como se muestra en cualquiera de las figuras 9, 10, 11 ó 12 y que comprende además una secuencia de cadena ligera kappa o lambda. Las secuencias de cadena ligera Fab pueden ser como se muestran en las figuras 5, 6, 7, u 8. Por ejemplo, el anticuerpo "AT" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 5 y 9 respectivamente; el anticuerpo "Y" tienen secuencias de cadena ligera y pesada de las figuras 6 y 10 respectivamente, el anticuerpo "S" tiene secuencias de cadena ligera y pesada de las figuras 7 y 11 respectivamente, y el anticuerpo "P" tiene secuencias de cadera ligera y pesada de la figuras 8 y 12 respectivamente. Los anticuerpos de la invención comprenden además una región Fc humana de cualquier isotipo, ya sea IgG, IgM, IgA, IgE ó IgD. Preferiblemente, la región Fc es de IgG humana tal como IgGl , IgG2 , IgG3 y IgG4.

La invención también proporciona anticuerpos o dominios de enlace de antígenos que comprenden fragmentos, variantes o derivados de las secuencias Fab descritas en la presente. Los fragmentos incluyen dominios variables de secuencias Fab de cadena ligera o pesada, que se unen típicamente a dominios constantes ligeros o pesados. Las variantes incluyen anticuerpos que comprenden secuencias Fab de cadena ligera que son al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ó 99% idénticas o similares a las secuencias Fab o los dominios variables correspondientes en cualquiera de las figuras 5-8, o anticuerpos que comprenden secuencias Fab de cadena pesada o los dominios de variable correspondientes que son al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ó 99% idénticos o similares a la secuencia Fab en cualquiera de las figuras 9-12. Los anticuerpos se pueden asociar típicamente con regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para formar anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos y dominios de enlace de antígenos y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, de la invención, contendrán la capacidad de enlazarse selectivamente a un polipéptido OPGbp, preferiblemente al polipéptido humano OPGbp. En una modalidad, un anticuerpo se enlaza a un polipéptido OPGbp con una constante de disociación (KD) de alrededor de 1 nM o menos, o alternativamente O .1 nM o menos, o alternativamente 10 pM o menos, o alternativamente menos de 10 pM. En el ejemplo 8, se observó que el anticuerpo "AT" se enlaza a OPGbp con una KD de alrededor de 0.33 a 0.43 nM. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales, policlonales monoespecífieos, monoclonales, recombinantes, quiméricos, humanizados, completamente humanos, de cadena simple y/o anticuerpos biespecífieos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellas porciones de un anticuerpo anti-OPGbp que se enlaza a un epítope de un polipéptido OPGbp. Ejemplos de tales fragmentos incluyen Fab F(ab'), F(ab)', Fv, y fragmentos sFv. Los anticuerpos se pueden generar por el desdoblamiento enzimático de anticuerpos de longitud completa, o por técnicas de ADN recombinante, tal como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican regiones variables de anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un antígeno es una molécula o una porción de una molécula, capaz de enlazarse por un anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal, a producir un anticuerpo capaz de enlazarse a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopes. La reacción específica referida arriba, significa que indica que el antígeno reaccionará en una forma altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos. Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido OPGbp, generalmente se formulan en animales (por ejemplo ratones o conejos) por inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales de OPGbp y un adyuvante. De conformidad con la invención, puede ser útil conjugar un polipéptido OPGbp o una variante, fragmento o derivado del mismo a una proteína portadora que es inmunogénica en las especies a inmunizarse, tal como una hemocianina de una variedad de lapa, suero, albúmina, tiroglobulina de bovino o inhibidor de la tripsina de soya. También, agentes de agregación tal como el alumbre se usan para aumentar la respuesta inmune. Después de la inmunización, se hacen sangrar los animales y se ensaya el suero para una titulación de anticuerpos anti -OPGbp. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) contienen una población substancialmente homogénea de anticuerpos específicos a los antígenos, cuya población contiene sitios de enlace de epítopes substancialmente similares. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención, se puede cultivar in vitro, in situ, o in vivo. La producción de altas concentraciones in vivo o in situ es un método preferido de producción. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia OPGbp, se producen usando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas de células continuas en cultivo. Los ejemplos de los métodos adecuados para la preparación de anticuerpos monoclonales, incluyen métodos de hibridoma de Kohler et al . , Nature 256 , 495-497 (1975) , y el método de hibridoma de la célula B-humana de Kozbor, J". I munol . 133, 3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); los contenidos de las cuales se incorporan completamente en la presente como referencia. Los agentes de enlace selectivo anti-OPGbp preferidos, incluyen anticuerpos monoclonales que inhibirán parcial o completamente el enlace de OPGbp humano a su receptor similar, ODAR, o un anticuerpo que tiene substancialmente las mismas características específicas de enlace así como fragmentos y regiones de los mismos. Los métodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad de anticuerpos monoclonales por inhibición competitiva, se pueden encontrar en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. And Wiley Intescience, N.Y., (1992-1993) y Muler, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1993). Estas referencias se incorporan en la presente como referencia. También se proporcionan por la invención líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con otros polipéptidos OPGbp. Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las cuales se derivan porciones diferentes de especies animales diferentes, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de purina y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar rendimientos en producción, por ejemplo, en donde los anticuerpos monoclonales murinos tienen rendimientos superiores de hibridomas pero una inmunogenicidad en humanos, tal que se usen anticuerpos monoclonales quiméricos humanos/murinos .

Los anticuerpos y métodos quiméricos para su producción se conocen en la técnica. Cabilly et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:3273-32777 (1984) Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature, 312:643-646 (1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270 (1985); Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443 (1987); y Harlow y Lañe Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) . Estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales quiméricos de la invención se pueden usar como terapéuticos. En tal anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y /o ligera, es idéntica con, u homologa a la secuencia correspondiente, en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular de anticuerpo o subclase, mientras que el resto de las cadenas es idéntico con u homólogo a la secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, con tal de que demuestren la actividad biológica deseada (ver patente de EUA No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 81, 6851-6855 (1985).

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena quimérica H asociada a través de los puentes disulfuro con una cadena quimérica L. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H2L2) formado por dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente disulfuro. Se puede también producir un anticuerpo quimérico polivalente por ejemplo, al emplear una región CH que agregue (por ejemplo, de una cadena IgM H, o cadena µ) . Los anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricas y murinas de la presente invención, pueden comprender cadenas individuales de inmunoglobulina pesada (H) y/o ligera (L) . Una cadena quimérica H comprende una región de enlace de antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano específico para OPGbp, que se liga a al menos una porción de una región C de cadena humana H (CH) tal como CHi o CH2. Una cadena quimérica L de conformidad con la presente invención, comprende una región de enlace de antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano específico para OPGbp, ligado a al menos una porción de una región C de cadena L humana (CL) .

Los agentes de enlace selectivos, tales como anticuerpos, fragmentos o derivados, que tienen cadenas quiméricas H y cadenas L de una especificidad de enlace de región variable igual o diferente, se pueden también preparar por asociación adecuada de las cadenas individuales de polipéptidos, de conformidad con etapas de métodos conocidos, por ejemplo según Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1993), y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) . Los contenidos de estas referencias se incorporan completamente en la presente como referencia. Con este enfoque, los huéspedes que expresan cadenas quiméricas H (o sus derivados) se cultivan separadamente de huéspedes que expresan cadenas quiméricas L (o sus derivados) , y las cadenas de inmunoglobulina se recuperan separadamente y después se asocian. Alternativamente, los huéspedes se pueden co-cultivar y las cadenas se permite que se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por la recuperación de la inmunoglobulina ensamblada, fragmento o derivado . Como un ejemplo, la región de enlace de antígeno del agente de enlace selectivo (tal como un anticuerpo quimérico) de la presente invención, se deriva preferiblemente de un anticuerpo no humano o específico para OPGbp humano. Las fuentes preferidas para el ADN que codifican tal anticuerpo no humano, incluyen líneas celulares que producen anticuerpos, tales como líneas celulares híbridas comúnmente conocidas como hibridomas. La invención también proporciona fragmentos, variantes y derivados, y fusiones de anticuerpos anti-OPGbp, en donde los términos "fragmentos", "variantes", "derivados" y fusiones" se definen en la presente. La invención abarca fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpos anti-OPGbp que son funcionalmente similares al anticuerpo anti-OPGbp no modificado, esto es, conservan al menos una de la actividades del anticuerpo no modificado. Además de las modificaciones antes establecidas, también se incluye la adición de secuencias genéticas que codifican proteínas citotóxicas tales como toxinas de plantas y bacterianas. Los fragmentos, variantes, derivados y fusiones de los anticuerpos anti-OPGbp se pueden producir de cualquiera de los huéspedes de esta invención. Los fragmentos adecuados incluyen por ejemplo Fab, Fab', F(ab')2' Fv y scFv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de la circulación y pueden tener menos enlace de tejido no específico que un anticuerpo intacto. Ver Wahl et al., J. Nucí. Med., 24:316-325 (1983). Estos fragmentos se producen de anticuerpos intactos usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por desdoblamiento proteolítico con enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). La identificación de estas regiones de enlace de antígenos y/o epítopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales de la presente invención, proporciona la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales, con características de enlaces similares y una utilidad terapéutica o diagnostica que tenga paralelo con las modalidades de esta solicitud. La invención proporciona anticuerpos anti-OPGbp o dominios de enlace de antígenos, que reconocen y se enlazan a epítopes que inhiben y/o neutralizan en OPGbp. Como resultado de este enlace, un anticuerpo anti-OPGbp puede inhibir parcial o completamente el enlace de OPGbp con su receptor, o puede inhibir parcial o completamente la formación de osteoclastos, resorción de hueso y/o pérdida ósea. Más particularmente, la invención proporciona anticuerpos anti-OPGbp que reconocen y se enlazan a un epítope que comprende una porción de la secuencia de aminoácido de una región de OPGbp (un "epítope DE") . Una región DE de OPGbp se abre aproximadamente en las regiones de lámina D y E beta y en la secuencia de circuito que interviene (un "circuito DE") . La región DE en el OPGbp humano comprende desde alrededor del residuo de aminoácido 212 hasta alrededor del residuo de aminoácido 250 inclusive (ver figura 29) . Sin embargo, las secuencias de aminoácidos y los puntos finales de la región DE del OPGbp humano, son meramente ejemplares, y se entiende que las regiones DE pueden tener secuencias y puntos finales que varían de aquellos en el OPGbp humano. La invención abarca anticuerpos que se enlazan a tales regiones variables DE. Aunque se contempla que un anticuerpo anti-OPGbp o un dominio de enlace de antígeno se puedan enlazar en cualquier ubicación dentro de una región DE, una modalidad preferida es un anticuerpo anti-OPGbp que se enlaza al menos a una parte del circuito DE. El circuito DE en el OPGbp humano, abarca aproximadamente cinco aminoácidos y se localiza alrededor de los residuos 230-234 inclusive. El circuito DE en OPGbp humano, tiene la secuencia DLATE. Sin embargo, las secuencias de aminoácido y los puntos finales del DE de OPGbp humano son meramente ejemplares y se entiende que los circuitos DE pueden mantener secuencias y puntos finales que varían desde aquellos en el OPGbp humano. La invención abarca anticuerpos que se enlazan a tales circuitos variables DE.

Como se muestra en el ejemplo 10, la introducción de la secuencia DLATE dentro del circuito correspondiente DE del OPGbp murino, resulta en el enlace de un anticuerpo "AT", mientras que el anticuerpo no tuvo una afinidad detectable para el OPGbp murino con la secuencia de circuito negativa de hasta una concentración de anticuerpo de alrededor de 2µg/ml. En otra modalidad, un anticuerpo anti-OPGbp se enlaza a la secuencia de aminoácidos DLATE en el OPGbp humano, o a una porción de la secuencia. En otra modalidad, un anticuerpo anti-OPGbp o un dominio de enlace de antígeno, se enlaza al OPGbp murino que comprende las substituciones de aminoácidos S229D, V230L, P231A y D233E, pero no se enlaza al OPGbp murino que carece de las substituciones bajo condiciones similares. Aunque los anticuerpos de la invención se caracterizan en parte por las secuencias de aminoácidos en OPGbp al cual se enlazan, se entiende y apreciará por alguien experto en la técnica, que un epítope DE sobre OPGbp reconocido por un anticuerpo, comprende típicamente una estructura tridimensional que puede involucrar aminoácidos fuera de la región DE. En una representación lineal de una secuencia OPGbp, los aminoácidos que comprenden el epítope DE pueden estar distantes de la región DE, pero en una estructura tridimensional de OPGbp, los aminoácidos del epítope DE probablemente estarán en proximidad con la región DE. Así, se entiende que el enlace de un anticuerpo anti-OPGbp a un epítope DE, puede involucrar aminoácidos diferentes a aquellos en la región DE. Sin embargo, se ha demostrado que los residuos de aminoácidos en el circuito DE, especialmente algunos o todos los residuos en la secuencia DLATE, se involucran en el enlace de anticuerpos a OPGbp y la inhibición de la actividad de OPGbp. Se proporcionan también variantes de agentes de enlaces selectivos. En una modalidad, las variantes de anticuerpos y dominios de enlace de antígenos, comprenden cambios en las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y/o ligera, que se presentan naturalmente o se introducen por ingeniería in ví tro de secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinantes. Las variantes que se presentan naturalmente incluyen variantes "somáticas" que se generan in vivo en las secuencias de nucléotidos de la línea germinal correspondiente durante la generación de una respuesta de anticuerpos con un antígeno externo. Las variantes modificadas por mutaciones somáticas en las secuencias de cadena pesada y ligera variables de línea germinal, que generan los Fab ejemplares de la presente invención en secuencias, se muestran en las figuras 16 y 19 para Fab "AT", figuras 16 y 20 para Fab "Y", figuras 17 y 21 para Fab "P" y figuras 18 y 22 para Fab "S" .

Las variantes de los anticuerpos anti-OPGbp y dominios de enlace de antígenos también se preparan por técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. En un ejemplo, se pueden introducir cambios de aminoácidos al azar a través de una región codificadora de anticuerpos, y las variables resultantes pueden separarse por exclusión para una actividad deseada, tal como afinidad de enlace para OPGbp. Alternativamente, se pueden introducir cambios de aminoácidos en regiones selectas de un anticuerpo OPGbp tal como en las regiones de CDR de cadena ligera y/o pesada y regiones de estructura, y los anticuerpos resultantes se pueden separar por exclusión para su enlace a OPGbp o alguna otra actividad. Los cambios de aminoácidos abarcan una o más substituciones de aminoácidos en un CDR, que va desde una diferencia simple de aminoácido hasta la introducción de todas las permutaciones posibles de aminoácidos dentro de un CDR dado, tal como un CDR3. En otro método, la contribución de cada residuo dentro de un CDR al enlace de OPGbp se pude evaluar al substituir al menos un residuo dentro del CDR con alanina (Lewis et al., Mol. Immunol . 32, 1065-1072 (1995) ) . Los residuos que no son óptimos para el enlace a OPGbp se pueden entonces cambiar con objeto de determinar una secuencia más óptima. También se abarcan variantes generadas por la inserción de aminoácidos para incrementar el tamaño de un CDR, tal como CDR3. Por ejemplo, la mayoría de las secuencias CDR3 de cadena ligera tienen nueve aminoácidos de longitud. Las secuencias CDR3 de cadena ligera en un anticuerpo, que son más cortas que los nueve residuos se pueden utilizar para enlazarse a OPGbp por la inserción de aminoácidos adecuados para incrementar la longitud del CDR. En una modalidad, las variantes del dominio de enlace de anticuerpo o antígeno, comprenden uno o más cambios de aminoácidos en una o más de las cadenas pesada o ligera CDRl, CDR2 o CDR3 y opcionalmente uno o más de las regiones de estructura de cadena ligera o pesada FR1, FR2 o FR3. Los cambios de aminoácidos comprenden substituciones, eliminaciones y/o inserciones de residuos de aminoácidos. Las variantes ejemplares incluyen una variante de región variable de cadena pesada "AT" con uno o más cambios de aminoácidos en las secuencias NYAIH (SEQ ID NO: 13) WINAGNGNTIKFSQKFQF (SEQ ID NO: 16); O DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID N0:19), o en una variante de región variable de cadena ligera "AT" con uno o más cambios de aminoácidos en las secuencias RASQSISRYLN (SEQ ID N0:01); GASSLQS (SEQ ID NO:05);o QHTRA (SEQ ID NO:09). Las variantes de región variable de cadena ligera y pesada "AT" antes mencionadas, pueden además comprender uno o más cambios de aminoácidos en las regiones de estructura.

En un ejemplo, se pueden introducir uno o más cambios de aminoácidos para sustituir un residuo de estructura mutada somáticamente con el residuo de la línea germinal en esa posición. Cuando los cambios antes mencionados de aminoácidos son substituciones, los cambios pueden ser substituciones conservadoras o no conservadoras. Los ejemplos 11 y 12 proporcionan variantes en la región CDR3 de cadena ligera y pesada del anticuerpo AT. En una modalidad, la invención proporciona variantes en SEQ ID NO: 19 (cadena pesada CDR3) o SEQ ID NO: 9 (cadena ligera CDR3) tal que los anticuerpos resultantes o dominios de enlace de antígenos, se enlacen selectivamente a una proteína de enlace OPG. En una modalidad, el OPGbp es un OPGbp humano. La invención proporciona anticuerpos anti-OPGbp que comprenden cadenas variables ligeras y variables pesadas, y que comprenden además una región CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de : XSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 80) DXSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 81) DSXNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 82) DSSXMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO : 83) DSSNXVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 84) DSSNMXRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO : 85) DSSNMVXGIIIAYYFDY (SEQ ID NO 86) ro DSSNMVRXIIIAYYFDY (SEQ ID NO 87) 30 DSSNMVRGXIIAYYFDY (SEQ ID NO 88) ra DSSNMVRGIXIAYYFDY (SEQ ID NO 89) ía DSSNMVRGIIXAYYFDY (SEQ ID NO 90) DSSNMVRGIIIXYYFDY (SEQ ID NO 91) DSSNMVRGIIIAXYFDY (SEQ ID NO 92) DSSNMVRGIIIAYXFDY (SEQ ID NO 93) DSSNMVRGIIIAYYXDY (SEQ ID NO 94) La DSSNMVRGIIIAYYFXY (SEQ ID NO 95) La DSSNMVRGIIIAYYFDX (SEQ ID NO 96) 2Q en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido que ae es diferente del residuo de aminoácido normalmente ía residente en esa posición, y en donde el anticuerpo 1, resultante se enlaza selectivamente a un OPGbp. 3l La invención también proporciona anticuerpos anti- :a OPGbp que comprenden cadenas pesada variable y ligera T" variable, y comprenden además una secuencia CDR3 de cadena 3. ligera que se incrementa desde cinco aminoácidos hasta le nueve aminoácidos. Más particularmente, la secuencia CDR3 de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de: ía QHTXXXXRA (SEQ ID NO: 97) íe en donde la primera presentación de X de izquierda a La derecha, denota cualquier residuo de aminoácido diferente ía a la arginina, la segunda, tercera y cuarta presencias de :a X denotan cualquier residuo de aminoácido, pero preferiblemente alanina, y en donde el anticuerpo resultante se enlaza selectivamente a un OPGbp. En otra modalidad de la invención, una secuencia CDR3 de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de: QHTXAAARA (SEQ ID NO: 98) en donde X es cualquier residuo de aminoácido diferente a la arginina. En otra modalidad, las variantes de anticuerpos de la invención comprenden cadenas Vi que tienen la secuencia CDRl como en SEQ ID NO:l y una secuencia CDR2 como en SEQ ID NO: 5, y comprenden cadenas Vb que tienen cadenas Vh que tienen una secuencia CDRl como en la SEQ ID NO: 13 y una secuencia CDR2 como en la SEQ ID NO: 16. En otra modalidad, las variantes de anticuerpos comprenden una cadena Vi del anticuerpo "AT" con las variantes CDR3 de cadena ligera antes mencionadas, y una cadena Vh de un anticuerpo "AT" con las variantes CDR3 de cadena pesada antes mencionadas. Las variantes también se pueden preparar por "mezclado de cadena" de cadenas ligeras o pesadas (Marks et al. Biotechnology 10, 779-783 (1992)). Típicamente, una cadena ligera simple (o pesada) se combina con una colección que tiene un repertorio de cadenas pesadas (o ligeras) y la población resultante se separa por exclusión para una actividad deseada tal como el enlace a OPGbp. Esta técnica permite la separación por exclusión de una muestra más grande de cadenas diferentes pesadas (o ligeras) en combinación con una cadena ligera simple (o pesada) que es posible con colecciones que comprenden repertorios de cadenas ligeras y de cadenas pesadas. Los agentes de enlace selectivo de la invención pueden ser biespecíficos . Los agentes de enlace selectivo biespecíficos de esta invención pueden ser de diversas configuraciones. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se asemejan a anticuerpos simples (o fragmentos de anticuerpos) pero tienen dos sitios de enlace de antígeno diferentes (regiones variables) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por técnicas químicas (ver ejemplo, Kranz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:5807 (1981)), por técnicas de "polidoma" (ver Pat. E.U.A. No. 4,474,893 para Reading) o por técnicas de ADN recombinante. Los agentes de enlaces selectivos de la invención también pueden ser heteroanticuerpos. Los heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos, o fragmentos de enlace de anticuerpos (Fab) unidos juntos, cada anticuerpo o fragmento tiene una especificidad diferente.

La invención también se refiere a anticuerpos "humanizados". Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en un anticuerpo humano de una fuente que no es humana. En general, los residuos no humanos estarán presentes en CDR. La humanización se puede llevar a cabo, siguiendo los métodos conocidos en la técnica (Jones et al .,Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239. 1534-1536 (1988)), al sustituir regiones determinantes de la complementariedad en roedores (CDR) por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano . Los agentes de enlace selectivos de la invención, incluyendo anticuerpos humanizados, quiméricos e injertados con CDR se pueden producir con métodos recombinantes conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, se introducen en células huésped y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en la presente y conocidos en el arte. En una modalidad preferida, los anticuerpos se producen en células huésped de mamíferos tales como células CHO. Se pueden producir anticuerpos humanos completamente, por la expresión del ADN recombinante transfectado en las células huésped o por la expresión en células de hibridoma como se describe arriba.

