CN114031673B - 一种多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多肽及其制备方法，涉及生物制药技术领域。本发明在天然来源的多肽基础上进行人工设计改造，提供了SEQ ID NO.1‑5的氨基酸序列所示的多肽，在保持其生物活性的基础上，减小其血溶性。所述制备方法包括：S1、人工设计所述多肽的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列；S2、将核苷酸序列与表达载体相连接，转化和/或转染进宿主细胞，筛选阳性克隆；S3、培养阳性克隆，诱导多肽表达；S4、破碎宿主细胞，进行蛋白多肽纯化，即得到所述多肽。该制备方法表达效率高，分离纯化过程简单，产物纯度高，得到的多肽纯度可达98％，已达到了制药产业化水平，且生产成本低，适用于大规模工业化生产。

Description

一种多肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种多肽及其制备方法。
背景技术
随着抗生素的广泛应用，滥用现象普遍增多，伴随而来的是耐药菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药危机之中。合成喹诺酮类抗菌药物上市时，临床致病菌对这类新型抗菌药物十分敏感，几乎没有耐药菌株，经过多年的广泛使用，临床致病菌对这类合成抗菌药物的耐药率迅速上升。如大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性已高达70％。为了应对耐药菌感染，现有技术一方面正在对传统抗生素进行结构改造降低细菌的耐药性，另一方面正在研究和开发新型抗菌药物。
由能够替代传统的小分子抗菌药物的抗菌药物包括：抗体与病原菌、侵袭因子或毒素结合；益生菌；溶细胞素；多肽；野生型细菌噬菌体；噬菌体基因工程菌；免疫刺激；疫苗等。
其中多肽广泛存在于生物界，是天然免疫系统的重要组成部分。许多多肽都表现出抗菌作。其作用机理独特，不易产生耐药性，已经成为抗菌药物的研究重点之一，具有广泛的发展前景。
中国专利201310296766.4中公开了一种广谱抗菌多肽的制备方法，其步骤包括：一、预测筛选；二、制备抗菌肽；三、抗菌性检测；四、溶血性检测；五、制备广谱抗菌多肽；最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽。该方法制备的多肽具有广谱的抗菌作用，尤其是对变异链球菌、幽门螺杆菌具有杀伤作用，而对正常细胞没有副作用；分子量小，结构简单，人工合成方便；作用持久，无溶血作用，显示其在治疗细菌性感染，特别是对变异链球菌、幽门螺杆菌感染的治疗方面具有重要应用价值。但其实际为筛选方法，具有不稳定性。
中国专利201110381231.8中公开了一种抗口腔致龋菌的多肽Pm1及制备方法，其制备方法是：通过对天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，对口腔常见致龋菌有一定的抗菌、杀菌能力，在确定活性中心的基础上，对其进行氨基酸的删除和替换形成新型的具有杀菌能力的抗菌多肽；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为变异链球菌；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为远缘链球菌；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为血链球菌。它克服天然抗菌肽长度过长，合成成本相对较高的问题。
但天然多肽多存在稳定性不理想，毒性大等问题。
发明内容
本发明为解决现有的天然多肽抗菌活性及稳定性不理想，毒性大等问题，提供了一系列高生物活性、低溶血率、高稳定性的多肽，以及生产该系列多肽的制备方法，同时提供所述多肽在制备诊断、预防和/或治疗细菌、真菌、病毒和/或原虫感染的产品中的应用。
本发明涉及的多肽是基因工程技术产品，是由几十个氨基酸构成，安全性高，稳定性好，具有显著的抗炎、促修复、抗菌、抗病毒性能，并且不会产生耐药性，与抗生素类产品相比，有明显的优势，具有广阔的市场前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种多肽，所述的多肽至少具有抗菌功能，其氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的序列中的任一种。
具体地，
SEQ ID NO.1的序列为：Met Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Arg Lys Lys LeuArg Ala Trp Lys；
