KR20140110017A - 항암 융합 단백질 - Google Patents

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아다메드 에스피. 제트 오.오.
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Abstract

본 발명은 hTRAIL95 보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하는, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성을 가지며 hTRAIL281의 위치에 있는 아미노산으로 종결하는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a) 및 세포막에서 구멍을 형성하는 세포용해성 효과기 펩타이드의 서열인 하나 이상의 도메인 (b)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 또는 N-말단에 부착되어 있다. 상기 융합 단백질은 암 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

항암 융합 단백질{Anticancer fusion protein}
본 발명은 치료적 융합 단백질, 특히 재조합 융합 단백질 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 가용성 인간 TRAIL 단백질의 서열 및 세포막 또는 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하는 펩타이드의 서열의 단편을 포함하는 융합 단백질, 이를 함유하는 약학적 조성물, 치료에서, 특히 항암제로서의 이의 용도, 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
Apo2L (Apo2-리간드)로도 공지되어 있는 사이토카인 계열의 구성원인 TRAIL (종양 괴사 인자-관련된 아폽토시스 유도 리간드) 단백질은, 바이러스에 의해 감염된 세포 및 종양 세포에서 아폽토시스의 강력한 활성제이다. TRAIL은 체내에서 자연적으로 발생하는 리간드이다. TRAIL 단백질, 이의 아미노산 서열, 코딩 DNA 서열의 서열 번호 및 단백질 발현 시스템은 EP 0 835 305 A1호에 최초로 개시되었다.
TRAIL 단백질은 아폽토시스 유발성 (pro-apoptotic) 표면 TRAIL 수용체 1 및 2 (TRAIL-R1/R2)에 결합하고 이어서 이들 수용체를 활성화시킴으로써 항암 활성을 나타낸다. DR4 및 DR5로도 공지되어 있는 이들 수용체(사멸 수용체 4 및 사멸 수용체 5)는 TNF 수용체 계열의 구성원이며 상이한 유형의 암세포에 의해 과발현된다. 이들 수용체의 활성화는, 활성화된 카스파제-8에 의해 실행성 카스파제의 활성화 및 이로 인한 핵산의 분해를 초래하는 억제 유전자 p53-독립적인 아폽토시스의 외부 신호전달 경로를 유도할 수 있다. TRAIL 활성화시에 방출된 카스파제-8은 또한 절단된 Bid 단백질의 방출을 유도할 수 있고, 이러한 Bid 단백질은 미토콘드리아로 전위되고, 이는 시토크롬 c의 방출을 자극하여, 사멸 수용체로부터 아폽토시스 신호를 간접적으로 증폭시킨다.
TRAIL은 이러한 단백질에 대해 내성을 나타내는 건강한 세포 내에서 아폽토시스를 필수적으로 유도하지 않고 종양 세포에 선택적으로 작용한다. 그러므로, TRAIL의 엄청난 잠재성은 혈액암 및 고형 종양을 포함한 광범위하고 상이한 유형의 종양에 작용하며 동시에 정상 세포에는 영향을 주지 않고 잠재적으로 비교적 작은 부작용을 나타내는 항암제로서 인식되었다.
TRAIL 단백질은 281개의 아미노산 길이를 가지는 유형 II 막 단백질이며, 프로테아제에 의한 절단시 아미노산 잔기 114-281을 포함하는 이의 세포외 영역은 생물학적으로도 또한 활성인 20 kDa 크기의 가용성 sTRAIL 분자를 형성한다. TRAIL 및 sTRAIL의 두 형태는 표적 세포 상에 존재하는 TRAIL 수용체와의 상호 작용을 통해 아폽토시스를 촉발할 수 있다. TRAIL 분자의 가용성 부분의 강한 항종양 활성 및 매우 낮은 전신 독성은 세포주 시험을 사용하여 입증되었다. 또한, INN 둘라너민(dulanermin)으로 알려진 hTRAIL의 아미노산 114-281에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 재조합 인간 가용성 TRAIL(rhTRAIL)에 관한 예비 인간 임상 연구는 이의 양호한 내성 및 독성 제한 용량의 부재를 보여주었다. 현재까지 보고된 간 세포에 대한 재조합 TRAIL 단백질의 독성 효과는 변형, 즉 폴리히스티딘 태그의 존재와 관련되는 것으로 보이며, 태그되지 않은 TRAIL은 어떠한 전신 독성도 나타내지 않았다.
예를 들면, EP 1 688 498에서 122-281hTRAIL의 재조합 원형 과변이된 돌연변이체에 대해 최근 보고된 바와 같이, 114-284 보다 짧은 TRAIL의 단편도 또한 막 사멸 수용체와 결합하고, 이들 수용체를 통해 아폽토시스를 유도할 수 있다.
그러나, 환자에 대한 추가의 임상 시험에서, 단일요법으로서의 TRAIL의 실제 효능은 낮은 것으로 입증되었다. 또한, 다수의 암세포에 의해 나타난 TRAIL에 대한 원발성 또는 후천성 내성은 문제가 있었다(예를 들면, WO 2007/022214 참조). 내성은 각종 메커니즘으로 인한 것일 수 있으며, 암 유형에 특이적이고/이거나 환자-의존적일 수 있다[Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24]. 이러한 내성은 항암제로서의 TRAIL의 유용성을 제한한다. TRAIL에 대한 내성의 메커니즘이 완전하게 이해되진 않았지만, 세포 표면 수용체의 수준으로부터 신호 전달 경로 내의 실행성 카스파제까지의 범위의 TRAIL-유도 아폽토시스 경로의 상이한 수준에서, 그 자체는 명백할 수 있는 것으로 믿어진다.
이러한 낮은 효능 및 TRAIL에 대한 종양의 내성을 극복하기 위해, 방사선요법제 및 화학요법제를 사용하는 각종 조합 요법이 설계되었으며, 이는 상승적인 아폽토시스 효과를 유발하였다(WO 2009/002947; [A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14(2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9(2010), p.1527-1533]). 선택된 통상의 화학요법제(파클리탁셀, 카보플라틴) 및 단일클론 항-VEGF 항체와의 조합에 의한 암치료를 위한 rhTRAIL의 용도는 WO 2009/140469에 개시되어 있다. 그러나, 이러한 조합은 종래의 화학요법 또는 방사선요법의 잘 공지된 결함을 필수적으로 내포한다. 그러나, 종래 기술은 TRAIL 단백질을 다른 단백질 또는 이의 단편과 융합시킴으로써 수득된 TRAIL에 대한 세포 내성의 제거를 제안하는 임의의 데이터에 대하여 침묵하고 있다.
더욱이, TRAIL 요법과 관련된 문제는 이의 낮은 안정성 및 투여 후 신체로부터의 신속한 제거인 것으로 입증되었다.
세포막 또는 미토콘드리아막 붕괴 (불연속)의 결과로서의 암세포 파괴 및 종량 증식 억제의 효과는 공지되어 있다. 항암 치료와 보조 항암 치료 둘 다로서 막 붕괴를 가능하게 하는 세포용해 효과를 가지는 물질을 사용하려는 시도도 또한 이루어지고 있다.
세포용해 활성을 가지는 다수의 천연 및 합성 펩타이드 및 단백질은 공지되어 있다. 세포용해성 펩타이드는 또한 구멍 형성 펩타이드 또는 세포용해소로서 개시되어 있다. 구멍 형성 펩타이드와 막 표면의 상호작용은 양으로 하전된 펩타이드와 음으로 하전된 세포막 표면의 비특이적 정전기 상호작용에 기초할 수 있다.
이들 펩타이드는 일반적으로 양이온 성질을 가지므로, 대부분 음으로 하전된 입자를 가지는 표면과 정전기 상호작용을 가능하게 한다. 세포용해성 펩타이드가 세포 표면상의 지질, 세포 내부로의 침투 후 미토콘드리아막 표면상의 지질과 접촉 및 상호작용할 때, 세포막 연속성이 중단되고, 이어서 소형 막관통 구멍이 형성되고, 이온을 포함한 세포질 내용물이 세포 외부로 누출되어, 세포에서의 신속한 비가역적 전해질 불균형, 세포 용해 및 사멸을 유발한다.
구멍 형성 펩타이드와 막 표면의 상호작용은 또한 표면상에 존재하는 특정 수용체와의 상호작용을 포함할 수 있다.
세포막에서 구멍을 형성할 수 있는 세균, 식물 또는 포유동물 기원의 공지된 자연적으로 발생하는 세포용해성 펩타이드는 종종 용혈소로 칭해지는데, 이는 이들이 절혁구 및 다른 진핵 세포의 용해를 유발하기 때문이다. 이들 독소는 세크로핀 A 및 B, 아우레인 1.2, 시트로핀 1.1, 디펜신 (HNP-2), 락토페리신 B, 타키플레신, PR-39, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis)의 세포용해소, δ 용혈소, 디프테리아 독소, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 세포용해소, 악티니아 에퀴나 (Actinia equina) 유래의 독소, 그라눌라이신, 스트렙토코커스 인터미디우스 (Streptococcus intermedius) 유래의 용해성 펩타이드, 렌티바이러스 용해성 펩타이드, 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 류코톡신, 마가이닌, 멜리틴, 림포톡신, 엔케팔린, 파라닥신, 퍼포린 (특히, 이의 N-말단 단편), 클로스트리듐 페르프린젠스 (Clostridium perfringens) 유래의 퍼프링고라이신 O (PFO/θ 독소) 및 스트렙토라이신을 포함한다. 약제로서의 이들의 유용성은 용혈을 일으키는 이들의 능력에 의해 제한된다.
천연 세포용해성 펩타이드는, 예를 들면, 문헌[R. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368]에 개시되어 있다.
합성 세포용해성 구멍 형성 펩타이드도 또한 공지되어 있다. 이들은 용혈 특성이 전혀 없거나, 덜 면역원성이거나, 예를 들면, VEGFR (혈관 내피 성장 인자 수용체) 계열 수용체 및 EGFR (상피 성장 인자 수용체) 계열의 수용체와 같은 세포 표적에 대해 높은 결합 특이성을 가능하게 하는 표면을 가지도록 설계된다. 이들은 종종 세크로핀 A 단편과 마가이닌 2 CA (1-8) MA (1-12) 단편의 하이브리드 또는 세크로핀 A 단편과 멜리틴 CAMEL (CA (1-7) MEL (2-9)) 단편의 하이브리드와 같은 천연 세포용해성 펩타이드 단편의 하이브리드이다. 일부가 D-아미노산의 형태인 아미노산 라이신, 아르기닌 및 류신으로 이루어진, 합성 세포용해성 펩타이드 D-K4-L2-R9 및 D-K6-L9도 또한 공지되어 있다. 인테그린 αVβ3과 결합하는 RGD 모티프 및 D-아미노산 KLAKLAKKLAKLAK로 이루어진 효과기 도메인을 함유하는 합성 키메라 펩타이드 RGD-4CD(KLAKLAK)2와 containing 세포를 관통할 수 있게 하는 PTD-5 모티프 및 D-아미노산 KLAKLAKKLAKLAK로 이루어진 효과기 도메인을 함유하는 PTD-5D(KLAKLAK)2도 또한 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[R. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009, 63: 360-368] 참조). 다른 잘 공지된 세포용해성 합성 펩타이드는, 예를 들면, 문헌[Regen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 566-571, 1989]에 개시되어 있다.
막에 대한 펩타이드의 부착 후 일어나는 막의 파괴는 "배럴 스테이브(barrel staves)" (배럴-스테이브 모델) 기작, "도넛형 형상"(환상면-구멍 모델) 기작 또는 "카펫" 기작에 의해 일어날 수 있다(예를 들면, 문헌[R. Smolarczyk et al., Postepy Hig. Med. Dosw., 2009; 63: 360-368].
"배럴 스테이브" 기작은 23개 이상의 아미노산의 길이를 가지는 α-헬릭스 형태의 양친매성 펩타이드에 대해서 관찰된다. 예를 들면, "배럴 스테이브" 기작에 의해 막의 파괴를 일으키는 펩타이드는 그라미시딘 A, 알라메티신, 퍼포린, 필로술린, 반복된 KLAK 모티프를 가지는 합성 펩타이드, 카텔리시딘, 엔타 모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica)로부터 분리된 펩타이드, 파라스포린 및 세크로핀이다. "환상면-구멍 모델"에 의해 막의 파괴를 일으키는 펩타이드는, 예를 들면, 멜리틴 및 마가이닌을 포함한다. 예를 들면, "카펫" 모델에 의해 막의 파괴를 일으키는 펩타이드는 세크로핀 A 및 B이다.
구멍의 형성에 의한 세포막의 붕괴는 또한 높은 양전하의 펩타이드와 음으로 하전된 막 성분이 상호작용에 의해 유발될 수 있다. 이러한 특성은 그 중에서도 그라눌라이신, 멜리틴의 유사체 및 유도체, K(L)xR 모티프를 포함하는 펩타이드, 타키플레신, 봄베신, 마가이닌 및 비스코톡신에서 나타난다.
표적 세포의 막에서의 구멍 형성은 또한 펩타이드의 효소 활성과 관련될 수 있다. 포스포리파아제 A의 효소 활성은, 예를 들면, 포스파티딜콜린 및 스핑고미엘린에 대해 특이적 포스포-디에스테라아제 활성을 가지는 포스포리파아제, 비특이적 세포용해성 활성을 가지는 세포용해소 및 용혈소, 또는, 예를 들면, 콜레스테롤을 함유하는 생체막에 대하여 세포용해성 활성을 가지는 세포용해소 및 용혈소에 의해 나타난다. 세포막 또는 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하는 이러한 유형의 효소 활성은 리스테리오라이신, 에퀴나톡신, 포스포리파아제 PC-PLC 및 클로스트리듐 페르프린젠스 유래의 α-독소에 의해 나타난다.
종양 세포를 표적화할 수 있는 도메인을 가지는 구멍 형성 펩타이드의 접합체 및 키메라도 또한 공지되어 있다. 표적화를 위해, 종양 세포의 표면상에서 과발현되는, 항원, 탄수화물 잔기 또는 성장 인자 수용체가 사용된다. 표적화된 전달은 세포용해성 활성에 필요한 세포 표면상에 고수준의 구멍 형성 펩타이드를 제공한다.
표적화된 구멍 형성 악티노포린의 사용은 문헌[Panchal RG. et al., Poreforming proteins and their application in biotechnology. Curr Pharm Biotechnol 2002, 3: 99-115; Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells. Biochem Pharmacol 1998, 55: 247-252; 및 Hoskin DW, Ramamoorthy A: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778: 357-87]에 개시되어 있다.
구멍 형성 펩타이드 및 단백질은 적절한 유전자 변형에 의해서 뿐만 아니라 적당한 리간드 또는 항체에 대한 화학적 접합에 의해서 종양 관련 항원 및 수용체로 유도하는 능력을 가질 수 있는 것으로도 또한 공지되어 있다. 이러한 변형은 바실러스 투링겐시스 (Bacillus thuringeinsis)의 d-내독소, 악티니아 에퀴나 유래의 에퀴나톡신 II, 스티코닥틸라 헬리안투스 (Stichodactyla helianthus)의 스티콜라이신 I 및 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae)의 디프테리아 독소에 대해 개시되어 있다[Soletti RC., Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells. Anti-Cancer Drugs 2008, 19: 517-525; Pederzolli C, Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin-II, a cytolysin from a sea anemone. Bioconjugate Chem 1995, 6: 166-173; 및 van der Spek JC., Fusion protein toxins based on diphtheria toxin: Selective targeting of growth factor receptors of eukaryotic cells. Appl Chimeric Genes 하이브리드 Proteins Pt B 2000, 327: 239-249].
구멍 형성 스티콜라이신 독소 I 및 종양 특이적 항원 C2에 대하여 유도된 단일클론 항체로 이루어진 융합 단백질 및 대장암 세포주 모델의 치료에서의 이의 유용성도 또한 개시되어 있다[Tejuca M. et al., Construction of an immunotoxin with the pore forming protein St1 and/or C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line, Int. Immunopharmacol. 2004, 4: 731-744]. 디프테리아 독소 및 인터류킨-2 또는 EGF를 포함하는 다수의 융합 단백질 및 표적 수용체를 과발현하는 세포를 파괴하는 이들의 잠재력은 또한 문헌[Murphy JR, van der Spek JC, Targeting diphtheria-toxin to growth-factor receptors, Semin Cancer Biol 1995, 6: 259-267]에 개시되어 있다.
종양 환경에서 효과기 단백질의 방출 및 그 결과 종양 세포로의 내재화를 가능하게 하기 위해 세포용해성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 분자에서 특정 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위의 사용도 또한 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Panchal R. et al., Nat Biotechnol 1996, 14: 852-856]은 종양 환경에서 존재하는 프로테아제에 의해 활성화되는 카텝신 B에 의해 인식되는 절단 부위를 서열에 포함하는 α-용혈소를 개시하고 있다.
전립선암 세포 (PSA)의 프로테아제에 의해 절단될 때 활성화되는 세균의 세포용해성 구멍 형성 단백질의 불활성 전구체인 변형된 프로에어로라이신 (PA)도 또한 공지되어 있다[Williams S.A. et al., JNCI J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (5): 376-385].
US 5817771 B1은 종양 세포상에 선택적으로 결합하는 요소로서 구멍 형성 세포용해성 펩타이드와 항체 또는 항원의 접합체 (융합 단백질을 포함함) 및 종양 환경에서 세포용해성 펩타이드의 선택적 활성화를 가능하게 하는 링커, 예를 들면, 프로테아제, 특히 종양 환경에서 특이적으로 과발현되는 프로테아제와 같은 효소에 의해 인식되는 절단 부위를 개시하고 있다.
문헌[Barua et al., Cancer Letters 293 (2010) 240-253]은 TRAIL에 내성을 가지고 사멸 수용체 작용제 항체 DR4 및 DR5에 의한 치료에 둔감한 전립선암 세포주가 KLAK 서열을 함유하는 합성 양이온성 양친매성 용해성 펩타이드 KLA에 의한 이들 세포의 예비 치료 후 이들 항체에 대해 민감해지는 것을 보고하고 있다.
본 발명은 TRAIL로부터 유래한 도메인 및 포유동물 세포의 세포막 및/또는 미토콘드리아막에 대해 구멍 형성 특성을 가지는 세포용해성 효과기 펩타이드 (cytolytic effector peptide)의 도메인을 함유하는, 항암 특성을 가지는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 단백질의 2개의 도메인은 각각 상이한 기능을 가진다. hTRAIL로부터 유래한 도메인의 존재로 인해, 본 발명에 따른 단백질은 암 세포에 선택적으로 유도되는데, 여기서 상기 단백질의 요소는 이의 효과를 발휘한다. 특히, 세포와 결합한 후의 TRAIL 도메인은 아폽토시스를 촉발하는 활성을 발휘하고, 효과기 펩타이드는 세포막 및/또는 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하여 암세포를 용해시키는 활성을 발휘한다.
종양 환경에 대한 본 발명의 단백질의 전달은 체내의 건강한 세포에 대하여 독성 및 부작용을 최소화할 뿐만 아니라, 약제의 투여 빈도를 감소시킬 수 있게 한다. 추가로, 본 발명에 따른 단백질을 사용하는 표적화 치료는 고독성에 의해 및 고용량 투여의 필요성에 의해 유발되는 세포막 또는 미토콘드리아에서의 구멍 형성에 기초하여 이전에 공지된 비특이적인 치료의 저효율성의 문제를 극복할 수 있게 한다.
다수의 경우에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열의 단편을 포함하는 가용성 hTRAIL 및 이의 변이체 보다 더욱 강력한 것으로 밝혀졌다.