Las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de las regiones de enlace de antígenos, de las moléculas de anticuerpos que desvían la generación de anticuerpos monoclonales, se abarcan dentro de la práctica de esta invención. Para hacerlo así, las moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpos, se extraen de células del sistema inmune tomadas de un animal inmunizado, y se transcriben dentro del ADN complementario (ADNc) . El ADNc se clona después en un sistema de expresión bacteriana. Un ejemplo de tal técnica adecuada para la práctica de esta invención, usa un sistema vector bacteriófago lambda que tiene una secuencia líder que provoca que la proteína expresada Fab migre al espacio periplásmico (entre la membrana de la célula bacteriana y la pared celular) o se secrete. Se pueden generar rápidamente y separar por exclusión grandes números de fragmentos funcionales Fab para aquellos que enlazan al antígeno. Tales agentes de enlaces selectivos OPGbp (fragmentos Fab con especificidad para un polipéptido OPGbp) se abarcan específicamente dentro del término anticuerpo como se define, discute y reivindica en la presente. También dentro del alcance de la invención, están las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos, al empalmar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad de antígeno apropiada junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada, tal como la capacidad para activar el complemento humano y mediar la ADCC. (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604 (1984)). Un ejemplo es el reemplazo de una región Fc con aquella de un isotipo diferente. Los agentes de enlace selectivo tales como los anticuerpos producidos por esta técnica, están dentro del alcance de la invención. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-OPGbp son anticuerpos completamente humanos. Así se abarcan por la invención anticuerpos que enlazan a los polipéptidos OPGbp y se modifican por secuencias de ácido nucleico, que son variantes somáticas que se presentan naturalmente de la secuencia de ácido nucleico de la inmunoglobulina de la línea terminal humana, y fragmentos, variantes sintéticas, derivados y fusiones de la misma. Tales anticuerpos se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen inmunización con un antígeno OPGbp (cualquier polipéptido OPGbp capaz de obtener una respuesta inmune, y conjugarla opcionalmente a un portador) de animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Ver por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Sci. 90,2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature , 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol . 7,33 (1993) . Alternativamente, se pueden generar anticuerpos humanos a través de la separación por exclusión in vi tro de colecciones de anticuerpos de despliegue de fagos. Ver Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581 (1991), que se incorpora en la presente como referencia. Se han descrito diversas colecciones de despliegue de fagos que contienen anticuerpos, y se pueden preparar por alguien con experiencia en la técnica. Las colecciones pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, tales como fragmentos humanos Fab, Fv, y scFv, que se pueden separar por exclusión contra un objetivo adecuado. El ejemplo 1 describe la separación por exclusión de una colección de fagos Fab contra OPGbp para identificar aquellas moléculas que enlazan selectivamente la OPGbp. Se apreciará que las colecciones de despliegue de fagos pueden comprender péptidos o proteínas diferentes a los anticuerpos que se pueden separar por exclusión para identificar agentes de enlace selectivo de OPGbp.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos, generalmente asociados con el sitio de enlace de antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar al 5 inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo una cepa de ratón) como la fuente de un anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal al cual se va a preparar un anti-ld. El animal inmunizado reconocerá y responderá a las determinantes idiotípicas del anticuerpo inmunizante, al producir un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-ld) . Ver por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 4,699,880, que se incorpora completamente en la presente como referencia. El anticuerpo anti-ld, se puede también usar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en todavía otro animal, produciendo un denominado, anticuerpo antianti-ld. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original que induce el anti-ld. Así, al usar anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAB, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de especificidad idéntica. Producción de Agentes de Enlace Selectivo de OPGbp. Cuando el agente de enlace selectivo de OPGbp a prepararse, es un agente de enlace selectivo proteináceo, tal como un anticuerpo o un dominio de enlace de antígeno, "• •rrrri — *"-están disponibles diversos métodos químicos o biológicos para la producción del agente. Los métodos biológicos son preferibles para producir cantidades suficientes de un agente de enlace selectivo para uso terapéutico. Las técnicas de ADN recombinante estándar, son particularmente útiles para la producción de anticuerpos y dominios de enlace de antígeno de la invención. Los vectores de expresión ejemplares, células huésped y métodos para la recuperación del producto expresado se describen abajo. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo OPGbp o un dominio de enlace de antígeno, se inserta dentro de un vector de expresión adecuado usando técnicas de unión estándar. El vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula huésped particular empleada (esto es, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped tal que la amplificación del gen y/o expresión del gen puede suceder) . Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-OPGbp puede amplificarse/expresarse en células huésped eucarióticas y/o procarióticas, de levadura, e insectos (sistemas de baculovirus) . La selección de la célula huésped dependerá en parte de si un anticuerpo anti-OPGbp va a modificarse post-transicionalmente (por ejemplo, glicosilado y/o fosforilado) . Si es así, son preferibles las células de levadura, insectos o células huésped de mamíferos. Para una revisión de los vectores de expresión, ver Meth. Enz . v. 185, D.V. Goeddel, ed. Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) . Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped, contendrán uno o más de los siguientes componentes: un promotor, una o más secuencias enriquecedoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia completa de intrón que contiene un donador y un sitio de empalme del aceptor, una secuencia líder para secreción, un sitio de enlace de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de polienlace para insertar el ácido nucleico que codifica al polipéptido a expresarse, y un elemento marcador de selección. Cada una de estas secuencias se discute con mayor detalle abajo. Los componentes del vector pueden ser homólogos (esto es, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped) heterólogo (esto es, de una especie diferente a la especie o cepa de célula huésped) , híbrido (esto es, una combinación de secuencias diferentes en más de una fuente) , secuencias sintéticas o nativas que funcionan normalmente para regular la expresión de inmunoglobulina. Como tal una fuente de los componentes del vector puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con tal de que los componentes sean funcionales y se puedan activar con la maquinaria de la célula huésped. Un origen de replicación se selecciona con base en el tipo de célula huésped que se usa para expresión. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (Producto no. 303 -3s, New England Biolabs Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, mientras que diversos orígenes del SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o virus de papiloma (tal como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el origen del componente de replicación no se necesita para los vectores de expresión mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 se usa a menudo solamente porque contiene el promotor temprano) . Una secuencia de terminación de la transcripción, se localiza típicamente 3 " del final de las regiones que codifican polipéptidos y sirve para terminar la transcripción. Usualmente una secuencia de terminación de la transcripción en células procarióticas, es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una colección o se compra aún comercialmente como parte de un vector, se puede -...., también fácilmente sintetizar usando métodos para la síntesis del ácido nucleico tales como aquellos antes descritos. Un elemento de un gen marcador de selección, codifica 5 una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes típicos del marcador de selección, codifican proteínas que: a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas; por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canamicina para células huésped procarióticas, b) complementan las deficiencias auxotróficas de las células ó c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos. Los • marcadores de selección preferidos son el gen de resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Un gen de resistencia a la neomicina puede también usarse para selección en células huésped procarióticas y eucarióticas . 20 Se pueden usar otros genes de selección para • amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso donde los genes que están en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento, se reiteran en tándem con los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de los marcadores de selección adecuados para células mamíferas, incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina cinasa. Los transformantes de células de mamíferos se colocan bajo presión de selección que solamente los transformantes están particularmente adaptados para sobrevivir en virtud del marcador presente en el vector. La presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, con lo cual conduce a la amplificación del gen de selección y el ADN que codifica un anticuerpo anti-OPGbp. Como resultado, las cantidades crecientes de un anticuerpo se sintetizan del ADN amplificado. Un sitio de enlace de ribosoma es igualmente necesario para el inicio de la traducción del mARN y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas) . El elemento se localiza típicamente 3' con el promotor y 5' con la secuencia de codificación del polipéptido a expresarse. La secuencia Shine-Dalgarno varía pero es típicamente una polipurina (esto es, tiene un alto contenido A-G) . Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgarno cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente usando métodos antes establecidos y usados en un vector procariótico.

Una secuencia líder, o de señal, se usa para dirigir la secreción de un polipéptido. Una secuencia de señal se puede colocar dentro o directamente en la terminación 5' de una región codificadora de polipéptido. Muchas secuencias de señal se han identificado y se pueden seleccionar con base en la célula huésped usada para la expresión. En la presente invención, una secuencia de señal puede ser homologa (que se presenta naturalmente) o heteróloga para una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-OPGbp o un dominio de enlace de antígeno. Una secuencia de señal heteróloga seleccionada, debe ser una que se reconozca y procese, esto es desdoblada, por una peptidasa de señal por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan una secuencia de señal de inmnunoglobulina nativa, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica, seleccionada por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, o líderes II de la enterotoxina estable al calor. Para la secreción de levadura, se puede substituir una secuencia nativa de señal de inmunoglobulina por la invertasa de levadura, factor alfa, o por líderes de la fosfatasa acida. En la expresión de células de mamíferos, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamíferos. En la mayoría de los casos, la secreción de un anticuerpo anti-OPGbp o dominio de enlace de antígeno de una célula huésped resultará en la separación del péptido de señal del anticuerpo. Así, el anticuerpo maduro carecerá de algunas secuencias de señal o líder. En algunos casos, tales como en donde se desea la glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariótica, se pueden manipular diversas presecuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de desdoblamiento de la peptidasa de un péptido de señal en particular o agregar prosecuencias que también pueden afectar la glicosilación. El producto de proteína final puede tener en la posición - 1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes para expresión, que pueden no haber sido totalmente separados. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos aminoácidos que se encuentran en el sitio de desdoblamiento de la peptidasa, colocado en la terminación-N. Alternativamente, el uso de algunos sitios de desdoblamiento de enzimas puede resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado OPGbp, si la enzima se corta en un área tal dentro del polipéptido maduro . Los vectores de expresión de la presente invención, contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se liga operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica a un anticuerpo anti-OPGbp o a un dominio de enlace de antígenos. Se puede usar un promotor nativo o heterólogo dependiendo de la célula huésped usada para expresión y el rendimiento de la proteína deseada. Los promotores adecuados para su uso como huéspedes procarióticos, incluyen sistemas promotores de lactosa y de beta-lactamasa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptofano (trp) , y promotores híbridos tales como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Se han publicado sus secuencias, con lo cual se permite que alguien con experiencia en la técnica los ligue a las secuencias deseadas de ADN, usando uniones o adaptadores como se necesiten para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores adecuados para su uso con los huéspedes de levadura también son bien conocidos en el arte. Los aumentadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para su uso con células huésped de mamíferos son bien conocidos e incluyen aquellos obtenidos de los genomas de virus, tal como el virus de polioma, virus de la viruela de aves de corral, adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma de bovinos, virus del sarcoma de las aves, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, y más preferiblemente virus 40 de los simios (SV40) . Otros promotores mamíferos adecuados incluyen promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores del choque térmico, y el promotor de la actina. Los promotores adicionales que se pueden usar para expresar los agentes de enlace selectivos de la invención incluyen pero no se limitan a: la región promotora temprana del SV40 (Bernoist and Chambón, Nature, 290:304-310, 1981); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición de la terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell, 22; 787-797, 1980); el promotor de la timidina cinasa de la herpes (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 78; 144-1445, 1981); las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina (Brinster et al., Nature, 296; 39-42, 1982); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff , et al., Proc. Nati., Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); o el promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25, 1983). También son de interés las siguientes regiones de control ,.A - -- -- Í -- i-l --, r rt-i--J&--.---• ------- —. --«-------n - - W*-1 transcripcional animal, que muestran especificidad de tejidos, y se han utilizado en animales transgénicos: La región del control del gen I de la elastasa que es activo en la células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell, 38; : 639-646, 1984; Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50; 399-409, 1986; MacDonald, Hepatology, 7; : 425-515, 1987; la región del control del gen de la insulina que es activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, Nature, 315; 115-122, 1985) ; la región del control del gen de la inmunoglobulina que es activo en las células linfoides (Grosschedl et al., Cell, 38; 647-658, 1984; Adames et al., Nature, 318; 533-538, 1985; Alexander et al., Mol. Cell. Bio., 7; 1436-1444, 1987) ; la región de control del virus de tumor mamario del ratón que es activo en las células testiculares, del pecho, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell, 45; 485-495, 1986) , la región de control del gen de la albúmina que se activa en el hígado (Pinkert et al., Genes and Devel., 1; 268-276, 1987); la región de control del gen de la alfafetoproteína que es activo en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5; 1639-1648, 1985 Hammer et al., Science, 235; 53-58, 1987); la región de control del gen de la alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., Genes and Devel, 1; 161-171, 1987) ; la región de control del gen de la beta-globina que i -.1, í, . ,i -i: í - .. . :-,.-.. -es activo en la células mieloides (Mogram et al., Nature, 315; 338-340, 1985; Kollias et al., Cell, 46; 89-94, 1986) ; la región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activo en células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., Cell, 48; 703-712, 1987); la región de control del gen 2 de la cadena ligera de la miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, Nature, 314; 283-286, 1985) y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que se activa en el hipotálamo (Masón et al., Science, 234; 1372-1378, 1986).

Una secuencia enriquecedora se puede insertar dentro de un vector para incrementar la transcripción en células huésped eucarióticas. Se conocen diversas secuencias enriquecedoras disponibles de genes mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usará un enriquecedor de un virus. El enriquecedor SV40, el enriquecedor del promotor temprano del citomegalovirus, el enriquecedor del polioma, y los enriquecedores del adenovirus son elementos enriquecedores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos. Aunque se puede empalmar un enriquecedor en un vector en la posición 5' o 3' para la región codificadora del polipéptido, se localiza típicamente en el sitio 5' desde el promotor.

Los vectores preferidos para practicar esta invención, son aquellos que son compatibles con células huésped mamíferas de insectos y bacterianas. Tales vectores incluyen entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3-l 5 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , PBSII (Strategene Company, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-alpha (Publicación PCT No. WO90/14363) y pFastBacDual 10 (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Los vectores adicionales posibles incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen pero no se 15 limitan a plásmidos tales como derivados del plásmido Bluescript* (un fagémido basado en ColEl de un número de alta copia, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA) , los plásmidos de clonación PCR designados para clonar productos PCR amplificados Taq (por ejemplo, kit de 20 clonación TOPOtx TA, derivados de plásmidos PDR2.1*, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y vectores de virus o de levadura, de mamíferos, tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . Las moléculas recombinantes se pueden 25 introducir en células huésped por medio de técnicas de • ¡tfji Mi**-'*a ';, j-.J."-». ---- ---- r -i,-.» -_-. i - .--_. - •"•*-«*-- -• - ->--l-i -U-ll-.l transformación, transfección, infección, elecroporación y otras conocidas . Las células huésped de la invención pueden ser células huésped procarióticas (tal como E. Coli) o células huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de invertebrado) . La célula huésped cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, expresa un anticuerpo o un dominio de enlace de antígeno de la invención que se puede recolectar posteriormente del medio del cultivo (si la célula huésped se secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no se secreta) . La selección de una célula huésped apropiada, dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificadores de polipéptidos que son deseables o necesarios para la actividad tal como glicosilación o fosforilación, y facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa. Se conocen diversas células huésped adecuadas en el arte y muchas están disponibles de American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA. Ejemplos incluyen células de mamíferos tales como las células de ovario del hámster chino (CHO) (ATCC No. CCL61) células CHO DHFR_ (Urlaud et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 4216-4220 (1980)), de riñon embriónico humano (HEK) o células 293, 293T (ATCC ^ ? ? _.*-< -~i. -» dé-A - ^ No. CRL1573) o células 3T3 (ATCC No. CCL92) . La selección de las células huésped adecuadas de mamífero y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, separación por exclusión y producción y purificación de productos se conocen en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son la de mono COS-1 (ATCC No. CRL1650) y las líneas celulares COS-7 (ATCC No. CRL1651) , y la línea celular CV-1 (ATCC No. CCL70) . Células huésped de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas de células primates y líneas de células de roedores, incluyendo células transformadas. Las células normales diploides, cepas de células derivadas de cultivos in vitro de tejido primario, así como explantes primarios, también son adecuados. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otras líneas de células de mamífero adecuadas, incluyen pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células de ratón L-929, líneas 3T3 derivadas de ratones suizos, líneas Balb-c o NIH de ratón, líneas de células de hámster BHK o HaK, que están disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, VA) . Cada una de estas líneas celulares se conoce y está disponible para aquellos expertos en la técnica de expresión de proteínas. uafcáa -...i...-. _ Similarmente útiles como células huésped adecuadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las cepas diversas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC No. 33694) DH5a, DH10, y MC1061 (ATCC No. 5 53338)), son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Se pueden también emplear en este método diversas cepas de B. Subtilis, especies Pseudomonas, otras especies Bacillus, especies Streptomyces., y similares. 10 Muchas cepas de células de levadura conocidas por aquellos expertos en la técnica, también están disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen por ejemplo, Saccharomyces cerivisae. 15 Adicionalmente, en donde se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insectos en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen por ejemplo en Kitts et al. (Biotechniques, 14, 810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 20 (1993) y Lucklow et al. (J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)). Las células de insectos preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La transformación o transfección de una molécula de ácido nucleico que codifica a un anticuerpo anti-OPGbp o 25 un dominio de enlace antígeno en una célula huésped ¡¡¡^gÍ^¡ ^j^¡ j . J ? * A£*M selecta, se puede llevar a cabo por métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como el cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método del dextrano DEAE. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped a usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el técnico preparado, y se establecen por ejemplo en Sambrook et al., supra. Se pueden también usar animales transgénicos para expresar agentes de enlace selectivos glicosilados, tales como anticuerpos y dominios de enlace de antígenos. Por ejemplo, se puede usar un animal productor de leche transgénico (una cabra o una vaca por ejemplo) y obtener agentes de enlace glicosilados en la leche animal. Alternativamente, se pueden usar plantas para producir agentes de enlace selectivos glicosilados. Las células huésped que comprenden (esto es, transformadas o transfectadas) un vector de expresión que codifica un agente de enlace selectivo de OPGbp, se pueden cultivar usando medios estándar bien conocidos por el técnico experto. Los medios contendrán usualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células E. coli son por ejemplo, caldo Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB) . Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM todos los cuales se pueden complementar con suero y/o factores de crecimiento como se requiera por la línea celular en particular a cultivarse. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio Grace complementado con levadurolato, hidrolisado de lactalbúmina, y/o suero de becerro fetal como sea necesario. Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas o transfectadas, se agrega como un suplemento a los medios. El compuesto a usarse se dictará por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la célula huésped. Por ejemplo, en donde el elemento marcador seleccionable es de resistencia a la canamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será canamicina. Otros compuestos para el crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina, y neomicina. La cantidad de un anticuerpo anti-OPGbp o un dominio de enlace de antígeno producido por una célula huésped, se puede evaluar usando métodos estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de manchado Western, electroforesis por gel de poliacrilamida SDS, electroforesis por gel no desnaturalizante, separación CLAR, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad. ---.a- .- -»- La purificación de un anticuerpo anti-OPG o un dominio de enlace antígeno que se ha secretado en los medios de células, se puede llevar a cabo usando una diversidad de técnicas incluyendo afinidad, inmunoafinidad o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de malla molecular, electroforesis de gel preparativo o focalización isoeléctrica, cromatofocalización, y cromatografía líquida de alta presión. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una región Fc se pueden purificar convenientemente por cromatografía de afinidad con proteína A, que se enlaza selectivamente a la región Fc. Las formas modificadas de un dominio de enlace de anticuerpo o de antígeno se pueden preparar con etiquetas de afinidad, tales como hexahistidina u otros péptidos pequeños tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen) , en sus terminaciones carboxilo o amino y purificarse por una columna de afinidad de una etapa. Por ejemplo, la polihistidina se enlaza con gran afinidad y especificidad al níquel, así una columna de afinidad del níquel (tales como las columnas de níquel Qiagen®) se pueden usar para purificación de agentes de enlaces selectivos etiquetados con polihistidina. (Ver por ejemplo, Ausubel et al . , eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)). En algunos casos se puede requerir más de una etapa de purificación. Los agentes de enlace selectivos de la invención que se expresan en células huésped procarióticas, pueden estar 5 presentes en forma soluble ya sea en el espacio periplásmico o en el citoplasma o en una forma insoluble como parte de los cuerpos de inclusión intracelulares. Los agentes de enlace selectivos se pueden extraer de la célula huésped usando cualquier técnica estándar conocida por el técnico experto. Por ejemplo, las células huésped se pueden lisar para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma por prensa Francesa, homogenización, y/o sonicación seguida por centrifugación. Las formas solubles de un anticuerpo anti-OPGbp o un dominio de enlace de antígenos presente en el citoplasma o liberado del espacio periplásmico se puede además purificar usando métodos conocidos en el arte, por ejemplo, se liberan los fragmentos Fab del espacio bacteriano periplásmico por técnicas de choque osmótico.