SEQ ID NO.2的序列为：Met Gly Lys Leu His Ser Lys Gly His Lys Lys LeuHis Ala Trp Lys；
SEQ ID NO.3的序列为：Gly Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Arg Lys Lys LeuArg Ala Trp Lys；
SEQ ID NO.4的序列为：Gly Gly Lys Leu His Ser Lys Gly Arg His Lys LeuHis Ala Trp Lys；
SEQ ID NO.5的序列为：Met Gly Lys Leu His Ser Lys Gly His Lys Lys LeuHis Ala Trp Lys。
进一步可以解释为：氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列的多肽在本发明的要求保护的范围内；
或，氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示序列的多肽在本发明的要求保护的范围内；
或，氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示序列中的任一个的多拷贝或多个的单拷贝或多拷贝的直接或间接连接形成的多肽在本发明的要求保护的范围内；
或，氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示的序列中的任一个的多拷贝或多个的单拷贝或多拷贝的直接或间接连接形成的多肽在本发明的要求保护的范围内。
应当说明的是，基于本发明上述具有抗菌功能的多肽而人工设计、诱变或自然突变形成的突变体多肽，也应当在本发明要求保护的范围之内。
进一步可以解释为：相较于上述氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的序列的多肽，所述的突变体多肽可以是发生了氨基酸的替换、缺失、增加、化学修饰和/或肽链环化。
进一步可以解释为：相较于上述氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的序列的多肽，所述的突变体多肽发生了氨基酸的替换、缺失、增加、化学修饰和/或肽链环化，仍维持和上述氨基酸序列包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的序列的多肽具有基本等同的功能的多肽，在本发明的要求保护的范围内。
作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：
基于对白色念珠菌的抑制效果，本发明所述的具有抗菌功能的多肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；优选为SEQID NO.1。
基于对大肠杆菌的抑制效果，本发明所述的具有抗菌功能的多肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；优选为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；更优选为SEQ ID NO.1。
基于对白色念珠菌和大肠杆菌的抑制效果，本发明所述的具有抗菌功能的多肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；优选为SEQ ID NO.1。
另一方面，本发明提供了一种编码上述的多肽的核酸序列。
进一步可以解释为：编码上述多肽的核酸序列在本发明的要求保护的范围内；
或，通过碱基互补配对原则与编码上述多肽的核苷酸序列互补的核酸序列在本发明的要求保护的范围内；
或，核苷酸序列包含编码上述多肽的核苷酸序列或通过碱基互补配对原则与编码上述多肽的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸序列在本发明的要求保护的范围内；
或，核苷酸序列为编码上述多肽的核酸序列序列或通过碱基互补配对原则与编码上述多肽的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的任一个的多拷贝或多个的单拷贝或多拷贝的直接或间接连接形成的核酸序列在本发明的要求保护的范围内；
或，核苷酸序列包含编码上述多肽的核酸序列序列或通过碱基互补配对原则与编码上述多肽的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的任一个的多拷贝或多个的单拷贝或多拷贝的直接或间接连接形成的核酸序列在本发明的要求保护的范围内；