지금까지, 본 발명의 융합 단백질에 사용된 효과기 펩타이드는 바람직하지 못한 동력학, 비특이적인 프로테아제에 의한 신속한 분해, 또는 표적 부위에서 효과기 펩타이드의 적절한 작용을 가능하게 하는데 필요한 적절한 경로 활성화 서열의 결핍에 의해 유발되는 체내 축적 때문에 의약에 사용되지 않았다. 융합 단백질에 대한 효과기 펩타이드의 혼입은 이의 작용이 바람직한 부위에 선택적으로 전달할 수 있게 한다. 더욱이, 효과기 펩타이드의 부착은 단백질의 질량을 증가시켜 종양에서 단백질의 반감기 연장 및 단백질의 보유 증가 및 이의 효율성 향상을 야기한다.
신규한 융합 단백질은 또한 이의 각각의 천연 세포용해성 펩타이드와 비교하여 적어도 감소되거나 제한되거나, 심지어 용혈 활성을 상당히 제거하였다.
추가로, 다수의 경우에서, 신규한 융합 단백질은 또한 TRAIL에 대한 천연 또는 유발 내성을 극복한다. 아마, 내성의 극복은 세포막 또는 미토콘드리아막의 지질에 결합하는 융합 단백질의 결과로서 세포막 전위의 불안정 및 세포 외부에 2가 이온의 누출을 야기하는 구멍 형성에 기인한다. 미토콘드리아막의 지질에 대한 결합의 결과로서, 세포질에 대한 시토크롬 C, SMAC/Diablo 단백질 및 AIF 인자의 방출이 일어날 수 있으며, 이는 감염된 세포에서 아폽토시스 유발성 카스파아제 활성화를 야기한다. 미토콘드리아막의 분해는 또한 카스파아제-9의 활성화를 야기하고, 그 결과 아폽토시스를 유도한다.
도 1은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 앓는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 2는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 앓는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 3은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 4는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 5는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460-Luc2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 6은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460-Luc2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 7은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 전립선암 PC3을 앓는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 8은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 전립선암 PC3을 앓는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 9는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 10은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 11은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 12는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 13은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 14는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 15는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo 205를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 16은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo 205를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 17은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 18은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 19는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암종 MIA Paca-2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 20은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암종 MIA Paca-2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 21은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 22는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 23은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간세포암종 HepG2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 24는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간세포암종 HepG2를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 25는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PLC/PRF/5를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 26은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PLC/PRF/5를 앓는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
본 발명은
- hTRAIL95 보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하고 hTRAIL281의 위치에 있는 아미노산으로 종결하는, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성을 가지는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및
- 세포막에서 구멍을 형성하는 세포용해성 효과기 펩타이드의 서열인 하나 이상의 도메인 (b)
를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로,
상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되어 있다.
본 발명에 따른 용어 "펩타이드"란, 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 복수의 아미노산으로부터 축조된 분자로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다.
본 발명에서, 펩타이드의 아미노산 서열은 펩타이드의 N-말단(N-종결)으로부터 이의 C-말단(C-종결) 쪽으로의 방향으로 당업계에서 채택되는 통상의 방식으로 제시될 것이다. 그러므로, 임의의 서열은 이의 선형 제시(presentation)의 좌측 상에 이의 N-말단 및 우측 상에 이의 C-말단을 가질 것이다.
용어 "가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 가용성 단편"이란, 세포의 표면에 있는 이의 수용체에 결합시 포유동물 세포에서 아폽토시스 신호를 유발할 수 있는 임의의 이러한 가용성 hTRAIL의 단편을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
TRAIL 서열의 70% 이상 또는 85% 이상의 상동성의 존재는 당업계에 공지되어 있는 것으로 당업자에게 또한 인식될 것이다.
본 발명의 융합 단백질에서 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 hTRAIL 단백질도 아니고 hTRAIL 단백질의 일부나 단편도 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 융합 단백질은 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착된, 효과기 펩타이드의 하나 이상의 도메인 (b)를 포함한다.
서열 hTRAIL이란, 수탁 번호 P505591로 GenBank 데이터베이스 및 EP 0835305 A1에 공개되고 서열 번호 90으로서 본 발명의 서열 목록에 제시된 hTRAIL의 공지된 서열로서 이해된다.
특정 실시형태에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95 내지 hTRAIL121 범위의 아미노산으로 개시하여 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 hTRAIL 서열의 단편이다.
특히, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 및 hTRAIL121-281에 상응하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 및 hTRAIL121-281이 상기 hTRAIL의 공지된 서열에서 각각 번호 95, 114, 115, 116, 119 및 121로 표시된 아미노산으로 개시하고 마지막 아미노산 281로 종결하는 인간 TRAIL 단백질의 단편을 나타낸다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
또 다른 특정 실시형태에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95 보다 낮지 않은 아미노산 위치에서 개시하고 아미노산 hTRAIL281에서 종결하는 가용성 TRAIL 단백질 서열의 기능적 단편의 동족체로서, 상기 서열은 본래의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 85% 이상 동일하다.
이러한 실시형태의 특정 변형에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 및 hTRAIL121-281에 상응하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단편의 동족체이다.
TRAIL 단편의 동족체는 이러한 단편의 아미노산 서열의 변경/변형임을 이해해야 하는데, 여기서 1개의 아미노산, 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산 및 15% 이하의 아미노산을 포함한 하나 이상의 아미노산은 변화되고, 변형된 서열의 단편은 TRAIL 서열의 기능성, 즉 세포 표면 사멸 수용체에 결합하여 포유동물 세포에서 아폽토시스를 유발하는 능력을 보존한다. 상기 아미노산 서열의 변형은, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결손 및/또는 부가를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 변형된 서열을 가지는 TRAIL 단편의 동족체는 TRAIL의 본래의 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 (TRAIL-R1) 또는 DR5 (TRAIL-R2)에 대한 변형된 친화성을 나타낸다.
용어 "변형된 친화성"이란, 증가된 친화성 및/또는 변경된 수용체 선택성을 가지는 친화성을 의미한다.
바람직하게는, 변형된 서열을 가지는 TRAIL 단편의 동족체는 TRAIL의 본래의 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 및 DR5에 대한 증가된 친화성을 나타낸다.
특히 바람직하게는, 변형된 서열을 가지는 TRAIL 단편의 동족체는 사멸 수용체 DR4와 비교하여 사멸 수용체 DR5에 대한 증가된 친화성, 즉 증가된 선택성 DR5/DR4를 나타낸다.
또한 바람직하게는, 변형된 서열을 가지는 TRAIL 단편의 동족체는 사멸 수용체 DR1 (TRAIL-R3) 및/또는 DR2 (TRAIL-R4)에 대한 친화성과 비교하여 사멸 수용체 DR4 및/또는 DR5에 대한 증가된 선택성을 나타낸다.
사멸 수용체 DR4 및 DR5에 대한 증가된 친화성 및/또는 선택성을 야기하는 TRAIL의 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ., DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283(29): 20560-8]은 DR4에 대한 증가된 선택성을 가지는 D218H 돌연변이를 개시하고 있으며, 문헌[Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87]은 DR4에 대한 감소된 친화성을 가지는 D269H 돌연변이를 개시하고 있다. DR1 및 DR2 수용체와 비교하여 DR4 및 DR5로부터 선택된 하나의 수용체에 대한 증가된 친화성 및 DR4와 비교하여 수용체 DR5에 대한 증가된 친화성을 야기하는 hTRAIL 돌연변이체는 또한 WO 2009077857 및 WO 2009066174에 개시되어 있다.
적절한 돌연변이는 아미노산 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 및 251로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 hTRAL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이이며, 특히 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산, 또는 글루탐산 또는 아스파라긴산과 같은 산성 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이이다. 특히, WO 2009066174에 개시된 바와 같은 G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 및 K251Q로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 언급할 수 있다.
적절한 돌연변이는 또한 아미노산 195, 269 및 214로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 hTRAIL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이이며, 특히 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이이다. 특히, WO 2009077857에 기재된 바와 같은 D269H, E195R 및 T214R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 언급할 수 있다.
특정 실시형태에서, hTRAIL 단편의 동족체인 도메인 (a)는, WO 2009066174에 기재된 바와 같은 천연 TRAIL 서열의 D218H 돌연변이체, 또는 문헌[Gasparian ME et al., Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87]에 기재된 바와 같은 천연 TRAIL 서열의 Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H 돌연변이체로부터 선택된다.
도메인 (a), 즉 TRAIL 단편은 세포 표면 상의 사멸 수용체에 대한 융합 단백질의 작제물의 결합을 담당하는 도메인이다. 더욱이, 결합시의 도메인 (a)는 이의 공지된 작용제 활성, 즉 아폽토시스의 외인성 경로의 활성화를 나타낼 것이다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)는 진핵 세포에 대하여 세포용해 활성을 가지는 효과기 펩타이드의 도메인이다.
본 발명의 융합 단백질의 특정 실시형태에서, 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 서열 번호 34 내지 서열 번호 56 및 서열 번호 125 내지 서열 번호 132로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암세포에 대하여 구멍 형성 활성 가지는 펩타이드이다.
세포용해 활성을 가지는 펩타이드의 경우, 이는 세포막에서 구멍을 형성하고, 세포 내부로의 침투 후 미토콘드리아막에서도 또한 구멍을 형성하고, 이렇게 함으로써 막의 연속성을 중단시키는 능력을 가지는 펩타이드를 의미한다. 막 중단의 결과로서, 이온을 포함한 세포질 내용물이 세포 외부로 누출되고, 이는 세포에서의 신속한 비가역적 전해질 불균형 및 이의 파괴 (세포 용해)를 야기한다.
세포막 또는 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하고 이렇게 하여 세포 용해를 일으키는 펩타이드의 능력은 당업자에게 공지된 세포막의 침투성을 시험하는 방법에 의해, 예를 들면, 세포에 이전에 적용된 세포내 물질, 예를 들면, ATP 또는 방사성 표지된 마커의 세포로부터의 방출을 측정함으로써 또는 세포가 온전할 때 발생하지 않는 트리판 블루와 같은 염료의 흡수를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 세포용해성 효과기 펩타이드는 천연 펩타이드 또는 합성 펩타이드일 수 있다.
천연 세포용해성 구멍 형성 펩타이드는 α-HL, 에어로라이신, 퍼프링고라이신, 뉴모라이신, 스트렙토라이신 O, 리스테리오라이신, 바실러스 투링겐시스 독소, 바실러스 투링겐시스의 파라스포린, 대장균 (E. coli)의 용해성 분자, 예를 들면, 용혈소 또는 콜리신과 같은 세균 외독소일 수 있다.
천연 세포용해성 구멍 형성 펩타이드는 또한 인간 그라눌라이신, 오스트레일리아 개미 미르메시아 필로술라 (Myrmecia Pilosula)의 독 유래의 필로술린 1 및 필로술린-5를 포함한 필로술린 계열, 마가이닌, 예를 들면, 아프리카 개구리 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis)의 피부 유래의 마가이닌-2, 아프리카 개구리 리 토리아 라니포르미스 (Litoria raniformis)의 피부 유래의 아우레인 1.2, 청개구리 리토리아 시트로파 (Litoria citropa)의 피부 유래의 시트로핀 1.1, 꿀벌 아피스 멜리페라 (Apis mellifera)의 독 유래의 멜리틴, 디펜신, 예를 들면, 인간 세포로부터 분리된 α-디펜신 및 β-디펜신, 락토페리신, 예를 들면, 우유 유래의 락토페리신 B, 게 타키플레우스 트리덴타투스 (Tachypleus tridentatus)의 백혈구 유래의 타키플레신, 세크로핀 A 및 B, 또는 플루로넥테 스 아메리카누스 (Pleuronectes americanus)로부터 분리된 플루로시딘과 같은 진핵생물 펩타이드일 수 있다.
합성 세포용해성 구멍 형성 펩타이드는 세크로핀 A 단편과 마가이닌 2 단편 CA(1-8)MA(1-12)의 하이브리드, 세크로핀 A 단편과 멜리틴 CAMEL (CA(1-7)MEL(2-9)) 단편의 하이브리드, 양으로 하전된 아미노산 라이신, 아르기닌 및 류신으로 이루어지고 이의 일부가 D-K4-L2-R9 및 D-K6-L9와 같은 D-아미노산의 형태인 합성 세포용해성 펩타이드, 및 D-아미노산 모티프 KLAKLAK 또는 이의 반복, 예를 들면, (KLAKLAK)2로 이루어진 도메인을 함유하는 펩타이드, 2개의 용해성 펩타이드의 합성 하이브리드 펩타이드, 예를 들면, 마가이닌-봄베신과 세크로핀-멜리틴의 하이브리드, TRAIL 수용체 이외의 다른 세포 표면상에 존재하는 수용체에 결합하는 도메인 또는 세포 내의 통과를 허용하는 도메인 및 합성 세포용해성 펩타이드를 함유하는 합성 융합 펩타이드, 또는 포유동물 기원의 KLLLK 및 KLLK 시리즈 또는 변형되고/되거나 절단된 펩타이드 (바람직하게는 전달 또는 표적화 도메인과의 융합 형태임)로 이루어진 양친매성 헬릭스 모델에 근거한 용해성 펩타이드와 같은 공지된 세포용해성 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 높은 양전하를 가지는 펩타이드와 음으로 하전된 막의 직접 상호작용에 의해 세포막 또는 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하는 펩타이드일 수 있다.
이러한 실시형태에서 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 34 (인간 그라눌라이신의 활성 형태), 서열 번호 35 (15개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드), 서열 번호 38 (타키플레신 유래의 펩타이드), 서열 번호 39 (봄베신-마가이닌 2의 융합 펩타이드), 서열 번호 40 (마가이닌-2), 서열 번호 42 (펩타이드 세크로핀-멜리틴의 26개의 아미노산 하이브리드), 서열 번호 53 (비스코톡신 A3 (VtA3)) 및 서열 번호 56 (EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드), 서열 번호 132 (멜리틴), 서열 번호 129 및 서열 번호 131 (봄베신과 BMAP27 (B27) 또는 BMAP28 (B28)의 절단된 버전을 포함하는 융합 펩타이드), 서열 번호 130 (17개의 아미노산 합성 펩타이드)으로 표시된다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 생체막과의 상호작용을 가능하게 하는 양친매성 α-헬릭스 형태를 가지는 구멍 형성 펩타이드일 수 있다.
이러한 실시형태에서 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 36 (필로술린-1), 서열 번호 37 (필로술린-5), 서열 번호 41 (14개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드), 서열 번호 43 (27개의 아미노산 펩타이드 FF/CAP-18), 서열 번호 44 (BAMP-28 펩타이드), 서열 번호 45 (엔타모에바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 C의 유사체), 서열 번호 46 (엔타모에바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 A의 유사체), 서열 번호 47 (엔타모에바 히스톨리티 카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 B의 유사체), 서열 번호 48 (인플루엔자 바이러스 혈구응집소의 HA2 도메인의 단편), 서열 번호 54 (인간 퍼포린의 활성 단편), 서열 번호 55 (바실러스 투링겐시스 유래의 파라스포린-2), 서열 번호 125 (KLLK 모티프를 가지는 합성 융합 펩타이드), 서열 번호 126 및 서열 번호 127 (플루로시딘 유사체), 서열 번호 128 (KLLK 모티프를 가지는 합성 펩타이드)로 표시된다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 포스포리파아제, 용혈소 및 세포용해소의 군으로부터 선택된 효소 활성을 가지는 구멍 형성 펩타이드일 수 있다. 이러한 실시형태에서 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 49 (포스포리파아제 C 활성을 가지는 클로스트리듐 페르프린젠스 유래의 α-독소의 N-말단 도메인), 서열 번호 50 (리스테리오라이신 O), 서열 번호 51 (포스포리파아제 PC-PLC) 및 서열 번호 52 (에퀴나톡신 EqTx-II)로 표시된다. 진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 막 지질에 대한 강한 결합 능력을 나타내고 사포닌 유사 계열에 속하는 인간 그라눌라이신의 활성 형태인 펩타이드일 수 있다[P. M. Lydyard, A. Whelan, M. W. Fanger, "Krotkie wyklady: Immunologia", Wydawnictwo Naukowe PWN 2001]. 막에 결합하는 능력으로 인해, 그라눌라이신은 미토콘드리아막을 분해할 수 있다. 이러한 과정은 시토크롬 C, 단백질 SMAC/Diablo 및 AIF 인자에 대한 세포질로의 방출을 유발하는데, 이는 아폽토시스 연쇄반응의 활성화 및 카스파아제-9의 활성화를 야기하고, 또한 아폽토시스의 유도를 야기한다. 그라눌라이신은 또한 Bid 단백질을 tBid의 형태로 활성화시키는데, 이는 미토콘드리아막에서의 구멍 형성에 직접 연관되어 있다[Zhang et al., The Journal of Immunology, 182: 6993-7000, 2009].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 34로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 83개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 류신 (L) 및 라이신 (K) 및 벌 독 유래의 구조적으로 유사한 천연 용해성 펩타이드 또는 아메바 히스톨리티카 (Ameba histolitica) 유래의 펩타이드로 이루어진 합성 세포용해성 펩타이드일 수 있다[Makovitzki, A., Suppression of Human Solid Tumor Growth in Mice by Intratumor and Systemic Inoculation of Histidine-Rich and pH-Dependent Host Defense-like Lytic Peptides, cancer Research, 2009]. 상기 아미노산의 높은 함량으로 인해, 펩타이드는 종양 형질전환된 세포의 막과의 선택적인 상호작용 및 이의 구조 내로의 침투와 함께 "배럴 스테이브" 기작에 따른 구멍의 형성을 허용하는 강한 양전하를 가진다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 35로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 15개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 오스트레일리아 개미 미르메시아 필로술라의 독으로부터 유래한 양이온성 분자인 펩타이드 필로술린-1일 수 있다. 필로술린-1은 서열에서 규칙적으로 반복되는 높은 함량의 라이신 및 아르기닌을 가지는 펩타이드이다. 이들 아미노산의 높은 함량으로 인해, 펩타이드는 암세포의 막과의 선택적인 상호작용 및 "배럴 스테이브" 기작을 통한 구멍의 형성을 허용하는 강한 양전하를 가진다[Kourie et al., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063-1087, 2000].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 36으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 56개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 구멍의 형성을 야기하는 세포막과의 이온성 상호작용 및 그 결과로서 종양 성장의 억제를 담당하는 펩타이드 필로술린-5일 수 있다. 필로술린-5는 오스트레일리아 개미 미르메시아 필로술라의 독으로부터 유래한 필로술린 계열에 속하는 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는 종양 세포 표면과의 상호작용을 강력하게 하는, 양이온성을 부여하는 아미노산 라이신, 알라닌 및 아스파르트산의 주기적인 반복 패턴을 그의 구조에 가진다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 37로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 100개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 게 타키플레우스 트리덴타투스의 백혈구로부터 분리된 양이온성 펩타이드인 타키플레신일 수 있다. 진핵 세포 내부의 관통 후, 타키플레신은 미토콘드리아막에 대한 높은 친화성을 나타내고, "배럴 스테이브" 기작을 통한 이의 불안정화 및 시토크롬 C, 단백질 SMAC/DIABLO 및 AIF 인자와 같은 인자에 대한 미토콘드리아로부터 세포질 내로의 누출을 야기하는데, 이는 세포 사멸을 야기한다[Chen, Y., et al., RGD - Tachyplezin inhibits tumor growth . Cancer Res, 2001. 61(6): p. 2434-8; Ouyang, G.L., et al., Effects of tachyplesin on proliferation and differentiation of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells . World J Gastroenterol, 2002. 8(6): p. 1053-8].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 38로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 17개의 아미노산 펩타이드이다.