Sí un anticuerpo o un dominio de enlace de antígeno ha formado cuerpos de inclusión, se enlazan a menudo a las membranas celulares interna y/o externa y se encontrarán así principalmente en el material peletizado después de la centrifugación. El material peletizado se puede tratar en extremos de pH o con un agente caotrópico tal como un •M-rifriffiñSfa.. i . - « ti-tJ .- — detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a un pH alcalino, o tris carboxietil fosfina a un pH ácido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El agente de enlace selectivo soluble se puede después analizar usando electroforesis de gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar un anticuerpo solubilizado o un dominio de enlace de antígeno, el aislamiento se puede llevar a cabo usando métodos estándar tales como aquellos abajo establecidos en Marston et al. (Meth Enz., 182:264-275 (1990)). En algunos casos, un anticuerpo o un domino de enlace de antígeno no puede ser biológicamente activo con el aislamiento. Se pueden usar diversos métodos para el "repliegue" o la conversión del polipéptido a su estructura terciaria y generar unión de disulfuro, para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen la exposición del polipéptido solubilizado a un pH usualmente arriba de 7 y en presencia de una concentración particular de caótropo. La selección del caótropo es muy similar a las selecciones usadas para solubilización de cuerpos de inclusión, pero usualmente el caótropo se usa a una concentración inferior y no es necesariamente el mismo que los caótropos usados para las solubilizaciones . En la mayoría de los casos, la solución de repliegue/oxidación .._--*_ también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial particular de óxido reducción, permitiendo que el mezclado del disulfuro suceda en la formación de los puentes de cisteína de las proteínas. Algunos de los acoplamientos comúnmente usados de óxido reducción incluyen cisteína/cistamina, glutation (GSH) / ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT, y 2 -mercaptoetanol (bME) /ditio-b (ME) . En muchos casos se puede usar un cosolvente o se puede necesitar incrementar la eficiencia del repliegue y los reactivos más comunes usados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares. Los anticuerpos y los dominios de enlace del antígeno de la invención, se pueden también preparar por métodos de síntesis química (tal como la síntesis de péptidos en base sólida) usando técnicas conocidas en el arte tales como aquellas establecidas por Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc, 85:2149 [1963]), Houghten et al. (Proc Nati Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), y Stewart and Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL [1984]) . Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en la terminación de amino. Los anticuerpos químicamente sintetizados y los dominios de enlace de -^-j .- -------.fe-? ... -.-.,,s ^. -a-*^-^ - --»..-- - -.,-*.«--.-, , .'- -.-' -.-.-* --._.-;A- -------KiL i.-.. antígenos se pueden oxidar usando métodos establecidos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Los anticuerpos así preparados, conservarán al menos una actividad biológica asociada con un anticuerpo anti-OPGbp nativo o producido recombinantemente o un dominio de enlace de antígeno. Ensayos para los agentes de enlace selectivo de OPGbp Los métodos de separación para identificar a los agentes de enlace selectivos que inhiben parcial o completamente al menos una actividad biológica de OPGbp se proporcionan por la invención. La inhibición de la actividad biológica de OPGbp incluye, pero no se limita a, inhibir el enlace de OPGbp con su receptor similar, ODAR, inhibir la simulación de la formación de osteoclastos in vitro o in vivo por OPGbp, y/o inhibir la inversión del hueso o la resorción del hueso mediada por OPGbp. Los agentes de enlaces selectivos en la invención incluyen anticuerpos anti-OPGbp y fragmentos, variantes, derivados y fusión de los mismos, péptidos, compuestos péptido miméticos o compuestos organomiméticos . Los métodos de separación por exclusión para identificar agentes de enlace selectivos, que pueden inhibir parcial o completamente, una actividad biológica de OPGbp pueden incluir ensayos in vitro o in vivo. Los ensayos in vitro incluyen aquellos que detectan el enlace * .4i.-t--L-.-i---. de OPGbp a ODAR y se pueden usar para separar por exclusión agentes de enlace selectivo de OPGbp para su capacidad de incrementar o disminuir la tasa o grado de enlace de OPGbp a ODAR. En un tipo de ensayo, un 5 polipéptido OPGbp, preferiblemente una forma soluble de OPGbp tal como un dominio extracelular, se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, perlas de agarosa o de acrílico) y se agrega el polipéptido ODAR en presencia o ausencia de un agente de enlace selectivo de OPGbp. El grado de enlace de OPGbp y ODAR con o sin un agente de enlace selectivo presente se mide. Se puede detectar el enlace mediante por ejemplo, etiquetado radioactivo, etiquetado fluorescente o reacción enzimática. Alternativamente, la reacción de enlace se puede llevar a cabo usando un sistema de vector de resonancia de plasmón de superficie tal como el sistema de ensayo BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Las reacciones de enlace se pueden llevar a cabo según el protocolo del fabricante. Los ensayos in vitro, tales como aquellos descritos arriba se pueden usar ventajosamente para separar por exclusión números crecientemente grandes de agentes de enlace selectivos para efectos en el enlace de OPGbp a ODAR. Los ensayos se puede automatizar para separar compuestos generados en el despliegue de fagos, colecciones de síntesis química y de péptidos sintéticos. -,j .fl|f¡fea¡J a^i ¡fí j¡¡ Los agentes de enlace selectivos que aumentan o disminuyen el enlace de OPBbp a ODAR, también se pueden separar por exclusión en cultivo de células usando células y líneas celulares que expresan al polipéptido. Las 5 células y líneas celulares se pueden obtener de cualquier mamífero, pero estarán preferiblemente de fuentes humanas o de otros primates, caninos o roedores. Como un ejemplo, el enlace de OPGbp a las células que expresan ODAR en la superficie, se evalúa en presencia o ausencia de agentes de enlace selectivos, y el grado de enlace se puede determinar por ejemplo, por citometría de flujo usando un anticuerpo biotinilado a OPGbp. Los ensayos de actividad in vitro también se pueden usar para identificar agentes de enlace selectivos que inhiben la actividad OPGbp. Ejemplos de los ensayos incluyen estimulación del crecimiento de las células y proliferación que son dependientes de OPGbp y de la formación de osteoclastos mediada por OPGbp de células de la médula ósea, lo último se describe en el ejemplo 1 de la presente solicitud. Los ensayos in vivo, también están disponibles para determinar si un agente de enlace selectivo es capaz de disminuir o inhibir el retorno de hueso y/o la resorción de hueso. La resorción de hueso se puede incrementar en animales por una diversidad de métodos, incluyendo ri-_-_-_-l,i ;... j, I.Í.-1.--. . -»...».. ... . . -.>- ..-...-l-Jß-.'-J-i- • . --» .»»-— «-».-..._ 4. --«-té ovarioectomía y la administración de agentes pro-resorción tales como OPGbp o IL-1. Ver WO 97/23614 Y WO 98/46751. Los efectos de los inhibidores OPG en la resorción de hueso en pacientes humanos, se puede medir por una diversidad de métodos conocidos tal como absorciometría simple (SPA) , absorciometría de fotón dual (DPA) , absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA) , tomografía computarizada cuantitativa (QCT) , y ultrasonografía (Ver Johnston et al. in Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism, 2ad ed. , M.J. Favus, ed. Raven Press pp. 137-146) . El retorno y resorición ed hueso se puede también determinar al medir los cambios en ciertos marcadores bioquímicos, tales como osteocalcina de suero, fosfatasa alcalina de suero, péptidos de extensión del procolágeno de suero, telopéptido de colágeno en la terminación N o en la terminación C, de suero o urinario, calcio urinario, hidroxiprolina y piridinolina urinaria y desoxipiridinolina. Se reconoce generalmente que una disminución en los niveles de los marcadores bioquímicos antes mencionados, indica que la resorción del hueso se disminuye y se reduce la pérdida de masa ósea. Alternativamente, los efectos en la resorción del hueso se pueden también determinar al medir un cambio en la resistencia mecánica del hueso, en particular, el aJ-,.,i <-i. üt-l->- „-«--«&•- •<= ,.-»-....-... incremento en la resistencia torsional (torcido) del hueso . Para aplicaciones de diagnóstico en ciertas modalidades, los agentes de enlace selectivos de OPGbp, tales como los anticuerpos y dominios de enlace de antígenos de los mismos, se etiquetarán típicamente con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 15I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o peroxidasa de raíz de rábano. Bayert et al., Meth. Enz . , 184: 138-163 (1990) . Los agentes de enlace selectivos de la invención, se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tales como radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivos, ensayos intercalados directos e indirectos (ELISA) , y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antiboidies: A Manual of Techniques, pp. 147- 158 (CRC Press, 1987) , para la detección y cuantificación de polipéptidos OPGbp. Los anticuerpos se enlazarán a los t,.j,t«-,- -Í-—- -ÍS---.- A .,----polipéptidos OPGbp con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea. Los agentes de enlace selectivos de la invención también son útiles para la formación de imágenes in vivo, en donde por ejemplo, un agente de enlace selectivo etiquetado con una porción detectable, se administra en el torrente sanguíneo, y la presencia y ubicación del anticuerpo etiquetado en el huésped se ensaya. El agente se puede etiquetar con cualquier porción que sea detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética, radiología, u otros medios de detección conocidos en el arte. La invención también se refiere a un kit que comprende un agente de enlace selectivo de OPGbp, tal como un anticuerpo o un dominio de enlace de antígeno, y otros reactivos útiles para la detección de niveles de OPGbp en muestras biológicas. Tales reactivos pueden incluir una actividad secundaria, una etiqueta detectable, suero de bloqueo, muestras de control negativas y positivas y reactivos de detección. Usos Terapéuticos de los agentes de enlace selectivos de OPGbp Los agentes de enlace selectivos de la invención, se pueden usar como terapéuticos. Los agentes de enlace selectivos terapéuticos pueden ser agonistas o antagonistas de OPGbp, y en una modalidad, son anticuerpos antagonistas anti- OPGbp que inhiben al menos una de las actividades biológicas de un polipéptido OPGbp in vitro o in vivo. Por ejemplo, un antagonista de OPGbp, inhibirá el enlace de OPGbp al ODAR por al menos alrededor de 100 veces, o alrededor de 1000 veces; o más de alrededor de 1000 veces. Alternativamente, un antagonista OPGbp inhibirá la formación de osteoclastos in vitro como se indica por un IC50 mesurable (una concentración que da un 50% de inhibición) en un ensayo de médula ósea tal como aquel descrito en el Ejemplo 1. Alternativamente, un antagonista OPGbp disminuirá los marcadores de retorno de hueso por al menos 20%, o al menos 50% en comparación con los niveles de la línea base. Los agentes de enlace selectivos antagonistas de OPGbp (tales como los anticuerpos) se identifican por ensayos de separación por exclusión aquí descritos. Los antagonistas OPGbp, tales como los anticuerpos antagonistas anti- OPGbp y los dominios de enlace de antígenos, se pueden usar para prevenir o tratar enfermedades del hueso, caracterizadas por la pérdida de masa ósea, o por el reemplazo de hueso estructuralmente normal con hueso estructuralmente anormal . Los antagonistas OPGbp se pueden administrar a un animal que tiene pérdida de masa ósea o es susceptible a tener pérdida de masa ósea que resulta de cualquier de los siguientes padecimientos: osteoporosis, tal como osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (hieprtiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing 5 y acromegalia) , formas congénitas y hereditarias de osteoporosis (osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menke y síndrome de Riley-Day) , y osteoporosis debida a la inmovilización de extremidades; osteomielitis, o una lesión infecciosa en el hueso, que conduce a la pérdida de masa ósea; hipercalcemia que resulta de tumores sólidos (pecho, pulmón, riñon) y malignidades hematológicas (mieloma múltiple, linfoma y leucemia) , hipercalcemia idiopática e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y padecimientos de la función renal; 15 osteopenia posterior a la cirugía, inducida por administración de esteroides, y asociada con padecimientos del intestino grueso y delgado y con enfermedades renales y hepáticas crónicas, o muerte celular ósea, asociada con lesión traumática o necrosis no traumática asociada con enfermedad de Gaucher, anemia de células anormales de los glóbulos rojos, lupus eritematoso sistémico y otras condiciones, pérdida de masa ósea debido a artritis reumatoide, pérdida periodontal de masa ósea, osteoartritis, ablandamiento prostético y metástasis osteolítica. Los antagonistas OPGbp se pueden también usar para prevenir o tratar ciertas padecimientos de los huesos que se caracterizan por el reemplazo de hueso sólido estructuralmente con hueso incompetente estructuralmente desorganizado, tal como la enfermedad de Paget del hueso (osteítis deformans) en adultos y jóvenes; hiperparatiroidismo, en padecimientos congénitos del hueso tales como displasia fibrosa, y en metástasis de hueso osteoesclerótica . En una modalidad de la invención, los antagonistas OPGbp se usan ventajosamente para tratar la pérdida de masa ósea que resulta de la destrucción osteolítica de hueso provocada por tumores metastáticos o malignos. Los polipéptidos OPG de la invención se pueden usar para tratar la pérdida de masa ósea asociada con cánceres de pecho, próstata, tiroides, pulmón, esófago, recto, vejiga, cervical, de los ovarios y del hígado, así como cáncer del tracto gastrointestinal . También se incluye la pérdida de masa ósea asociada con ciertas malignidades hematológicas tales como mieloma múltiple y linfomas tales como la enfermedad de Hodgkin. Los antagonistas OPGbp de la invención, que incluyen anticuerpos antagonistas y dominios de enlace de antígenos, se administran solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, en particular, en combinación con otros agentes para terapia de cáncer. Tales agentes « &£á^ ^£~ &¡a incluyen generalmente terapia de radiación o quimioterapia. La quimioterapia puede involucrar el tratamiento con uno o más de los siguientes: antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorubicina, 5- 5 fluorouracilo y otros fármacos conocidos por el trabajador experto. En una modalidad, el agente de terapia para el cáncer es el antagonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) , preferiblemente un antagonista de péptidos. Más preferiblemente, un 10 antagonista de LHRH es un decapéptido que comprende la siguiente estructura: A-B-C-D-E-F-G-H-I-J en donde A es piro-glu, Ac-D-Nal, Ac-D-Qal; Ac-Sar, o Ac-D- 15 Pal; B es His o 4 -Cl -D-Phe; C es Trp; D-Pal, D-Nal, L-Nal-D-Pal (N-O) , o D-Trp; D es Ser; E es N-Me-Ala, Tyr, N-Me-Tyr, Ser, Lys(iPr), 4-C1- 20 Phe, His, Asn, Met, Ala, Arg o lie; F es x y *TY 25 J»^JJ»fi«----l--------i-----Í---^-' * " . -.-?.-fc-u-? -. ma------- , t -—..----,-,.- 1» - - ---.<-----»-.-.•-. -.-,*.-. . ~~ •*"" -. ------ «-"'•» en donde R y X son independientemente, H y alquilo, e Y comprende una entidad polar pequeña. G es Leu o Trp; H es Lys(iPr), Gln, Met o Arg; I es Pro; y J es Gly-NH2 o D-Ala-NH2; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, un antagonista LHRH comprende el péptido: N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-FD-Asn-Leu- Lys (iPr) -Pro-D-Ala-NH2. Las abreviaturas y convenciones estándar se usan en la presente y se abrevian los siguientes residuos y porciones no estándar como siguen: Nal 3- (2-naftil)alaninil 4-Cl-Phe (4' -clorofenil) alaninil Pal 3- (3 '-piridil) alaninil Pal (N-O) 3 - (3 ' -piridina-N-óxido) alaninil IPr-Lys N-epsilon-2 -propil -lisinil Qal 3- (2' -quinolinil) alaninil Las formas alternativas de los decapéptidos del antagonista LHRH también se abarcan por la invención. Tales decapéptidos se describen en la patente de E.U.A. No. 5,843,901 que se incorpora en la presente como referencia.

También se incluyen combinaciones de antagonistas OPGbp con anticuerpos que se enlazan a células de tumor e inducen un efecto citotóxico y/o citoestático en el crecimiento del tumor. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan a proteínas de superficie celular Her2 , CDC20, CDC33, glicoproteína de tipo mucina y receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR) presente en las células de tumor e inducen un efecto citoestático y/o citotóxico en las células de tumor que despliegan estas proteínas. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen HERCEPTIN para el tratamiento del cáncer de pecho y RITUXAN para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin. También se incluyen como agentes de terapia de cáncer los polipéptidos que inducen selectivamente la apoptosis en células de tumor, tal como el polipéptido TRAIL relacionado con TNF. Los antagonistas OPGbp se pueden administrar previo a, concurrente con, o posterior al tratamiento con un agente de terapia del cáncer. Los antagonistas OPGbp se pueden administrar profilácticamente para evitar o mitigar el comienzo de la pérdida de masa ósea por cáncer metastático o se pueden dar para el tratamiento de una condición existente de pérdida de masa ósea debida a la metástasis. Los antagonistas OPGbp de la invención, se pueden usar para evitar y/o tratar el crecimiento de células de 1 tumor en el hueso. El cáncer que forma metástasis en el hueso se puede esparcir fácilmente ya que las células de tumor estimulan los osteoclastos para resorber la matriz interna del hueso. El tratamiento con un antagonista de OPGbp mantendrá la densidad del hueso al inhibir la resorción y disminuir la probabilidad de que se esparzan las células de tumor a través del esqueleto. Cualquier cáncer que forme metástasis con el hueso se puede evitar y/o tratar con un antagonista OPGbp. En una modalidad, el mieloma múltiple se puede evitar y/o tratar con un antagonista OPGbp, tal como un anticuerpo. El mieloma múltiple se localiza en el hueso y los pacientes afectados muestran típicamente una pérdida de masa ósea debida a una activación creciente de osteoclastos en las regiones localizadas. Las células de mieloma producen directa o indirectamente OPGbp, que a su vez activa los osteoclastos que resultan de una lisis local de hueso que rodea a las células de mieloma alojadas en espacios de la médula ósea. Los osteoclastos normales adyacentes a la célula de mieloma a su vez producen IL-6, lo que conduce al crecimiento y proliferación de las células de mieloma. Las células de mieloma se expanden de una forma clonal y ocupan espacios de hueso que se crean por la resorción inadecuada del hueso. El tratamiento de un animal con un antagonista OPGbp bloquea la activación _«--_-------. un ?*-* ~**.±ji*.- * l?/?íilifak .** ^ . L* A i- i r--?.tfr -üi - de osteoclastos, lo que a su vez conduce a una disminución en la producción de IL-6 por osteoclastos, y una supresión de todo el crecimiento y/o proliferación del mieloma. Los antagonistas OPGbp se pueden usar solos para el tratamiento de las condiciones antes referenciadas resultan de una pérdida de masa ósea o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente promotor del crecimiento del hueso (anabólico) o un agente anti-resorción del hueso que incluye factores morfogénicos del hueso designados por BMP-1 al BMP-12, factor-ß del crecimiento de transformación y miembros de la familia TGF-ß, factores del crecimiento de fibroblastos FGF-1 al FGF-10, inhibidores de la interleucin-1 , inhibidores TNFa, hormona paratiroide, prostaglandinas de la serie E, bisfosfonatos y minerales que enriquecen el hueso tales como fluoruro y calcio. Los agentes anabólicos incluyen la hormona paratiroide y el factor de crecimiento del tipo insulina (IGF) , en donde el último agente forma complejos preferiblemente con una proteína de enlace IGF. Las modalidades preferidas también incluyen la combinación de un antagonista OPGbp con un antagonista receptor de la interleucin-1 (IL-1) o un antagonista OPGbp con un receptor soluble TNF, tal como el receptor-1 TNF soluble o receptor-2 TNF soluble. Un antagonista receptor del IL-1 ejemplar se describe en WO89/11540 y un receptor-1 TNF soluble ejemplar se describe en WO 98/01555. Una disminución en la tasa de resorción del hueso puede conducir a la osteoporosis, una condición marcada por una densidad excesiva del hueso. Los agonistas de OPGbp pueden incrementar la formación de osteoclastos y la resorción del hueso y se pueden administrar a un animal que tenga o sea susceptible a una resorción disminuida del hueso, y un incremento anormal en la masa ósea. Composiciones Farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de agentes de enlace selectivo OPGbp están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un agente de enlace selectivo OPGbp tal como un anticuerpo, o un fragmento, variante, derivado o fusión del mismo, en una mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos antagonistas anti-OPGbp que inhiben parcialmente o completamente al menos una actividad biológica del OPGbp en una mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los anticuerpos estarán suficientemente purificados para la administración a un animal .

^^^ Los agentes farmacéuticamente aceptables para usarse en las composiciones de la invención incluyen portadores, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservadores, colorantes, saborizantes y de agentes de dilución, agentes emulsificantes, agentes de suspensión, solventes, rellenadores, agentes de volumen, amortiguantes, vehículos de entrega, agentes de tonicidad, co-solventes, agentes humectantes, agentes de complejo, agentes amortiguantes, antimicrobianos y tensoactivos, como son bien conocidos en la técnica. La solución salina amortiguada neutral o la mezcla salina con albúmina de suero, son portadores apropiados ejemplares. También se incluyen en las composiciones antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como Tween, plurónicos o polietilen glicol. También a modo de ejemplo, los agentes apropiados aumentadores de la tonicidad incluyen haluros de metal alcalino (preferiblemente cloruro de sodio o potasio) , manitol, sorbitol y similares. Los conservadores apropiados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y similares. El peróxido de hidrógeno también puede usarse como conservador. Los co-solventes apropiados son, por ejemplo, glicerina, propilen glicol, y polietilen glicol. Los agentes de complejo apropiados son, por ejemplo, cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina o hidroxi-propil-beta-ciclodextrina. Los tensoactivos o agentes humectantes apropiados incluyen esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal y similares. Los amortiguantes pueden ser amortiguantes convencionales tales como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato o Tris-HCl. El amortiguante de acetato puede estar a un pH de alrededor de 4.0-5.5 y el amortiguante Tris puede estar a un pH alrededor de 7.0- 8.5. los agentes farmacéuticos adicionales se exponen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company 1990, las porciones relevantes de las cuales se incorporan por la presente para referencia.

Las composiciones pueden estar en forma líquida o en una forma liofilizada o secada por congelado. Las formas liofilizadas pueden incluir excipientes tales como sacarosa. Las composiciones de la invención son apropiadas para administración parenteral. En modalidades preferidas, las composiciones son apropiadas para inyección o infusión en un animal por cualquier ruta disponible para el trabajador experto, tales como rutas subcutáneas, intravenosas, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal) , intracerebovascular, intramuscular, intraocular, intraarterial , o intralesional . Una formación parenteral típicamente será una solución acuosa isotónica, estéril, libre de pirógenos, que contiene opcionalmente conservadores farmacéuticamente aceptables. La formulación farmacéutica óptima, puede ser fácilmente determinada por alguien experto en la técnica, dependiendo de la ruta pretendida de administración, formato de entrega y dosis deseada. Otras formulaciones también se contemplan por la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc, o la introducción de un agente de enlace selectivo QPGbp (tal como un anticuerpo) en las ¡ja¿ ---i------»---»=«^-^^*^^ -'"'- - **t-^" -.-ft— liposomas. También puede usarse el ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Las composiciones farmacéuticas también incluyen la formación de agentes de 5 enlace selectivos OPGbp (tales como anticuerpos) con el agente, tales como microesferas inyectables, partículas o perlas biodegradables, o liposomas, que se proporcionan para la liberación controlada o sostenida del agente de enlace selectivo que puede después entregarse como una inyección de depósito. Otros medios apropiados para la entrega incluyen dispositivos de entrega implantables. La composición farmacéutica que comprende el agente de enlace selectivo OPGbp (tal como un anticuerpo) puede formularse como un polvo seco para inhalación. Tales soluciones para inhalación pueden también formularse en un propelente licuado para entrega en aerosol. Todavía en otra formulación, las soluciones pueden nebulizarse. También se contempla que ciertas formulaciones que contienen agentes de enlace selectivos OPGbp puedan administrarse oralmente. Las formulaciones administradas de esta manera, pueden formularse con o sin aquellos portadores regularmente usados en la composición de formas de dosis sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación al punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de un agente de enlace selectivo. Los diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de la tableta, y aglutinantes, también pueden emplearse. Otra preparación puede involucrar una cantidad efectiva de un agente de enlace selectivo OPGbp en una mezcla con excipientes no tóxicos que son apropiados para la manufactura de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en forma de dosis unitaria. Los excipientes apropiados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de enlace, tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Formulaciones adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que involucran agentes de enlace selectivos OPGbp en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de entrega sostenida o controlada, tales como portadores de liposoma, micropartículas o perlas porosas biodegradables e inyecciones de depósito, también son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo Supersaxo y colaboradores, la descripción de micropartículas poliméricas porosas de liberación controlada para la entrega de composiciones farmacéuticas (ver WO 93/15722 (PCT/US93/00829) la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. Con respecto a la manera de administración, la dosis específica puede calcularse de conformidad con el peso corporal, área de superficie corporal o tamaño de órgano. Además, el refinamiento de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento que involucra cada una de las formulaciones arriba mencionadas, se hace de manera rutinaria por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, y está dentro del ámbito de tareas realizadas de manera rutinaria por ellos. Las dosis apropiadas pueden acertarse a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados. Las composiciones farmacéuticas presentes pueden administrarse además por administración pulmonar, ver, por ejemplo, PCT WO94/20069, que describe la entrega pulmonar de proteínas químicamente modificadas, incorporadas en la presente para referencia. Para la entrega pulmonar, el tamaño de partícula debería ser apropiado para la entrega i—.-— — . a- ¡--rf iiiiBiirft * . fu» -V**"* ' al pulmón distal. Por ejemplo, el tamaño de partícula puede ser desde lµm hasta 5 µm, sin embargo, pueden usarse partículas más grandes, por ejemplo, si cada partícula es razonablemente porosa. Alternativamente o adicionalmente, las composiciones pueden administrarse localmente por medio de implantes en el área afectada de la membrana, esponja, u otro material apropiado en el cual se absorbe o encapsula un agente de enlace selectivo OP u OPGbp. Donde se usa un dispositivo de implante, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano apropiado, y la entrega de un agente de enlace selectivo OPGbp puede ser directamente a través del dispositivo por medio de bolos, o por medio de administración continua, o por medio de un catéter usando infusión continua. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en una formulación o preparación de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semi-permeables en forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilacturos (Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L- j—t—._--,!..» .li-.--i.-i.-, i-jtÉgttw ,,*-,-„ ^ j^ig .?á----¿- glutamato (Sidman y colaboradores, Biopoly ers, 22: 547- 556 [1983]), poli (2 -hidroxietil-metacrilato) (Langer y colaboradores, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), acetato de etilen vinilo, o ácido poli-D(-) -3-hidroxibutírico. Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualesquiera de varias métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Eppstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; y EP 143,949. Los agentes de enlace selectivos OPGbp, tales como anticuerpos y fragmentos, variantes, derivados y fusiones de los mismos, pueden emplearse solos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas comprenden, separadamente o junto, un antagonista de OPGbp y un antagonista del receptor de interleucin-1, o un antagonista OPGbp y un receptor- 1 del TNF soluble, o un antagonista OPGbp y un receptor-2 del TNF soluble puede usarse para el tratamiento de la artritis reumatoide. Además, las composiciones que comprende separadamente o junto un antagonista OPGbp y un agente de terapia de cáncer, pueden usarse para el tratamiento de cáncer y pérdida asociada de masa ósea. Otras combinaciones con un antagonista o agonista de OPGbp, son posibles dependiendo de la condición a tratarse. Puede desearse en algunos casos, usar una composición farmacéutica que comprende composiciones de agente de enlace selectivo OPGbp de una manera ex vivo. Aquí, las células, tejidos, u órganos que se remueven del paciente, se exponen a composiciones farmacéuticas que comprende agentes de enlace selectivos OPGbp después de lo cual las células, tejidos y/o órganos se implantan posteriormente de regreso al paciente. En otros casos, una composición que comprende un agente de enlace selectivo OPGbp puede entregarse a través del implante en paciente de ciertas células que se han producido por ingeniería genética, con el uso de métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos, agentes de enlace selectivos, fragmentos, variantes, o derivados. Tales células pueden ser células de animal o humano, y pueden derivarse del propio paciente o tejido de otra fuente, ya sea humano o no humano. Opcionalmente, las células pueden inmortalizarse. Sin embargo, con objeto de reducir la oportunidad de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células se encapsulen para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente cercados o membranas biocompatibles, semi- permeables que permiten la liberación de los productos de proteína, pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes. Los métodos usados para la encapsulación de membrana de células, son familiares para los técnicos expertos, y la preparación de células encapsuladas y su implante en los pacientes, puede realizarse sin experimentación indebida. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,892,538; 5,011,472; y 5,106,627. Un sistema para el encapsulado de células vivas se describe en la PCT WO 91/10425 (Aebischer y colaboradores) . Las técnicas para formular una variedad de otros medios de entrega sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, partículas o perlas biodegradables, también son conocidas por aquellos en la técnica, y se describen. Las células, con o sin encapsulación, pueden implantarse en tejidos u órganos corporales apropiados del paciente. Una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de una composición farmacéutica, que comprende un agente de enlace selectivo OPGbp (tal como un anticuerpo anti-OPGbp, o fragmento, variante, derivado, y fusión de los mismos) dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la cual se usa la composición, la vía de administración, y la condición -á-—.-. fc -—-a __^M¿fe.^M ¡---del sujeto. Los anticuerpos antagonistas o dominios de enlace de antígeno de la invención, se administran en una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva para prevenir y/o tratar la pérdida ósea asociada con la enfermedad metastática ósea. Una "cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva" de un anticuerpo de antagonista OPGbp es tal cantidad que reduce la relación y/o extensión de pérdida de masa ósea o previene la pérdida de masa ósea en un sujeto que tiene una masa ósea normal. Los cambios en la masa ósea se detectan por una variedad de métodos conocidos tales como absorciometría de fotón sencilla (SPA) , absorciometría de fotón doble (DPA) , absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA) , tomografía computarizada cuantitativa (QCT) , y ultrasonografía (ver Johnston y colaboradores, en Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism, 2da edición, M.J. Favus, ed. , Raven Press páginas 137-146) . Alguien experto en la técnica puede usar estos métodos para determinar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión OPG. Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede determinarse al medir los cambios en los marcadores bioquímicos para cambios óseos, tales como osteocalcina de suero, fosfatasa alcalina de suero, péptidos de extensión de procolágeno I de suero, telopéptido de colágeno de ^^^-,------.aartfi-n terminal C o terminal N de orina o suero, calcio urinario, hidroxiprolina y piridinolina urinaria y desoxipiridinolina. Generalmente se reconoce que una reducción en los niveles de los marcadores bioquímicos anteriormente mencionados, indica que la resorción ósea se reduce y la pérdida de masa ósea se ha reducido. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión OPG, también puede determinarse al medir un cambio en la fuerza mecánica del hueso, en particular un incremento en la resistencia torsional (de torsión) del hueso. En consecuencia, puede ser necesario para el personal clínico titular la dosis y modificar la ruta de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede estar en el rango desde alrededor de 0.1 µg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. En otras modalidades, la dosis puede estar en el rango desde 1 µg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg; ó 5 µg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg; ó 0.1 µg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg; ó 1 µg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg. Típicamente, el médico clínico administrará la composición hasta una dosis elevada que alcance el efecto deseado. La composición puede, por lo tanto, administrarse como una dosis sencilla, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de un agente de enlace selectivo OPGbp) durante el tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implante o catéter. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se construyen como limitante del alcance de la misma. Ejemplo 1 Reactivos y Ensayos El objetivo de selección utilizado en estos estudios se preparó a partir de la expresión de un ADNc que codifica al OPGbp humano de 140 aminoácidos hasta 317 aminoácidos inclusive como se muestra en la Figura 4 de la PCT W098/46751 en una célula hospedera de CHO y se purifica como sigue. Una columna de Sepharose Q (Pharmacia) se equilibró con tris 20 mM pH 8.5. Se aplicó el medio condicionado que también se había titulado hasta un pH de 8.5, la columna se lavó con el amortiguador Tris, y las proteínas se eluyeron con un gradiente de NaCl 100-600 mM sobre 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían el OPGL se identificaron a través de SDS-PAGE y análisis de manchado Western. Entonces se titularon las fracciones que contenían OPGbp hasta un pH de 4.8 y se aplicaron a una columna Sp (Pharmacia) que se había equilibrado con acetato de sodio 20 mM a un pH 4.8.