应当说明的是，基于本发明上述核酸序列而人工设计、诱变或自然突变形成的突变体核酸序列，也应当在本发明要求保护的范围之内。
进一步可以解释为：相较于上述核酸序列的核苷酸序列包含编码上述多肽的核苷酸序列或通过碱基互补配对原则与编码上述多肽的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述的突变体核酸序列发生了核苷酸的替换、缺失、插入和/或二级结构的改变。
作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：
基于SEQ ID NO.1在大肠杆菌内的表达效率，本发明所述的核酸序列的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11；优选为SEQ ID NO.9。
再一方面，本发明提供了一种基因工程载体，包含上述核酸序列序列。
具体地，所述基因工程载体包括质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。
作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：
基于SEQ ID NO.1在大肠杆菌内的表达效率，本发明所述的基因工程载体优选为pET-28a(+)质粒。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，具有表达上述多肽和/或复制上述核酸序列的功能。
进一步可以解释为：具有表达上述多肽和/或复制上述核酸序列功能的宿主细胞在本发明的要求保护范围内；
或，包含上述基因工程载体的宿主细胞在本发明的要求保护的范围内。
作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：
基于SEQ ID NO.1的表达效率和大规模发酵培养工艺，本发明所述的宿主细胞优选为BL21(DE3)pLysS。
又一方面，本发明提供了一种上述多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、人工合成或基因克隆编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
S2、将步骤S1中得到的核苷酸序列与表达载体相连接，转化和/或转染进宿主细胞，筛选阳性克隆；
S3、培养步骤S2得到的阳性克隆，诱导多肽表达；
S4、破碎宿主细胞，进行蛋白纯化，即得到所述的多肽。
又一方面，本发明提供了上述多肽、上述核酸序列、上述基因工程载体和宿主细胞在制备诊断、预防和/或治疗细菌、真菌、病毒和/或原虫感染的产品中的应用。
具体地，上述细菌、真菌、病毒和/或原虫感染包括细菌、真菌、病毒或原虫感染和细菌、真菌、病毒或原虫中至少两种交叉感染。
具体地，上述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
又一方面，本发明提供了一种用于诊断、预防和/或治疗细菌、真菌的药物。
所述的药物中通过上述多肽、上述的核酸序列、上述的基因工程载体和/或上述的宿主细胞进行制备。
相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明根据天然多肽BAMP 28，人工设计出本发明所述的多肽SEQ ID NO.1-5，并采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码SEQ ID NO.1-5的核苷酸序列，通过原核表达系统大量获取多肽SEQ ID NO.1-5。经实验证明本发明多肽SEQ ID NO.1-5具备较强的广谱抗菌活性，可同时抑制细菌和真菌，同时具备较低溶血性，因此，其可作为一类新型抗菌药物，在食品防腐、疾病治疗等方面具有良好的应用前景，极具开发潜力。
2.本发明提供的多肽SEQ ID NO.1-5制备方法表达效率高，分离纯化过程简单，产物纯度高，得到的多肽纯度可达98％，已达到了制药产业化水平，且生产成本低，适用于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中多肽SEQ ID NO.1-5溶血活性检测。
图2为本发明实验例3中实施例5-7的基因工程菌中多肽SEQ ID NO.1表达量检测；
其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为实施例5基因工程菌表达的多肽SEQ IDNO.1；泳道2为实施例6基因工程菌表达的多肽SEQ ID NO.1；泳道3为实施例7基因工程菌表达的多肽SEQ ID NO.1。