도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 진핵 세포에 대해 세포용해 활성을 가지는 융합 펩타이드 봄베신-마가이닌일 수 있다.
마가이닌 계열은 아프리카 개구리 제노푸스 래비스의 피부로부터 분리된 21개 내지 27개의 아미노산 폴리펩타이드로 이루어진다. 펩타이드의 양친매성 α-나선 구조는 이들이 "배럴 스테이브" 기작을 통해 세포막에 구멍을 형성하도록 한다[Matsuzaki et al., Biochim Biophys Acta, 1327: 119-130, 1997]. 개구리의 피부로부터 분리된 높은 양전하를 가지는 14개의 아미노산 펩타이드인 봄베신은 종양-호밍(homing) 펩타이드의 군에 속하며, 또한 세포막의 강한 음전하를 특징으로 하는 일부 유형의 고형 종양 및 혈액암의 표면에 대한 높은 친화성을 나타낸다[Moody et al, Peptides, 1983; volume 4: 683-686]. 봄베신은 인간 체내에 존재하는 봄베신의 유사 동족체인 뉴로메딘 B에 대한 세포 수용체에 결합할 수 있는데, 상기 세포 수용체는 종양 세포의 표면상에 많이 발현된다. 이는 전신 독성을 최소화하면서 봄베신의 특이성의 수준 및 종양에 의해 점유된 조직에서의 이의 축적을 상당히 증가시킨다. 독성 펩타이드와 봄베신의 접합체는 각각의 단백질과 비교하여 향상된 항종양 활성을 나타낸다[Huawei et al., Mol. Pharmaceutics, 2010; 2: 586-596]. 마가이닌은 종양 세포 수용체에 대한 제한된 결합 특성을 특징으로 하고, 그 결과 이의 세포독성은 고농도에서만 나타난다. 마가이닌 및 봄베신을 포함하는 융합 펩타이드는 종양 세포에 대한 특이성 및 세포독성의 증가를 가능하게 하는 것으로 나타났다[Liu S. et al., Enhancement of cytotoxicity of antimicrobial peptide magainin II in tumor cells by bombesin-targeted delivery. Acta Pharmacol Sin. 2011 Jan; 32(1): 79-88].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 39로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 40개의 아미노산 펩타이드이다.
도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 또한 진핵 세포에 대해 세포용해 활성을 가지는 BMAP27 (B27) 또는 BMAP28 (B28)의 절단된 버전과 봄베신을 포함하는 융합 펩타이드일 수 있다. 이러한 키메라 펩타이드는 세포독성 활성을 나타내고 전신 독성을 감소시킨다[Cai H. et al., Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides, Mol. Pharmaceutics, 2010, 7(2), pp. 586-596].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 129로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 31개의 아미노산 펩타이드 및 서열 번호 131로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 29개의 아미노산 펩타이드이다.
도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 진핵 세포에 대해 세포용해 활성을 가지고 세포막 및 미토콘드리아막에서 구멍을 형성하는 마가이닌-2 펩타이드일 수 있다. 특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 40으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 23개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 합성 분해성 펩타이드일 수 있다. 세포 내부로의 침투 후 양친매성 및 α-나선 단백질로서의 식 (KLAKKLA)n (여기서, n은 모티프의 반복의 수이다)의 합성 펩타이드는 음으로 하전된 미토콘드리아막에 선택적으로 축적되어, 구멍의 형성 및 미토콘드리아의 정전기 전위의 불안정화를 야기하고, 이렇게 함으로써 선택된 암세포주의 세포를 제거한다[Javadpour et al ., J Med Chem, 39: 3107-13, 1996].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 41로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 14개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 세포용해 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 세제-유사 방식으로 세포막을 분해하는 또 다른 합성 분해성 펩타이드일 수 있다[Papo N, Shai Y., New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry. 2003 Aug 12; 42(31): 9346-54].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 128로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 17개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 세포용해 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 세포막에서 구멍의 형성을 야기하고 그 결과 종양 성장의 억제를 야기하는 세크로핀-멜리틴 하이브리드 펩타이드일 수 있다. 세크로핀 A는 라이신, 류신 및 알라닌과 같은 다수의 양으로 하전된 아미노산을 그의 구조에 함유하며[Quellette, A., J., and Selsted, M., E., 1996, FASEB. J., 10(11), 1280-9], 이들로 인해 진핵 세포의 막에 구멍을 형성한다. 또한, 세크로핀 A는 미세소관의 구조를 불안정화함으로써 세포 골격 구조를 파괴하는 독성 활성을 가진다[Jaynes, J. et al., 1989, Peptide Res., 2 (2), 157-60].
멜리틴은 높은 양전하 및 α-나선 구조를 가지며, 따라서 종양 세포의 막과 강하게 상호작용하여 "배럴 스테이브" 기작에 의해 구멍을 형성하는 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드이다[Smolarczyk, R. et al., Peptydy - nowa klasa lekow przeciwnowotworowych, Postepy Hig and Med. Doswiadczalnej, 2009, 63: 360-368]. 추가로, 멜리틴은 세포막의 지질 이중층의 성분인 지방산의 방출을 야기하는 막 인지질의 분해를 담당하는 막 효소 포스포리파아제 A2를 자극한다. 세크로핀 펩타이드의 양으로 하전된 N-말단과 멜리틴 펩타이드의 소수성 N-말단의 유전자 융합으로부터 수득된 합성 키메라 펩타이드 세크로핀-멜리틴은 표적 세포에 대해 더욱 우수한 세포독성 활성을 나타내며, 세크로핀 및 멜리틴에 대한 용혈 활성 특징이 전혀 없다[Boman, H., G. et al., (1989) FEBS Lett 259, 103-106; Andreu, D. et al., (1992) FEBS Lett. 296, 190-194].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 42로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 26개의 아미노산 펩타이드이다.
구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 문헌[Isogai E., "Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira", The Journal of Applied Research, Vol. 4, No. 1, 2004, 180-185]에 개시되어 있는 펩타이드 FF/CAP18이다. FF/CAP18은 페닐알라닌에 의한 2개의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된 인간 카텔리시딘 hCAP18109 -135의 27개의 아미노산 C-말단 서열의 유사체이다. FF/CAP18은 혼입된 변형으로 인해 천연 서열과 비교하여 증가된 강한 양이온성 특징을 가지며, 진핵 세포의 막에 강하게 결합한다. 일단 막의 표면에 결합되면, FF/CAP18은 세포의 정전기 균형의 불안정화를 야기하는 채널 및 이온성 구멍을 형성한다. 또한, 세포 내부로의 침투 후, 유사체는 마토콘드리아막에 축적되어 이온 채널을 형성하고, 따라서 미토콘드리아의 정전기 전위를 불안정화시키고, 아폽토시스의 과정을 개시하는 시토크롬 C, SMAC/Diablo 또는 AIF 인자와 같은 세포기질 인자에 대한 미토콘드리아로부터의 방출을 야기한다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 43으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 27개의 아미노산 펩타이드이다.
구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 카텔리시딘 계열에 속하는 강한 양전하를 가지는 펩타이드 BAMP-28이다. 이러한 펩타이드는 또한 침샘 세포에 의해 생성된 4 kDa 이하의 질량을 가지고 항세균 및 항진균 특성을 나타내는 12개의 펩타이드 군인 인간 히스타틴의 구조 유사체이다[W. Kamysz et al., Histatyny - bialka liniowe bogate w histydyne Nowa Stomatologia 2004]. BAMP-28 펩타이드의 N-말단 도메인은 강하게 양으로 하전되어 있으며 세포막에 대한 결합을 담당하는 반면, C-말단 부분은 세포독성 활성을 담당한다[Hugosson, M., D. et al., 1994]. 항세균 펩타이드 및 미토콘드리아 전구서열(presequence)은 마토콘드리아의 커플링, 호흡 및 단백질 유입에 영향을 미친다[Eur. J. Biochem. 223: 1027-1033]. BMAP-28 펩타이드 활성의 기작은 주로 세포막 및 미토콘드리아막에서 구멍의 형성에 근거한다[A. Risso et al., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926-1935].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 44로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 27개의 아미노산 펩타이드이다.
구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 구멍 형성을 야기하고 그 결과 종양 성장의 억제를 야기하는 세포 표면상의 축적을 담당하는 엔타모에바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 A의 유사체이다. 엔타모에바 히스톨리티카의 펩타이드의 3개의 이소형 A, B 및 C는 확인되었고, 기생충의 과립 세포질에 위치한다. 이들은 이차 구조에 4개의 양친매성 헬릭스를 함유하는 3개의 황화물 브릿지에 의해 안정화된 77개의 아미노산 폴리펩타이드이다[Leippe, M et al., EMBO J. 11, 3501-3506, 1992]. 이들 펩타이드는 진핵 세포에 대해 용해 특성을 가진다[Leippe, M. and Muller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994]. 이들 펩타이드의 구조에서의 제3 헬릭스는 세포막의 관통 및 구멍의 형성에 적합한 길이를 가진다. 3개의 모든 이소형의 제3 헬릭스 도메인만을 포함하는 아미노산 서열에 근거하여, 인간 암 세포주에 대해 구멍 형성 및 세포독성 활성을 가지며 낮은 용혈 활성을 특징으로 하는 일련의 유사 합성 펩타이드 (A3, B3 및 C3)를 제작하였다[Andra et al., FEBS Letters 385: 96-100, 1996].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 45로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 24개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 엔타모에바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 B의 유사체이다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 46으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 24개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 엔타모에바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 C의 유사체이다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 47로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 24개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 숙주의 세포막에서 구멍의 형성을 야기하는 숙주 세포막과 바이러스 캡시드의 상호작용 (게재)을 담당하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 HA2 도메인의 20개의 아미노산 N-말단 단편, 소위 "융합 펩타이드"의 동족체이다. 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA)은 바이러스 캡시드와 숙주 세포막의 융합을 담당하는 동형 삼량체성 당단백질이다. 2개의 도메인은 단백질의 구조에서 구별되며, HA1은 수용체 결합을 담당하고 H2는 세포막과의 상호작용을 담당한다. HA2 도메인의 구조에서, N-말단 부분 (20개의 아미노산), 소위 "융합 펩타이드"는 세포막의 구조에 직접 게재된다[Durrer P et al., J Biol Chem 271: 13417-13421, 1996]. 융합 펩타이드 동족체의 구조 분석은 이의 활성이 엔도솜 막 천공을 가능하게 하는 양친매성 α-헬릭스의 형성을 야기하는 형태 변화와 관련되어 있는 것을 보여준다[Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990]. 따라서, "융합 펩타이드"의 유도체는 엔도솜으로부터 효율적이고 신속한 "이탈"을 제공하는 생물학적 활성 물질의 효과적인 캐리어로서 사용될 수 있다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 48로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 12개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 세포막 유래의 포스파티딜콜린 및 스핑고미엘린에 대해 포스포리파아제 C 활성을 가지는 클로스트리듐 페르프린젠스 유래의 α 독소의 N-말단 도메인으로서, 구멍의 형성을 가능하게 한다. 클로스트리듐 페르프린젠스의 α-독소의 N-말단 도메인은 포스포리파아제 C의 활성 중심을 포함한다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 49로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 247개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 병원체에 의해 분비되고 엔도솜 환경 산성화 후 활성화된 용혈소의 군에 속하는 콜레스테롤-의존적 구멍 형성 펩타이드인 리스테리오라이신 O의 단편이다[Schnupf P, Portnoy DA . Listeriolysin O: a phagosome-specific lysin. Microbes Infect. 2007 Aug ; 9(10): 1176-87. Epub 2007 May 7]. 표적화 단백질을 가지는 융합 단백질 형태의 리스테리오라이신 O는 종양 세포를 특이적으로 제거할 수 있다[Bergelt S, Frost S, Lilie H. Listeriolysin O as cytotoxic component of an immunotoxin. Protein Sci . 2009 Jun ; 18(6): 1210-20].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 50으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 468개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 포스포리파아제 PC-PLC의 활성 단편이다. 포스포리파아제 PC-PLC는 일차 내피 세포에서 액포의 효율적인 용해를 담당하며, 일차 및 2차 액포의 용해에서 리스테리오라이신과 상승적으로 작용한다. PC-PLC에 대한 기질은 포스파티딜콜린이다[Smith GA , Marquis H, Jones S, Johnston NC , Portnoy DA , Goldfine H., The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun . 1995 Nov ; 63(11): 4231-7].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 51로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 288개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 에퀴나톡신 단백질이다. 에퀴나톡신 EqTx-II는 포유동물 세포에 관하여 높은 비특이적 독성을 특징으로 하는 악티니아 에퀴나 아네모네로부터 분리된 구멍 형성 세포용해소이다.
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 52로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 179개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 비스코톡신 A3 (VtA3)이다. 비스코톡신 A3은 겨우살이 (비스쿰 알붐 (Viscum album)) 유래의 티오닌의 하나이다. 구조적으로, 이는 계열에 전형적인 3개의 이황화물 브릿지를 가지는 46개의 아미노산 쇄로 이루어져 있다[Coulon A. et al., Comparative membrane interaction study of viscotoxins A3, A2 and B from mistletoe (Viscum album) and connections with their structures., Biochem J. 2003 Aug 15; 374(Pt 1): 71-8]. 암 세포주에 대한 비스코톡신의 독성 특성은 공지되어 있다[Tabiasco J. et al., Mistletoe viscotoxins increase natural killer cell - mediated cytotoxicity . Eur J Biochem . 2002 May ; 269(10): 2591-600]. 정확한 분자의 작용 기작은 VtA3에 대해 개시되어 있지 않다. 그러나, 이는 이온 채널의 형성 및 투과에 의한 막 구조의 손상을 포함하는 것으로 공지되어 있다. 분자의 강한 양전하는 핵산과 인지질 둘 다에 대한 결합을 선호한다[Giudici M, Pascual R, de la Canal L, Pfuller K, Pfuller U, Villalain J. Interaction of viscotoxins A3 and B with membrane model systems : implications to their mechanism of action . Biophys J. 2003 Aug ; 85 (2): 971-81].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 53으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 46개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 인간 퍼포린의 활성 단편인 펩타이드이다. 인간 퍼포린을 포함한 면역계에 "보이지 않는(invisible)" 인간 기원의 단백질의 사용은 생성된 강한 면역원성 때문에 세균, 동물 또는 식물 기원의 독소를 함유하는 단백질 키메라의 제한된 임상 유용성의 문제를 해결할 수 있다[Frankel AE., Reducing the immune response to immunotoxin. Clin Cancer Res. 2004 Jan 1; 10(1 Pt 1): 13-5]. 세포막에서 구멍을 비특이적으로 형성하는 인간 퍼포린의 N-말단 34개의 아미노산 단편은 완전한 단백질의 선택적인 세포독성 활성을 보유한다[Liu CC, Walsh CM, Young JD., Perforin: structure and function. Immunol Today.1995 Apr; 16(4): 194-201]. 암세포를 표적으로 하는 항체에 융합된 퍼포린 단편은 완전한 단백질의 선택적인 세포독성 활성을 보유한다[Wan L., Expression, purification, and refolding of a novel immunotoxin containing humanized single-chain fragment variable antibody against CTLA4 and the N-terminal fragment of human perforin. Protein Expr. Purif. 2006 Aug; 48(2): 307-13. Epub 2006 Mar 9].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 54로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 33개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 바실러스 투링겐시스 유래의 파라스포린-2이다. 파라스포린 계열은 하위군 PS1, PS2, PS3, PS4에 속하는 13개의 상이한 독소를 포함한다[Ohba M., Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis . Anticancer Res. 2009 Jan ; 29(1): 427-33]. 파라스포린-2는 암세포 (MOLT-4, Jurkat, HL60, HepG2, CACO-2)에 대해 특이성을 나타내며, 각각 51개 및 36개의 아미노산의 N- 및 C-말단 단편의 일부를 프로테이나아제 K에 의해 절단함으로써 활성화된 37 kDa 독소전구물질의 형태로 존재한다. 파라스포린-2의 주요 작용은 약 3nm의 직경을 가지는 구멍을 형성하여 이의 투과성을 증가시키기 위한 세포막 내의 올리고머화로 이루어진다. 파라스포린-2 활성의 효과는 시험되는 세포주의 유형에 좌우되며, 세포로부터 세포질의 유출 및 이들의 용해 (HepG2 및 NIH-3T3 세포)에 의해 야기된 소위 "기포(blebbs)" 또는 돌출부의 형성 또는 세포 (MOLT-4)의 파열을 야기하는 액포 유사 구조의 형성을 포함한다[Kitada S., Cytocidal actions of parasporin-2, an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis. J. Biol. Chem. 2006 Sep 8; 281(36): 26350-60]. 또한, 파라스포린-2의 활성은 미세소관 구조의 파괴, 액틴 필라멘트 얽힘, 미토콘드리아 및 소포체의 단편화를 야기한다[Akiba T., Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells. J. Mol. Biol. 2009 Feb 13; 386(1): 121-33].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 55로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 251개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 합성 용해성 펩타이드 및 세포 표면상의 EGF 수용체의 펩타이드 억제제를 포함하는 융합 단백질이다. 세포 표면상의 EGFR의 억제제의 결합은 세포 표면에 대한 용해성 펩타이드의 위치화를 가능하게 하고, 국소화된 세포내 수용체 타이로신 키나아제를 추가로 억제한다. 키나아제 활성의 억제는 해당 경로, 단백질 합성의 활성을 증가시키는 RAS 신호전달 경로의 활성화 및 세포질 Ca2+ 이온의 방출을 야기하는 생화학 신호의 연쇄반응의 결핍을 유발하고, 따라서 감소된 세포 증식 및 제한된 종양 진행을 야기한다[Carpenter G, Cohen S., (May 1990). "Epidermal growth factor". The Journal of Biological Chemistry 265 (14): 7709-12]. 양친매성 나선 단백질로서 반복된 류신 및 라이신 잔기를 포함하는 합성 펩타이드는 선택된 암 세포주를 선택적으로 제거한다[Javadpour et al., J. Med. Chem., 39: 3107-13, 1996].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 56으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 32개의 아미노산 펩타이드이다.
EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 서열 번호 56으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 융합 단백질은 신규하고 이전에 개시되어 있지 않다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 KLLK 모티프를 가지는 합성 용해성 펩타이드 및 세포 표면상의 PDGF 수용체의 길항제인 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 세포 표면상의 PDGF의 억제제의 결합은 세포 표면에 대한 용해성 펩타이드의 위치화를 가능하게 하고, 추가로 결합은 세포 증식 및 혈관신생에 영향을 미친다[Ostman A. et al., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment, Adv. Cancer Res., 2007; 97: 247-74].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 125로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 39개의 아미노산 펩타이드이다.
서열 번호 125로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 융합 단백질 및 서열 번호 125의 PDGF 길항제 및 합성 용해성 펩타이드의 융합 변이체는 신규하고 이전에 개시되어 있지 않다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는 플루로시딘의 유사체인 단백질이다. 플루로시딘은 세포막과 상호작용하는 양이온성 α-나선 단백질이다[Cole AM et al., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. J Biol Chem.1997 May 2; 272(18): 12008-13]. 플루로시딘 유사 단백질은 약물 내성 및 저성장 유방암 세포를 포함한 유방암종 세포에 대해 활성이다[Hilchie AL et al., Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. Breast Cancer Res. 2011 Oct 24; 13(5): R102].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 126으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 25개의 아미노산 펩타이드 및 서열 번호 127로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 26개의 아미노산 펩타이드이다.