Después de lavar, las proteínas se eluyeron con un gradiente de NaCl 0-0.3 M seguido por etapas con NaCl 0.5 M y 1 M. La OPGbp se eluyó con todos los amortiguadores sin embargo, solamente se encontró que las fracciones del gradiente NaCl 0-0.3 M eran activas en bioensayos de estimulación de osteoclastos, in vitro. El rendimiento fue de 40 mg/l. La secuenciación amino-terminal reveló que aproximadamente el 80% de la proteína purificada empezó con el aminoácido 143 de la OPGbp humana mientras que el resto aproximadamente el 20% empezó con el aminoácido 147. El producto final utilizado para las genotecas del fago de selección, están referidas como OPGbp [143-317] , la forma purificada predominante. Los anticuerpos policlonales anti-OPGbp se prepararon como sigue. Tres conejos blancos de Nueva Zelanda (Western Oregon Rabbit Co., Philomath, OR) se inyectaron inicialmente con cantidades iguales del Titulador Hunter Titer Max (CytRx Corp., Atlanta, GA) y OPGbp [143-317] . Se inyectaron 0.2 mgs por conejo. Esto se repitió de cuatro a seis semanas más tarde. Se realizó un sangrado de 50 ml a las siete semanas y una vez por semana posteriormente para un total de seis sangrados. Los anticuerpos se purificaron por afinidad a partir del suero de los conejos inmunizados en una resina de OPGbp como sigue. Tres ml de la resina Actigel Aid (Sterogene) se ¡..JL..... -t-.--j-------A.--i..-a---.--.....1tuaMM^ 1AJ-j--í^4 --»----'- "• — *•* **& & •-<£-***"-' --^a->'-- 3---..-.---.-asaa¿---i. agregaron a una columna de 10 ml (Kontes Flex Colum) y se lavaron con 50 ml de PBS. Tres mgs de OPGbp [143-317] diluidos en 3 ml de PBS se agregaron a la columna Actigel y se agitaron suavemente para mezclarse. Se agregaron entonces 0.6 ml de Cianoborohidruro de Sodio 1 M y la mezcla se agitó entonces durante toda la noche a 4°C. La columna se lavó con 50 ml de Amortiguador de Elusión Pierce Gentle (Pierce) seguido por 15 ml de PBS. Se filtraron para esterilización 50 ml de suero a partir de conejos inmunizados a través de un filtro de 0.45 µm, se agregaron a la columna y la mezcla se agitó durante toda la noche a 4°C. El siguiente día se permitió que los contenidos de la columna se sedimentaran y se drenó la fase líquida. La columna se lavó entonces con 150 ml de PBS hasta un OD280 de 0.002. Se agregó el amortiguador de Elución Pierce Gentle con Acido Acético Glacial, a la columna y se recolectaron fracciones de 1 ml a intervalos de 10 min y se analizaron por OD28o- Las fracciones que contenían la cantidad más alta de material que absorbe OD28o, se conjuntaron y se dializaron contra dos litros de PBS durante 48 horas. Hubo un cambio de amortiguador durante este tiempo. Los ensayos ELISA se realizaron sobre colecciones de fago, eluidas, mediante la colocación de placas de OPGbp [143-317] a 1.5 µg/ml en PBS pH 8.0 durante 2 horas a yit ,_i_-__-S—""*" -----.-..-. -_ij.?a_--it--" «-•-—..... -_a-ifc. —>-- -.... -.«..A -8.-fc.-i-l-.-temperatura ambiente en Inmunoplacas de Nunc Maxisorp en un balancín. Una solución de enjuague de MPBS al 2% (Amortiguador Block) se agregó a las inmunoplacas, se incubaron durante 3 min a temperatura ambiente y se desecharon. El bloqueo se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente con MPBS al 2%. Los lavados se realizaron 5X utilizando TBS-Tween-20 (0.1%) (TBS; Solución Salina Amortiguada con Tris; Tris-HCl 10 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) . Se agregó una titulación de fago utilizando un mínimo de 1010 fago/pozo en Amortiguador de Dilución Conjugado (Lecha Seca Sin Grasa al 0.4% en TBS o, M-TBS al 0.4%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los lavados se realizaron utilizando TBS-Tween-20 (0.1%). Se utilizó el Conjugado de Anticuerpo Monoclonal de peroxidasa de rábano (HRP) , Anti-M13 (Pharmacia Piscataway, NJ) a una dilución de 1/2000 en MTBS al 0.4% durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Los lavados se realizaron 5 veces con TBS-Tween-20 (0.1%). Se agregó 2 , 2 ' -azinobis (3-etilbenztiazolina-ácido sulfónico) (ABTS) (Pierce, Rockford, IL) un substrato colorimétrico para la detección a OD405. Los controles positivos para la detección del huOPG bp [143-317] , colocados en placas, se realizó mediante la adición de OPG [22-194] -Fc, seguido por anti-Fc-fosfatasa alcalina y substrato de para-nitrofenilfenol (pNPP) para la detección.

—- SÉiri----—-• ili-K—i—-i Condiciones PCR y cultivo de 2xTY—AG Se realizó una reacción en cadena, típica de la polimerasa (PCR) en una placa Thermowell de 96 pozos. Cada pozo contenía 20 µl de la mezcla de reacción PCR [2 µl del amortiguador PCR 10X (Gibco BRL Products, Grand Island, NY) , 17.3 µl de agua, 0.2 µl de dNTPs (25 mM) , 0.2 µl del Cebador 870-02, 0.2 µl del Cebador 2182-83 (reservas del cebador 10 pmol/µl para amplificación del inserto), 0.1 µl de polimerasa Taq] . Las colonias individuales se recogieron y se resuspendieron en un pozo y se recubrieron con 20 µl de aceite mineral, se sellaron, luego se colocaron en la máquina PCR. 870-02 5' -CCG ACT TTG CAC CTA GTT (SEC. ID NO: 22) 2182-83 5' -TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT (SEC. ID NO: 23) Un duplicado de placa para la preparación de los cultivos se generó mediante la transferencia de la misma colonia recogida a la posición del pozo correspondiente en un segundo bloque de 96 pozos. Los cultivos se hicieron crecer en 0.3 a 1.0 ml 2xTY-AG (caldo 2xTY: (16 g de bacto-triptona/litro de agua, 10 g de Extracto de levadura/litro de agua, 5 g de NaCl/litro de agua) , que contenía 100 µg/ml de ampicilina y glucosa al 2%) . El bloque se selló con una cinta permeable al aire, se centrifugó a 1000 rpm durante 2 minutos para llevar hacia .. --¡i-—i-- fijt'ifi- 1 i? ir?-f^-"- j:> - --_--l abajo el líquido, y a 37°C en la incubadora de 300 a 350 rpm durante toda la noche para formar el cultivo. Los cultivos formados durante la noche recibieron 150 µl/pozo de glicerol al 50%, se mezclaron, y se congelaron a -80°C. Las condiciones de reacción de PCR fueron de 40 ciclos de 45 seg. a 90°C, 45 seg a 55°C, 1.5 min a 72°C, seguidos por una extensión de 72°C durante 10 min. Después de que la reacción PCR se completó, se hicieron correr 2.5 a 4.0 µl sobre geles de agarosa al 1% de 25 pozos con 0.5 µl/ml de bromuro de etidio, usando estándares de peso molecular de ADN (Gibco BRL Products, Grand Island, NY, o Stratagene, La Jolla, CA) durante 90 min a 90 voltios. Se consideraron solamente insertos de longitud completa mayores de 1.6 kb. Una alícuota de 16 µl de las reacciones PCR se digirió con BstNI durante 3 horas a 60°C con una mezcla de digestión, total, de 30 µl, que contenía 10 µl de agua, 3 µl del Amortiguador 2 REact 10X (GIBCO BRL Products), 0.3 µl de BSA (10 mg/ml), 0.7 µl de BstNI (GIBCO; 10,000 unidades/ml) . Las muestras digeridas se hicieron correr sobre geles de agarosa al 3% de 25 pozos durante 3.5 horas a 80 voltios. Ensayo de células RAW Las concentraciones variantes de muestras de prueba Fab se mezclaron con una cantidad constante de OPGbp [143- ttf-l. I I [Ü^- t-J-fctt*fe-.-,-.- ^-<^---th---«i--*-' .jM^^ --^-------- . „l-..---.--»l 317] y se incubaron durante al menos una hora a temperatura ambiente en DMEM, suero de bovino fetal al 10% y lx de mezcla de glutamina-penicilina-estreptomicina. Las concentraciones de las muestras de Fab y OPGbp se indicaron para cada experimento. Después de la incubación, la mezcla se agregó a 2 x 104 RAW 267.7 células/pozo (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas VA, No. de Acceso TIB-71) en una placa de cultivo de tejido, de fondo plano, de 96 pozos. Las células RAW se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal al 10% y lx de glutamina-penicilina-estreptomicina. Después de tres días a 37°C y C02 5%, el medio se aspiró de los pozos y las células se tiñeron para la Prueba de Fosfatasa Acida Resistente al Tartrato (TRAP) , un marcador de diferenciación de osteoclastos, mediante la adición de 100 µl por pozo de amortiguador de citrato 0.1M con Tritón X-100 al 0.1%, la incubación se realizó durante cinco minutos a temperatura ambiente, la adición del substrato de para-nitrofenilfosfato (pNPP) y tartrato en amortiguador de citrato que contiene Tritón X-100 (la concentración del substrato fue de 20 mM de pNPP y 335 mM de tartrato) y la incubación por incubación cinco minutos adicionales a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de NaOH a una concentración de 0.05M. La fosfatasa acida convierte el substrato de pNPP a para-nitrofenol que se detectan mediante absorbancia a 405 nm. El cambio en la absorbancia a 405 nm se gráfico como una función logarítmica de la dosis tanto para los controles como para las muestras de prueba. Se calculo un análisis de la Varianza (ANOVA) y la potencia relativa con límites de confianza del 95%. Los controles positivos incluyeron concentraciones variantes de la preparación de la proteína de fusión OPG [22-194] -Fc o un anticuerpo policlonal anti-OPGbp, preincubada con OPGbp [143-317] e incubada con células RAW64.7 como se describió arriba. Ensayo de la Médula Osea Se realizó un ensayo de la médula ósea, murina, para la formación de osteoclastos esencialmente como se describió en Lacey et al. (Cell 93, 165-176 (1998)) y Kong et al. (Nature 397, 315-323 (1999)). De manera breve, el ensayo es una modificación del ensayo de cocultivo de la médula ósea, murina, descrita en la PCT W097/23614 en la cual se cultivaron células de la médula ósea, murina, no adherentes, en un medio por aproximadamente siete días en la presencia de OPGbp (143-317) pero sin la adición de una línea de células, estromales ST2 , 1,25 (OH) 2 vitamina D3 y dexametsona. Se detectaron las células que tenían un fenotipo de osteoclasto mediante la aparición de células positivas TRAP. Se midió la actividad TRAP en solución o mediante teñido histoquímico. -ji-..-áaaiA-i-'.Ít. -,- ?ctaiJ i? Para la detección de la actividad TRAP en solución, las células de la médula ósea de adulto, se lisaron en Amortiguador de Citrato 100 M (Sigma, Cat # 91-5) + Tritón X-100 al 0.1%, pH 5.0, 3-5 min. Se agregaron pNPP 20 mM, Tartrato 80 mM, y Citrato 100 mM + Tritón X-100 al 0.1%, ' pH 5.0 y se incubaron a temperatura ambiente, 3-5 min, y se midieron a 405 nm después de detener la reacción con 50 µl de NaOH 500 mM/pozo. Una respuesta positiva fue una disminución dependiente de la concentración en la absorbancia a 405 nm desde aproximadamente 2.0 OD hasta aproximadamente 0.6 OD. Para el teñido histoquímico, las células se fijaron en una solución fijadora a base de formaldehído, luego se tiñeron con solución Fast Garnet GBC (2-metil-4- [ (2-metilfenil) azo] -bencendiazonio) + solución de fosfato Naphthol AS-BI (C?8H?5BrN06P) + Solución de Acetato + Solución de Tartrato, se incubó 1 hora a 37°C, luego se enjuagó, se secó, y se evaluó microscópicamente. Una célula que fue positiva al TRAP y que contenía tres o más núcleos (MNC positiva al TRAP) se consideró como una célula osteoclástica. Ejemplo 2 Selección de una Genoteca Fab Humana Una genoteca de aproximadamente 4 x 1010 fragmentos Fab, humanos, únicos, preparada en el bacteriófago M13 se .y, -_«--- 1-..J-- ... obtuvo a partir de Target Quest, NV (Amsterdam, Holanda) . Los procedimientos generales para la construcción y selección de genotecas Fab, humanas, se describe en de Haard et al. (Advanced Drug Delivery Reviews 31, 5-31 (1998); J. Biol. Chem. 274, 18218-18230 (1999)). La genoteca se seleccionó para fragmentos Fab que se enlazaron al OPGbp [143-317] mediante los siguientes procedimientos . Formación directa en placas de la fase sólida La OPGbp [143-317] prepara como se describió arriba se inmovilizó en una fase sólida utilizando inmunotubos Nunc Maxisorb (12 x 75 mM, capacidad de 5 ml) mediante la formación de placas directamente en la fase sólida a una concentración de proteína de 1.5 µg/ml en TBS, pH 8.0 (el TBS fue la solución salina amortiguada con Tris: Tris 10 mM (pH 7.5), NaCl 150 mM) a temperatura ambiente durante 2 horas. Estas condiciones permitieron que el 80% de la formación de placas, máxima, de la fase sólida en 2 horas (máximo en 2 horas estaba aún sin saturación) mientras que retenía las capacidades de enlace o aglutinamiento al OPG [22-194] -Fc. Después de las 2 horas de incubación, el tubo se lavó tres veces con PBS. El objetivo colocado en placas se bloqueó mediante el llenado del inmunotubo con leche seca sin grasa al 2%, (Marvel o Carnation) en PBS (MPBS) durante 1 a 4 horas a temperatura ambiente, se lavó dos L,—.-*.- l ta¡-li—fc..i ...-.-._-.- .m.-»-'^«-*'J>.'-.. -<a,-,l^---. .-•i**.-, i . --a-f veces cada una en PBS-Tween 20 (0.1%) y PBS. El fago concentrado con PEG (aproximadamente 1013) se pre-bloqueó en MPBS al 2% para absorber el fago de aglutinamiento a la leche antes de la exposición del fago al objetivo de fase sólida. El fago pre-bloqueado se incubó en 4 ml con el objetivo conformado en placas a temperatura ambiente durante 2 horas, (haciéndolo girar durante 30 min extremo sobre extremo y dejándolo reposar 90 min) . Los contenidos enlazados al tubo se lavaron 20 veces con PBS-Tween 20 (0.1%) y 2 veces con PBS para remover el fago no enlazado y para reducir el enlace no específico. El fago se eluyó de la fase sólida mediante una elución de fago, total, de diez minutos, con 1 ml de trietilamina (TEA) 100 mM pH 12, haciendo girar el tubo de extremo a extremo, seguido por la neutralización con 0.5 ml de Tris-HCl 1 m pH 7.4. Alternativamente, los aglutinantes específicos del fago se recuperaron mediante elución con 1 ml de ya sea 1 uM de OPGbp [143-317] ó 1 uM de OPG [22-194] -Fc en MPBS al 0.4%, pH 8.0 ó pH 7.4, respectivamente. Los fagos eluidos (aglutinantes) se titularon en la cepa TGl de E. coli (Pharmacia, Piscataway, NJ.). La titulación se realizó en duplicado mediante una modificación del método de "Dilución por Rastreo" (Huycke et al. BioTechniques 23, 648-650 (1997)) mediante la dilución de 10 µl del fago en caldo 2xTY en 90 ul de fase logarítmica (A600 0.2 a 1.0 ODs) células TGl, mezcladas e incubadas 20-30 minutos a temperatura ambiente. Diez µl se hicieron correr horizontalmente en un carril, 6 carriles por placa de petri cuadrada de 2xTY-AG (caldo 2xTY, que 5 contiene glucosa al 2%, 100 µl/ml de ampicilina y 15 g/litro de agar) , y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Los fagos eluidos (aglutinantes) se amplificaron a través de infección bacteriana en células TGl. Veinticinco 0 ml del caldo 2xTY se inocularon con células TGl de E. coli y se hicieron crecer a 30°C durante más de 12 horas, 270 rpm. El cultivo durante toda la noche se inoculó con 1:100 en 50 ml del caldo 2xTY, y se hicieron crecer aproximadamente 1.5 horas, 270 rpm a un OD600 de 0.5. Para 5 la amplificación de los fagos seleccionados, se agregaron 5 volúmenes de células TGl de E. coli , exponenciales, 4 volúmenes del caldo 2xTY y 1 volumen de los fagos eluidos (neutralizados) conjuntamente y se incubaron en un baño de agua a 37°C durante 30 min. Para reducir el volumen de la 0 formación de placas las células se centrifugaron a 4,000 rpm y las pelotillas se resuspendieron en caldo 2xTY (100 ug/ml de ampicilina, glucosa al 2%) . En la primera ronda de selección, la muestra se colocó sobre dos a cuatro placas de 16 cm2 de 2x TY-AG (caldo 2xTY, que contiene 5 glucosa al 2%, 100 ug/ml de ampicilina y 15 g de agar) -_<--fe-, ---.„,A...^---> _^^ ...^|¿ JM-l^---¿->i-t^*^**^^'*<---> >11ÍI rl I td- --y--». para mantener la diversidad. Para las rondas posteriores de selección, una placa fue suficiente. Las placas se incubaron durante toda la noche a 30°C. Después del crecimiento durante toda la noche, se agregaron 5 ml de 2xTY-AG a cada placa grande, y las bacterias se rasparon con un raspador estéril. Después de la resuspensión completa y la concentración haciéndolas girar a 4,000 rpm, 10 min, una muestra concentrada se transfirió a un Criotubo Nunc. Se agregó glicerol estéril hasta una concentración final del 15% y se almacenó inmediatamente a -70°C. Las células amplificadas se resuspendieron en caldo 2x TY-AG a aproximadamente 0.1 OD y se hicieron crecer durante 1.5-2.5 horas a 37°C, 270 rpm, a un OD600 de 0.5 y se transfirieron (5 ml) a un tubo Falcon de 50 ml que contenía una cantidad apropiada de fago M13K07 de ayuda (Gibco BRL Products, Grand Island, NY) , con una proporción de 20 a 1 de fago a bacteria. La mezcla de fago y bacteria se incubó a 37°C durante 30 min sin agitación seguido por centrifugación durante 15 min, 3,700 rpm. El sobrenadante se removió y las pelotillas bacterianas se resuspendieron en 25 ml de 2xTY-AK (100 ug/ml de ampicilina, 25 ug/ml de canamicina) y se transfirieron a un matraz de 250 ml para incubación durante toda la noche a 30°C con agitación a 270 rpm. El siguiente día, el cultivo se centrifugó en un tubo Falcon de 50 ml durante 20 min a 3,700 rpm para formar pelotillas de las bacterias. Al sobrenadante, se agregó 1/5 del volumen de una solución de polietilenglicol (PEG) (PEG 8000 al 20%, NaCl 2.5M) y se mantuvo en hielo durante al menos 1 hora. Los fagos se formaron en pelotillas durante 20 min, 3,700 rpm a 4°C. El sobrenadante se desechó y las pelotillas se resuspendieron en aproximadamente 1.0 ml de PBS estéril y se transfirieron a un tubo eppendorf de 1.5 ml . La muestra se microcentrifugó durante 2 min. Aproximadamente 14,000 rpm para remover las bacterias restantes y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. La precipitación de PEG se repitió Los fagos precipitados con PEG concentrado, se utilizaron en la selección o ensayos de selección. El rendimiento estándar fue de aproximadamente 1-5 x 1013 fagos de 25 ml de cultivo. Para un almacenamiento más largo, se agregó glicerol a los fagos (concentración final 15%) y los fagos se almacenaron a -70°C. Este procedimiento describe una ronda de selección, que comprende las etapas de enlace o aglutinamiento, elución y amplificación. Típicamente, de tres a cinco rondas de selección se realizaron para obtener una colección de fagos eluidos que se unieron a la OPGbp [143-317] en un ensayo ELISA a un nivel de al menos cuatro veces sobre el antecedente. Después de que se completó la - -»-«-.a.--.,t^af».«^-*«-- •-*-»-»<--------.-te¿«----- j-_t-i -selección, los fagos eluidos, finales, se colocaron en placas para formar colonias individuales y el ADN insertado se analizó mediante la PCR de la colonia y la digestión con BstNI como se describe abajo. Fase de solución Los fagos se prebloquearon durante 60 min en un motocultor a temperatura ambiente en MPBS al 2%. El péptido en forma de ciclo b-b' de OPGbp, biotinilado (500 nM) , se agregó directamente en la mezcla de fago, equilibrada, y se incubó durante 30 min a 1 hora en un motocultor (extremo sobre extremo) a temperatura ambiente.