图3为本发明实施例9中多肽SEQ ID NO.1凝胶过滤层析图谱。
图4为本发明实施例9中Tricine-SDS-PAGE检测多肽SEQ ID NO.1纯度；
其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为实施例9中纯化后的多肽SEQ ID NO.1。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例1多肽SEQ ID NO.1-5的设计、合成及纯度检测
根据天然多肽BAMP 28(No.OCB93651.1)成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明多肽SEQ ID NO.1-5的氨基酸序列，采用化学固相合成的方式，合成得到多肽。
采用HPLC检测合成的多肽纯度，确定合成的多肽纯度均大于95％；HPLC检测条件：流动相A为含有0.05％(V/V)的三氟乙酸；流动相B为含有0.05％(V/V)的乙腈，检测波长为210nm，在40分钟内，流动相B从0线性提高至90％(V/V)。
实施例2
本实施例与实施例1的不同在于：人工设计出多肽SEQ ID NO.6的氨基酸序列SEQID NO.6。其余与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同在于：人工设计出多肽SEQ ID NO.7的氨基酸序列SEQID NO.7。其余与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同在于：人工设计出多肽SEQ ID NO.8的氨基酸序列SEQID NO.8。其余与实施例1相同。
实验例1多肽SEQ ID NO.1-8生物活性检测
通过微量稀释法测定实施例1-4中多肽SEQ ID NO.1-8对于大肠杆菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)，对其进行抑菌活性评价。
具体实验步骤如下：使用LB培养基将大肠杆菌和白色念珠菌制备成1×106CFU/mL的菌液，分别加入96孔细胞培养板内，每孔100μL。使用LB培养基将多肽SEQ ID NO.1-8溶液分别稀释成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL，并加入96孔细胞培养板内，每孔100μL。设置空白对照组仅含等量的LB液态培养基，条件对照组仅含有实验菌株的菌液，置于37℃培养箱中培养20h，测定每孔的OD600值。可完全抑制细菌生长的最低溶液浓度即为多肽SEQ ID NO.1-8针对该实验菌株的MIC。
实验结果如下表1：
表1
从上表数据可以看出，本发明多肽SEQ ID NO.1-5均具有良好的抑菌能力，其中SEQIDNO.1具有较优的抑菌能力，因此作为优选序列进行进一步开发，而多肽SEQ ID NO.6-8的抑菌能力较差。
实验例2多肽SEQ ID NO.1-5溶血性检测
具体实验步骤如下：使用pH＝7.4的PBS溶液将人红细胞悬浮，1000g离心7min，洗涤2-3次。将实施例1中多肽SEQ ID NO.1-5分别溶解至同样的PBS溶液中，按照0μM、100μM、200μM、400μM的浓度与洗涤后的人红细胞等比例混合，37℃孵育1h后，1000g离心5min，测定上清液于405nm的吸收值。使用PBS溶液作为阴性对照组，使用1％Triton X-100作为阳性对照组，按照405nm吸收值计算各个多肽的溶血率。
实验结果见图1：
多肽SEQ ID NO.1浓度为50μM时，溶血率仅为1.54％，推测其针对人红细胞的HC50值应远远超出50μM，而多肽SEQ ID NO.1发挥生物活性的浓度仅需1.25-2.5μg/mL(即为*μM)，由此可以认为其不表现溶血活性。多肽SEQ ID NO.1具有极低的溶血率，且发挥生物活性所需浓度较低，因此作为优选序列进行进一步开发。
多肽SEQ ID NO.2浓度为50μM时，溶血率仅为1.42％，推测其针对人红细胞的HC50值应远远超出50μM，而多肽SEQ ID NO.2发挥生物活性的浓度仅需2.5-3.5μg/mL(即为*μM)，由此可以认为其不表现溶血活性。
多肽SEQ ID NO.3浓度为50μM时，溶血率仅为1.65％，推测其针对人红细胞的HC50值应远远超出50μM，而多肽SEQ ID NO.3发挥生物活性的浓度仅需2.5-4.0μg/mL(即为*μM)，由此可以认为其不表现溶血活性。