진핵 세포에 대해 구멍 형성 활성을 가지는 도메인 (b)의 또 다른 효과기 펩타이드는는 B27 펩타이드 - 카텔리시딘 계열에 속하는 소의 골수세포로부터 분리된 BMAP27 단백질의 절단 버전이다[Donati M. et al., Activity of Cathelicidin Peptides against Chlamydia spp., Antimicrob Agents Chemother. 2005 March; 49(3): 1201-1202].
특히, 이러한 효과기 펩타이드는 서열 번호 130으로 열거되어 있는 첨부된 서열에 제시된 25개의 아미노산 펩타이드이다.
암세포의 표면상에 존재하는 TRAIL 수용체에 대한 결합시, 융합 단백질은 이중 효과를 나타낸다. TRAIL의 기능적 단편 또는 보존된 기능성을 가지는 이의 동족체인 도메인 (a)는 이의 공지된 작용제 활성, 즉 세포 표면상의 사멸 수용체에 대한 결합 및 아폽토시스의 외인성 경로의 활성화를 나타낼 것이다. 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 TRAIL 도메인의 활성과 병행하여 세포외에서 또는 세포내에서 이의 작용을 잠재적으로 나타낼 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질에서, 항종양 TRAIL 활성은 세포의 정전기 전하의 교란, 세포질로부터 이온의 누출 또는 미토콘드리아 정전기 전위의 불안정화 및 DR 시리즈의 기능적 수용체에 대한 TRAIL의 부착으로부터의 신호와 상승적인 내부적으로 유도된 아폽토시스를 활성화하는 시토크롬 C, SMAC/DIABLO 또는 인자 AIF와 같은 인자의 세포질로의 방출을 야기하는 세포막 또는 미토콘드리아막에서의 구멍의 형성에 의해 강력해진다.
신규한 융합 단백질은 또한 각각의 천연 세포용해성 펩타이드에 대해 적어도 감소되거나 제한되거나 심지어 상당히 제거된 용혈 활성 특징을 나타낸다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 도메인 (a) 및 도메인 (b)는 세포 환경, 특히 종양 세포 환경에서 존재하는 프로테아제, 예를 들면, 메탈로프로테아제, 유로키나아제 또는 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 포함하는 하나 이상의 도메인 (c)에 의해 연결되어 있다.
프로테아제에 의해 인식되는 서열은,
- 메탈로프로테아제 MMP Pro　Leu　Gly　Leu　Ala　Gly　Glu　Pro/ PLGLAGEP에 의해 인식되는 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열을 형성하는 이의 단편,
- 유로키나아제 uPA Arg　Val　Val　Arg/RVVR에 의해 인식되는 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 유로키나아제에 의해 인식되는 서열을 형성하는 이의 단편, 및
이들의 조합, 또는
- 푸린 Arg　Gln　Pro　Arg/RQPR, Arg　Gln　Pro　Arg　Gly/RQPRG, Arg　Lys　Lys　Arg/RKKR에 의해 인식되는 서열, 문헌[M. Gordon et al., in Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87]에 개시되어 있는 푸린에 의해 인식되는 다른 이례적인 서열 또는 푸린 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL 또는 HisArgGlnProArgGlyTrpGluGln / HRQPRGWEQ에 의해 인식되는 천연 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 푸린에 의해 인식되는 서열을 형성하는 이의 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열 및/또는 유로키나아제 uPA에 의해 인식되는 서열 및/또는 임의의 순서로 서로 옆에 위치하는 푸린에 의해 인식되는 서열의 조합이다.
바람직하게는, 하나의 실시형태에서, 도메인 (c)는 Arg　Val　Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ RVVRPLGLAG 및 Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg　Val　Val Arg/PLGLAGRVVR로부터 선택된 푸린에 의해 인식되는 서열이다.
프로테아제인 메탈로프로테아제 MMP, 유로키나아제 uPA 및 푸린은 종양 환경에서 과발현된다. 프로테아제에 의해 인식되는 서열의 존재는 도메인 (b)로부터 도메인 (a)의 절단, 즉 기능적 도메인 (b)의 방출 및 이에 따른 이의 가속화된 활성화를 가능하게 한다.
세포 내로 융합 단백질의 내재화 후 효과기 펩타이드 - 기능적 도메인 (b)의 활성화는 리소좀(lisosomal) 효소 (비특이적 프로테아제)에 의한 본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)로부터 도메인 (a)의 절단에 의해 비특이적으로 발생할 수 있다.
프로테아제 절단 부위의 존재는 효과기 펩타이드의 신속한 방출을 가능하게 함으로써, 비특이적인 프로테아제에 의한 융합 단백질의 무작위 분해가 일어나기 전에 종양 환경에서 과발현된 프로테아제에 의한 hTRAIL 단편으로부터의 절단의 결과로서 펩타이드를 이의 작용 부위까지 운반하는 기회를 증가시킨다.
추가로, 운반 도메인 (d)는 본 발명의 융합 단백질의 효과기 펩타이드의 도메인 (b)에 부착될 수 있다.
도메인 (d)는,
- (d1) 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 히스티딘 잔기 (His/H)로 이루어진, 세포막을 통해 운반하는 폴리히스티딘 서열,
- (d2) 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 아르기닌 잔기 (Arg/R)로 이루어진, 세포막을 통해 운반하는 폴리아르기닌 서열,
- (d3) PD4 운반 서열 (단백질 전달 도메인 4) Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /YARAAARQARA,
- (d4) 트랜스페린 수용체 결합 서열로 이루어진 운반 서열 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /THRPPMWSPVWP,
- (d5) PD5 운반 서열 (단백질 전달 도메인 5, TAT 단백질) Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR,
- 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 운반 도메인 (d1) 또는 (d2)의 서열을 형성하는 이들의 단편, 및
- 이들의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
도메인, 예를 들면, (d1) 및 (d2)의 조합은 특히 조합 (d1)/(d2) 및 (d2)/(d1)을 포함할 수 있다.
더욱이, 도메인, 예를 들면, (d1) 및 (d2)의 조합은 서로 옆에 위치하고 도메인 (b)의 하나의 말단에 연결된 도메인 및/또는 도메인 (b)의 상이한 말단에 연결된 도메인을 포함할 수 있다.
융합 단백질이 도메인 (b)에 부착된 운반 도메인 (d)와 도메인 (a) 및 도메인 (b) 사이의 절단 부위의 도메인 (c) 둘 다를 가지는 경우, 작제물의 절단 후에도 운반 도메인 (d)가 여전히 도메인 (b)에 부착되어 있는 방식으로 도메인 (c)가 위치되어 있음을 이해해야 한다. 즉, 융합 단백질이 운반 도메인 (d)와 절단 부위 도메인 (c) 둘 다를 함유하는 경우, 도메인 (d)는 도메인 (b)와 도메인 (c) 사이에 위치되어 있거나, 도메인 (d)의 부착 부위에 대향하는 도메인 (b)의 말단에 위치되어 있다.
본 발명은 또한 도메인 (d)가 2개의 도메인 (c) 사이에 위치되어 있는 변이체, 즉 작제물의 절단 후 운반 도메인, 바람직하게는 전위 도메인이 TRAIL 도메인에도 효과기 펩타이드 도메인에도 부착되어 있지 않은 변이체를 포함한다.
본 발명은 도메인 (d)가 도메인 (c)와 도메인 (a) 사이에 위치되어 있는 변이체, 즉 작제물의 절단 후에도 운반 도메인이 여전히 TRAIL 도메인에 부착되어 있는 변이체를 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 융합 단백질에 대한 PEG 분자의 부착에 적절한 서열 (페길화 링커)을 포함하는 도메인 (e)가 추가로 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 위치되어 있다. 이러한 링커는 공지된 서열인 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu Gly/ASGCGPEG 또는 이의 단편일 수 있으며, 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 PEG 분자의 부착에 적합한 서열을 형성한다. 페길화 링커는 또한
Ala　Ala　Cys　Ala　Ala/AACAA,
Ser　Gly　Gly　Cys　Gly　Gly　Ser/SGGCGGS,
Ser　Gly　Cys　Gly　Ser/SGCGS 또는
이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 PEG 분자의 부착에 적합한 서열을 형성한다.
바람직하게는, 페길화 링커의 서열은 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu Gly/ ASGCGPEG이다.
융합 단백질의 주요 기능적 요소 및 절단 부위 도메인(들) 이외에도, 본 발명의 융합 단백질은 가요성 입체 링커의 중립(neutral) 서열/서열들을 함유할 수 있다. 이러한 입체 링커는 잘 공지되어 있으며, 문헌에 개시되어 있다. 융합 단백질 내로 이들의 혼입은 숙주 세포에서 이의 과발현의 과정에 의해 생성된 단백질의 정확한 접기(folding)를 제공하는 것으로 의도된다. 특히, 입체 링커는 글리신, 글리신-세린 또는 글리신-시스테인-알라닌 링커일 수 있다.
특히, 입체 링커는 글리신과 세린 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Gly　Gly　Gly　Ser/GGGGS, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Gly　Gly　Ser/GGGS, Gly　Gly　Gly/GGG 또는 Gly　Gly　Gly　Gly/GGGG, Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Ser Gly/GGSG, Gly Ser Gly/GSG, Ser Gly Gly/SGG 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 실시형태에서, 입체 링커는 글리신, 세린 및 알라닌 잔기의 임의의 조합, 예를 들면, Ala　Ser　Gly　Gly/ASGG, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, Ala Ser Gly/ASG일 수 있다. 입체 링커, 예를 들면, 서열 Gly Gly Gly Ser Gly/ GGGSG, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Gly　Gly/GGG와 입체 링커로서 작용하는 또 다른 단편의 조합을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이러한 경우, 입체 링커는 글리신, 세린 및 알라닌 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Gly　Gly　Ser　Ala　Ser　Gly　Gly/GGGSASGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly /GGSGGGSGGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGSGGGGGS 또는 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGGGGS일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 입체 링커는 세린과 히스티딘 잔기의 조합, 예를 들면, Ser　His　His　Ser/SHHS 또는 Ser　His　His　Ala　Ser/SHHAS일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 입체 링커는 또한 단일 아미노산 잔기, 예를 들면, 단일 글리신 또는 시스테인 잔기, 특히 1개 또는 2개 내지 4개 이하의 글리신 또는 시스테인 잔기로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 링커는 또한 부착되는 서열의 말단 아미노산에 의해 입체 링커 서열을 형성하는, 상기에 개시된 입체 링커의 단편에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 입체 링커는 본 발명의 융합 단백질의 삼량체의 구조의 형성 및 안정화를 촉진하고, 이렇게 하여 혈액 순환계에서 이의 반감기를 증가시키고, 혈액 순환계 내로의 투여 후 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 탈결합(deasociation)을 방지한다. 이러한 경우, 상기 링커는 시스테인과 알라닌의 조합, 예를 들면, 단편 Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/ CAAACAAC 또는 Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys / CAACAAAC 또는 이들의 단편이며, 부착되는 말단 아미노산 서열이고 삼량체 구조를 안정화하는 입체 링커 서열을 형성한다.
또한, 입체 링커는 또한 비특이적 방식으로 발생하는 기능적 도메인 (b)의 활성화에 유용할 수 있다. 비특이적 방식에서의 도메인 (b)의 활성화는 입체 링커의 pH-의존적 가수분해로 인해 본 발명에 따른 융합 단백질의 도메인 (b)로부터 도메인 (a)를 잘라냄으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 특정 실시형태는 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 125, 서열 번호 126, 서열 번호 127, 서열 번호 128, 서열 번호 129, 서열 번호 130, 서열 번호 131 및 서열 번호 132로 표시되는 펩타이드의 군으로부터 선택된 구멍 형성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다.
상기에서 언급된 대표적인 융합 단백질의 구조에 대한 상세한 설명은 하기에 제시된 실시예에 나타낸다.
본 발명에 따르면, 융합 단백질이란 2개 이상의 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 단일 단백질 분자를 의미하며, 이는 추가의 화학 링커를 사용하지 않고 이의 각각의 펩타이드 쇄 내의 펩타이드 결합을 통해 공유결합되어 있다.
융합 단백질은 또한 대안적으로 단백질 작제물 또는 키메라 단백질로서 개시될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "작제물" 또는 "키메라 단백질"은, 사용된다면, 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이와 같이 정의된 융합 단백질이 펩타이드 및 단백질의 공지된 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
융합 단백질은 화학 펩타이드 합성 방법, 특히 캐리어로서 적절한 수지를 사용하는 고체상에서의 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 것이고 당업계에 공지되어 있으며, 그 중에서도 특히 논문, 예를 들면, [Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company]에 개시되어 있다.
융합 단백질은 연속 단백질로서 펩타이드의 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 단백질의 각 단편(도메인)을 별개로 합성하고, 이어서 제2 펩타이드의 카복실 말단으로부터 하나의 펩타이드 단편의 아미노 말단을 축합함으로써, 펩타이드 결합을 통해 하나의 연속 펩타이드로 함께 조합할 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 것이고 잘 공지되어 있다.
그러나, 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질은 숙주 세포 내의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 유전자 발현 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이다.
생성된 펩타이드의 구조를 증명하기 위해, 고분해능 질량 분석법과 같은 펩타이드의 아미노산 조성의 공지된 분석 방법을 사용하여 펩타이드의 분자량을 측정할 수 있다. 펩타이드 서열을 확인하기 위해, 순차적으로 펩타이드를 분해하고 아미노산의 서열을 식별하는 단백질 서열 분석기도 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA 서열이다.
바람직하게는, 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA는 대장균에서의 발현에 최적화된 서열이다.
본 발명의 또 다른 측면은 또한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 융합 단백질의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 대장균 세포이다.
융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 생성 방법은 잘 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 이러한 기술은 폴리뉴클레오타이드 분자, 예를 들면, 표적 단백질의 아미노산 서열을 암호화하고 숙주에서 표적 단백질의 발현을 유도하는 DNA 분자의 생성에 있다. 이어서, 폴리뉴클레오타이드 분자를 암호화하는 표적 단백질을 적절한 발현 벡터에 혼입하는데, 이 발현 벡터는 폴리펩타이드의 효율적 발현을 보장한다. 이어서, 형질 감염/형질 전환을 위해 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 그 결과로서 형질 전환된 숙주 세포가 생성된다. 이후, 형질 전환된 세포를 배양하여 표적 단백질을 과발현시키고, 수득된 단백질을 정제하고, 임의로 단백질의 발현 또는 정제에 사용된 태그 서열을 절단하여 잘라낸다.
발현 및 정제의 적절한 기술은, 예를 들면, 논문[Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990); 및 A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995]에 개시되어 있다.
숙주 세포에서 DNA 서열의 도입 및 복제를 위한 발현 벡터로서, 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 사용할 수 있다. 전형적으로 플라스미드를 발현 벡터로서 사용한다. 적절한 플라스미드는 잘 공지되어 있으며, 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 및 적절한 숙주 세포에 혼입된 암호화 서열의 전사 및 해독을 위한 필수 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 선택은 숙주 세포의 유형에 의존하며 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라아제 결합 서열, 암호화 서열 전에 삽입된 전사 개시 신호를 함유하는 리보솜 결합 서열, 및 암호화 서열 후에 삽입된 전사 종결자 서열이다. 더욱이, 사용되는 숙주 세포 및 벡터에 따라, 복제 원점, 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사의 유도를 허용하는 서열과 같은 기타 서열을 발현 벡터에 도입할 수 있다.
발현 벡터는 또한 형질전환된 세포에 정의된 표현형을 부여하고 형질전환된 세포의 특이적인 선택을 가능하게 하는 마커 유전자 서열을 포함할 것이다. 더욱이, 벡터는 또한 삽입된 표적 단백질의 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포와 삽입되지 않은 플라스미드를 취한 세포를 구별하게 하는 제2 마커 서열을 함유할 수 있다. 가장 종종 전형적인 항생제 내성 마커를 사용하지만, 자가방사선 기술, 분광광도법, 생체발광 또는 화학발광을 사용하여 세포내(생체내)의 존재를 용이하게 측정할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다른 리포터 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포에 따라, β-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 루시페라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 사용할 수 있다.
더욱이, 발현 벡터는 접기를 용이하게 하는 적절한 세포 구획, 예를 들면, 주변세포질(periplasma)로 단백질을 운반하는 신호 서열을 함유할 수 있다. 추가로, N-말단에 부착된 HisTag 또는 C-말단에 부착된 GST와 같은 라벨/태그를 암호화하는 서열이 존재할 수 있으며, 이는 니켈 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피를 통해, 친화성의 원리를 사용하여 생성된 단백질의 후속 정제를 용이하게 한다. 숙주 세포 내에서 단백질 가수분해에 대해 단백질을 보호하는 추가의 서열 뿐만 아니라, 이의 용해도를 증가시키는 서열도 또한 존재할 수 있다.
표적 단백질의 서열에 부착된 보조 요소는 이의 활성을 차단하거나, 예를 들면, 독성으로 인한 것과 같은 또 다른 이유로 유해할 수 있다. 이러한 요소를 제거해야 하는데, 이는 효소 절단 또는 화학 절단에 의해 달성될 수 있다. 특히, 6개의 히스해딘 태그 HisTag 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 정제를 허용하도록 부착된 이러한 유형의 다른 마커를 제거해야 하는데, 그 이유는 가용성 TRAIL 단백질의 간 독성에 대해 기술된 효과 때문이다. 대장균 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 세균, 사카로마이세스 세르비지 애(Saccharomyces cervisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모의 원핵 세포 및 진핵 세포주(곤충, 포유동물, 식물)를 포함한 공지된 각종 숙주 세포를 기반으로 하는 이종 발현 시스템을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 배양 및 유전자 조작의 용이성 및 다량의 수득 생성물로 인해, 대장균 발현 시스템을 사용한다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 대장균에서의 발현을 위해 최적화될 것이고, 즉 당업계에 공지된 가능한 서열 변이체로부터 선택된 대장균에서의 발현에 최적인 코돈을 암호화 서열에 함유할 것이다. 더욱이, 발현 벡터는 암호화 서열에 부착된 대장균에 적합한 상기에서 개시된 요소를 함유할 것이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 서열 번호 122, 서열 번호 123 및 서열 번호 124로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 서열의 군으로부터 선택되며, 이들은 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 106, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질을 암호화한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 또한 상기에서 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열인 서열 번호 57 내지 서열 번호 87 및 서열 번호 108 내지 서열 번호 124의 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 대장균의 형질 전환에 적절한 발현 벡터 뿐만 아니라, 이러한 발현 벡터로 형질전환된 대장균 세포를 제공한다.
형질 전환, 즉 세균성 숙주 세포, 특히 대장균 내로 DNA 서열의 도입은, 예를 들면, 저온(4℃)에서 칼슘 이온으로 처리하고, 이어서 열 충격(37℃ 내지 42℃에서)을 수행하거나, 전기천공법에 의해 DNA를 취하도록 제조된 적격 세포상에서 일반적으로 수행된다. 이러한 기술은 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 발현 시스템의 제조업자에 의해 결정되거나, 문헌 및 실험 작업을 위한 매뉴얼[Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982]에 개시되어 있다.