El péptido en forma de ciclo tuvo la secuencia [bÍ?tÍn(LC) -TDIPSGSHKVSLSSWYHDRG] (SEC. ID NO: 24) en donde LC (cadena lineal es decir, (CH2)s-NH2)) se utilizó para enlazar la secuencia del ciclo OPGbp b-b' a la biotina. Las Dynacuentas revestidas con estreptavidina (100 µl por selección en tubos eppendorf de 1.5 ml) se utilizaron para capturar la fase de solución de los complejos antígeno-fago, biotinilados (3X para negativo y IX para selección de antígeno objetivo) . Las cuentas revestidas con estreptavidina se pre-equilibraron extrayéndolas al lado del tubo utilizando un magneto Dynal, el amortiguador se eliminó y las cuentas se resuspendieron en 1 ml de MPBS al 2%. El equilibrio a temperatura ambiente fue durante 1-2 horas en un motocultor extremo sobre extremo. Se realizaron tres selecciones negativas en las rondas 2 y 3. Para una selección negativa se agregaron los fagos prebloqueados a un tubo de Dynacuentas revestidas con estreptavidina pre-equilibradas en MPBS al 2% y se incubaron durante 30 min en un motocultor extremo sobre extremo a temperatura ambiente (se repitió dos veces) . Las cuentas se extrajeron lateralmente y los fagos no enlazados se transfirieron a un tubo eppendorf, fresco, para ser utilizados para una selección de antígeno. El péptido en forma de ciclo b-b' huOPGbp, biotinilado (500 nM) se agregó directamente a la mezcla de fago equilibrada y se incubó durante 30 min a 1 hora en un motocultor extremo sobre extremo a temperatura ambiente. Las cuentas equilibradas se extrajeron al lado del tubo, se removió el amortiguador y se resuspendió con la mezcla del péptido biotinilado y fago seguido por la incubación durante 15 min en un motocultor extremo sobre extremo a temperatura ambiente. Los tubos se colocaron en una rejilla magnética durante 1 min, se aspiraron y las cuentas se lavaron 6x con 1 ml de MPBS-Tween-20 al 2% (0.1%), 6x con 1 ml de PBS-Tween-20 (0.1%), y 2 x con 1 ml de PBS. Los fagos se fluyeron con 1 ml de TEA 100 mM pH 12 durante 5-10 minutos ..a-J-fc^'^-«*ii-^íAi8^fe.^-??iy^^?¿ --fc---en un motocultor a temperatura ambiente seguido por la neutralización con 0.5 ml de Tris-HCl 1M, pH 7.4. Ejemplo 3 Identificación de los clones Fab que se enlazan a la OPGbp Se infectaron las células TGl de E. coli con la recolección de fagos a partir de una ronda responsiva a ELISA y las colonias individuales se recogieron para análisis PCR. Típicamente se recogieron de una a cuatro placas de 96 colonias para cada selección. Los ADNcs de Fab se amplificaron mediante PCR por un grupo específico de cebadores y se analizaron en un gel de agarosa para la longitud de inserto de Fab. Las longitudes del inserto de Fab > 1.6 kb fueron de longitud completa. Los ADNcs también se digirieron con la enzima de restricción BstNI y el patrón de banda se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa. Los clones que exhibieron insertos de longitud completa por PCR, de tamaño idéntico, y los patrones de formación de banda de BstNI, idénticos, en dos o más aislados fueron candidatos para un análisis adicional. Utilizando el criterio anterior, se identificaron los siguientes Fabs. El patrón "P" de Fab se identificó después de la selección de fase de solución utilizando tres rondas de elución con trietilamina, pH 12, seguido por la selección --t.-.- ABfci... --fa^ --.---------. de fase sólida como se describió arriba utilizando una ronda de elución con 1 uM de OPGbp [143-317] . El patrón "S" de Fab se identificó mediante selección de fase de solución utilizando tres rondas de elución con trietilamina, pH 12, seguido por la selección de fase sólida como se describió anteriormente utilizando dos rondas de elución con 1 uM de OPG [22-194] -Fc . El patrón "AT" de Fab se identificó mediante selección de fase sólida como se describió anteriormente utilizando cuatro rondas de elución con 1 uM de OPG [22- 194] -Fc. El patrón "Y" de Fab se identificó mediante selección de fase sólida como se describió anteriormente utilizando tres rondas de elución con OPGbp [143-317] . Los fagos se prepararon a partir de colonias individuales que muestran patrones AT, Y, P y S de Fab mediante el siguiente procedimiento. Las preparaciones de plásmido se hicieron y se transformaron en células TGl . el análisis por PCR confirmaron la transformación de un inserto de longitud completa. Las células se hicieron crecer en ya sea un bloque de pozo profundo (volumen de 0.5 ml) o como un cultivo de 10 ml . Los fagos se recuperaron mediante una proporción de 20:1 de la infección de fagos M13K07 de ayuda/células, el PEG se precipitó 1 vez (como en el protocolo de formación directa de placas de fase sólida) y se resuspendieron en aproximadamente 200 ul a partir de un bloque de pozos profundos de tamaño de 2 ml por pozo o aproximadamente 500 ul a partir de un cultivo de 10 ml en PBS. Las concentraciones de los fagos estuvieron en el rango de 101:L-1014 fago/ml en el ELISA. Las titulaciones se realizaron basadas en el volumen utilizando un máximo de adiciones de 50 µl/pozo dando un rango típico de 109-101:? fago/pozo en un ELISA. Se realizó una ELISA a los fagos como se describió previamente. El ELISA utiliza el conjugado anti—M13 -HRP para la detección del fago enlazado con ABTS, un substrato colorimétrico a 405 nm. El conjugado anti-M13 HRP fue específico para la proteína VIII de revestimiento principal sobre el fago. Los valores fueron de determinaciones de un punto sencillo. Los resultados de un ELISA de un clon representativo de cada uno de los patrones principales "AT" , "Y" , "P" y "S" , se muestran en la Figura 1. Todos los cuatro clones Fab demostraron reactividad significativa con la OPGbp [143-317] . Todos los miembros de los clones de los patrones "AT" y "Y" (27 miembros de 672 clones y 9 miembros de 96 clones, respectivamente) se secuenciaron encontrándose idénticos dentro de sus patrones. Por lo tanto cualquier miembro patrón será representativo del patrón entero para los patrones "AT" y "Y" . tifa - .-á-a-L- •ff1" --!-------'-- ^-ii-4.:--- ——J-3S- -A,—--_..---- .,.,--1-- ¡— -j —J Los patrones "Q" (3 miembros de 96 clones) , "X" (3 miembros de 96 clones) y "AB" (2 miembros de 96 clones) también fueron positivos al ELISA a la formación de placas de OPGbp [143-317] como se determinó por un clon representativo (Figura 1) . Puesto que las señales del ELISA fueron considerablemente inferiores que los patrones "AT" , "Y" , "P" y "S" , y representadas por solamente dos a tres miembros en 96 clones, se supuso que tenían Kds en el rango µM y no se analizaron posteriormente. El patrón "X" fue solamente positivo al ELISA cuando la concentración de Tween-20 en los lavados se redujeron de 0.1% a 0.01%. Ejemplo 4 Purificación de los Fab solubles Los fagos que contienen "AT" , "Y", "P" y "S" de Fabs se infectaron en HB2151 de E. coli (Pharmacia, Piscataway, NJ) y se indujo la expresión de los fragmentos Fab mediante la adición de IPTG a 1 mM generalmente por al menos 5 horas, excepto para el patrón Y los niveles IPTG se redujeron a 0.25 mM. Después de la inducción, las células (750 ml) se cosecharon mediante centrifugación y los Fab se liberaron del espacio periplásmico mediante choque osmótico. Las pelotillas totales se resuspendieron en 8 ml de TES enfriado con hielo (Tris 0.2 M, EDTA 0.5 M, sucrosa al 17.1%, pH 8.0), se transfirieron a un tubo de 50 ml y lat--.-a«m.-*,|| l|l?r''-«fl|if¿?ri-i».-'---..-..,_¿m^-^-.--^-J--^.-_taaa-Í^'--~a*As-?a»- -.--*-*-__ IJÉflf -á-. se incubaron durante 5 a 10 min en hielo con una agitación suave, ocasional. Mientras tanto, los tubos vacíos se lavaron con 8.8 ml de TES/H20 (1:3) para recuperar las pelotillas de células restantes y se agregaron a las otras células y se incubaron otros 20 min en hielo. Las células se centrifugaron a 14,000 rpm durante 3 min y el sobrenadante se transfirió desde las pelotillas de células derramadas ligeramente a otro tubo de 50 ml . El sobrenadante se centrifugó otra vez a 14,000 rpm durante 10 min a 4°C para remover la contaminación residual de las células. El sobrenadante se refirió como la fracción periplásmica liberada de TES. Las pelotillas bacterianas se resuspendieron en 10 ml de TS más 15 MgS04 15 mM, se incubaron en hielo durante 15 min y se centrifugaron dos veces como se hizo arriba. El sobrenadante se refirió como la fracción periplásmica liberada de Mg. Se agregó albúmina de suero bovino (BSA; grado RÍA, Sigma) como un portador y estabilizante para cada fracción periplásmica hasta una concentración final de 1 mg/ml y se dializó durante toda la noche a 4°C en 2 L con 1 intercambio del amortiguador de columna Talón (Tris-HCl 20 mM/NaCl 0.1 M, pH 8.5) más los inhibidores de proteasa a las concentraciones finales, Pefabloc 0.05 mg/ml, leupeptina 50 nM, aprotinina 0.06 µg/ml y pepstatina A 0.9 µg/ml.

IÍ.Í----. .

Los extractos periplásmicos que contenían Fab (liberados de TES y Mg) se sometieron separadamente al método por lotes de enlace con un movimiento de vaivén 1 hora a 4°C con 0.8 ml a 1.5 ml de resina Talón preequilibrada (1/20 a del volumen del extracto) (Clontech) , luego por el método por lotes se lavó en al menos 2X de 20 volúmenes de columna del amortiguador de columna. La resina Talón se empacó en columnas, se lavó con 10 volúmenes de columna del amortiguador de columna, y 2 volúmenes de columna del amortiguador de columna más imidazol 50 mM para liberar proteínas enlazadas no específicamente. Los Fabs purificaron se fluyeron con 2 a 3 volúmenes de columna de imidazol 200 mM, glicerol al 4%. Los extractos purificados se concentraron/intercambiaron en un Centricon 10 (Amicon, Inc. Beverly, MA) en PBS, pH 7.4 hasta una concentración final de 0.5 a 5 mg/ml. La pureza del "AT" de Fab soluble se determinó en un Gel NuPAGE de Bis Tris al 10% Novex (San Diego, CA) con Amortiguador de Corrida NuPAGE MOPS SDS (No reductor) y el Amortiguador de Muestra 4X LDS (pH 8.45). Las muestras del Fab purificado que contenían el Amortiguador de Muestra LDS, se calentaron a 70 °C durante 10 min y se cargaron 40 ul/carril. El gel se hizo correr a 200 voltios, 20 min, luego se redujo a 50 voltios aproximadamente 1.5 horas, se tiñó con Tinción Azul de Coomassie Coloidal Novex -g^^rf ..j-mh-.<-*-»_----*.---__.,-i.-;-aproximadamente 14 horas, y se destiñó. El "AT" de Fab soluble se determinó que tenía una pureza mayor del 98%. Ejemplo 5 Actividad de los Fabs anti-OPGbp purificados Se analizó la actividad de los "AT" y "Y" de Fabs solubles, purificados, mediante los siguientes ensayos. Ensayo de inhibición de la interacción OPGbp/ODAR La interacción de la OPGbp [143-317] humana y su receptor ODAR, se midió en un ensayo de transferencia de energía de fluorescencia (FRET) . Se agregó OPGbp a una 1 hora de preicubación para incrementar la sensibilidad. Se construyó un dominio extracelular, soluble, de ODAR humano como un polipéptido de fusión con una etiqueta FLAG aminoterminal y una región Fc humana carboxiterminal . La región Fc se reconoció y se enlazó mediante aloficocianina específica de Fc anti-humana de cabra, policlonal (APC) la cual se detectó mediante absorbancia a 665 nm. La OPGbp [143-317] se etiquetó con Eu2+ que se detectó mediante absorbancia a 620 nm. El enlace de la OPGbp a la ODAR en este ensayo dispara una transferencia de energía fluorescente y es altamente sensible para las curvas de competición. Una disminución de la proporción de absorbancia de A665/A620 indica la inhibición del enlace de OPGbp a ODAR. jKj« f H tí-HX *^1 ?~ «H*"**"- Se observó una inhibición dependiente de la concentración del enlace de OPGbp-Eu al sODAR-Fc para las preparaciones duplicadas de los "AT" y "Y" de Fabs solubles. El "AT" de Fab soluble (preparación A) inhibió el enlace de OPGbp a la fusión ODAR-Fc con un IC50 de 550 mM. El "Y" de Fab soluble se inhibió con un IC50 de 6 µM. El clon 1B5 del "AT" de Fab se obtuvo a partir del patrón predominante de 27 miembros de siete placas de 96 pozos (todas con la misma secuencia de aminoácidos) obtenidos mediante la elución del OPGbp objetivo utilizando una solución de 1 µM de OPG [22-194] -Fc durante 90 min. El clon 1B4 de "Y" de Fab se seleccionó a partir del patrón predominante de 9 miembros de una placa de 96 pozos (todos con la misma secuencia de aminoácidos) desde la selección de OPGbp colocada en placas, optimizada, utilizando una elución de 1 µM de OPGbp durante 90 min. Una segunda purificación del clon 6F11 del "AT" de Fab, (designada preparación B) generó un IC50 similar de 440 nM para PBS e IC50 de 354 nM para TBS. Una segunda purificación del "Y" de Fab (preparación B) da un IC50 similar de 4.1 µM para TBS. El control positivo fue de OPGbp [143-317] en TBS o PBS con los correspondiente IC50s de 0.89 y 0.93 nM, respectivamente. Se obtuvieron IC50's similares con las preparaciones duplicadas de "A" y "B" . Lo resultados de la L--A¿- -hi--i---;^----------.- -f J^-i^M-ii-i»----preparación "B" de "AT" y "Y" de Fabs en TBS, se muestran en la figura 2. Ensayo de la Médula Osea Los "AT" , "Y" y "P" de Fabs solubles se purificaron como en el Ejemplo 4 seguidos por dos etapas de remoción de endotoxinas secuenciales utilizando una columna de afinidad Polymyxin (aproximadamente 1 ml; BioRad, Hercules, CA) en PBS a temperatura ambiente de conformidad con las instrucciones de los fabricantes excepto como sigue. Para incrementar la probabilidad de remoción del enlace de la endotoxina al Fab, después de la adición de la muestra, se recicló una alícuota de 100 µl a 150 µl desde el fondo hacia la parte superior de la columna cada 5 min durante 2 a 2.5 horas. El Fab se eluyó con 3 volúmenes de columna de PBS con glicerol al 4%. Las muestras se probaron para la endotoxina utilizando el sistema de detección de E-Toxato (Limulus Amebocyte Lysate) (Sigma, St . Louis, MO) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las muestras entonces se estilizaron mediante filtración (0.2 µm) . El "P" de Fab se desnaturalizó después de la purificación y se enlazó de manera pobre a la OPGbp [143-317] en un ELISA. Se utilizó como un control negativo en estos experimentos .