대장균 발현 시스템에서의 본 발명의 융합 단백질의 과발현의 절차는 하기에서 더 개시될 것이다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질 및 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 통상의 보조 성분을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 담체 또는 희석제에 용해 또는 분산된 유효량의 본 발명의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 보조 성분을 함유할 것이며, 바람직하게는 단위 투여 형태로 제형화된 약학적 조성물 또는 복수의 용량을 함유하는 제형의 형태일 것이다. 약학적 형태 및 이의 제형화 방법 뿐만 아니라, 다른 성분, 담체 및 희석제는 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌에 개시되어 있다. 예를 들면, 이들은 논문[Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA]에 개시되어 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 보조 성분"이란, 당업계에 공지된 임의의 용매, 분산매, 계면활성제, 항산화제, 안정화제, 보존제(예를 들면, 항세균제, 항진균제) 및 등장제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 선택된 투여 경로 및 목적하는 투여 형태, 예를 들면, 경구, 비경구, 흡입, 국소용 액체, 고체 및 에어로졸 형태에 따라 및 이러한 선택된 형태가 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균 상태이어야 하는지에 따라 각종 유형의 담체, 희석제 및 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 종양내와 같은 주사 경로, 또는 단일 또는 지속적 정맥내 주입을 포함한 비경구이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 종양에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 피하로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은, 필요에 따라, 적절한 pH로 완충되고 체액과 등삼투성인 약제학적으로 허용 가능한 수성 또는 비수성 매질 중의 용액 또는 분산액일 수 있으며, 또한 수용자의 조직 또는 혈액과 조성물을 상용가능하게 하는 항산화제, 완충액, 정균제, 가용성 물질도 함유할 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 기타 성분은, 예를 들면, 물, 알콜, 예를 들면, 에탄올, 폴리올, 예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 예를 들면, 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포솜을 포함할 수 있다. 상기 물질의 적절한 유동성 및 입자 크기는 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴 및 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리소르베이트 등에 의해 제공될 수 있다.
액체 비경구 조성물을 위한 적절한 등장제는, 예를 들면, 글루코스와 같은 당, 염화 나트륨 및 이들의 조합이다.
대안적으로, 주사 투여 또는 주입 투여를 위한 약학적 조성물은, 예를 들면, 발열원이 없는 멸균수와 같은 적절한 캐리어에서 사용되기 직전에 재구성하기 위한 분말 형태, 예를 들면, 동결 건조된 분말일 수 있다.
비경구 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물은 또한 용액, 스프레이 또는 에어로졸을 포함하는 비강 투여의 형태를 가질 수 있다. 바람직하게는 비내 투여를 위한 형태는 수용액일 것이며, 코 분비물과 유사한 특성을 유지하기 위해 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지하도록 완충되거나 등장성일 것이다. 더욱이, 이는 잘 공지된 비내 제제에서와 같이 보존제 또는 안정화제를 함유할 것이다.
조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 각종 항산화제를 함유할 수 있다. 더욱이, 미생물의 작용을 방지하기 위해, 조성물은, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 티메로살, 소르브산 및 이러한 유형의 공지된 유사 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 각종 항세균제 및 항진균제를 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들면, 약 0.01 중량% 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 보다 특히, 조성물은 조성물 단위당 활성 성분을 1 중량% 내지 75 중량%의 양으로 또는, 예를 들면, 25 중량% 내지 60 중량%의 양으로 함유할 수 있으나, 지정된 값으로 한정되는 것은 아니다. 인간을 포함한 환자에게 투여되는 본 발명에 따른 조성물의 실제 복용량은 체중, 병태의 중증도, 치료될 질환의 유형, 선행 또는 수반되는 치료적 개입, 투여 환자 및 투여 경로와 같은 육체적 및 생리적 요인에 의해 결정될 것이다. 적절한 단위 복용량, 전체 복용량 및 조성물 중 활성 성분의 농도는 치료하는 의사에 의해 결정된다.
조성물은, 예를 들면, 환자의 체중 1kg 당 약 1μg 내지 약 1000mg, 예를 들면, 환자의 체중 1kg 당 5mg 내지 100mg의 범위 또는 5mg 내지 500mg의 범위의 복용량으로 투여될 수 있다. 융합 단백질 및 이를 함유하는 조성물은 항암 또는 항종양을 나타내며, 암 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 인간을 포함한 포유동물에서 암 질환을 치료하기 위한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 인간을 포함한 포유동물에서 신생물/암 질환을 치료하는 방법도 제공하는 것으로서, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상에게 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질을 항신생물/항암 유효량으로, 임의로 적절한 약학적 조성물의 형태로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 백혈병, 육아종증, 골수종 및 기타 혈액암과 같은 혈액암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 융합 단백질은 또한 유방암, 비소세포 폐암을 포함한 폐암, 대장암, 췌장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신장암, 뇌암 등과 같은 고형 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다. 암의 치료에서 융합 단백질의 적절한 투여 경로는 특히 비경구 경로일 것이며, 이는 주사액 또는 주입액의 형태의 본 발명의 융합 단백질을 이러한 투여 경로에 적절한 조성물 및 형태로 투여하는데에 있다. 본 발명은 하기의 특정 융합 단백질의 일반 절차 및 실시예에서 더 상세히 개시될 것이다.
융합 단백질의 과발현을 위한 일반 절차
플라스미드의 제조
대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 표적 융합 단백질의 아미노산 서열은 이를 암호화하는 DNA 서열을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. 이러한 절차는 대장균에서의 표적 단백질 합성의 추가 단계의 효율을 증가시키는 것을 가능하게 한다. 이어서, 생성된 뉴클레오타이드 서열은 자동적으로 합성되었다. 추가로, 제한 효소 Ndel (선도 가닥의 5'-말단에서) 및 Xhol (선도 가닥의 3'-말단에서)의 절단 부위를 표적 단백질을 암호화하는 생성된 유전자에 첨가하였다. 이들을 사용하여 벡터 pET28a(Novagen)에 유전자를 클로닝하였다. 이들은 또한 단백질을 암호화하는 유전자를 다른 벡터에 클로닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 작제물로부터 발현된 표적 단백질은 트롬빈에 의해 인식된 부위에 후행하는 폴리히스티딘 태그(6개의 히스티딘)가 N-말단에 임의로 설치되며, 이는 이어서 친화성 크로마토그래피를 통해 정제를 위해 제공되었다. 일부 표적은 어떠한 태그도 없이, 특히 히스티딘 태그 없이 발현되었고, 이어서 이들을 SP 세파로스상에서 정제하였다. 생성된 작제물의 정확성을 효소 Ndel 및 Xhol을 사용하여 분리된 플라스미드의 제한 분석에 의해 우선적으로 확인한 후, 표적 단백질의 전체 해독틀의 자동 서열분석에 의해 확인하였다. 서열분석을 위해 사용된 프라이머는 벡터에 존재하는 T7 프로모터 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') 및 T7 종결자 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')의 서열에 상보적이다. 생성된 플라스미드는 제조업자의 추천에 따라 형질전환된 시판용 대장균 균주에서의 표적 융합 단백질의 과발현을 위해 사용되었다. 선택 배지(LB 한천, 카나마이신 50 μg/ml, 1% 글루코스) 상에서 수득된 콜로니는 카나마이신(50μg/ml) 및 1% 글루코스로 보충된 LB 액체 배지에서 밤새 배양하기 위해 사용되었다. 진탕 배양기에서 약 15시간의 성장 후, 배양물을 사용하여 적절한 배양물에 접종하였다.
융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 A
카나마이신(30μg/ml) 및 100μM 황산아연을 포함하는 LB 배지에 밤새 배양한 배양물을 접종하였다. 600nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 상기 배양물을 37℃에서 배양하였다. 이어서, IPTG를 0.25mM 내지 1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서의 진탕 배양 (3.5시간 내지 20시간) 후, 배양물을 25분간 6,000g에서 원심분리하였다. 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 완충액에 세균 펠릿을 재현탁시켰다. 현탁액을 8분 동안 얼음상에서 초음파처리하였다(40% 진폭, 15초 펄스, 10초 간격). 생성된 추출물을 20,000g, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로스(GE Healthcare) 수지를, 세균 세포 추출물의 제조를 위해 사용된 완충액에 의한 평형으로 예비처리하였다. 이어서, 추출물의 원심 분리 후 수득된 상청액과 함께 상기 수지를 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 이를 크로마토그래피 컬럼에 주입하고, 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸의 pH 7.4의 완충액 15용적 내지 50용적으로 세정하였다. 수득된 단백질을 0.5M NaCl을 함유하는 pH 7.4의 50mM KH2PO4 완충액 중의 이미다졸 구배를 사용하여 컬럼으로부터 수득된 단백질을 용출시켰다. 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 적절한 분획을 합하고, 50mM 트리스 완충액, pH 7.2, 150mM NaCl, 500mM L-아르기닌, 0.1mM ZnSO4, 0.01% Tween 20에 대하여 4℃에서 밤새 투석하고, 동시에, 존재하는 경우, Histag를 트롬빈 (1:50)으로 절단하였다. 절단 후, 벤즈아미딘 SepharoseTM 수지를 사용하는 정제에 의해, Histag와 함께 발현된 표적 융합 단백질로부터 트롬빈을 분리하였다. Histag 없이 발현된 표적 융합 단백질의 정제는 SP 세파로스 상에서 수행하였다. 생성물의 순도를 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석하였다[Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982].
융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 B
카나마이신(30μg/ml) 및 100μM 황산아연을 포함하는 LB 배지에 밤새 배양물을 접종하였다. 600nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 상기 배양물을 37℃에서 배양하였다. 이어서, IPTG를 0.5mM 내지 1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서의 진탕 배양 20시간 후, 배양물을 25분 동안 6,000g에서 원심분리하였다. 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-머캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)를 함유하는 pH 7.8의 완충액에서, 과발현 후의 세균 세포를 프렌치 프레스(French Press)로 파괴하였다. 생성된 추출물을 8,000g에서 50분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로스 수지를 수득된 상청액과 함께 밤새 배양하였다. 이어서, 결합 단백질을 포함하는 수지를 크로마토그래피 컬럼에 충전하였다. 비결합 단백질을 함유하는 분획을 세정하여 제거하기 위해, 컬럼을 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-머캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)의 pH7.8의 완충액 15용적 내지 50용적으로 세정하였다. 이어서, 층(bed)과 특이적으로 결합하는 대부분의 단백질을 세정하여 제거하기 위해, 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 500mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0,5mM PMSF를 함유하는 pH 7.5의 완충액으로 컬럼을 세정하였다. 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다[Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982]. 표적 단백질을 함유하는 분획을 합하고, 단백질이 히스티딘 태그와 함께 발현된 경우, 트롬빈으로 절단하여(1U/4mg의 단백질, 16℃에서 8시간) 폴리히스티딘 태그를 제거하였다. 이어서, 분획을 제형 완충액(500mM L-아르기닌, 50mM 트리스, 2.5mM ZnSO4, pH 7.4)에 대하여 투석하였다.
본 상세한 설명에서, 이어서 제거된 히스티딘 태그와 함께 최초로 발현된 단백질의 실시예는 실시예 번호 옆에 위첨자 a)로 지정된다. 히스티딘 태그 없이 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호 옆에 위첨자 b)로 지정된다.
2-D 전기영동에 의한 융합 단백질의 특성화
수득된 단백질을 더 특성화하고 크로마토그래피 조건을 정확하게 선택하기 위해, 단백질의 등전점을 측정하였다. 이러한 목적을 위해, 하기 계획에 따라 2단계로 2차원 전기영동(2-D) 방법을 사용하였다.
단계 1. pH 구배 및 변성 조건에서 단백질의 등전점전기영동(isoelectrofocusing)
1mg/ml 내지 2mg/ml 농도의 단백질 제제를 아세톤 중의 10% 트리클로로아세트산 및 0.07% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 침전 용액과 1:1 비율로 혼합하여 침전시켰다. 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 배양하고, 이어서 15,000g 및 4℃에서 25분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 0.07% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 냉 아세톤으로 2회 세정하였다. 이어서, 탐지 가능한 냄새가 검출되지 않을 때까지 아세톤 잔기를 증발시켰다. 이어서 사용된 스트립(strip)에 따라, pH 3 내지 pH 11 또는 pH 6 내지 pH 11의 프로파일을 가지는 8M 우레아, 1% CHAPS, 15mM DTT, 0.5% 양쪽성 물질(GE Healthcare)의 재수화 완충액 250ml에 단백질 펠릿을 현탁시켰다. 등전점전기영동을 위해 단백질 용액을 세라믹 챔버에 넣은 후, 적절한 pH 프로파일(3-11 또는 6-11)을 가지는 13cm DryStrip (GE Healthcare)에 넣었다. 전체를 미네랄 오일 층으로 덮었다. 챔버를 Ettan IPGphor III 장치에 넣고, 등전점전기영동을 스트립의 치수 및 pH 프로파일에 할당된 하기 프로그램에 따라 수행하였다:
20℃에서의 16시간 탈수
고정된 pH 구배로 전기장에서의 등전점전기영동
Figure pct00001
이어서, 등전점전기영동된 단백질을 함유하는 스트립을 탈이온수에서 1분간 세정하고, Coomassie Brilliant로 염색하고, 이어서 탈색하고, 단백질의 위치를 표시하기 위해 이미지 파일로 보관하였다. 변색된 스트립을 다음 조성의 완충액으로 15분 동안 2회 평형화시켰다: 50mM 트리스-HCl pH 8.8, 6M 우레아, 1% DTT, 2% SDS, 30% 글리세롤.
단계 2. SDS-PAGE에 의한 제2 방향에서의 분리
스트립을 표준 크기 당 단일 웰을 함유하는 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 위에 놓고, 이어서 3시간 동안 200V의 전압에서 SDS-PAGE용 장치로 분리를 수행하였다. 겔을 Coomassie Brilliant로 염색하고, 이어서 적용된 스케일로 파일 보관하였다. 단백질은 표준 크기를 기준으로 이의 중량을 측정하여 확인되었고, 이의 IPI는 제조업자(GE Healthcare)에 의해 제공된 곡선(애노드로 표시된 말단으로부터 스트립 길이의 %에 대한 pH의 비율)을 기준으로 하여 6-11의 규모로 판독되거나 등전점전기영동 캘리브레이션 키트(GE Healthcare)에 의해 실험적으로 측정된 곡선을 기준으로 3-11의 규모로 판독되었다.
실시예
본 발명의 융합 단백질의 대표적인 실시예는 하기 실시예에 나타낸다.
실시예에서, 융합 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 N-말단으로부터 C-말단으로 기재된다. 실시예에서, TRAIL이란 항상 hTRAIL을 의미한다.
하기 아미노산 서열 성분의 명칭이 사용되며, 3개의 문자 옆에는 동등한 1개의 명칭이 주어진다.
LINKER1: 입체 링커 Gly　Gly　/GG
LINKER2: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　/ GGG
LINKER3: 입체 링커 Gly　Ser　Gly　/GSG
LINKER4: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Gly Ser /GGGGS
LINKER5: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Gly Gly Ser /GGGGGS
LINKER6: 입체 링커 Gly　Gly　Ser　Gly　Gly /GGSGG
LINKER7: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly /GGGSGGG
LINKER8: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　/GGGGSG
LINKER9: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Gly　Gly　Ser /GGGSGGGGGS
LINKER10: 입체 링커 Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly Gly　Gly /GGGGSGGGG
LINKER11: 입체 링커 Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly /GSGGGSGGG
LINKER12: 입체 링커 Cys　Ala　Ala　Cys　Ala　Ala　Ala　Cys /CAACAAAC
LINKER13: 입체 링커 Cys　Ala　Ala　Ala　Cys　Ala　Ala　Cys /CAAACAAC
LINKER14: 입체 링커 Cys /C
LINKER15: 입체 링커 Gly /G
LINKER16: 입체 링커 Ser Gly Gly /SGG
FURIN: 푸린에 의해 절단된 서열 Arg　Lys　Lys　Arg /RKKR
FURIN.NAT: 푸린에 의해 절단된 최초 서열 His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln /HRQPRGWEQ
UROKIN: 우로키나아제에 의해 절단된 서열 Arg　Val　Val　Arg /RVVR
MMP: 메탈로프로테아제에 의해 절단된 서열 Pro　Leu　Gly　Leu　Ala　Gly /PLGLAG
PEG1: 페길화 링커 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu /ASGCGPE
PEG2: 페길화 링커 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu　Gly /ASGCGPEG
TRANS1: 운반 서열 His　His　His　His　His　His /HHHHHH
TRANS2: 운반 서열 Arg Arg　Arg　Arg　Arg　Arg　Arg /RRRRRRR
TRANS3: 운반 서열 Arg Arg　Arg　Arg　Arg　Arg　Arg　Arg /RRRRRRRR
TRANS4: 운반 서열 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /YARAAARQARA
TRANS5: 운반 서열 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /THRPPMWSPVWP
TRANS6: 운반 서열 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR
실시예 1. 서열 번호 1의 융합 단백질
서열 번호 1의 단백질은 258개의 아미노산의 길이 및 29.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 사람 그라눌라이신 (서열 번호 34)의 83개의 아미노산 활성 형태이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 G, 입체 링커 (GSG), 메탈로프로테아제 MMP 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER15-LINKER3-MMP-UROKIN-(서열 번호 34)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 57이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 1을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 57을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 2. 서열 번호 2의 융합 단백질
서열 번호 2의 단백질은 261개의 아미노산의 길이 및 30.09 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL119-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 사람 그라눌라이신 (서열 번호 34)의 83개의 아미노산 활성 형태이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 입체 링커 (GGGGS)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 34)-UROKIN-MMP-LINKER4-(TRAIL119-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 58이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 2를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 58을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 2a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 2b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 3. 서열 번호 3의 융합 단백질
서열 번호 3의 단백질은 186개의 아미노산의 길이 및 21.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 합성 15개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 35)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-MMP-UROKIN-(서열 번호 35)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 59이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 3을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 59를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 4. 서열 번호 4의 융합 단백질
서열 번호 4의 단백질은 227개의 아미노산의 길이 및 25.7 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 56개의 아미노산 필로술린-1 (서열 번호 36)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 36)-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 60이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 4를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 60을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 5. 서열 번호 5의 융합 단백질
서열 번호 5의 단백질은 264개의 아미노산의 길이 및 29.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 56개의 아미노산 필로술린-1 (서열 번호 36) 이며 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (CAACAAC), 입체 링커 (GGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL95-281)-LINKER12-LINKER2-MMP-UROKIN-(서열 번호 36)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 61이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 5를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 61을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 6. 서열 번호 6의 융합 단백질
서열 번호 6의 단백질은 299개의 아미노산의 길이 및 33.2 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 90개의 아미노산 펩타이드 필로술린 5 (서열 번호 37)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GSG), 입체 링커 (CAACAAAC), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 입체 링커 (G)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL95-281)-LINKER3-LINKER12-MMP-UROKIN-LINKER15-(서열 번호 37)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 62이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 6을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 62를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 6a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 6b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 7. 서열 번호 7의 융합 단백질
서열 번호 7의 단백질은 224개의 아미노산의 길이 및 25.6 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 타키플레신 (서열 번호 38) 유래의 17개의 아미노산 활성 펩타이드이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (CAACAAAC), 입체 링커 (GG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL95-281)-LINKER12-LINKER1-MMP-UROKIN-(서열 번호 38)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 63이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 7을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 63을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 7a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 7b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 8. 서열 번호 8의 융합 단백질
서열 번호 8의 단백질은 202개의 아미노산의 길이 및 23.8 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 타키플레신 (서열 번호 38) 유래의 17개의 아미노산 활성 펩타이드이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 7개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL114-281)-MMP-UROKIN-TRANS2-(서열 번호 38)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 64이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 8을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 64를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 8a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 8b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 9. 서열 번호 9의 융합 단백질
서열 번호 9의 단백질은 243개의 아미노산의 길이 및 27.6 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 38개의 아미노산 융합 펩타이드 봄베신-마가이닌 (서열 번호 39)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 입체 링커 (CAAACAAC)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 39)-UROKIN-MMP-LINKER13-(TRAIL95-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 9 및 서열 번호 65이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 9를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 65를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 10. 서열 번호 10의 융합 단백질
서열 번호 10의 단백질은 196개의 아미노산의 길이 및 22.4 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL119-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 23개의 아미노산 마가이닌-2 (서열 번호 40)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 40)-UROKIN-MMP-(TRAIL119-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 66이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 10을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 66을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 11. 서열 번호 11의 융합 단백질
서열 번호 11의 단백질은 202개의 아미노산의 길이 및 23 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 8개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 11 및 서열 번호 67이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 11을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 67을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 11a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 11b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 12. 서열 번호 12의 융합 단백질
서열 번호 12의 단백질은 205개의 아미노산의 길이 및 23.2 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 합성 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GG), 페길화 링커 서열 (ASGCGPEG), 입체 링커 서열 (GGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 폴리아르기닌 운반 서열 (RRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL 121-281)-LINKER1-PEG2-LINKER2-MMP-UROKIN-TRANS2-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 68이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 12를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 68을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 13. 서열 번호 13의 융합 단백질
서열 번호 13의 단백질은 228개의 아미노산의 길이 및 25.9 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 8개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL 95-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 13 및 서열 번호 69이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 13을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 69를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 13a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 13b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 14. 서열 번호 14의 융합 단백질
서열 번호 14의 단백질은 192개의 아미노산의 길이 및 22.1 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (C), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 효과기 펩타이드의 N-말단에서, 폴리히스티딘 운반 도메인 (HHHHHH)이 부착되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
TRANS1-(서열 번호 41)-LINKER14-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 70이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 14를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 70을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 15. 서열 번호 15의 융합 단백질
서열 번호 15의 단백질은 200개의 아미노산의 길이 및 23.3 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (C), 8개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRRR), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 폴리히스티딘 운반 도메인 (HHHHHH)이 효과기 펩타이드의 N-말단에서 부착되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
TRANS1-(서열 번호 41)-LINKER14-TRANS3-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 15 및 서열 번호 71이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 15를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 71을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 16. 서열 번호 16의 융합 단백질
서열 번호 16의 단백질은 202개의 아미노산의 길이 및 23.1 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 합성 14개의 아미노산 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 8개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL 121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN TRANS3-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 72이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 16을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 72를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 16a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 16b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 17. 서열 번호 17의 융합 단백질
서열 번호 17의 단백질은 208개의 아미노산의 길이 및 23.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL116-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 26개의 아미노산 하이브리드 펩타이드 세크로핀 A-멜리틴 (서열 번호 42)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 42)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 17 및 서열 번호 73이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 17을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 73을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 18. 서열 번호 18의 융합 단백질
서열 번호 18의 단백질은 203개의 아미노산의 길이 및 23.6 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL116-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 27개의 아미노산 펩타이드 hCAP-18/LL-37 (서열 번호 43)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 43)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 18 및 서열 번호 74이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 18을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 74를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 19. 서열 번호 19의 융합 단백질
서열 번호 19의 단백질은 203개의 아미노산의 길이 및 23.3 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL116-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 27개의 아미노산 펩타이드 BAMP-28 (서열 번호 44)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 44)-UROKIN-MMP-(TRAIL116-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 75이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 19를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 75를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 20. 서열 번호 20의 융합 단백질
서열 번호 20의 단백질은 200개의 아미노산의 길이 및 22.8 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 엔타모에 바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 C의 24개의 아미노산 유사체 (서열 번호 45)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGSGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(서열 번호 45)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 76이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 20을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 76을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 21. 서열 번호 21의 융합 단백질
서열 번호 21의 단백질은 200개의 아미노산의 길이 및 22.8 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 엔타모에 바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 A의 24개의 아미노산 유사체 (서열 번호 46)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGSGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(서열 번호 46)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 77이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 21을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 77을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 22. 서열 번호 22의 융합 단백질
서열 번호 22의 단백질은 200개의 아미노산의 길이 및 22.8 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 엔타모에 바 히스톨리티카 유래의 용해성 펩타이드의 이소형 B의 24개의 아미노산 유사체 (서열 번호 47)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGSGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER6-MMP-UROKIN-(서열 번호 47)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 22 및 서열 번호 78이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 22를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 78을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 23. 서열 번호 23의 융합 단백질
서열 번호 23의 단백질은 190개의 아미노산의 길이 및 22.1 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 HA2 도메인의 12개의 아미노산 단편 (서열 번호 48)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 7개의 아르기닌 운반 서열 (RRRRRRR), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 48)-TRANS2-UROKIN-MMP-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 23 및 서열 번호 79이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 23을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 79를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질(실시예 23a)과 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질(실시예 23b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 24. 서열 번호 24의 융합 단백질
서열 번호 24의 단백질은 429개의 아미노산의 길이 및 48.6 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 포스포리파아제 C 활성을 가지는 클로스트리듐 페르프린젠스 유래의 α-독소의 N-말단 도메인의 247개의 아미노산 단편 (서열 번호 49)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (G), 입체 링커 (GGGGGS), 페길화 링커 (ASGCGPE) 및 입체 링커 (GGGGGS)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 49)-LINKER15-LINKER5-PEG2-LINKER5-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 24 및 서열 번호 80이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 24를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 80을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 25. 서열 번호 25의 융합 단백질
서열 번호 25의 단백질은 658개의 아미노산의 길이 및 73 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 468개의 아미노산 펩타이드 리스테리오라이신 O (서열 번호 50)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (G), 입체 링커 (GGGGSGGGGGS), 푸린 절단 부위 (RKKR), 페길화 링커 (ASGCGPEG) 및 입체 링커 서열 (GGGGGS)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 50)-LINKER15-LINKER9-FURIN-PEG2-LINKER5-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 25 및 서열 번호 81이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 25를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 81을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 26. 서열 번호 26의 융합 단백질
서열 번호 26의 단백질은 478개의 아미노산의 길이 및 54 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 289개의 아미노산 포스포리파아제 PC-PLC (서열 번호 51)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (GGGSGGGGGS), 푸린 절단 부위 (RKKR), 페길화 링커 (ASGCGPEG) 및 입체 링커 (GGGGGS)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 51)-LINKER9-FURIN-PEG2-LINKER5-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 26 및 서열 번호 82이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 26을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 82를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 27. 서열 번호 27의 융합 단백질
서열 번호 27의 단백질은 361개의 아미노산의 길이 및 40.2 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 179개의 아미노산 에퀴나톡신 EqTx-II (서열 번호 52)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 입체 링커 (GGGGS), 푸린 절단 부위 (RKKR), 페길화 링커 (ASGCGPE) 및 입체 링커 (GGGGS)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 52)-LINKER4-FURIN-PEG1-LINKER4-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 27 및 서열 번호 83이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 27을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 83을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 28. 서열 번호 28의 융합 단백질
서열 번호 28의 단백질은 227개의 아미노산의 길이 및 25.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL116-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 46개의 아미노산 펩타이드 비스코톡신 A3 (VtA3) (서열 번호 53)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 입체 링커 (GGSGG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 53)-MMP-UROKIN-LINKER6-(TRAIL116-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 28 및 서열 번호 84이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 28을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 84를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 29. 서열 번호 29의 융합 단백질
서열 번호 29의 단백질은 224개의 아미노산의 길이 및 24.9 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 46개의 아미노산 펩타이드 비스코톡신 A3 (VtA3) (서열 번호 53)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGSGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER7-MMP-UROKIN-(서열 번호 53)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 29 및 서열 번호 85이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 29를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 85를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 30. 서열 번호 30의 융합 단백질
서열 번호 30의 단백질은 200개의 아미노산의 길이 및 22.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 인간 퍼포린의 33개의 아미노산 활성 단편 (서열 번호 54)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 서열 (GGGGSG)이 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER8-(서열 번호 54)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 30 및 서열 번호 86이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 30을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 86을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 31. 서열 번호 31의 융합 단백질
서열 번호 31의 단백질은 210개의 아미노산의 길이 및 23.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 인간 퍼포린의 33개의 아미노산 활성 단편 (서열 번호 54)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER8-UROKIN-MMP-(서열 번호54)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 31 및 서열 번호 87이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 31을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 87을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 32. 서열 번호 32의 융합 단백질
서열 번호 32의 단백질은 436개의 아미노산의 길이 및 48 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL116-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 바실러스 투링겐시스 유래의 251개의 아미노산 파라스포린-2(서열 번호 55)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 입체 링커 (GSGGGSGGG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 55)-UROKIN-MMP-LINKER11-(TRAIL116-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 32 및 서열 번호 88이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 32를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 88을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 33. 서열 번호 33의 융합 단백질
서열 번호 33의 단백질은 215개의 아미노산의 길이 및 24.3 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 32개의 아미노산 융합 펩타이드 (서열 번호 56)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (G), 입체 링커 (CAACAAAC), 입체 링커 (GGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER15-LINKER12-LINKER2-MMP-UROKIN-(서열 번호 56)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 33 및 서열 번호 89이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 33을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 89를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가진 단백질이 발현되었다.
실시예 34. 서열 번호 91의 융합 단백질
서열 번호 91의 단백질은 223개의 아미노산의 길이 및 25.2 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 PDGFR 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 39개의 아미노산 융합 펩타이드 (서열 번호 125)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 입체 링커 (GG), 입체 링커 (CAAACAAC) 및 입체 링커 (SGG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 125)-UROKIN-MMP- LINKER1-LINKER13-LINKER16-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 91 및 서열 번호 108이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 91을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 108을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 35. 서열 번호 92의 융합 단백질
서열 번호 92의 단백질은 223개의 아미노산의 길이 및 25.6 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 융합 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 폴리아르기닌 운반 도메인 (RRRRRRR), 푸린 절단 부위 (RKKR), 입체 링커 (GGG) 및 입체 링커 (CAAACAAC)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 41)-TRANS2-FURIN-LINKER2-LINKER13-(TRAIL95-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 92 및 서열 번호 109이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 92를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 109를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 36. 서열 번호 93의 융합 단백질
서열 번호 93의 단백질은 232개의 아미노산의 길이 및 26.7 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 융합 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a)의 사이에, 폴리아르기닌 운반 도메인 (RRRRRRR), 푸린 절단 부위 (RKKR), 최초 푸린 절단 부위 (HRQPRGWEQ), 입체 링커 (GGG) 및 입체 링커 (CAAACAAC)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 41)-TRANS2-FURIN-FURN.NAT-LINKER2-LINKER13-(TRAIL95-281)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 93 및 서열 번호 110이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 93을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 110을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 37. 서열 번호 94의 융합 단백질
서열 번호 94의 단백질은 207개의 아미노산의 길이 및 23 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 융합 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YARAAARQARA) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 94 및 서열 번호 111이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 94를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 111을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 38. 서열 번호 95의 융합 단백질
서열 번호 95의 단백질은 218개의 아미노산의 길이 및 24.4 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 25개의 아미노산 플루로시딘 유사체 (서열 번호 126)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YARAAARQARA) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(서열 번호 126)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 95 및 서열 번호 112이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 95를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 112를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 39. 서열 번호 96의 융합 단백질
서열 번호 96의 단백질은 219개의 아미노산의 길이 및 24.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 26개의 아미노산 플루로시딘 유사체 (서열 번호 127)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YARAAARQARA) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS4-LINKER1-(서열 번호 127)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 96 및 서열 번호 113이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 96을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 113을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 40. 서열 번호 97의 융합 단백질
서열 번호 97의 단백질은 212개의 아미노산의 길이 및 23.9 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 17개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 128)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (THRPPMWSPVWP) 및 입체 링커 (GGG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS5-LINKER2-(서열 번호 127)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 97 및 서열 번호 114이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 97을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 114를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 41. 서열 번호 98의 융합 단백질
서열 번호 98의 단백질은 207개의 아미노산의 길이 및 23.3 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 14개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YGRKKRRQRRR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS6-LINKER1-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 98 및 서열 번호 115이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 98을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 115를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 42. 서열 번호 99의 융합 단백질
서열 번호 99의 단백질은 207개의 아미노산의 길이 및 24 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 31개의 아미노산 합성 펩타이드 (서열 번호 129)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-(서열 번호 129)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 99 및 서열 번호 116이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 99를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 116을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 43. 서열 번호 100의 융합 단백질
서열 번호 100의 단백질은 210개의 아미노산의 길이 및 24.1 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 17개의 아미노산 합성 펩타이드 (서열 번호 130)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YGRKKRRQRRR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS6-LINKER1-(서열 번호 130)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 100 및 서열 번호 117이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 100을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 117을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 44. 서열 번호 101의 융합 단백질
서열 번호 101의 단백질은 211개의 아미노산의 길이 및 23.7 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 29개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 131)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-LINKER1-(서열 번호 131)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 101 및 서열 번호 118이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 101을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 118을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 45. 서열 번호 102의 융합 단백질
서열 번호 102의 단백질은 234개의 아미노산의 길이 및 26.2 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 2개의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 순차적으로 부착되어 있는 25개의 아미노산 멜리틴 펩타이드 (서열 번호 132) 및 14개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 41)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 입체 링커 (GGGGS)가 2개의 효과기 도메인 사이에 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-LINKER1-(서열 번호 132)-LINKER4-(서열 번호 41)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 102 및 서열 번호 119이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 102를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 119를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 46. 서열 번호 103의 융합 단백질
서열 번호 103의 단백질은 205개의 아미노산의 길이 및 23 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 25개의 아미노산 멜리틴 펩타이드 (서열 번호 132)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG) 및 우로키나아제 절단 부위 (RVVR)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-(서열 번호 132)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 103 및 서열 번호 120이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 103을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 120을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 47. 서열 번호 104의 융합 단백질
서열 번호 104의 단백질은 215개의 아미노산의 길이 및 24.5 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 25개의 아미노산 멜리틴 펩타이드 (서열 번호 132)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 폴리아르기닌 운반 도메인 (RRRRRRRR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS3-LINKER1-(서열 번호 132)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 104 및 서열 번호 121이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 104를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 121을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 48. 서열 번호 105의 융합 단백질
서열 번호 105의 단백질은 215개의 아미노산의 길이 및 24.4 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 25개의 아미노산 멜리틴 펩타이드 (서열 번호 132)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는 폴리아르기닌 운반 도메인 (RRRRRRRR)이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-LINKER1-(서열 번호 132)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 105 및 서열 번호 122이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 105를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 122를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 49. 서열 번호 106의 융합 단백질
서열 번호 106의 단백질은 203개의 아미노산의 길이 및 23.3 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 15개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 35)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR) 및 폴리아르기닌 운반 도메인 (RRRRRRRR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS3-(서열 번호 35)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 106 및 서열 번호 123이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 106을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 123을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 50. 서열 번호 107의 융합 단백질
서열 번호 107의 단백질은 208개의 아미노산의 길이 및 23.7 kDa의 질량을 가지는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있는 15개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (서열 번호 35)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에, 입체 링커 (GGGGSGGGG), 메탈로프로테아제 절단 부위 (PLGLAG), 우로키나아제 절단 부위 (RVVR), 운반 도메인 (YGRKKRRQRRR) 및 입체 링커 (GG)가 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER10-MMP-UROKIN-TRANS6-LINKER1-(서열 번호 35)
아미노산 서열 및 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 107 및 서열 번호 124이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 107을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 124를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다. 히스티딘 태그를 가지지 않은 단백질이 발현되었다.
실시예 51. 융합 단백질의 항종양 활성 검사
종양 세포주에 대한 세포독성 분석법으로 시험관내에서 및 마우스의 생체 내에서 융합 단백질의 항종양 활성의 검사를 수행하였다. 비교 목적을 위해서, rhTRAIL114-281 단백질 및 위약(placebo)을 사용하였다.
1. 원편광 이색성(Circular Dichroism: CD)의 측정: 수득된 단백질의 2차 구조 조성의 측정
실시예 23, 실시예 11 및 실시예 13의 융합 단백질에 대하여 원편광 이색성(CD)에 의해 이들의 구조의 관점에서 융합 단백질 제제의 품질을 측정하였다.
단백질의 2차 구조 및 입체형태의 측정을 위해 원편광 이색성을 이용하였다. CD 방법은 타원 편광의 외관 및 광의 편광면 회전으로 명백해지는 단백질 구조의 광학 활성을 이용한다. 원자외선(far UV)에서 단백질의 CD 스펙트럼은 주요 폴리펩타이드 쇄의 입체형태에 대한 정확한 데이터를 제공한다.
투석
분석될 단백질의 샘플을 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.1mM ZnCl2, 80mM 사카로스, 5mM DTT로 이루어진 완충액으로 제형화한 후 컷오프 12 kDa의 투석 백(Sigma-Aldrich)에서 투석하였다. 4℃에서 몇 시간 동안 교반하면서, 단백질 제제를 100배 과량 (v/v)의 완충액에 대하여 투석을 수행하였다. 투석을 완료한 후, 각각의 제제를 원심분리하고(25,000 rpm, 10분, 4℃), 상청액을 수집하였다. 이렇게 하여 수득된 샘플 중의 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 법에 의해 측정하였다.
0.1 mg/ml 내지 2.7 mg/ml의 농도 범위의 단백질에 대한 원편광 이색성의 측정을, 0.2mm 또는 1mm의 광로를 가지는 석영 큐벳트에서 Jasco J-710 분광편광계로 수행하였다. 7 L/분의 질소의 유동 하에서 측정을 수행하였으며, 이는 195nm 내지 250nm의 파장 범위에서 측정을 수행할 수 있게 한다. 측정 파라미터: 스펙트럼 해상도 - 1nm; 광선의 반치폭 1nm; 감도 20mdeg, 1파장에 대한 평균 시간 - 8초, 스캔 속도 10 nm/분. CDPro 소프트웨어를 사용하여, 수득된 스펙트럼을 193nm 내지 250nm의 범위에서 수치 분석하였다. 이러한 파장 범위에서 너무 낮은 신호 대 노이즈 비율 때문에, 광전자증배관에서의 전압이 700 V를 초과하는 포인트는 생략하였다.
CDPro 소프트웨어를 사용하여 수득된 데이터를, 분석된 단백질에서의 특정한 2차 구조 함량의 산출을 위해 제공한다(표 1 참조).
[표 1]
Figure pct00002
대조군 분자 (rhTRAIL114-281)은 주로 β-시트형 구조를 가진 단백질에 대해 특징적인 CD 스펙트럼 (220nm 파장에서 급격한 윤곽의 타원율 최소치)을 나타낸다. 이는 2차 구조 성분의 산출을 확인해 주며, 미미한 수치의 α-헬릭스 요소를 제시한다. 수득된 결과는 또한 hTRAIL 단백질의 결정 구조로부터의 데이터와 일치하고, 실시예 23의 본 발명의 융합 단백질에 대한 특징이며, 여기서 베타 성분은 그 구조의 42%를 구성한다. 실시예 11 및 실시예 13의 단백질의 경우, 높은 α-헬릭스 함량이 관찰되었다(파장 208nm에서 스펙트럼의 추가의 최소치). 이는 강한 양친매성 특성을 가지고 α-나선형 구조를 형성하는 KLAKLAK 모티프의 작제물의 존재에 기인한다. 불행하게도, CD 측정용 완충액에서 실시예 23, 실시예 11 및 실시예 13으로부터의 단백질의 낮은 안정성 및 분석된 제제의 낮은 농도로 인해, 이들의 스펙트럼은 높은 노이즈 수준 및 낮은 해상도를 특징으로 한다. 따라서, 이들은 실제 상황을 완전히 반영할 수 없으며, 단지 결과만을 제시한다.