El formato de ensayo incluye una pre-incubación de 1 hora del Fab anti-OPGbp con 10 ng/ml de OPGbp [143-317] humana (concentración final de los pozos de células) . Los ensayos TRAP se realizaron en una solución utilizando el substrato cromogénico pNPP. Los resultados se mostraron en la Figura 3. El "AT" de Fab dio una disminución del 50% (IC50) a 57.8 nM; el "Y" de Fab dio una disminución del 50% a 212 nM; el "P" de Fab dio una disminución del 50% a 1.5 nM. Se utilizó un peso molecular del Fab estimado de 50,000 en estos cálculos para dar un factor de conversión de 1 µg/ml = 20 nM. Los IC50 como se determinaron mediante teñido histoquímico con TRAP, fueron similares a aquéllos de arriba como se determinaron en el ensayo pNPP. Ensayo de Células RAW Los efectos de la adición de los "AT" , "Y" y "P" de Fabs solubles al ensayo de células RAW, se muestran en la Figura 4. El punto del 50% para la gráfica, se tomó como 1.65 OD405 nm. El "AT" de Fab tuvo un IC50 de 15 µg/ml, 300 nM (suponiendo un peso molecular del Fab de 50,000). El "Y" de Fab tuvo una señal de decremento hasta 2.15 OD405 desde 2.5 OD405, un punto del 80%. Mediante extrapolación, un punto del 50% de 1.65 para el "Y" de Fab se podría alcanzar a aproximadamente 400 µg/ml x 20 r^- ^^-^-^--|^c^^afc?-..-»fcVt1--1"---u>¿--—""«->*• aproximadamente 8 µM. El "P" no muestra ninguna reactividad detectable en el ensayo. Ejemplo 6 Secuenciación y Análisis de los clones Fab El ADN y las secuencias de aminoácidos predichas para las cadenas ligeras del "AT" , "Y", "P" y "S" de los Fabs, se muestran en las Figuras 5, 6, 7, y 8 respectivamente. El ADN y las secuencias de aminoácidos predichas para las cadenas pesadas del "AT" , "Y", "P" y "S" de los Fabs, se muestran en las Figuras 9, 10, 11, y 12 , respectivamente. La Figura 13 muestra una matriz de comparación de la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras respectivamente de los cuatro clones del patrón del Fab predominante con base en la identidad y similaridad. La identidad y similaridad se obtuvieron ya sea mediante el programa GCG o mediante el cálculo manual. Las secuencias de cadena pesada del "AT" y "Y" de los Fabs, tienen la coincidencia más cercana cuando las mismas difieren por un solo aminoácido (cambio conservativo) y por consiguiente tuvieron una identidad del 99.6% y una similaridad del 100%. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera, se compararon entre los cuatro patrones, superiores, tanto por su identidad como por su similaridad entre sí. El "AT", "Y" y "P" de los Fabs muestran una identidad de al ---a-tMt.. ^ fc^j .<t....i.-..-.*-.- t, i?_fte--lÉ-- .- .. ,..„,- «a^a^É-ki-li.. menos 85% y una similaridad de al menos 89%. El patrón "S" fue el más disimilar de la familia lambda V más rara. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones de determinación, complementarias (CDRs) , se muestra en la Figura 14. El "AT" y "Y" de los Fabs tuvieron secuencias de aminoácidos de cadena pesada, idénticas, en la CDRl, CDR2 y CDR3. La CDRl de la cadena pesada del "P" y "S" de los Fabs, cada una tuvo 3 residuos de aminoácidos idénticos al "AT" y "Y" de la secuencia CDRl. La secuencia CDR2 del "P" y "S" muestran una mayor identidad entre sí que el "AT" y "Y" de la secuencia CDR2. Las cadenas ligeras del "AT" y "Y" de los Fabs, muestran longitudes idénticas de la CDRl, CDR2 y CDR3. Los patrones "AT" y "Y" de las CDRs 1 y 3 de la cadena ligera, muestran una identidad en 7 de 11 residuos (64%) y 3 de 5 residuos (60%), respectivamente. Aunque los patrones "AT" y "Y" de la CDR2 de la cadena ligera, no muestran identidad entre sí, cada uno contiene parte de la secuencia de consenso para la CDR2 de cadena ligera. Cuando los primeros 4 residuos del patrón "AT" , se combinan con al menos 3 residuos del patrón "Y", se obtiene la CDR2 de la cadena ligera del patrón "P" . La CDR3 de la cadena ligera puede variar en su longitud desde 5 hasta 25 residuos. Por lo tanto, las CDR3s de cadena ligera, obtenidas en los patrones "AT" , "Y" y "P" fueron muy cortas. En sumo grado . i.* ,*.. -....*. j tjgmni„.?,~'-- J-«:.^--»i---*-»-*'ili^ — - "*-** el único de los cuatro clones del patrón predominante, fue el "S" del Fab. Una comparación de las clases de Fab, representada en los cuatro patrones predominantes, se muestra en la Figura 15. Estos resultados se obtuvieron a partir del Análisis PLOT de ADN de Base V. Como se esperaba el "AT" y "Y" de los Fabs fueron de la misma familia VH1 (familia Pesada Variable 1) con las mismas regiones VDJ (Variable, Diversidad y Unión) . El "AT" y "Y" de los Fabs pertenecen a diferentes familias de cadena ligera. El "P" y "S" pertenecen a la misma familia de cadena pesada VH3 pero a diferentes familias de cadena ligera. Todas las cadenas pesadas tuvieron las mismas regiones de unión JH4b. Una alineación de las secuencias Fab y las correspondientes secuencias de línea germinal, se muestra en las Figuras 16-18 para las cadenas pesadas y en la Figura 19-22 para las cadenas ligeras. Los cambios en las cadenas ligeras y pesadas del "AT" , "Y", "P" y "S" , resultaron de la matastis somática, presente de manera natural, que surgen en las secuencias de línea germinal del anticuerpo durante una respuesta del anticuerpo. Las regiones variables de las cadenas pesadas de "AT" y "Y" (los 127 aminoácidos amino-terminales en las Figuras 9 y , respectivamente) , tuvieron 17 y 18 cambios de aminoácidos, respectivamente, comparadas con las &^^_t<---Í--ft-ri-^¿a--a--a:^- . -!«.__-...-__..*.-*--«-«-*--*&--_-- ¡¿Hin correspondientes secuencias de línea germinal de VDJ. La región variable de la cadena pesada de "P" (los 117 aminoácidos amino-terminales en la Figura 11) tuvo 16 cambios de aminoácidos, comparada con la correspondiente secuencia de línea germinal de VDJ. La región variable de la cadena pesada de "S" (los 124 aminoácidos amino-terminales en la Figura 12) , tuvo 14 cambios de aminoácidos, comparada con las secuencias de línea germinal. La región variable de la cadena ligera de "AT" (residuos 6-108 en la Figura 5) tuvo 16 cambios de aminoácidos, comparada con la correspondiente secuencia de línea germinal de VJ; la cadena ligera de "Y" (residuos 6-108 en la Figura 6) tuvo 14 cambios de aminoácidos; la cadena ligera de "P" (residuos 5-108 en la Figura 7) tuvo 14 cambios de aminoácidos; y la cadena ligera de "S" (residuos 5-112 en la Figura 8) tuvo 12 cambios de aminoácidos. En general, las diferencias de aminoácidos en lo que ocurre con mayor frecuencia en las regiones CDR3 tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Ejemplo 7 Clonación y Expresión de los anticuerpos de la OPGbp humana, de longitud completa Los clones Fab se convirtieron a anticuerpos de longitud completa mediante los siguientes procedimientos. __»t-.-,-.j-».----' - _-j-H,'-?»..'.-.aa¡-.-aj»--.^-i*^¡- F?X? FS _a_ ..I-t Construcción del pDSRal9:hCH El plásmido pDSRal9:EP0 se digirió con HindIII y Salí para remover la región de codificación de la eritropoyetina. El plásmido pCRBluntCHl-3 que contiene los dominios CH1, de articulación, CH2 y CH3 de la IgGl humana, insertados en el vector pCRBlunt (Invitrogen) , se utilizó para obtener un dominio constante de la IgGl humana, de 1.4 kb. El pCRBluntCHl-3 se digirió con HindIII y Sal I y las secuencias del dominio constante, se insertaron en el pDSRal9 para generar un pDSRal9:hCH. Construcción del pDSRa!9 :AT-VH21 Cuatro ADNcs de cadena pesada del Fab anti-huOPGbp, se clonaron en el pDSRal9:hCH para convertir los Fabs en IgGs de longitud completa. La construcción de un plásmido que codifica la cadena pesada del "AT" , se describe aquí. Las otras cadenas pesadas del Fab, se clonaron utilizando procedimientos similares. Para generar el Fab con una secuencia de señal, se realizó un PCR de tres etapas. Primero, los cebadores 2249-25 y 2248-22 se utilizaron con la plantilla de ADNc del Fab. Las condiciones fueron: 94 °C durante 1 min, (95°C durante 30 seg., 50°C durante 1 min., 68°C durante 1 min) durante 20 ciclos, 68°C durante 10 min., con la polimerasa Pfu y el amortiguador y nucleótidos apropiados. El producto de PCR se amplificó entonces con los cebadores 2209-21 y 2248-22 seguido por la amplificación con los cebadores 2209-20 y 2248-22. El producto de PCR final se limpió, se cortó con HindIII y BsmBI, y el gel se purificó. Este fragmento contiene el Fab con un sitio 5' Kozak (inicio de traducción) y la siguiente señal de secuencia para la expresión de los mamíferos de la cadena pesada del "AT" del Fab: MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEC. ID NO: 25) Esta secuencia de señal se designa como la secuencia de señal VH2?. El plásmido pDSRal9:hCH se digirió con HindIII y BamBl para remover el polienlazador antes de que los dominios CHl-3 de la IgG y el producto de PCR del Fab se insertaran para generar el pDSRal9 :AT-VH21. Cebadores : HindlII Kozak 2209-20 5 ' -CAGAAGCTTAGACCAC ATG GAA TGG AGC TGG GTC TTT CTC TTC T-3 ' (SEC. ID NOS: 26 & 27) M E W S W V F L F 2209-21 5*-G AGC TGG GTC TTT CTC TTC TTC CTG TCA GTA ACG ACT GGT GTC CA- 3' (SEC. ID NOS: 28 _ 29) S W V F L F F - S V T T G V 2249-25 5' -TCA GTA ACG ACT GGT GTC CAC TCA CAG GTC CAG CTG GTG CAG-3' (SEC.ID NOS: 30 & 31) S V T T G V H S Q V Q - V Q BsmBI 2248-22 5'-GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTGACC AGG GTG-3 ' {SEC. ID NO: 32) Construcción del pDSRa!9:AT-L Los ADNcs de cadena ligera del "AT" , "Y", "P" y "S" de los Fab, se clonaron en el pDSRal9 para convertir los Fab en anticuerpos de longitud completa. La construcción tj Jja£tjt^MS_-»'-fc^^-^*^~^1^J^'^~-^:,'ah,*t--de un plásmido que codifica la cadena ligera del "AT" , se describe aquí. Los otros Fabs se clonaron utilizando procedimientos similares. Para generar el "AT" del Fab con una secuencia de señal, se realiza una PCR de tres etapas. Primero, los cebadores 2233-50 y 2233-51 se utilizaron con la plantilla de ADNc del Fab. Las condiciones de PCR fueron: 94°C durante 1 min, (95°C durante 30 seg., 50°C durante 1 min., 68°C durante 1 min.) durante 20 ciclos, 68°C durante 10 min., con la polimerasa Pfu y el amortiguador y nucleótidos apropiados. El producto de PCR se amplificó entonces con los cebadores 2148-98 y 2233-51 seguido por la amplificación con los cebadores 2148-97 y 2233-51. El producto de PCR final se limpió, se cortó con HindIII y Salí, y el gel se purificó. Este fragmento contiene el Fab con un sitio 5' Kozak (inicio de traducción) y la siguiente señal de secuencia para la expresión de los mamíferos de la cadena ligera del "AT" : MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEC. ID NO: 33) Esta secuencia de señal se designa como la secuencia de señal "ligera" . El plásmido pDSRal9:EP0 se digirió con HindIII y Salí para remover el gen EPO antes de que el producto de PCR de cadena ligera de la IgG, se insertara para generar el pDSRal9:AT-L. Í í^^.m^^^, ^¡^?^&^:^^Ff^r^¡ .Mls ÍÍ&ÍSi Cebadores : HindIII Kozak 2148-97 5 ' -CAGAAGCTTGACCACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GG- 3' (SEC. ID NO: 34 & 35) M D M R V P A Q 2148-98 5'-CC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTA TTG TGG TTG AGA GGT GCC AGA T-3' (SEC. ID NO: 36 i 37) A Q L L G _ _ _ L W L R G A R 2233-50 5'-G TGG TTG AGA GGT GCC AGA TGT GAA ATT GTG ATG ACÁ CAG TCT C- 3' (SEC. ID NO: 38 & 39) W L R G A R C E I V M T Q S Salí 2233-51 5'- TTTGGACGJTCGAC TTA TTA ACÁ CTC TCC CCT G-3' (SEC. ID NO: 40 & 41) * * C E G R Construcción del pDSRa!9 :AT-tPA Los vectores de expresión para la producción de las cadenas pesadas de longitud completa del "AT" , "Y" , "P" y "S" , se construyeron como se describió anteriormente excepto que los cebadores se modificaron para introducir la siguiente secuencia de señal : MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVFSPSRGRFRR (SEC. ID NO: 42) Esta secuencia de señal se designa como la secuencia de señal "tPA-RGR" . Construcción del pLDH-AT Se construyó un vector de expresión, que se incluyó en las cadenas tanto ligeras como pesadas del "AT" . El plásmido pDSRal9 :AT-Vh21 se digirió con AatH y Ndel y los extremos se llenan mediante polimerasa de ADN T4. El fragmento que contiene el cásete de expresión de la cadena pesada del "AT" (cadena pesada del "AT" que codifica la secuencia flanqueada por el promotor y el sitio de lilB.iin i lili ii rlliiliif] ' u^J^to^tt*< ^* "^?-?l^'* ^l^-^'M?****'"~ '" "*" '*"*" ^-*fo" poliadenilación del pDSRal9) se purifica con gel y se liga al pDSR l9:AT-L que se ha linearizado con Nhel, se llena con polimerasa de ADN T4 y se desfosforila con fosfatasa alcalina. El cásete de expresión de la cadena pesada, estuvo en la misma orientación de trascripción que la cadena ligera y los genes DHFR. Preparación del Anticuerpo Los vectores de expresión que contienen el ADNc que codifica los anticuerpos de longitud completa del "AT" , "Y", "S" y "P" de cadena pesada y ligera (ya sea en vectores separados o en un solo vector) se transfectan en células de CHO y se cultivan bajo condiciones que permitan la expresión de las cadenas pesadas y ligeras y la secreción en el medio celular. El medio condicionado se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa, de 0.45 µm (Corning, Acton, MA) y se aplicó a una columna de Proteína G sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) que se ha había equilibrado con PBS - Solución Salina Amortiguada con Fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio y sin cloruro de magnesio (Gibco BRL Products, Grand Island, NY) . Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbencia a 280 nm alcanzó la línea base. La elución de la proteína se logró utilizando Glicina 100 mM, pH 2.5. Las fracciones se recogieron y se neutralizaron inmediatamente por la adición de Tris-HCl 1M, pH 9.2. Los anticuerpos se detectaron por medio de los geles de SDS-poliacrilamida visualizados mediante el teñido de Coomassie. Las fracciones que contienen el anticuerpo se conjuntaron, concentraron y diafiltraron en PBS utilizando ya sea Centricon 10 (Amicon) o para volúmenes más grandes Centriprep 10 (Amicon) . El anticuerpo aislado se caracterizó mediante filtración con gel en Superóse 6 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se mostró que corre como una IgG monomérica. Ejemplo 8 Análisis BIAcore del enlace del Fab y el anticuerpo a la OPGbp La constante del enlace (Kd) , sobre la constante de velocidad (ka) y la constante fuera de velocidad (kd) para el anticuerpo del "AT" y "Y" y "AT" de los Fabs, se determinaron mediante técnicas de resonancia con un plasmón de superficie (BIAcore, Pharmacia, Piscataway, New Jersey) y los resultados se muestran en la Tabla II. Las Fabs se prepararon como se describe en el Ejemplo 4 y el anticuerpo del "AT" se preparó como se describió en el Ejemplo 7. La OPGbp se inmovilizó en un circuito CM5 mediante el acoplamiento estándar de la amina. La Kd y las i-Hi- ti -"t '*"^*- ^i^i^ M^?a?feaj constantes de velocidad se determinaron mediante el programa para computadora BIAEVALUATION 3.0 (Pharmacia). TABLA II Análisis BIAcore del anticuerpo del "AT" y "Y" y "AT" de los Fabs Ka (M'V1) Kd (s'1) KD (nM) "Y" de Fab 9.44 X 10; 5.91 x 10"3 594 "AT" de Fab 2.2 x 10e 0.31 140 "AT" Ab (147 RU) 5.7 x 10e 2.4 x 10 -3 0.42 "AT" Ab (80 RU) 8.1 X 10e 2.7 X 10 -3 0.33 "AT" Ab (47 RU) 7.3 x 10* 3.1 x 10" 0.43 La afinidad del enlace del "AT" de Fab se incrementó desde aproximadamente 140 nM hasta aproximadamente 0.33 a 0.43 nM, o aproximadamente 350 a 400 veces, cuando se agregó una región constante de la IgGi Fc como se describió en el Ejemplo 7 Ejemplo 9 Actividad de los anticuerpos anti-OPGbp Ensayo de las Células RAW Las preparaciones del anticuerpo de "AT" , designadas como 405, 406 y 407, se probaron en un ensayo de células RAW como se describió en el Ejemplo 1. El "AT" 405, "AT" 406 y "AT" 407 difirieron solamente en las secuencias líder, utilizadas para la expresión (el "AT" 405 se .__.,- „,..t -µ._-_ _-.--..----t--.-- "^---^-^-^A--.,-"^--¿tf.------ expresó utilizando la secuencia de señal "ligera", el "AT" 406 utilizó la secuencia de señal tPA-RGR, y el "AT" 407 utilizó la secuencia de señal VH21) . Los anticuerpos maduros, purificados, fueron idénticos en cada preparación. Los resultados se muestran en la Figura 23. Los IC50 para el "AT" 405, "AT" 406 y "AT" 407, fueron de 20.1 nM, 60.3 nM y 21.4 nM, respectivamente, correspondiendo a 3.0 ug/ml, 9.0 ug/ml y 3.2 ug/ml, respectivamente (suponiendo un peso molecular de 150,000). Los controles positivos de la OPG [22-194] -Fc y el anticuerpo policlonal, anti-OPGbp, estuvieron en 33 ng/ml y 150 ng/ml. La diferencia en el IC50 en el ensayo de las células Raw del fragmento del Fab "AT" fue de 300 nM cuando se comparó con aproximadamente 20 nM para la longitud completa del "AT" , o de aproximadamente un incremento de 15 veces para el anticuerpo de longitud completa del "AT" . Tomando en cuenta las diferencias en las concentraciones de la OPGbp en los dos experimentos (150 ng/ml / 60 ng/ml = 2.5 veces), el incremento en la avidez de la función de las células para el anticuerpo de longitud completa del "AT" , fue de aproximadamente 15 x 2.5 = 37.5 veces. Ensayo de la Médula Osea Los efectos de la adición de las preparaciones del "AT" 405 ó "AT" 407 al ensayo de la médula ósea, murina, se muestran en la Figura 24. Los IC50's para el "AT" 405 y "AT" 407, fueron de 2.15 ug/ml (14.4 nM) , y 1.85 ug/ml (12.5 nM) , respectivamente, (PM = 150,000). Un anticuerpo policlonal, anti-OPGbp, de rata, inhibió la formación de TRAP con un IC50 a aproximadamente 50 ng/ml. En un experimento separado, el "AT" 406 se probó en el ensayo de cocultivo de la médula ósea y se inhibió la formación de TRAP con un IC50 de 2.35 µg/ml (14.4 nM) suponiendo un peso molecular del anticuerpo de 150,000 (ver la Figura 25) . La diferencia en el IC50 en el ensayo de la médula ósea para el fragmento del Fab "AT" fue de aproximadamente 50 nM cuando se comparó con aproximadamente 13 nM para el anticuerpo de longitud completa del "AT" , o de aproximadamente un incremento de 3.85 veces. Tomando en cuenta las diferencias en las concentraciones de la OPGbp en los dos experimentos (50 nM / 9 nM = 5.55 veces), la ganancia aproximada en la avidez de la función de las células del anticuerpo de longitud completa del "AT" , fue de aproximadamente 3.85 x 5.55 = 21.4 veces. Los ADNc que codifican el "Y" , "P" y "S" de los Fabs también se fusionaron a las secuencias CH1, CH2 , y CH3 de la IgGl humana como se describió en el Ejemplo 7 y se transfectaron en las células de CHO. Los anticuerpos resultantes se expresaron y purificaron a partir del medio condicionado y la exotoxina se removió como anteriormente. Los anticuerpos de cadena ligera del "S" y "Y" (referidos como "S Ligero" y "Y Ligero" ) se probaron en el ensayo de la médula ósea y los resultados se muestran en la Figura 26. Los anticuerpos del "S ligero" y "Y ligero" se expresaron utilizando las correspondientes secuencias líder de cadena ligera y se designaron como "S" 435 y "Y" 429, respectivamente. El "Y" 429 ("Y Ligero") tuvo un IC50 de 23 ug/ml ó 154 nM. El "S" 435 ("S Ligero") no exhibió suficiente actividad para una determinación de un IC50. El "Y Campath" y el "P Ligero" fueron el "Y" y "P" de la secuencia Hu-IgGl, respectivamente con la secuencia líder del "Campath" y de Cadena "Ligera", y se designaron como "Y" 442 y "P" 444, respectivamente. El "Y" 442 ("Y Campath") tuvo un IC50 de 20 µg/ml ó 134 nM. El "P" 444 ("P Ligero") no mostró actividad detectable (ver la Figura 27) . La diferencia en el IC50 en el ensayo de la médula ósea del fragmento del Fab "Y", fue de 212 nM comparada con 134-154 nM para el anticuerpo de longitud completa de "Y", o de aproximadamente un incremento de 1.38 a 1.58 veces. Tomando en cuenta las diferencias en las concentraciones de la OPGbp en los dos experimentos (50 nM / 9 nM = 5.55 veces), la ganancia aproximada en la avidez de la función de las células del anticuerpo del Fab "Y" respecto al anticuerpo de longitud completa de "Y" , por lo tanto fue de aproximadamente (1.38 a 1.58) x 5.55 = 7.7 a 8.8 veces o aproximadamente 8 veces . Ejemplo 10 Identificación de un Epítope para el Anticuerpo de "AT" en la OPGbp Producción de la OPGbp murina, variante La OPGbp [143-317] humana se produjo como se describió en el Ejemplo 1. La OPGbp [158-316] murina que contiene los residuos de aminoácidos 158 a 316 como se muestra en la Figura 1 de la PCT W098/46751 precedida por un residuo de metionina N-terminal, introducido, se produjo en E. coli y se purificó a partir de la fracción soluble de bacterias como se describió previamente (Lacey et al. Cell 93, 165-176 (1998)). La OPGbp [158-316] FLAG-murina se generó mediante la introducción de los residuos de ácido nucleico que codifican una metionina N-terminal seguida por la secuencia marcada con FLAG (DYKDDDDKKL (SEC. ID NO: 99)), fusionada al N-terminal de los residuos 158-316 como se muestra en la Figura 1 de la PCT W098/46751 utilizando los métodos conocidos para un experto en la técnica. La molécula FLAG-OPGbp [158-316] se clonó en el vector de expresión bacteriana pAMG21 (depositado con la Colección de Cultivo Tipo Americano y tiene el no. de acceso 98113) . lii 1 i I liiirf -Í-.IÍ--1--Éf Wf "~ —«*— Se construyó una variante del polipéptido OPGbp [158- 316] FLAG-murino, en la cual los residuos de aminoácidos SVPTD en las posiciones 229-233 inclusive como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID NO: 1) de la W098/46751, se substituyeron con los residuos de aminoácidos correspondientes DLATE en las posiciones 230-234 inclusive como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID NO: 3) de la W098/46751. El constructo resultante, referido como OPGbp [158-316] /DE FLAG-murino" , tiene la secuencia de ácido nucleico y proteína como se muestra en la Figura 28. Los cambios de la secuencia de aminoácidos se colocan en una región de OPGbp entre las regiones D y E. La Figura 29 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos, murinas, humanas, y de variantes DE murinas, en esta región. Los cambios de la secuencia en la variante murina son S229D, V230L, P231A y D233E con la T en la posición 234 sin cambio. Las secuencias flanqueantes en esta región virtualmente son idénticas entre la OPGbp murina y humana. Esta molécula se construyó utilizando una reacción de PCR de dos etapas, donde la primera etapa contenía dos reacciones de PCR separadas, designadas como reacción A y reacción B. Tanto para la reacción A como para la reacción B, se utilizó el ADN del OPGbp [158-316] del pAMG21-FLAG- murino como una plantilla para la PCR. La reacción A empleó los oligonucleótidos #2640-90 y #2640-91 para la PCR, mientras que la reacción B empleó los oligonucleótidos #2640-92 y 2640-93. Se realizó la termociclización y los productos de PCR de las reacciones A y B, se purificaron a partir de un gel de agarosa utilizando métodos disponibles para un experto en la técnica. La segunda etapa de la reacción de PCR, designada como reacción C, utilizó los productos de PCR purificados de la reacción A y reacción B como una plantilla y los oligonucleótidos #2640-90 y #2640-93 como cebadores. Siguiendo la termociclización, el producto de la reacción C se clonó en el vector de clonación pCRII-TOPO (Invitrogen) & se sometieron a electroporación en células DHlOb (Gibco) utilizando los métodos proporcionados por el fabricante. Los clones se seleccionaron y la secuencia se confirmó verificando que las mutaciones introducidas, den como resultado el cambio de la secuencia de aminoácidos SVPTD en la OPGbp [158-316] murina al DLATE. El ADN verificado de la secuencia se digirió entonces con Ndel y Xhol, se purificó, y se subclonó en el vector pAMG21 de expresión bacteriana que da el surgimiento del plásmido pAMG21-OPGbp [158-316] /DE FLAG-murino. 2640-90: CCTCTCATATGGACTACAAGGAC (SEC. ID NO: 100) 2640-91: AGTAGCCAGGTCTCCCGATGTTTCATGATG (SEC. ID NO: 101) 2640-92: CTGGCTACTGAATATCTTCAGCTGATGGTG (SEC. ID NO: 102) 2640-93: CCTCTCCTCGAGTTAGTCTATGTCC (SEC. ID NO: 103) ^¿¿^ El GM94 hospedero de E. coli (depositado con la Colección de Cultivo Tipo Americano bajo el número de acceso 202173) que contiene el plásmido pAMG21-OPGbp [158-316] /DE FLAG-murino, se hizo crecer en un medio 2XYT hasta una fase de crecimiento, exponencial, y se indujo para expresar la proteína OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina mediante la adición de un automductor sintético de V. fischeri hasta 100 ng/ml. Aproximadamente 3-6 horas después de la inducción, las células se colocaron en placas y la proteína OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina, recombinante, se purificó a partir de la fracción soluble de E. coli utilizando los métodos descritos en Lacey et al . ibid. Enlace del Anticuerpo "AT" a la OPGbp [143-317] humana, OPGbp [158-316] murina, y OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina Las Placas Costar E. I .A. /R. I .A. (Enlace Superior de Fondo Plano, Cat. #3590) se recubrieron con 100 µl/pozo ya sea de OPGb [143-317] humana, OPGbp [158-316] murina, u OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina a 3 µg/ml en PBS, durante toda la noche a 4°C con agitación. Después de la incubación durante toda la noche, las soluciones de proteína se removieron de la placa y 200 µl de Suero de Pollo al 5% (Gibco/BRL Cat# 16110-082) en PBST (PBS más Tween 20 al 0.05%) se agregó a cada pozo de la placa y las placas se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 90 min con agitación. Después de la incubación y el bloqueo, las placas se lavaron 4 veces con solución de lavado IX K-P en dH20 (Cat #50-63-00, Kirkegaard & Perry Laboratorios) y se secaron. El anticuerpo del "AT" purificado o la proteína OPG [22-194] -Fc humana se diluye 1:1 en serie desde 2 ug/ml descendentemente hasta 1.953 ng/ml en PBST y se agregaron 100 ul/pozo a los pozos apropiados de la placa microtituladora, revestida ya sea con OPGbp [143-317] humana, OPGbp [158-316] murina, o proteína OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina. Las placas se incubaron durante tres horas a temperatura ambiente con agitación, se lavaron cuatro veces con solución de lavado IX K-P y se secaron. La IgG anti-humana de cabra (Fc) (Jackson ImmunoResearch, Cat# 109-036-098), se diluyó 1:5000 en Suero de Pollo al 5% en PBST y se agregaron 100 µl a cada pozo. Las placas se incubaron durante 1.25 horas a temperatura ambiente con agitación, se lavaron seis veces con solución de lavado IX K-P, y se secaron. Se agregaron 100 µl del substrato de ABTS sin diluir (Kirkegaard & Perry; Cat# 50-66-00) a cada pozo y el plato se incubó a temperatura ambiente hasta que se desarrolló suficiente color azul verdoso. El desarrollo del color se detuvo mediante la adición de 100 µl de SDS al 1%. La cuantificación de desarrollo del color se realizó utilizando un lector de placa microtituladora con detección a 405 nm. lilif. iili-fir"*" --.———--*"'»' .-.-.--*---«.

Los resultados del EIA se muestran en la Figura 30. El anticuerpo de "AT" se enlaza a la OPGbp [143-317] humana pero no muestra un enlace detectable a la OPGb [158-316] murina en el rango de concentración del anticuerpo, probado. Sin embargo, el anticuerpo de "AT" se enlaza tanto" a la OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina como a la OPGbp [143-317] humana bajo las condiciones de ensayo anteriores. Se concluye que los cambios de aminoácidos en la OPGbp [158-316] /DE murina, comparados con la OPGbp [158-316] murina se involucraron en el enlace del anticuerpo de "AT" . La OPGbp [158-316] /DE FLAG-murina se ensayó para actividad en el ensayo de células RAW como se describe en el Ejemplo 1 y se observó que tenía un ED50 similar para la formación de osteoclastos como la OPGbp [143-317] humana, que indica que la variante DE se activa para promover la actividad de osteoclastos in vitro. Por lo tanto, el enlace del anticuerpo de "AT" a la OPGbp [158-316] /DE murina de manera similar inhibe la formación de osteoclastos. El epítope del anticuerpo de "AT" se localiza en una región de la OPGbp humana que incluye al menos residuos de aminoácidos DLATE (residuos 230 a 234 de la OPGbp humana como se muestra en la Figura 4 de la PCT W098/46751) .

Ejemplo 11 Construcción de Anticuerpos "AT" Fab y Variantes. Estos enfoques se usan para generar variantes de CDR del anticuerpo "AT" : mutagénesis exploradora de alanina de la región CDR3 de cadena pesada, mutagénesis de substitución de sitios seleccionados en la región CDR3 de cadena pesada, y mutagénesis de inserción de la región CDR3 de cadena ligera. Variantes de Alanina de CDR3 de cadena pesada. La mutagénesis aleatoria de alanina se da en la región CDR3 de la cadena pesada AT. La secuencia de aminoácido usada para exploración de alanina fue: DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID N0:_104) Los cebadores 12 y 15 se combinaron en sus pares base uno al otro y se extienden por reacción de cadena de polimerasa (PCR) bajo las siguientes condiciones: 25 pmol de cada cebador, 6 ciclos de 30 segundos a 94°, 2 minutos a 55°, 20 segundos a 74°. 12) 5 'AGA GAT TCC TCA AAT ATG GTT CGG GGA ATT ATT ATA GCG (SEQ ID NO: 105) 15) 5' GTA GTC AAA ATA GTA CGC TAT AAT AAT TCC CCG AAC (SEQ ID NO: 106) El producto PCR de esta reacción se nombra Plantilla A. mg^^yj ^&j&^í^iy&MA? La Plantilla A se extiende por PCR con el uso de los cebadores 11 y 14 bajo las siguientes condiciones: 0.5 microlitros de plantilla A, 10 pmol de cada cebador, 15 ciclos de 30 segundos a 94°, 2 minutos a 43°, 20 segundos a 74°. 11) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT TCC TCA AAT ATG (SEQ ID NO: 107) 14) 5' CAG GGT GCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA ATA GTA CGC (SEQ ID NO: 108) El producto PCR de esta reacción se nombra Plantilla B. Las variantes de alanina de CDR3 se generan después con el uso ya sea de la plantilla A o B. áe dan dos rondas de PCR (20 ciclos de 94° durante 20 segundos y 74° durante 40 segundos) con el uso de un cebador que contiene el codón de alanina deseado. El cebador que contiene el codón de alanina está en orientación delantera para el residuo CDR3 (la numeración sigue el sistema Kabat, ver Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 4* edición (1991)) D95, S96, V100, RIOOa. El cebador que contiene el codón de alanina está en la orientación inversa para los residuos S97, N98, M99, GlOOb, 1100c, HOOe, YlOOg, YlOOh, F100Í, D101, Y102.