2. 시험관내에서의 세포주에 대한 시험
세포주
세포주를 ATCC 및 CLS로부터 입수하고, 이어서 Adamed's Laboratory of Biology Cell Line Bank에서 번식시키고 보관하였다. 실험 동안, Venor®GeM Mycoplasma PCR Detection Kit (Minerva Biolabs, Berlin, Germany) 키트를 사용하여, 마이코플라스마의 존재에 대하여 PCR 기술에 의해 관례대로 세포를 확인하였다. 배양물을 다음의 표준 조건으로 유지하였다: 37℃, 5% CO2 (DMEM의 경우 - 10% CO2) 및 85% 상대 습도. 특정 세포주를 ATTC에 의해 추천된 적절한 배지에서 배양하였다.
[표 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 3]
Figure pct00006
MTT 세포독성 시험
MTT 분석법은 세포의 증식, 생존성 및 세포독성을 측정하기 위해 사용되는 비색분석법이다. 이는 미토콘드리아의 효소 석시네이트-테트라졸륨 리덕타제 1에 의해 황색 테트라졸륨 염 MTT (4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 수불용성 자색 염료인 포르마잔으로 분해하는 데에 있다. MTT 환원은 살아있는 세포에서만 일어난다. 데이터 분석은 단백질의 IC50 농도(ng/ml)의 측정에 있으며, 여기에서 세포수의 50% 환원은 대조군과 비교하여 처리된 집단에서 발생한다. 결과는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 시험은 문헌[Celis, JE, (1998), Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004), Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183]의 설명에 따라 수행하였다.
세포 배양 배지를 소정의 밀도(100μl 당 104 내지 105 세포)로 희석하였다. 이어서, 적절하게 희석된 세포 현탁액 100μl를 96웰 플레이트에 3반복으로 적용하였다. 이렇게 하여 제조된 세포를 사용된 배지에 따라 5% CO2 또는 10% CO2에서 24시간 동안 37℃에서 배양하고, 이어서 상기 세포(100μl의 배지 중)에 다양한 농도의 시험된 단백질을 함유하는 배지 100μl를 추가로 첨가하였다. 3회 내지 4회의 세포 분열에 상당하는 다음 72시간에 걸쳐 시험된 단백질과 함께 세포를 배양한 후, 시험 단백질을 포함하는 배지에 MTT의 작업 용액[5 mg/ml] 20 ml를 가하고, 5% CO2에서 3시간 동안 37℃에서 계속 배양하였다. 이어서, MTT 용액을 포함하는 배지를 제거하고, DMSO 100μl를 가하여 포르마잔 결정을 용해하였다. 교반한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다(기준 필터 690nm).
EZ4U 세포독성 시험
비부착 세포주에서 단백질의 세포독성 활성을 시험하기 위하여 EZ4U (Biomedica) 시험을 이용하였다. 본 시험은 MTT 법의 변형이며, 여기서 테트라졸륨 염의 환원시에 형성된 포르마잔은 수용성이다. 단백질(각각 3반복에서 7개 농도의 단백질)과 함께 세포를 72 시간 연속 배양한 후 세포 생존성 연구를 수행하였다. 이에 기초하여, GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 (2개의 독립적인 실험의 평균으로서) 측정하였다. 대조군 세포는 단지 용매와 함께 배양하였다.
시험관내 세포독성 시험의 결과를 IC50 값 (ng/ml)으로서 요약하였으며, 이는 용매만으로 처리된 대조군 세포에 대하여 융합 단백질의 세포독성 효과가 50% 수준으로 관찰되는 단백질 농도에 상응한다. 각각의 실험은 3반복으로 수행된 2개 이상의 독립적인 실험의 평균값을 나타낸다. 단백질 제제의 활성 결여의 기준으로는 2000 ng/ml의 IC50 한도를 채택하였다. 2000을 초과하는 IC50 값을 가지는 융합 단백질은 비활성인 것으로 간주하였다.
본 시험을 위한 세포는 종래의 항암제에 대해 내성인 암 세포주로서 독소루비신 라인 MES-SA/DX5에 대해 내성이고 TRAIL 단백질에 대해 민감한 종양 세포주 뿐만 아니라, TRAIL 단백질에 대해 자연 내성(TRAIL에 대한 자연 내성의 기준: TRAIL 단백질에 대한 IC50 > 2000)인 종양 세포주를 포함한다.
비-암세포에서 융합 단백질의 효능/독성의 평가를 위해, 분화되지 않은 HUVEC 세포주를 건강한 대조군 세포주로서 사용하였다.
수득된 결과는 TRAIL에 대해 자연 내성인 세포에 본 발명의 특정 융합 단백질을 투여함으로써 TRAIL에 대한 세포주의 내성을 극복할 가능성을 확인해 준다. TRAIL에 대해 민감한 세포에 본 발명의 융합 단백질을 투여할 때, 일부의 경우 분명하고 강력한 작용 효능의 강화 작용이 관찰되었으며, 이는 TRAIL 단독에 대한 IC50과의 비교하여 융합 단백질의 IC50 값의 감소가 명백하였다. 더욱이, 고전적인 항암제 독소루비신에 대해 내성인 세포에서 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성이 수득되었고, 일부의 경우 이는 TRAIL 단독의 활성보다 더 강력했다.
비-암세포주에 대해 수득된 2000 초과의 IC50 값은 건강한 세포에 대한 본 발명의 단백질의 사용과 관련된 독성 효과가 없음을 나타내며, 이는 단백질의 전신 독성 가능성이 낮음을 나타낸다.
확대된 종양 세포주 패널에 대해 선택된 단백질 제제의 세포독성 활성의 측정
표 4는 광범위하고 가장 흔한 암에 상응하는, 상이한 장기로부터의 광범위한 종양 세포 패널에 대해 선택된 본 발명의 융합 단백질의 시험관내 세포독성 활성에 대한 시험 결과를 나타낸다.
실험 결과는 평균값 ± 표준 편차(SD)로 제시된다. 모든 계산 및 그래프는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 작성하였다.
수득된 IC50 값은 융합 단백질의 높은 세포독성 활성과 이에 따른 암 치료에서의 잠재적 유용성을 확인해 준다.
[표 4]
Figure pct00007
[표 4a]
Figure pct00008
[표 4b]
Figure pct00009
[표 4c]
Figure pct00010
[표 4d]
Figure pct00011

3. 이종이식에 대한 생체내 융합 단백질의 항암 효능
인간 대장암 Colo 205 및 HCT-116, 인간 폐암 A549 및 NCI-H460-Luc, 인간 전립선암 PC-3, 인간 췌장암 Panc-1 및 MIA PaCa-2, 인간 간암 PCL/PRF/5 및 HepG2 및 인간 다중약물 내성 MES 인간 자궁 육종 -SA.Dx5의 마우스 모델에서 단백질 제제의 항종양 활성을 시험하였다.
세포
인간 폐암 A549 및 NCI-H460-Luc2 및 인간 전립선암 PC3 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다.
인간 대장암 Colo 205 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA) (임의로 Opto-MEM (Invitrogen, Cat.22600-134)과 1:1 비율로 혼합함)에서 유지하였다.
인간 췌장암 PANC-1, 인간 간암 PLC/PRF/5, 췌장암 MIA PaCa-2 및 인간 대장암 SW-620 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다.
인간 대장암 HCT-116 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 McCoy 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다.
다중약물 내성 인간 자궁 육종 MES-SA.Dx5 세포를 10% 우태아 혈청, 2mM 글루타민 및 1μM 독소루비신 하이드로클로라이드 (Sigma, Cat. No. D1515-10MG)로 보충된 McCoy 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 세포 이식 3일 전, 세포를 독소루비신이 없는 배지에서 배양하였다.
인간 간암 HepG2 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 MEM 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
마우스
본 발명의 단백질의 항종양 활성의 검사는 Centrum Medycyny Doswiadczalnej in Bialystok로부터 입수한 4주령 내지 6주령의 (폐암 모델) Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스 또는 9주령 내지 10주령 (전립선암 모델), Charles River Germany로부터 입수한 4주령 내지 5주령의 암컷 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 대하여 수행하였다. 마우스를 음식물과 탈이온수 (임의로)에 대한 자유로운 접근과 함께 특정 병원체가 없는 조건 하에 유지하였다. 동물에 대한 모든 실험은 다음의 지침서에 따라 수행하였다: New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research에 의해 발행되고, IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)에 의해 승인된 "Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education".
실험의 과정 및 평가
전자 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하고, 다음 식을 사용하여 종양 체적을 산출하였다: (a2 x b)/2, 여기서 a = 종양의 짧은 대각선 (mm) 및 b = 종양의 긴 대각선 (mm). 하기 식을 사용하여 종양 성장 억제값을 산출하였다:
TGI [%] (종양 성장 억제값) = (WT/WC) x 100 - 100%
여기서, WT는 처리군에서의 평균 종양 체적이고, WC는 대조군에서의 평균 종양 체적이다.
실험 결과는 평균값 ± 표준 편차(SD)로 제시된다. 모든 계산 및 그래프는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 작성하였다.
폐암 모델 c
실험 A.
0일째에, Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS:Matrigel의 4:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 19일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 75mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (15 mg/kg), 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) 및 대조군으로서의 주사용수의 제제를 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 35일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 1 및 도 2에 도시된다.
도 1 및 도 2에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 35일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 TGI 28%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 0% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
실험 B.
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 17일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 100 내지 120mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (40 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 34일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 3 및 도 4에 도시된다.
도 3 및 도 4에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 35일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 TGI 45%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 21.8% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
실험 C.
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액 0.1ml에 현탁된 5x106의 NCI-H460-Luc2 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 11일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 100 내지 120mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (40 mg/kg 및 30 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다 (실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 경우, 먼저 40 mg/kg의 용량으로 투여하고, 이어서 30 mg/kg의 용량을 투여함). 실험 29일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 5 및 도 6에 도시된다.
도 5 및 도 6에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 29일째에 대조군에 비하여 NCI-H460-Luc2 종양 성장을 TGI 93%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 억제 효과를 76% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
전립선암 모델
0일째에, Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액 0.18ml 및 Matrigel 0.02ml에 현탁된 5x106의 PC3 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 29일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 90mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (15 mg/kg) 및 대조군으로서의 0.9% NaCl의 제제를 투여하였다. 제제를 6일 동안 1일 1회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 60일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 7 및 도 8에 도시된다.
도 7 및 도 8에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 60일째에 대조군에 비하여 PC3 종양 성장을 TGI 33%로 억제하였음을 나타낸다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
췌장암 모델
PANC -1 세포에 대한 실험 A
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS:Matrigel의 3:1 혼합물 0.10ml에 현탁된 5x106의 PANC-1 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 31일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 110mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (40 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 42일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 9 및 도 10에 도시된다.
도 9 및 도 10에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 42일째에 대조군에 비하여 PANC-1 종양 성장을 TGI 32.6%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 26% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
MIA PaCa -2 세포에 대한 실험 B
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 MIA PaCa-2 세포를 우측 옆구리 영역에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 60mm3 내지 398mm3의 크기에 도달할 때 (20일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 170mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질 (50 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)의 제제 및 기준 화합물 겜시타빈 (Gemzar, Eli Lilly) (50 mg/kg)을 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하고, 겜시타빈을 동일한 계획으로 복강내(i.p.) 적용하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다.
치료군이 약 1000mm3의 평균 종양 크기에 도달할 때, 경추 탈골을 통해 마우스를 희생시켰다.
실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질, 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 및 겜시타빈으로 처리된, MIA PaCa-2 췌장 암종을 앓는 마우스 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr에서 수득된 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로서 도 19에 도시되며, 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 20에 도시된다.
도 19 및 도 20에 제시된 실험 결과는 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 61일째에 대조군에 비하여 MIA PaCa-2 종양 성장을 TGI 93%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 및 겜시타빈의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 각각 68% 및 42.6% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독 및 표준 화학요법과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
대장암 모델
HCT116 세포에 대한 실험 A
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액 0.1ml에 현탁된 5x106의 HCT116 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 18일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 400mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (5mM NaH2PO4, 95mM Na2HPO4, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로오스, pH 8.0)에 대하여 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (35 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 32일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된 마우스에서 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 11 및 도 12에 도시된다.
도 11 및 도 12에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 32일째에 대조군에 비하여 HCT116 종양 성장을 TGI 33.5%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 5.6% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
HCT116 세포에 대한 실험 A1
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 HCT116 세포를 우측 옆구리 영역에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 71mm3 내지 432mm3의 크기에 도달할 때 (13일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질 (90 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (65 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다.
실험군이 약 1000mm3의 평균 종양 크기에 도달할 때, 경추 탈골을 통해 마우스를 희생시켰다.
실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된, HCT116 대장암을 앓는 마우스 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr에서 수득된 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로서 도 21에 도시되며, 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 22에 도시된다.
도 21 및 도 22에 제시된 실험 결과는 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 24일째에 대조군에 비하여 HCT116 종양 성장을 TGI 65.8%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 37.9% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
SW620 세포에 대한 실험 B
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 SW620 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 17일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 320mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질 (20 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 31일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281로 처리된, SW620을 앓는 마우스 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr에서 수득된 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로서 도 13에 도시되며, 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 14에 도시된다.
도 13 및 도 14에 제시된 실험 결과는 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 31일째에 대조군에 비하여 SW620 종양 성장을 TGI 25%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 어떠한 억제 효과도 -9% 수준의 TGI로 수득하지 못하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
Colo 205 세포에 대한 실험 C
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액 0.1ml에 현탁된 5x106의 Colo 205 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 13일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 115 mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다.
대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질 (30 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 33일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 15 및 도 16에 도시된다.
도 15 및 도 16에 제시된 실험 결과는 실시예 16a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 33일째에 대조군에 비하여 Colo 205 종양 성장을 TGI 80%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 18.8% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
다중약물 내성 자궁 육종 모델
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS:Matrigel의 10:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 MES-SA/Dx5 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 18일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 대조군으로서의 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 대하여 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질 (30 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg)의 제제를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 매 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 35일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 17 및 도 18에 도시된다.
도 17 및 도 18에 제시된 실험 결과는 실시예 11a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 35일째에 대조군에 비하여 MES-SA/Dx5 종양 성장을 TGI 81%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 29% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 본 발명의 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
간암 모델
HepG2 세포에 대한 실험 A
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 HepG2 세포를 우측 옆구리 영역에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 64mm3 내지 529mm3의 크기에 도달할 때 (25일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 230mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질 (80 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)의 제제 및 기준 화합물 5-FU (5-Fluorouracil, Sigma-Aldrich) (20 mg/kg)를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하고, 5-FU를 복강내(i.p.) 적용하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다.
치료군이 약 1000mm3의 평균 종양 크기에 도달할 때, 경추 탈골을 통해 마우스를 희생시켰다.
수득된 실험 결과는 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 23 및 도 24에 도시된다.
도 23 및 도 24에 제시된 실험 결과는 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 42일째에 대조군에 비하여 HepG2 종양 성장을 TGI 94.6%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 23.2% 수준의 TGI로 수득하였다. 기준 화합물 5-FU는 HepG2 종양에 대해 어떠한 효능도 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독 및 표준 화학요법과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
PLC / PRF /5 세포에 대한 실험 B
0일째에, Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 가지는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.10ml에 현탁된 7x106의 PLC/PRF/5 세포를 우측 옆구리 영역에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 72mm3 내지 536mm3의 크기에 도달할 때 (29일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 205mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질 (50 mg/kg) 및 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)의 제제 및 기준 화합물 5-FU (5-Fluorouracil, Sigma-Aldrich) (30 mg/kg)를 처리군에 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하고, 5-FU를 계획 (q1dx5)x2로 복강내(i.p.) 적용하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다.
실험군이 약 1000mm3의 평균 종양 크기에 도달할 때, 경추 탈골을 통해 마우스를 희생시켰다.
수득된 실험 결과는 종양 체적 변화 및 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)의 다이어그램으로서 도 25 및 도 26에 도시된다.
도 25 및 도 26에 제시된 실험 결과는 실시예 16b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 43일째에 대조군에 비하여 PLC/PRF/5 종양 성장을 TGI 53%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서의 rhTRAIL114-281 및 5-FU의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 각각 25.2% 및 32.2% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독 및 표준 화학요법과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
SEQUENCE LISTING <110> ADAMED PIECZYKOLAN Jerzy Szczepan PAWLAK Sebastian Dominik ?REK Bart?miej Maciej R?GA Piotr Kamil <120> ANTICANCER FUSION PROTEIN <130> P070 02 PL <160> 132 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 1 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 20 25 30 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His 35 40 45 Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile 50 55 60 Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr 65 70 75 80 Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 85 90 95 Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 100 105 110 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe 115 120 125 Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His 130 135 140 Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg Gly 165 170 175 Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys Met 180 185 190 Val Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg Val 195 200 205 Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met 210 215 220 Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu Thr 225 230 235 240 Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg Leu Cys Ile Pro Ser Thr Gly 245 250 255 Pro Leu <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 2 Gly Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys 1 5 10 15 Met Val Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg 20 25 30 Val Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe 35 40 45 Met Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu 50 55 60 Thr Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg Leu Cys Ile Pro Ser Thr 65 70 75 80 Gly Pro Leu Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg 100 105 110 Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly 115 120 125 Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu 130 135 140 Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly 145 150 155 160 Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile 165 170 175 Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys 180 185 190 Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn 195 200 205 Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln 210 215 220 Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val 225 230 235 240 Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly 245 250 255 Ala Phe Leu Val Gly 260 <210> 3 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 3 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 20 25 30 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His 35 40 45 Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile 50 55 60 Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr 65 70 75 80 Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 85 90 95 Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 100 105 110 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe 115 120 125 Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His 130 135 140 Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 145 150 155 160 Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg Lys Leu Leu Leu Arg 165 170 175 Leu Leu Lys Lys Leu Leu Arg Leu Leu Lys 180 185 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 4 Gly Leu Gly Ser Val Phe Gly Arg Leu Ala Arg Ile Leu Gly Arg Val 1 5 10 15 Ile Pro Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Pro Lys Val Ala Lys Val Leu 20 25 30 Pro Lys Val Met Lys Glu Ala Ile Pro Met Ala Val Glu Met Ala Lys 35 40 45 Ser Gln Glu Glu Gln Gln Pro Gln Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 85 90 95 Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn 100 105 110 Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr 115 120 125 Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu 130 135 140 Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys 165 170 175 Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly 180 185 190 Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn 195 200 205 Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe 210 215 220 Leu Val Gly 225 <210> 5 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 5 Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile 1 5 10 15 Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile 20 25 30 Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys 35 40 45 Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg 50 55 60 Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu 65 70 75 80 Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe 85 90 95 Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 100 105 110 Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu 115 120 125 Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly 130 135 140 Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp 145 150 155 160 Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 165 170 175 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Cys Ala Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Ala Cys Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala 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<211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> effector <300> <301> Andr?J, Berninghausen O, W?fken J, Leippe M. <302> Shortened amoebapore analogs with enhanced antibacterial and cytolytic activity. <303> FEBS Lett. <304> 385 <305> 1 <306> 96-100 <307> 1996-04-29 <400> 47 Gly Phe Leu Gly Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ser Phe Gly Val Asp Glu 1 5 10 15 Leu Val Lys Leu Ile Glu Asn His 20 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> effector <300> <301> Ines Neundorf, Robert Rennert, Jan Hoyer, Franziska Schramm, Kristin L?ner Igor Kitanovic and Stefan W?fl <302> Fusion of a Short HA2-Derived Peptide Sequence to Cell-Penetrating Peptides Improves Cytosolic Uptake, but Enhances Cytotoxic Activity. <303> Pharmaceuticals <304> 2 <305> 2 <306> 49-65 <307> 2009 <400> 48 Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala Glu Leu Leu Glu Gly 1 5 10 <210> 49 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> effector <300> <308> GenBank/AAP15462.1 <309> 2003-04-27 <313> (1)..(247) <400> 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atttctggtt 480 ggtggtggta gcggtccgct gggtctggca ggtcgtgttg ttcgtggtcg tgattatcgt 540 acctgtctga ccattgtgca gaaactgaaa aaaatggtgg ataaaccgac ccagcgtagc 600 gttagcaatg cagcaacccg tgtttgtcgt accggtcgta gccgttggcg tgatgtttgt 660 cgtaatttca tgcgtcgtta tcagagccgt gttacccagg gtctggttgc cggtgaaacc 720 gcacagcaga tttgtgaaga tctgcgtctg tgtattccga gcaccggtcc gctg 774 <210> 58 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 58 ggtcgtgatt atcgtacctg tctgaccatt gttcagaaac tgaaaaaaat ggtggataaa 60 ccgacccagc gtagcgttag caatgcagca acccgtgttt gtcgtaccgg tcgtagccgt 120 tggcgtgatg tttgtcgtaa ctttatgcgt cgttatcaga gccgtgttac ccagggtctg 180 gttgccggtg aaaccgcaca gcagatttgt gaagatctgc gtctgtgtat tccgagcacc 240 ggtccgctgc gtgttgttcg tccgctgggt ctggcaggcg gtggtggtgg tagtccgcag 300 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 360 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 420 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 480 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcaag aagaaattaa agaaaatacc 540 aaaaatgata agcagatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 600 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 660 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 720 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 780 ggt 783 <210> 59 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <400> 59 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagccct gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 240 aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct 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109 aaactggcaa aactggccaa aaaactggct aaactggcga aacgtcgtcg tcgccgtcgt 60 cggcgtaaaa aacgtggtgg tggttgtgca gcagcatgtg cagcctgtac cagcgaagaa 120 accattagca ccgttcaaga aaaacagcag aatattagtc cgctggttcg tgaacgtggt 180 ccgcagcgtg ttgcagcaca tattaccggc acccgtggtc gtagcaatac cctgagcagc 240 ccgaatagca aaaatgaaaa agcactgggt cgcaaaatta acagctggga aagcagccgt 300 agcggtcata gctttctgag caatctgcat ctgcgtaatg gtgaactggt gattcatgaa 360 aaaggcttct actatatcta cagccagacc tattttcgct tccaagaaga gattaaagaa 420 aacaccaaaa acgataaaca aatggtgcag tacatctata aatacaccag ctatccggat 480 ccgattctgc tgatgaaaag cgcacgtaat agctgttgga gcaaagatgc agaatatggc 540 ctgtatagca tttatcaggg tggcatcttt gaactgaaag aaaacgatcg tattttcgtg 600 agcgtgacca atgaacatct gatcgatatg gatcatgaag cgagcttttt tggtgcattt 660 ctggtgggt 669 <210> 110 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 110 aaactggcaa aactggccaa aaaactggct aaactggcga aacgtcgtcg tcgccgtcgt 60 cggcgtaaaa aacgtcatcg tcagccacgt ggttgggaac agggtggtgg ttgtgcagca 120 gcatgtgcag cctgtaccag cgaagaaacc attagcaccg ttcaagaaaa acagcagaat 180 attagtccgc tggttcgtga acgtggtccg cagcgtgttg cagcacatat taccggcacc 240 cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 300 aaaattaaca gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 360 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttctact atatctacag ccagacctat 420 tttcgcttcc aagaagagat taaagaaaac accaaaaacg ataaacaaat ggtgcagtac 480 atctataaat acaccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 540 tgttggagca aagatgcaga atatggcctg tatagcattt atcagggtgg catctttgaa 600 ctgaaagaaa acgatcgtat tttcgtgagc gtgaccaatg aacatctgat cgatatggat 660 catgaagcga gcttttttgg tgcatttctg gtgggt 696 <210> 111 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 111 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc ccgctgggcc tggcgggccg tgtggtgcgt 540 tatgcgcgtg cggcggcgcg tcaggcgcgt gcgggcggca aactggcgaa actggcgaaa 600 aaactggcga aactggcgaa a 621 <210> 112 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 112 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc ccgctgggcc tggcgggccg tgtggtgcgt 540 tatgcgcgtg cggcggcgcg tcaggcgcgt gcgggcggcc gttggggcaa atggtttaaa 600 aaagcgaccc atgtgggcaa acatgtgggc aaagcggcgc tgaccgcgta tctg 654 <210> 113 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 113 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc ccgctgggcc tggcgggccg tgtggtgcgt 540 tatgcgcgtg cggcggcgcg tcaggcgcgt gcgggcggcg gccgtcgtaa acgtaaatgg 600 ctgcgtcgta ttggcaaagg cgtgaaaatt attggcggcg cggcgctgga tcatctg 657 <210> 114 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 114 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc ccgctgggcc tggcgggccg tgtggtgcgt 540 acccatcgtc cgccgatgtg gagcccggtg tggccgggcg gcggcaaact gctgctgaaa 600 ctgctgaaaa aactgctgaa actgctgaaa aaaaaa 636 <210> 115 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 115 cgcgtggcgg cgcatattac cggcacccgc ggccgcagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgcagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgc aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg caacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgcatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc ccgctgggcc tggcgggccg cgtggtgcgc 540 tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgcggcggca aactggcgaa actggcgaaa 600 aaactggcga aactggcgaa a 621 <210> 116 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 116 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 ggtcgtttta aacgttttcg caaaaaattt aaaaaactgt tcaaaaaact gagccagcgc 600 ctgggtaatc agtgggcagt tggtcatctg atg 633 <210> 117 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 117 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 tatggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtggtggtc gttttaaacg ttttcgcaaa 600 aaatttaaaa aactgttcaa aaaactgagc 630 <210> 118 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 118 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 ggtggtctgc gtagcctggg acgtaaaatt ctgcgtgcat ggaagaaata tggtcagcgt 600 ctgggtaatc agtgggcagt tggtcatctg atg 633 <210> 119 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 119 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgc 540 ggaggtggta ttggtgcacg tctgaaagtt ctgaccaccg gtctgcctcg tattagctgg 600 attaaacgta aacgtcagca gggtgggggt ggtagcaaac tggcaaaact ggcgaaaaaa 660 ctggctaaac tggccaaacg tcgtcgtcgc cgtcgtcggc gt 702 <210> 120 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 120 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 ggtattggtg cacgtctgaa agttctgacc accggtctgc ctcgtattag ctggattaaa 600 cgtaaacgtc 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agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgc 540 ggaggtggta ttggtgcacg tctgaaagtt ctgaccaccg gtctgcctcg tattagctgg 600 attaaacgta aacgtcagca gcgtcgtcgt cgccgtcgtc ggcgt 645 <210> 123 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 123 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 cgtcgtcgcc gtcggcgtcg tcgtaaactg ctgctgcgtc tgctgaaaaa actgctgcgc 600 ctgctgaaa 609 <210> 124 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 124 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt cctctgggtc tggcaggtcg tgttgttcgt 540 tatggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtggtggta aactgctgct gcgtctgctg 600 aaaaaactgc tgcgcctgct gaaa 624 <210> 125 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 125 Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Pro Arg Gln Ser Gly Lys Lys Arg Lys 20 25 30 Arg Lys Arg Leu Lys Pro Thr 35 <210> 126 <211> 25 <212> PRT <213> Pleuronectes americanus <300> <301> Hilchie AL, Doucette CD, Pinto DM, Patrzykat A, Douglas S, Hoskin DW. <302> Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts <303> Breast Cancer Res. <304> 13 <305> 5 <306> R102 <307> 2011-10-24 <400> 126 Arg Trp Gly Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr His Val Gly Lys His Val 1 5 10 15 Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ala Tyr Leu 20 25 <210> 127 <211> 26 <212> PRT <213> Pleuronectes americanus <300> <301> Hilchie AL, Doucette CD, Pinto DM, Patrzykat A, Douglas S, Hoskin DW. <302> Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. <303> Breast Cancer Res. <304> 13 <305> 5 <306> R102 <307> 2011-10-24 <400> 127 Gly Arg Arg Lys Arg Lys Trp Leu Arg Arg Ile Gly Lys Gly Val Lys 1 5 10 15 Ile Ile Gly Gly Ala Ala Leu Asp His Leu 20 25 <210> 128 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> - <300> <301> Papo N, Shai Y. <302> New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. <303> Biochemistry <304> 42 <305> 31 <306> 9346-54 <307> 2003-08-12 <400> 128 Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys 1 5 10 15 Lys <210> 129 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> - <300> <301> Cai H, Yang H, Xiang B, Li S, Liu S, Wan L, Zhang J, Li Y, Cheng J, Lu X. <302> Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides. <303> Molecular Pharmacology <304> 7 <305> 2 <306> 586-96 <307> 2010-04-05 <400> 129 Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met 20 25 30 <210> 130 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> - <300> <301> Cai H, Yang H, Xiang B, Li S, Liu S, Wan L, Zhang J, Li Y, Cheng J, Lu X. <302> Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides. <303> Molecular Pharmacology <304> 7 <305> 2 <306> 586-96 <307> 2010-04-05 <400> 130 Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ser <210> 131 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> - <300> <301> Cai H, Yang H, Xiang B, Li S, Liu S, Wan L, Zhang J, Li Y, Cheng J, Lu X. <302> Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides. <303> Molecular Pharmacology <304> 7 <305> 2 <306> 586-96 <307> 2010-04-05 <400> 131 Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met 20 25 <210> 132 <211> 25 <212> PRT <213> Apis mellifera <300> <308> genbank/AAU87881 <309> 2004-10-04 <313> (1)..(25) <400> 132 Gly Ile Gly Ala Arg Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Arg Ile 1 5 10 15 Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25

Claims (30)

  1. - hTRAIL95 보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하고 hTRAIL281의 위치에 있는 아미노산으로 종결하는, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성을 가지는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및
    - 세포막에서 구멍을 형성하는 세포용해성 효과기 펩타이드 (cytolytic effector peptide)의 서열인 하나 이상의 도메인 (b)
    를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되어 있는 것인 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 도메인 (a)는 hTRAIL95 내지 hTRAIL121 범위의 아미노산으로 개시하고, 아미노산 hTRAIL281로 종결하는, 가용성 hTRAIL (서열 번호 90) 단백질 서열의 단편을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 및 hTRAIL121-281로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)는
    - 서열 번호 34의 인간 그라눌라이신의 활성 형태,
    - 서열 번호 35의 15개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드 (synthetic lytic peptide),
    - 서열 번호 36의 필로술린-1,
    - 서열 번호 37의 필로술린-5,
    - 서열 번호 38의 타키플레신으로부터의 펩타이드,
    - 서열 번호 39의 융합 펩타이드 봄베신-마가이닌 2,
    - 서열 번호 40의 마가이닌-2,
    - 서열 번호 41의 14개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드,
    - 서열 번호 42의 26개의 아미노산 하이브리드 펩타이드 세크로핀-멜리틴,
    - 서열 번호 43의 27개의 아미노산 펩타이드 FFhCAP18,
    - 서열 번호 44의 BAMP-28 펩타이드,
    - 서열 번호 45의 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica)로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 C의 유사체,
    - 서열 번호 46의 엔타모에바 히스톨리티카로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 A의 유사체,
    - 서열 번호 47의 엔타모에바 히스톨리티카로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 B의 유사체,
    - 서열 번호 48의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 HA2 도메인의 단편,
    - 서열 번호 49의 포스포리파아제 C 활성을 가지는 클로스트리듐 페르프 린젠스 (Clostridium perfringens)로부터의 α-독소의 N-말단 도메인,
    - 서열 번호 50의 리스테리오라이신 O,
    - 서열 번호 51의 포스포리파아제 PC-PLC,
    - 서열 번호 52의 에퀴나톡신 EqTx-II,
    - 서열 번호 53의 비스코톡신 A3 (VtA3),
    - 서열 번호 54의 인간 퍼포린 (perforin)의 활성 단편,
    - 서열 번호 55의 바실러스 투링겐시스 (Bacillus thuringensis)로부터의 파라스포린-2,
    - 서열 번호 56의, EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드,
    - 서열 번호 125의, KLLK 모티프를 가지는 합성 용해성 펩타이드 및 PDGF 수용체의 길항제인 펩타이드를 포함하는 융합 단백질,
    - 서열 번호 126의 플루로시딘 유사체,
    - 서열 번호 127의 플루로시딘 유사체,
    - 서열 번호 128의 합성 용해성 펩타이드,
    - 서열 번호 129의, 봄베신 및 B27 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드,
    - 서열 번호 130의 17개의 아미노산 합성 B27 펩타이드,
    - 서열 번호 131의, 봄베신 및 B28 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드, 및
    - 서열 번호 132의 멜리틴 펩타이드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)는
    - 서열 번호 34의 인간 그라눌라이신의 활성 형태,
    - 서열 번호 35의 15개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드,
    - 서열 번호 38의 타키플레신으로부터의 펩타이드,
    - 서열 번호 39의 융합 펩타이드 봄베신-마가이닌 2,
    - 서열 번호 40의 마가이닌-2,
    - 서열 번호 42의 26개의 아미노산 하이브리드 펩타이드 세크로핀-멜리틴,
    - 서열 번호 53의 비스코톡신 A3 (VtA3),
    - 서열 번호 56의, EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드,
    - 서열 번호 129의, 봄베신 및 B27 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드,
    - 서열 번호 130의 17개의 아미노산 합성 B27 펩타이드,
    - 서열 번호 131의, 봄베신 및 B28 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드, 및
    - 서열 번호 132의 멜리틴 펩타이드
    로 이루어진 군으로부터 선택된, 강한 양전하를 가지는 펩타이드인, 융합 단백질.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)는
    - 서열 번호 36의 필로술린-1,
    - 서열 번호 37의 필로술린-5,
    - 서열 번호 41의 14개의 아미노산 합성 용해성 펩타이드,
    - 서열 번호 43의 27개의 아미노산 펩타이드 FFhCAP18,
    - 서열 번호 44의 BAMP-28 펩타이드,
    - 서열 번호 45의 엔타모에바 히스톨리티카로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 C의 유사체,
    - 서열 번호 46의 엔타모에바 히스톨리티카로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 A의 유사체,
    - 서열 번호 47의 엔타모에바 히스톨리티카로부터의 용해성 펩타이드의 이소형 B의 유사체,
    - 서열 번호 48의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 HA2 도메인의 단편,
    - 서열 번호 54의 인간 퍼포린의 활성 단편,
    - 서열 번호 55의 바실러스 투링겐시스로부터의 파라스포린-2,
    - 서열 번호 125의, KLLK 모티프를 가지는 합성 용해성 펩타이드 및 PDGF 수용체의 길항제인 펩타이드를 포함하는 융합 단백질,
    - 서열 번호 126의 플루로시딘 유사체,
    - 서열 번호 127의 플루로시딘 유사체, 및
    - 서열 번호 128의 합성 용해성 펩타이드
    로 이루어진 군으로부터 선택된 양친매성 α-헬릭스를 가지는 펩타이드인, 융합 단백질.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)는 포스포리파아제, 용혈소 및/또는 세포용해소의 군으로부터 선택된 효소 활성을 가지는 펩타이드이고, 바람직하게는
    - 서열 번호 49의 포스포리파아제 C 활성을 가지는 클로스트리듐 페르프린젠스로부터의 α-독소의 N-말단 도메인,
    - 서열 번호 50의 리스테리오라이신 O,
    - 서열 번호 51의 포스포리파아제 PC-PLC, 및
    - 서열 번호 52의 에퀴나톡신 EqTx-II
    로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 활성을 가지는 펩타이드인, 융합 단백질.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 또는 도메인 (b)들 사이에, 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열, 우로키나아제 uPA에 의해 인식되는 서열, 푸린에 의해 인식되는 서열 및 천연 푸린에 의해 인식되는 서열로부터 선택된, 프로테아제 절단 부위를 포함하는 도메인 (c)를 포함하는, 융합 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열은 Pro Leu Gly Leu Ala Gly이고, 상기 우로키나아제 uPA에 의해 인식되는 서열은 Arg　Val　Val Arg이고, 상기 푸린에 의해 인식되는 서열은 Arg Lys Lys Arg이고, 천연 푸린에 의해 인식되는 서열은 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu 또는 His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln인, 융합 단백질.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서, 상기 도메인 (c)는 상기 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열과 서로 바로 옆에 위치된 상기 우로키나아제 uPA에 의해 인식되는 서열의 조합인, 융합 단백질.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는,
    - (d1) 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 히스티딘 잔기를 포함하는, 세포막을 통해 운반하는 폴리히스티딘 서열,
    - (d2) 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 아르기닌 잔기로 이루어진, 세포막을 통해 운반하는 폴리아르기닌 서열,
    - (d3) PD4 운반 서열 (단백질 전달 도메인 4) Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala,
    - (d4) 트랜스페린 수용체 결합 서열로 이루어진 운반 서열 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro,
    - (d5) PD5 운반 서열 (단백질 전달 도메인 5, TAT 단백질) Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg, 및
    - 이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 운반 도메인 (d)와 추가적으로 연결되어 있는 것인, 융합 단백질.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 서열 (d)는 상기 도메인 (b)의 효과기 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 운반 도메인 (d)는 상기 도메인 (b)와 도메인 (c) 사이에, 상기 도메인 (a)와 도메인 (c) 사이에, 또는 2개의 도메인 (c) 사이에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 서열 (d)는 상기 융합 단백질의 C-말단에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  15. 청구항 8 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 2개의 도메인 (c) 사이에, Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu　Gly 및 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro Glu로부터 선택된, PEG 분자의 부착을 위한 링커인 도메인 (d)를 함유하는 것인, 융합 단백질.
  16. 청구항 8 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 도메인 (a), 도메인 (b) 및/또는 도메인 (c) 사이에, 가요성 입체 링커를 더 포함하는 것인, 융합 단백질.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 입체 링커는 Gly　Gly, Gly　Gly　Gly, Gly　Ser　Gly, Gly　Gly　Gly　Gly　Ser, Gly　Gly　Gly　Gly　Gly　Ser, Gly　Gly　Ser　Gly　Gly, Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly, Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly, Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Gly　Gly　Ser, Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Gly, Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly, Cys　Ala　Ala　Cys　Ala　Ala　Ala　Cys, Cys　Ala　Ala　Ala　Cys　Ala　Ala　Cys, Ser Gly Gly, 단일 글리신 잔기 Gly, 단일 시스테인 잔기 Cys 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 106 및 서열 번호 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는, 융합 단백질.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 재조합 단백질인, 융합 단백질.
  20. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 대장균(E. coli)에서의 유전자 발현에 최적화되어 있는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 서열 번호 122, 서열 번호 123 및 서열 번호 124로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
  23. 청구항 20 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  24. 청구항 23에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균 세포인, 숙주 세포.
  26. 활성 성분으로서의 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여를 위한 형태인, 약학적 조성물.
  28. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간을 포함한 포유동물에서 신생물성 질환의 치료에 사용하기 위한, 융합 단백질.
  29. 인간을 포함한 포유동물에서 암 질환의 치료 방법으로서,
    상기 치료 방법은 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질이나 청구항 26 또는 청구항 27에 기재된 약학적 조성물을 항신생물성 유효량으로 이의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 암 질환의 치료 방법.
  30. 서열 번호 56의 EGF 억제제 및 합성 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드와 서열 번호 125의 PDGF 길항제 및 합성 용해성 펩타이드의 융합 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드.
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