Las reacciones de mutagénesis son después seguidas por hasta tres reacciones de extensión con el uso de ser cebadores comunes. Estas reacciones extienden el producto para abarcar la región CDR3 completa e incluir los sitios de restricción de flanqueo únicos BglII y BstEII. Los cebadores para la substitución de alanina se muestran a continuación en la orientación 5' y 3'. El codón de alanina se muestra en tipo resaltado. 60) 5 'GTG TAT TAC TGT GCG AGA GCT TCC TCA AAT ATG GTT CGG (SEQ ID NO: 109) 59) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT GCC TCA AAT ATG GTT CGG (SEQ ID NO: 110) 58) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT TGC GGA ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 111) 57) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT AGC TGA GGA ATC TCT CGC ACÁ (SEQ ID NO: 112) 56) 5' AAT AAT TCC CCG AAC GGC ATT TGA GGA ATC TCT CGC (SEQ ID NO: 113) 55) 5 'GAT TCC TCA AAT ATG GCT CGG GGA ATT ATT ATA GCG (SEQ ID NO: 114) 54) 5' GAT TCC TCA AAT ATG GTT GCC GGA ATT ATT ATA GCG TA (SEQ ID NO: 115) 53) 5' GTA GTC AAA ATA GTA CGC TAT AAT AAT TGC CCG AAC CAT ATT TGA (SEQ ID NO: 116) -.-sfrlti. 52) 5' GTA GTC AAA ATA GTA CGC TAT AAT GGC TCC CCG AAC CAT ATT (SEQ ID NO: 117) 51) 5' GTA GTC AAA ATA GHTA GCG TAT GGC AAT TCC CCG AAC CAT (SEQ ID NO: 118) 50) 5' GTA GTC AAA ATA GTA CGC TGC AAT AAT TCC CCG AAC (SEQ ID NO: 119) 20) 5' GGT GCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA ATA GGC CGC TAT AAT AAT TCC (SEQ ID NO: 120) 19) 5' GGT GCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA AGC GTA CGC TAT AAT AAT TCC (SEQ ID NO: 121) 18) 5' CAG GGT GCC CTG GCC CCA GTA GTC AGC ATA GTA CGC TAT AAT (SEQ ID NO: 122) 17) 5' CAG GGT GCC CTG GCC CCA GTA GGC AAA ATA GTA CGC TAT (SEQ ID NO: 123) 16a) 5' CAG GGT GCC CTG GCC CCA GGC GTC AAA ATA GTA CGC TAT (SEQ ID NO: 124) Los seis cebadores comunes para la PCR de extensión se muestran a continuación. Las secuencias de los sitio BglII (hebra superior) y BstEII (hebra inferior) de flanqueo, se muestran en el tipo resaltado. Cebadores Comunes Delanteros. 10) 5' AGT CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA (SEQ ID NO: 125) 11) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT TCC TCA AAT ATG (SEQ ID NO: 126) 12) 5 'AGA GAT TCC TCA AAT ATG GTT CGG GGA ATT ATT ATA GCG (SEQ ID NO: 127) Cebadores Comunes Inversos . 13) 5' CTT GAG ACG GTG ACC AGG GTG CCC TGG CCC CA (SEQ ID NO: 128) 14) 5' CAG GGT GCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA ATA GTA CGC (SEQ ID NO: 129) 15) 5' GTA GTC AAA ATA GTA CGC TAT AAT AAT TCC CCG AAC (SEQ ID NO: 130) La siguiente tabla muestra la plantilla de partida y los pares cebadores usados secuencialmente para construir fragmentos sintéticos de ADN que contiene residuos de alinanina sustituidos. TABLA III a?«¿^^ts?¡t-=?^^fa^¿ii1Éiíái¿i^ Para los cebadores usados para el barrido con alanina, las condiciones PCR fueron 20 ciclos a 94°C por 20 segundos, después 74°C por 40 segundos. Para las reacciones de extensión con el par cebador 10 + 15, las condiciones fueron 20-25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 42 °C por 1 minutos 30 segundos, 74°C por 20 segundos. Para las reacciones de extensión con el par cebador 10 14, las condicioens fueron 20-25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 48-50°C por 1 min 30 segundos, 74°C por 20 segundos. Para las reacciones de extensión con el par cebador 10 + 13, las condiciones fueron 20-25 ciclos de 94°C por 20 segundos 64° por 1 minutos 30 segundos, 74°C por 20 segundos. Los productos PCR se digirieron con enzimas de restricción BglII y BsEII y se clonaron con FabAT que se _j___-.-----. había digerido con BglII y BstETT, con lo cual se reemplaza el CDR2 de AT con CDR3 de alanina sustituida. Los constructos sustituidos de alanina se verificaron por formación de secuencias de ADN. Variantes de sustitución de cadena pesada CDR3 Se utilizó una estrategia similar a aquella usada para la mutagénesis de barrido de alanina, para la aleatorización de las posiciones S96, S97 y N98 de la cadena pesada CDR3 de "AT" . Las plantillas A y B se generaron como se describió previamente. Las posiciones 96, 97 y 98 se aleatorizaron en un conjunto de 4 cebadores para cada posición. Las posiciones en paréntesis tienen nucleótidos variables como se índica. Para la posición S96 23) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT TGA G(AT) (ACGT) ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 131) 24) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT TGA G(CG) (ACGT) ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 132) 25) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT TGA CT(CGT) ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 133) 26) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT TGA C(AC) (AT) ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 134) Para la posición S97 27) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT G(AT) (ACGT) GGA ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 135) 28) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT G (CG) (ACGT) GGA ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 136) 29) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT CT(CGT) GGA ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 137) 30) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT ATT C (AC) (AT) GGA ATC TCT CGC ACÁ GTA (SEQ ID NO: 138) Para la posición N98 31) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT G (AT) (ACGT) TGA GGA ATC TCT CGC ACÁ (SEQ ID NO: 139) 32) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT G(CG) (ACGT) TGA GGA ATC TCT CGC ACÁ (SEQ ID NO: 140) 33) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT CT(CGT) TGA GGA ATC TCT CGC ACÁ (SEQ ID NO: 141) 34) 5' AAT AAT TCC CCG AAC CAT C (AC) (AT) TGA GGA ATC TCT CGC AC (SEQ ID NO: 142) Las reacciones por PCR se hicieron usando el cebador de aleatorización inversa y cebador 10. El producto resultante se extendió por cuatro reacciones secuenciales de PCR usando pares cebadores 10 + 15, 10 + 14, 10 + 13 y 10 + 22. El extremo 5' de la región variable de la cadena pesada de "AT" , se amplificó de un clon de longitud completa de la región variable de cadena pesada "AT" , usando los cebadores 16 y 72. Todos los productos por PCR se purificaron por gel. Los productos de aleatorización se translaparon con el producto 16/72, con cebadores de :..»-,i^------*----flanqueo que eran 16 y 22. La región variable de longitud completa se clonó después en un vector que contenía la región constante IgGl como un fragmento HindlIl/BsmBI . Los clones del anticuerpo de longitud completa se seleccionaron por formación de secuencias. Cebadores usados para translapar PCR para mutantes por aleatorización 10 5' AGT CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA (SEQ ID NO : 143) 16 5' CAG CAG AGG CTT AGA CCA CCA TGG ACÁ TGA GGG TCC CCG CTC AGC TCC TGG G (SEQ ID NO: 144) 72 5' CAC AGC CGT GTC TTC AGA TCT CAG ACT GCG CAG CTC (SEQ ID NO: 145) 22 5' GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTG (SEQ ID NO: 146) Las variantes S97A, S97A, y N98A se convirtieron de los Fab a anticuerpos de longitud completa por amplificación PCR del clon Fab que tiene la secuencia de señal bacteriana reemplazada con una secuencia de señal mamífera. El ADN plásmido del Fab que contenía la mutación deseada se usó como plantilla. Los pares cebadores secuenciales fueron 21 + 22, 98 + 22, y 16 + 22. Se seleccionaron los clones correctos por análisis de secuencia de ADN. É„á*í_É?f-Él iiiii lT---3li----«*-8u*i^* ¿¡^J^ 3 Las variantes múltiples de alanina (S96A, S8A; S96A, N98A; S97A, N98A y S96A, S97A y N98A) se generaron usando el plásmido IgGl de longitud completa de cadena pesada AT convertido como plantilla. La reacción inicial PCR se llevó a cabo con uno de los cebadores en listados abajo y el cebador 22. Estos productos se extendieron después usando los pares cebadores 10 + 22. Ese producto se translapó después con el producto 16/72 usando cebadores de flanqueo 16 y 22, y clonado en la región constante IgGl como antes. Los clones correctos se seleccionaron por análisis de secuencias de ADN. S96A, A97A 63) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT GCC GCA AAT ATG GTT CGG GGA ATT ATT (SEQ ID NO: 147) S96A, N98A 64) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT GCC TCA GCT ATG GTT CGG GGA ATT ATT ATA GC (SEQ ID NO: 148) S97A, N98A 65) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT TCC GCA GCT ATG GTT CGG GGA ATT ATT ATA GC (SEQ ID NO: 149) S96A, S97A, N98A 66) 5' GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT GCC GCA GCT ATG GTT CGG GGA ATT ATT ATA GC (SEQ ID NO: 150) 21) 5' GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G (SEQ ID NO: 151) j.rf?lt-r ?jjgip^¿atW>th^^S--------^tjfc"————'->*••• ->-H"Jfa¿*--—» 98) 5' CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT (SEQ ID NO: 152) Variantes de inserción de la región CDR3 de cadena ligera La CDR3 de cadena ligera de AT contiene un circuito de 5 aminoácidos que tienen la secuencia QHTRA (SEQ ID NO: 09) . Las variantes de la secuencia CDR3 de cadena ligera se construyeron como sigue. Los siguientes cebadores se usaron por PCR usando un plásmido que contiene un cADN de cadena ligera Fab "AT" como plantilla: (HincII) CCG GTC AAC ACÁ CT (ACGT) (ACGT) (GT)G CGG CGG CGC GGG CGT TCG GCC AAG GG (SEQ ID NO: 153) en donde (ACGT) indica una mezcla de 4 bases en esta posición. CCG GGC GCG CCT TAT TAA CAC TC(AscI) (SEQ ID NO: 154) El producto PCR resultante tuvo una secuencia de circuito CDR3 que va de 5 a 9 aminoácidos y cambia de QHTRA a GHTXAAARA en donde X puede ser cualquier aminoácido. El clon AT se digirió con digestión de HincII y AscI y la región CDR3 de cadena ligera "AT" se reemplazó con la secuencia variante. Los clones que contienen todos los 20 residuos de aminoácidos en la posición X junto con los 3 residuos de alanina insertados en el circuito CDR3 se aislaron y su identidad se confirmó por formación de secuencias de ADN.

Purificación de variantes Fab Las variantes de sustitución con alanina del CDR3 de cadena pesada y as variantes de inserción de CDR3 cadena ligera se produjeron y purificaron como fragmentos Fab por el siguiente procedimiento. Cada variante se hizo crecer en 50 ml de 2XYT con 2% de glucosa y 100 µg/ml de ampicilina mientras se agitaba a 37°C hasta un OD60o de 0.8-1.0. Cada cultivo se acento y se volvió a suspender en 50 ml de 2XYT con 100 µg/ml de ampicilina con 1 mM IPTG a 30°C para inducir la producción de Fab soluble. Los Fab solubles migraron después al área periplásmica y se concentraron durante la noche previo a la liberación por choque osmótico. El choque osmótico se llevó a cabo por el lavado de las células con solución fría de sacarosa 0.2 M en solución amortiguadora Tris y EDTA para romper la pared de las células bacterianas y después diluir rápidamente en una solución fría de baja resistencia osmótica. Los Fab solubles liberados se purificaron en una cromatografía de afinidad de metal TALÓN vía los residuos etiquetados con His 6X en el Fab expresado. Se lavaron las impuresas completamente con NaCl y se disminuyeron las concentraciones de imidazol previo a la elución de la proteína por imidazol. La expresión y purificación de cada mutante se analizó por manchados western reductores, no ^^j¡£ reductores y anti-His. La concentración total de proteína se determino por A2so • Ejemplo 12 Análisis BIAcore de las variantes "AT" La constante de enlace (Kd) en la constante de tasa (Kd) y la constante de tasa apagada (Kd) para las variante de anticuerpo "AT" y la constante de tasa apagada (Kd) para las variantes Fab "AT" , se determinaron por técnicas de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore) usando OPGbp (143-317) inmobilizado. Los resultados se muestran en la tablas IV-VIII. Las variantes CDR3 de cadena ligera descritas en el ejemplo 11 no demuestran un enlace detectable . "-' - - ^i? i ilíifnf Í? . ,jp^*^ TABLA IV Análisis BIAcore de "AT" Fabs de una mutagénesis por barrido de alanina de cadena pesada CDR3 TABLA V Análisis BIAcore de los Abs "AT" de mutagénesis por barrido de alanina del CDR3 de cadena pesada TABLA VI Análisis BIAcore del Abs "AT" substituido en S96 del CDR3 de cadena pesada TABLA VII Análisis BIAcore del Abs "AT" sustituido en S97 de cadena pesada CDR3 TABLA VIII Análisi BIAcore del Abs "AT" substituido en N9 del CDR3 de cadena pesada Aunque la presente invención se a descrito en términos de las modalidades preferidas, se entiende que sucederán variaciones y modificaciones para aquellos expertos en la técnica, por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran tales variaciones equivalentes que vendrían dentro del alcance de la invención como se reivindica. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS < 110> AMGEN INC . < 120> AGENTES DE ENLACE SELECTIVOS ANTAGONISTAS DE LA PROTEINA DE ENLACE DE OSTEOPROTEGERINA <130> A-633A <150> 09/511.139 <151> 2000-02-23 <160> 154 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Arg Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211-> 11 <212> PRT < 213 > HOGG? sap iens <400 > 2 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ala Thr Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213 Homo sapiens -.-.A.J---- l_________É?i__ÍI_l___i_-l-? <400> 7 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln His Thr Arg Ala i 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln His Arg Arg Thr 1 5 <210> 11 <21i> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 ------ —?¿--«_--.—.v> Gln Gln Tyr Gly Ala 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gin Ser Thr Asp Ser Ser Gly Thr Tyr Val Val 1 5 10 <210> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asn Tyr Ala lie His 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213 > Horro sapiens <400> 14 Asn Tyr Pro Met His 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 16 <2il> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Phe Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400= 17 Val He Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly He Ser Trp Asn Ser Gly Arg He Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens -.A-----JJt4---.-,>-,-A J-. -^«^-- *^... .^.- <-.«>» - -------.--_-^.-^^ <400> 19 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tvr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 21 <21i> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Gly Ser Thr Ser Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 ccgactttgc acctagtt <210> 23 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 tttgtcgcct ttccagacgt tagt 24 --a¿-------?-ju ^.-.-,.?^-..»sa¿Í---»a-- ...-.-.---.-.-i- -f-_-.f-t .j .. <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Asp He Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr 1 5 10 15 His Asp Arg Gly 20 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 2 ! Met Glu Trp Ser Tro Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210 26 <211 45 <212 ADN <213-« Homo sapiens <220> <221> CDS <222? ¡18) .. (44) <400> 26 cagaagctta gaccacc atg gaa tgg age tgg gtc ttt etc ttc t 45 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe 1 5 .10= - - -t 8.. t.-i <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe 1 5 <210> 28 <211> 44 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> 12) .. (43) <400> 28 a gct ggg tet ttc tet tet tec tgt cag taa cga ctg gtg tec Ala Gly Ser Phe S°" c - °~- "-- "- 44 Ala Gly Ser Phe Ser Ser Ser Cys G1l-n A-r-g- -Leu .V.a-l S-er 1 5 10 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Gly Ser Phe Ser Ser Ser Cys Gln 1 5 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Leu Val Ser 1 <210> 31 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (42) <400> 31 tca gta acg act ggt gtc cae tca cag gtc cag ctg gtg cag 42 Ser Val Thr Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ser Val Thr Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 1 5 10 <210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Ho o sapiens <400> 33 gtggaggcac tagagacggt gaccagggtg 30 <210-> 34 <211> 22 -i-Jr-l---- -t_ll i_-h^..J-fc«í-l_>. ...^^^_-»_Mj___ -..---^-.«tJt-J. <212> PPT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ara Gly Ala Arg Cys 20 <210> 35 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (17) (46) <400> 35 cagaagcttg accacc atg gac atg agg gtc ccc gct cag etc ctg gg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <2i2? PRG < 13? Homo sapiens <400 36 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu 1 5 10 <210-« 37 <211> 48 <213> Homo sapiens „__ ijtj <220> <221> CDS <222> (3) (47) <400> 37 ce gct cag etc ctg ggg etc ctg cta ttg tgg ttg aga ggt gcc aga t 48 Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ara Gly Ala Aro 1 5 10 15 <210> 38 <21?> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ma Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg 1 5 10 15 <210- 39 <211> 44 <212> ADN < 13^ Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (2) (43) <400> 39 g tgg ttg aga ggt gcc aga tgt gaa att gtg atg acá cag tet c 44 Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu He Val Met Thr Gln Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 14 ^212 PRT <21i> Homo sapiens f.j..- -i... ^----- Ji- " <400> 40 Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu He Val Met Thr Gln Se- 5 10 <210> 41 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (20).. 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'-<l^' Gln Glu Ser Ala Thr Glu Gln Asp Ser Lvs Asp Sei Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ma Aso Tyr Glu Lys His Lys Vai 180 185 190 Tyr Ala Cvs Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 46 <211> 645 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) (645) 400> 46 tet cae agt gca ctt gaa att gtg ctg act cag tet cea gcc acc ctg 48 Ser Hs Ser Ala Leu Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 1 5 10 15 tet ttt tet ccg ggt gaa aga gcc acc etc tec tgc agg gcc agt cag 96 Ser Phe Ser Pro Gly Glu Arg Ala Tnr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 agt gtt ggc age tac tta gcc tgg tac cag cag aga cct ggc cag gct 144 Ser Val Gly Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala 35 40 45 ccc agg ccc etc atc tat gat gca acc aac agg gcc act ggc atc cea 192 Pro Arg Pro Leu He Tyr Asp Ala Thr Asn Arg Ala Thr Gly He Pro 50 55 60 acc agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg acá gac ttc act etc acc atc 240 Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 80 age age cta gag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt caá cae cga 288 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Arg 85 90 95 agg act ttt ggc cgg ggg acc aag ttg gag atc aaa cga act gtg gct 336 Arg Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Ara Thr Val Ala 100 105 110 gca cea tet gtc ttc atc ttc ccg cea tet gat gag cag ttg aaa tet 384 .--<-----. ^—-—--. ..u-jn—^" -z.1. .. .í^. .»-__.,-f--...- Jy| i Ala Pro Ser Val Phe He Pne Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 gga act gcc tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag 432 Gly Tnr Ala Ser Val Val Cye Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc etc caá tcg ggt aac tec 480 Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 cag gag agt gtc acá gag cag gac age aag gac age acc tac age etc 528 Glr. Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 age age acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac gag aaa cae aaa gtc 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lye His Lys Val 180 185 190 tac gcc tgc gaa gtc act cat cag ggc ctg age tcg ccc gtc acá aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 age ttc aac agg gga gag tgt 645 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 47 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ser His Ser Ala Leu Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 1 5 10 15 Ser Phe Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 Ser Vai Gly Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro 2.r Pro Leu He Tyr Asp Ala Thr Asn Arg Ala Thr Gly He Pro 50 55 60 Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Arg 85 90 95 . L Arg Thr Phe Gl_ Arg Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val a 100 105 110 Ala Pro Ser Va-. Phe He Pne Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Tbr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Tnr Leu Thr Leu Ser Lys Aia Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tvr Ala Cvs Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asp Arg Gly Glu Cys 2-.0 215 <2 0> 48 <211> 645 <?.2> ADN <213 • HOTIO sapiens <220> <221> CDS <222> (1) (645) <400-- 48 cae ast gca ctt gaa att gtg atg acá cag tet cea ggc acc ctg tet 48 ns Ser A±a Leu Glu He Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 15 ttg te ea. gsg gaa aga gcc acc etc tec tgc agg gcc agt cag agt 96 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 20 25 30 gtt age age age tec tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct 144 Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lye Pro Gly Gln Ala 35 40 45 ccc agg etc tc atc tat ggt gca tec age agg gcc act ggc atc cea 192 Pro Arg Leu Leu He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg acá gac ttc act etc acc atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Tnr He 65 70 75 80 age aga ctg gag cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat .88 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 ggt gct ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cga act gtg gct 336 Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 gca cea tet gtc ttc atc ttc ccg cea tet gat gag cag ttg aaa tet 384 Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 gga act gcc tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag 432 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc etc caá tcg ggt aac tec 480 Aia Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 cag gag agt gtc acá gag cag gac age aag gac age acc tac age etc 528 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 age age acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac gag aaa cae aaa gtc 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg aac tcg ccc gtc acá aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Asn Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 age ttc aac agg gga gag tgt 645 Ser Phe Asn Arg Giy Glu Cys 210 215 <210> 49 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 His Ser Ala Leu Glu He Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ara Ala Ser Gln Ser 20 25 30 lJfc--ll -- l_----ít*1'-* -.a—------...

Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gil Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 80 Ser Arg Leu Giu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Tnr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Asn Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn ?.rg Gly Glu Cys 210 215 <210> 50 •-211,- 654 <212-> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) (654) a, t¿i--t.__.J .&-,.a---_-at»---j.?-:--- .. - ----- -tefe. <400> 50 tet cae agt gca cag tet gtg ctg act cag cea ccc tcg gtg tca gtg 48 Ser His Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val 1 5 10 15 tec cea gga cag acg gcc acg atc acc tgc tet gga gat gca ttg c a 96 Ser Pro Gly Gln Thr Ala Thr He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro 20 25 30 aag caá tat gtt tat tgg tac cgg cag aag cea ggc cag gcc cct cta 144 Lys Gln Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu 35 40 45 ttg gtg ata tat gaa gac agt gag agg ccc tca ggg atc cct gaa cga 192 Leu Val He Tyr Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg 50 55 60 ttc tet ggc tec agt tca ggg act gaa gtc acg ttg agt atc agt gga 240 Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Glu Val Thr Leu Ser He Ser Gly 65 70 75 80 gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tat tgt caá tca acá gac age 288 Val Gln Aia Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Asp Ser 85 90 95 agt ggg act tat gtc gtc ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336 Ser Gly Thr Tyr Val Val Phe Gly GLy Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 agt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tec tet 384 Ser Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 115 120 125 gag gag ctt caá gcc aac aag gcc acá ctg gtg tgt etc ata agt gac 432 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp 130 135 140 ttc tac ccg gga gcc gtg acá gtg gcc tgg aag gca gat age age ccc 480 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lye Ala Asp Ser Ser Pro 145 150 155 160 gtc aag gcg gga gtg gag acc acc acá ccc tec aaa caá age aac aac 528 Val Lys Ala Gly Val Giu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 165 170 175 aag tac gcg gcc age age tat ctg age ctg acg cct gag cag tgg aag 576 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Tnr Pro Glu Gln Trp Lys 180 185 190 tec cae aga age tac age tgc cag gtc acg cat gaa ggg age acc gtg 624 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 195 200 205 gag aag acá gtg gcc cct acá gaa tgt tca 654 Glu Lys Thr Val Ala Pro Tnr Glu Cys Ser 210 215 <210> 51 <211> 21E ü m»~* á? m?*ß?ÍIlj jkiirdA* ..**----£-«--- <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser His Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Ser Pro Gly Gln Thr Ala Thr He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro 20 25 30 Lys Gln Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu 35 40 45 Leu val lie Tyr Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Glu Val Thr Leu Ser He Ser Gly 65 70 75 80 Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Asp Ser 85 90 95 Ser Gly Thr Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Ser Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 115 120 125 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp 130 135 140 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 145 150 155 160 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 165 170 175 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 180 185 190 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 195 200 205 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 .---¡¡a-»»?- • -t,i.i-i..a -- -a—_ t._ |i*.fa-4--a <210> 52 <211> 690 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. 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Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val 20 25 30 Lys Thr Ser He Lys He Pro 35 <210> ^9 <211> 39 <212> PRT <213> Mus usculus <400> 79 Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn He Cys Phe Arg His His Glu Thr 1 5 10 15 Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val 20 25 30 Lys Thr Ser He Lys He Pro 35 <210> 80 <211> 17 <212> PRT < 213 -- Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> ( 1 ) ( 1 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente del aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220 < 221 > Características diversas <223 Sintético <400-- 80 Xaa Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 81 <2 i:> i" <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222 (2 ) ( 2 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 81 Asp Xaa Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 82 <211> 17 <21?> PPT < 213 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas <222> ( 3 * ( 3 ) < 223 -> X es cualquier aminoácido diferente del aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <- 223 -» Sintético , ' *""*»•• -ajean-.-- -.-f»-.. <400> 82 Asp Ser Xaa Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 83 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (4) .. (4) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 83 Asp Ser Ser Xaa Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 84 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (5) .. (5) t-,?-.--í-á-— f? i----! r-iiM-ft ilaü-a-ij- . ^-t i? ¡á- rti "iüi 'É-ñ? i < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> <2 1 > Características diversas <223 Sintético <400> 84 Asp Ser Ser Asn Xaa Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> ( 6 ) . . ( 6 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 85 Asp Ser Ser Asn Met Xaa Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 86 <211> 17 <212> PRT fcuL-»-¡to- ---¿-- jJá^«----l-¿---i-. «» --*-»•'• &¡->*,«a---, .....sJtíiíMf?M^ á.íi < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (7) .. (7) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 86 Asp Ser Ser Asn Met Val Xaa Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr *.210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (8) . (8) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas < 223 > Sintético <400> 87 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Xaa He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 m*.»*-!.»*».- ..--»-[----«--.-.-. .,—-.—--...-----.----<»."—-*—' -"»-?- Tyr 210> 88 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> <2 1> Características diversas <222> (9) .. (9) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 88 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly Xaa He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 89 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (10) .. (10) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición -20> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 89 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He Xaa He Ala Tyr Tyr Phe Aep 1 5 10 15 Tyr <210> 90 <2H> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (11) .. (11) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 90 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He Xaa Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <.210> 91 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> ii-a,áJ,- [--A---..., .. ; .-_.--»^^-..^j^a-^a^-^"-'-^~^.<~.^~ -?l"l - ? — --¿ -.- i <221> Características diversas <222> ( 12 ) . . ( 12 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Caracteristicas diversas <223> Sintético <400> 91 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Xaa Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 92 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Caracteristicas diversas <222> ( 13 ) . . ( 13 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> <221> Características diversas <223> Sintético <400> 92 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Xaa Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 93 H H H-tti-to ..-J-M-ií <211> 17 <212> PRT < 13 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> ( 14 ) ( 14 ) < 223 > X ee cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 93 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Xaa Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 94 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 2 1 > Características diversas <222> ( 15 ) ( 15 ) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al amioácido que reside normalmente nt en tal posición <220> <221> Caracteríticas diversas <223> Sintético ,J n--.f*-t--» .> - --»-----.. <400> 94 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Xaa Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 95 <2il> 17 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222> (16) .. (16) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición <220> <221> Características diversas <223> Sintético <400> 95 Asp Ser Ser Asn Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Xaa 1 5 10 15 Tyr <210> 96 <211> 17 <212> PRT < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Caracteristicas diversas <222> (17) .. (17) < 223 > X es cualquier aminoácido diferente al aminoácido que reside normalmente nt en tal posición jé-r-j. J. -.---- ----->'. .ü,.-.--:... -. ---.^.«M^. <220> < 221 > Características diversas <223> Sintético <400> 96 Asp Ser Ser Aen Met Val Arg Gly He He He Ala Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Xaa <210> 97 <211> 9 <212> PRT < 2 i 3 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <222 > ( 4 ) . . ( 7 ) < 223 > Primera apapción de X de izquierda a derecha denota cualquier residuo de aminoácido diferente a la arginina, la segunda, tercera y cuarta aparición de X, denota cualquier residuo de aminoácido <220-> < 2 1 > Características diversas <223> Sintético <400> 97 Gln His Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Ala 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PR1 < 213 > Secuencia artificial — -_..a----- -lír .. <400> 100 cctctcatat ggactacaag gac 23 <210> 101 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 101 agtagccagg tctcccgatg tttcatgatg 30 <210> 102 <211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 2 ? 3 > Oligonucleotido sintético <400> 102 ctggetactg aatatcttca gctgatggtg 30 <210> 103 <211> 25 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético i, ti J <^ -*" **iA— - '"• -•*-" .jj-a,--- > "*- * «*»"*- - - *£** ! ?á? 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< 213 > Secuencia artificial • "üff.1.'"" -.-.--^ ,iM**M,í** * .....-.-^--yyi i^^^ ^ £^^^g <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 109 gtgtattact gtgcgagagc ttcctcaaat atggttcgg 39 <210> 110 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 110 gtgtattact gtgcgagaga tgcctcaaat atggttcgg 39 <210> 111 <211> 42 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótído sintético <400> lil aataattccc cgaaccatat ttgcggaatc tctcgcacag ta 42 <210> 112 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 112 aataattccc cgaaccatag ctgaggaatc tctcgcace 39 <210> 113 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 113 aataattccc cgaacggcat ttgaggaatc tctcgc 36 <210> 114 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Caracteristicas diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 114 gattcctcaa atatggctcg gggaattatt atagcg 36 <210> 115 <211> 38 i«- i»—b—t.fc-fat--..-.. • •—?..-fcl?j>1>ja^_ia1¿--.-.-..,, —á-_- i-t --.-_,jj¿_--_ ..i.---.......-.———^. -..--t.-i--..-B->) . <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 2 1 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 115 gattcctcaa atatggttgc cggaattatt atagcgta 38 <210> 116 <211> 45 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 116 gtagtcaaaa tagtacgcta taataattgc ccgaaccata tttga 45 <210> 117 <211> 42 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 117 gtagtcaaaa tagtacgcta taatggctcc ccgaaccata tt 42 <210> 118 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 118 gtagtcaaaa tagtacgcta tggcaattcc ccgaaccat 39 <210> 119 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 119 gtagtcaaaa tagtacgctg caataattec cegaac 36 <210> 120 <211> 45 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Caracteristicas diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 120 ggtgccctgg ccccagtagt caaaataggc cgctataata attec 45 <210> 121 <211> 45 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <223> Oligonucleótido sintético <400> 121 ggtgccctgg ccccagtagt caaaagcgta cgctataata attec 45 <210> 122 <211> 42 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 2 1 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 122 cagggtgccc tggccccagt agtcagcata gtacgctata at 42 <210> 123 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 123 cagggtgccc tggccccagt aggcaaaata gtaegetat 39 <210> 124 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 124 cagggtgccc tggccccagg cgtcaaaata gtacgctat 39 <210> 125 <211> 42 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 125 agtctgagat ctgaagacac ggetgtgtat tactgtgcga ga 42 <210> 126 <211> 33 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <2 3> Oligonucleótido sintético <400> 126 gtgtattact gtgcgagaga ttcctcaaat atg 33 <210> 127 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 127 agagattect caaatatggt teggggaatt attatageg 39 <210> 128 <211> 32 <212> ADN < 1 > Secuencia artificial <220> <221> Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 128 cttgagacgg tgaccagggt gccctggccc ca 32 <210> 129 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético j?MJrÚ?jí- i-U^? ¡ ! •--->--— <400> 129 cagggtgccc tggccccagt agtcaaaata gtacgc 36 <210> 130 <211> 36 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 130 gtagtcaaaa tagtacgcta taataattcc cegaac 36 <210> 131 <211> 46 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <223 > Oligonucleótido sintético <400> 131 aataattccc cgaaccatat ttgagatacg tatctctcgc acagta 46 <210> 132 <211> 46 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 132 aataattccc cgaaccatat ttgagcgacg tatctctcgc acagta 46 <210> 133 <211> 44 <212> ADN < 21 > Secuencia artificial <220> <221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 133 aataattccc cgaaccatat ttgactcgta tctctcgcac agta 44 <210> 134 <211> 44 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Ollgonucleótido sintético <400> 134 aataattccc cgaaccatat ttgacacata tctctcgcac agta 44 <210> 135 <211> 46 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 135 aataattccc cgaaccatat tgataegtgg aatctctcgc acagta 46 <210> 136 <211> 46 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 136 aataattccc cgaaccatat tgcgacgtgg aatctctcgc acagta 46 <210> 137 <211> 44 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 137 aataattccc cgaaccatat tctcgtggaa tctctcgcac agta 44 <210> 138 <211> 44 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial - ^- -.^-.--.-.-^^.,.fe^a-^..^-^-^^'^-^.^»-^-"^^ -°^-i t4-*^ <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 138 aataattccc cgaaccatat tcacatggaa tctctcgcac agta 44 <210> 139 <211> 43 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 139 aataattccc cgaaccatga tacgttgagg aatctctcgc acá 43 <210> 140 <211> 43 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 140 aataattccc cgaaccatgc gacgttgagg aatctctcgc acá 43 <210> 141 <211> 41 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial ,.---J-y--* - ?.--f-..f|-- í-.ff <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 141 aataattccc cgaaccatct cgttgaggaa tctctcgcac a 41 <210> 142 <211> 41 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 142 aataattccc cgaaccatca cattgaggaa tctctcgcac a 41 <210> 143 <211> 42 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 2 1 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 143 agtctgagat ctgaagacac ggetgtgtat tactgtgcga ga 42 <210> 144 <211> 52 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 144 cagcagaagc ttagaccacc atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gg 52 <210> 145 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 145 cacagccgtg tcttcagatc tcagactgcg cagetc 36 <210> 146 <211> 30 <212> ADN < 13 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleótido sintético <400> 146 gtggaggcac tagagacggt gaccagggtg 30 <210> 147 <211> 48 iiíüitirt' •' "*• *-***— •^-*-fa-> <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <223> Oligonucleotido sintético <400> 147 gtgtattact gtgcgagaga tgccgcaaat atggttcggg gaattatt 48 <210> 148 <2il> 53 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <223> Oligonucleotido sintético <400> 148 gtgtattact gtgcgagaga tgcctcagct atggttcggg gaattattat age 53 210> 149 <?11> 53 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < ? ? 3 > Oligopucleótido sintético <400> 149 gtgtattact gtscgagaga ttccgcagct atggttcggg gaattattat age 53 <210> 150 a ?i?iK? ?i?iÉi-i..?? .? r miÉli --ni-fÉiiir a." ttff-f. i'Jtt tfc ,aag*f'^'*~" " ''"jt" '**--A - <211> 53 <212 > ADN < 2 i 3 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <2 3> Oligonucleótido sintético <400> 150 gtgtattact gtgcgagaga tgccgcagct atggttcggg gaattattat age 53 <210> 151 <211> 40 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> •«.221 > Características diversas < 223 > Oligopucleótido sintético <400> 151 gtggttgaga ggtgccagat gtcaggtcca gctggtgcag 40 <210> 152 <211> 48 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas < 223 > Oligonucleotido sintético <400> 152 ccgctcagct cctggggctc ctgctattgt ggttgagagg tgccagat 48 tff -...--..---_ -i -.-..-----». <210> 153 <2H> 51 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 2 1 > Características diversas <223 > Oligonucleótido sintético <400> 153 ccggtcaaca cactacgtac gtgtgcggcg gcgcgggcgt tcggccaagg g 51 <210> 154 <211> 23 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <220> < 221 > Características diversas <223 > Oligonucleótido sintético <400> 154 ccgggcgcgc cttattaaca etc 23 ?j-a--.J-?.-?,.j--¿.>.. *. *~-.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno, o fragmento, variante o derivado del mismo, caracterizado porque se enlaza a un proteína de enlace de osteoprotegerina y es un anticuerpo antagonista.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de enlace de osteoprotegerina es una proteína de enlace de osteoprotegerina mamífera.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de enlace de osteoprotegerina es una proteína de enlace de osteoprotegerina humana o un fragmento inmunogénico de la misma.
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el fragmento inmunogénico comprende al menos parte del dominio extra celular de una proteína de enlace de osteoprotegerina humana .
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe el enlace 184 de la proteína de enlace de osteoprotegerina a un receptor de activación y diferenciación de osteoclastos.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la formación o activación de osteoclastos.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la resorción del hueso.
8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de Fv, scFv, Fab, Fab' y F(ab')2-
9 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo humano .
10. Un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno caracterizado porque comprende (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada Fab como se muestra en la figura 9 (SEQ ID NO: 51) o figura 10 (SEQ ID NO: 53) ; (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada que comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos de la secuencias en (a) ; (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada que es al menos alrededor de 80% idéntica con la secuencia en (a) ; o ¿^jg^^^^^jtg^ iji (d) un fragmento derivado de (a) , (b) , o (c) ; en donde el anticuerpo o dominio de enlace de antígeno se enlaza selectivamente a OPGbp.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además una cadena ligera lambda o kappa.
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además una región Fc humana.
13. Un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno que reconoce un epitope en un OPGbp humano reconocido por un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada Fab como se muestra en la figura 9 (SEQ ID NO: 51) o en la figura 10 (SEQ ID NO: 53) y la secuencia de aminoácido ligera Fab como se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO: 43) o figura 6 (SEQ ID NO: 45) .
14. Un dominio de enlace de anticuerpo o de antígeno caracterizado porque comprende una cadena ligera variable (Vi) y una cadena pesada variable (Vh) : en donde cada cadena Vi comprende secuencia de aminoácidos CDR designadas CDRl (Vx) , CDR2 (Vx) y CDR3 (Vx) separadas por secuencias de aminoácidos de estructura CDRl (Va.) que se seleccionan del grupo que consiste de: RASQSISRYLN (SEQ ID NO: 01) ; tjÉte ^Ulí^ 186 RASQSVGSYLA (SEQ ID NO: 02); RASQSVSSSSLA (SEQ ID NO: 03) y SQDALPKQY (SEQ ID NO: 04); CDR2 (Vi) se selecciona del grupo que consiste de: GASS QS (SEQ ID NO: 05) DATNRAT (SEQ ID NO: 06) GASSRAT (SEQ ID NO: 07) EDSERPS (SEQ ID NO: 08) y CDR3 (Vi) se selecciona del grupo que consiste de: QHTRA (SEQ ID NO: 09); QHRRT (SEQ ID NO: 10); QQYGA (SEQ ID NO: 11) ; y QSTDSSGTYW (SEQ ID NO: 12); En donde CDRl (Vx) , CDR2 (Vx) y CDR3 (Va) se selecciona independientemente uno de la otra y En donde cada cadena Vh comprende la secuencia de aminoácidos CDR designadas CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) , CDR3 (Vh) , separadas por las secuencias de aminoácidos de estructura CDRl (Vh) , se selecciona del grupo que consiste de: NYAIH (SEQ ID NO: 13); NYPMH (SEQ ID NO: 14); y DYAMH (SEQ ID NO: 15) CDR2 (Vh) se selecciona del grupo que consiste de: INAGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16); VISYDGNNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 17); y a---t-i- 187 GIS NGRIGYADSVKG (SEQ ID NO: 18) CDR3 (Vh) se selecciona del grupo que consiste de: DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); GGGGFDY (SEQ ID NO : 20); y GGSTSARYSSG YY (SEQ ID NO: 21) En donde CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) y CDR3 (Vh) se seleccionan independientemente uno del otro.
15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende una cadena ligera variable (Vx) y una cadena pesada variable (Vh) en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia RASQSISRY N (SEQ ID NO: 01), CDR2 que tiene la secuencia GASSLQS (SEQ ID NO: 05) , y CDR3 que tiene la secuencia QHTRA (SEQ ID NO: 09), y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID NO: 13), CDR2 que tiene la secuencia WINAGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y CDR3 que tiene la secuencia DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena VI y Vh se separan por secuencia de aminoácidos de estructura.
16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque comprende además una región humana Fc . 188
17. Un anticuerpo caracterizado porque comprende una cadena ligera variable (Vi) y una cadena pesada variable (Vh) en donde : la cadena Vi comprende una variante somática o reconfigurada de la secuencia de la línea germinal de la figura 19 (SEQ ID NO: 66), y la cadena Vh comprende una variante somática o re arreglada de la secuencia de la línea germinal de la figura 16 (SEQ ID NO: 59) ; y el anticuerpo se enlaza selectivamente a una proteína de enlace de osteoprtegerina .
18. Un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable (Vx) y una cadena pesada variable (Vh) en donde: la cadena Vi comprende una variante somática o reconfigurada de la secuencia de la línea germinal de la figura 20 (SEQ ID NO: 68); la cadena Vh comprende una variante somática o reconfigurada de la secuencia de la línea germinal de la figura 16 (SEQ ID NO: 59); y el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de osteoprotegerin .
19. Un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable (Vi) y una cadena pesada variable (Vh) caracterizado porque: la cadena Vx comprende una variante somática o reconfigurada durante la secuencia de la línea germinal de la figura 21 (SEQ ID NO: 70), y la cadena Vh comprende una variante somática o reconfigurada de la secuencia de la línea germinal de la figura 17 (SEQ ID NO: 62) , y el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina .
20. Un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable (Vi) y una cadena pesada variable (Vh) caracterizado porque: la cadena Vi comprende una variante somática o reconfigurada durante la secuencia de la línea germinal de la figura 22 (SEQ ID NO: 72), y la cadena Vh comprende una variante somática o reconfigurada de la secuencia de la línea germinal de la figura 18 (SEQ ID NO: 64) , y el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina .
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, una anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena simple o un heteroanticuerpo .
22. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica en anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ó 21.
23. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22.
24. Una célula huésped caracterizado porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 23.
25. La célula huésped de la reivindicación 24, caracterizado porque es una célula CHO.
26. Un método para la producción de un anticuerpo, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 25 bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico.
27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicaciones, 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 caracterizado porque el isotipo IgG se selecciona de IgG, IgM, IgA, IgE y IgD.
28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el isotipo es IgGi, IgG2, IgG3 ó IgG4.
29. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo o el dominio de enlace de antígeno, o fragmento variante o derivado del mismo, de cualesquiera de las -..^-^«.^.aa.^é.i reivindicaciones 1, 10, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ó 21 y un portador farmacéuticamente aceptable.
30. Un método para inhibir la formación de osteclastos o la activación, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 29.
31. Un método para inhibir la resorción del hueso, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 29.
32. Un método para prevenir o tratar la pérdida de masa ósea caracterizada por que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de la composición de la reivindicación 29.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la pérdida de masa ósea resulta de osteoporosis como metástasis al hueso, artritis reumatoide, hipercalcemia de malignidades o osteoporosis inducida por esteroides.
34. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30, 31, 32, ó 33, caracterizado porque comprende además administrar una composición que comprende al menos un agente adicional anti-resorción del hueso.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agente anti-resorción es un estrógeno, un bisfosfonato, o un modulador receptor de estrógeno selectivo.
36. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30, 31, 32, ó 33, caracterizado porque comprende además administrar una composición que comprende un agente anabólico para el hueso.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el agente anabólico es la hormona paratiroide o un complejo del factor de crecimiento del tipo insulina y la proteína de enlace del factor de crecimiento tipo insulina.
38. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30, 31, 32, ó 33, caracterizado porque comprende además administrar un inhibidor de la interleucin-1 o un inhibidor del factor alfa de necrosis de tumor.
39. Un método para prevenir o tratar el crecimiento de células de tumor en el hueso, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 29.
40. Un anticuerpo o dominio de enlace antígeno, caracterizado porque reconoce un epítope DE en la proteína de enlace humana de la osteoprotegerina (OPGbp) . 193
41. Un anticuerpo o dominio de enlace antígeno, caracterizado porque reconoce un epítope DE en la OPGbp humana .
42. El anticuerpo o dominio de enlace antígeno, de conformidad con la reivindicación 40 ó 41, caracterizado porque el epítope DE comprende la secuencia DLATE.
43. Un anticuerpo o dominio de enlace de antígeno, que se enlaza a un OPGbp murino, caracterizado porque comprende las substituciones de aminoácidos S229D, V230L, P231A y D233E, pero no se enlaza al POPGbp murino que carece de tales substituciones.
44. El anticuerpo o dominio de enlace antígeno, de conformidad con la reivindicación 40, 41, 42 ó 43, caracterizado porque inhibe la formación de la activación de osteoclastos.
45. El anticuerpo o dominio de enlace antígeno, de conformidad con la reivindicación 40, 41, 42 ó 43, caracterizado porque inhibe la resorción del hueso.
46. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque la cadena VI comprende un CDRl que tiene la secuencia RASQSISRYLN (SEQ ID NO.01), un CDR2 que tiene la secuencia GASSLQS (SEQ ID NO: 05), y un CDR3 que tiene la secuencia QHTRA (SEQ ID NO: 9); y en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena VI se separan por secuencias 194 de estructura de aminoácidos, y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina .
47. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque la cadena Vh comprende un CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID N0.13), CDR2 que tiene la secuencia INANGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y el CDR3 tiene la secuencia DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena Vh se separan por secuencias de estructura de aminoácidos y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina.
48. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque: la cadena VI comprende un CDRl que tiene la secuencia RASQSISRYLN (SEQ ID NO: 01), un CDR2 que tiene la secuencia GASSLQS (SEQ ID NO:05), y un CDR3 que tiene la secuencia QHTRA (SEQ ID NO:9); y la cadena Vh comprende un CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID N0.13), CDR2 que tiene la secuencia WINANGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y el CDR3 tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de: XSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 80) DXSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 81) DSXNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 82) DSSXMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 83) DSSNXVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 84) DSSN XRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 85) DSSNMVXGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 86) DSSN VRXIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 87) DSSNMVRGXIIAYYFDY (SEQ ID NO: 88) DSSNMVRGIXIAYYFDY (SEQ ID NO: 89) DSSNMVRGIIXAYYFDY (SEQ ID NO: 90) DSSNMVRGIIIXYYFDY (SEQ ID NO: 91) DSSNMVRGIIIAXYFDY (SEQ ID NO: 92) DSSNMVRGIIIAYXFDY (SEQ ID NO: 93) DSSNMVRGIIIAYYXDY (SEQ ID NO: 94) DSSNMVRGIIIAYYFXY (SEQ ID NO: 95); y DSSNMVRGIIIAYYFDX (SEQ ID NO: 96) en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena VI y Vh se separan por secuencias de estructura de aminoácidos y X es cualquier aminoácido diferente del aminoácido normalmente residente en esa posición; y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina.
49. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque: fi.rs 196 la cadena Vh comprende un CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID NO: 13), CDR2 que tiene la secuencia WINANGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y el CDR3 tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de: XSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 80) DXSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 81) DSXNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 82) DSSXMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 83) DSSNXVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 84) DSSNMXRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 85) DSSNMVXGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 86) DSSNMVRXIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 87) DSSNMVRGXIIAYYFDY (SEQ ID NO: 88) DSSNMVRGIXIAYYFDY (SEQ ID NO: 89) DSSNMVRGIIXAYYFDY (SEQ ID NO: 90) DSSN VRGIIIXYYFDY (SEQ ID NO: 91) DSSNMVRGIIIAXYFDY (SEQ ID NO: 92) DSSNMVRGIIIAYXFDY (SEQ ID NO: 93) DSSNMVRGIIIAYYXDY (SEQ ID NO: 94) DSSNMVRGIIIAYYFXY (SEQ ID NO: 95); y DSSNMVRGIIIAYYFDX (SEQ ID NO: 96) en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena VI y Vh se separan por secuencias de estructura de aminoácidos y X es cualquier aminoácido diferente del aminoácido normalmente residente en esa posición; y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina.
50. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque: la cadena VI comprende un CDRl que tiene la secuencia RASQSISRYLN (SEQ ID NO:01), un CDR2 que tiene la secuencia GASSLQS (SEQ ID N0:05), y un CDR3 que tiene la secuencia QHTRA (SEQ ID NO: 9); y la cadena Vh comprende un CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID NO:13), CDR2 que tiene la secuencia WINANGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y el CDR3 tiene una o más substituciones de aminoácidos en la secuencia DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena VI y Vh se separan por secuencias de estructura de aminoácidos y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina.
51. Un anticuerpo que comprende una cadena variable ligera (VI) y una cadena variable pesada (Vh) , caracterizado porque: la cadena Vh comprende un CDRl que tiene la secuencia NYAIH (SEQ ID N0.13), CDR2 que tiene la secuencia WINANGNGNTKFSQKFQG (SEQ ID NO: 16), y el CDR3 tiene una o 198 más substituciones de aminoácidos en la secuencia DSSNMVRGIIIAYYFDY (SEQ ID NO: 19); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 , en cada cadena VI y Vh se separan por secuencias de estructura de aminoácidos y en donde el anticuerpo se enlaza selectivamente a la proteína de enlace de la osteoprotegerina.
52. Un anticuerpo o dominio de antígeno caracterizado porque se enlaza selectivamente a un OPGbp humano con una constante de disociación (KD) de alrededor de 1 nm o menos .
53. Un anticuerpo o dominio de antígeno caracterizado porque se enlaza selectivamente a un OPGbp humano con una constante de tasa de disociación (kd) de alrededor de 3 x 10-3 o menos.