多肽SEQ ID NO.4浓度为50μM时，溶血率仅为9.23％，推测其针对人红细胞的HC50值应远远超出50μM，而多肽SEQ ID NO.4发挥生物活性的浓度仅需2.5-5.0μg/mL(即为*μM)，由此可以认为其不表现溶血活性。
多肽SEQ ID NO.5浓度为50μM时，溶血率为36.92％，推测其针对人红细胞的HC50值应超出50μM，而多肽SEQ ID NO.5发挥生物活性的浓度仅需5.0μg/mL(即为*μM)，由此可以认为其表现较低的溶血活性。
实施例5构建原核表达载体和基因工程菌
根据实验例的结果，对实施例1得到的多肽SEQ ID NO.1的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该多肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶NcoI和XhoI识别位点，形成目的基因，序列如SEQ ID NO.9所示。
使用NcoI和XhoI核酸限制性内切酶对获得的目的基因和原核表达质粒pET-28a(+)同时进行双酶切操作。纯化酶切产物后，将目的基因片段与pET-28a(+)质粒连接，构建原核表达载体，并采用热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用硫酸卡那霉素鉴定筛选基因工程阳性菌。
实施例6构建原核表达载体和基因工程菌
与实施例5不同的是，设计的核酸序列为SEQ ID NO.10，其余与实施例5相同。
实施例7构建原核表达载体和基因工程菌
与实施例5不同的是，设计的核酸序列为SEQ ID NO.11，其余与实施例5相同。
实验例3基因工程菌中多肽SEQ ID NO.1表达量检测
按1：100的接种量将实施例5-7中筛选到的基因工程阳性菌分别接种至200mL LB(含30μg/mL硫酸卡那霉素)液态培养基中，37℃、220rpm培养，当菌体密度OD600达到0.5-1时，降温至30℃，添加IPTG诱导多肽表达，使IPTG终浓度为1mM，诱导4-5小时，取0.1mL菌液离心收集菌体，加入4×loading buffer 20μL、蒸馏水60μL，100℃加热10min后，12000rpm离心，取上清进行SDS-PAGE，检测多肽SEQ ID NO.1表达量。结果见图2。
由图2可知，实施例5的基因工程阳性菌中多肽SEQ ID NO.1表达量比实施例6-7高了近1倍，表明实施例5中的多肽SEQ ID NO.1编码序列(SEQ ID NO.9)的表达效率更高。
实施例8多肽SEQ ID NO.1的制备方法
为了制备多肽SEQ ID NO.1纯品，需要将基因工程菌进行发酵培养和表达，方法如下：
取实施例5得到的基因工程阳性菌进行种子培养，待大肠杆菌OD600为2-3时，接种于LB培养基中，接种量为1:1000，37℃转速170r/min培养10h后，进行IPTG诱导表达，IPTG的终浓度为1mM，诱导温度30℃，诱导时间为6-8h。
诱导结束后，取少量培养液在4℃9000r/min下离心15min，弃上清，沉淀用PBS洗涤一次，等体积重悬菌体，加入HCl水浴锅中60-70℃反应30分钟后，离心取上清，采用实施例1中HPLC的检测方法检测多肽SEQ ID NO.1的含量。
结果显示，在LB培养基摇瓶培养条件下，多肽SEQ ID NO.1的表达水平可以达到20mg/L以上。
实施例9多肽SEQ ID NO.1的纯化
(1)将实施例8得到的培养液，使用低温高速离心机离心后，收集菌体；
(2)使用蒸馏水将收集的菌体进行重悬，加入一定量浓HCl水浴锅中60-70℃下反应30分钟，反应结束后离心，收集上清液；
(3)使用用Tris干粉调节上述上清液pH至6.5-7.4后在4℃9000r/min下离心30min，取上清；
(4)离心后的上清液加入(NH4)2SO4至终浓度为2M，4℃过夜沉淀，次日去除部分上清液后，4℃10000rpm离心15min，去上清，沉淀使用含有1MNaCl的0.02M Tris-HCl PH7.4缓冲液溶解；
(5)将步骤(4)得到的溶液进行阳离子层析，阳离子层析所用的层析介质为CM-Sepharose Fast Flow介质，上样完成后先用含有1M NaCl的0.02MTris-HClpH7.4缓冲液冲洗，改用含有2M NaCl的0.02M Tris-HClpH7.4缓冲液洗脱并收集洗脱峰对应的溶液；
(6)将步骤(5)得到的溶液进行HW-40F凝胶过滤，缓冲液为0.1M NaCl的0.02MTris-HCl pH7.4缓冲液，收集纯度较高的洗脱峰液，图谱见图3；
(7)将步骤(6)得到的洗脱峰液经过1kD的超滤膜膜浓缩、脱盐、换液后，得到纯度较高的多肽SEQ ID NO.1，其中超滤时缓冲液为纯化水；
(8)对步骤(7)得到的得到的多肽SEQ ID NO.1进行Tricine-SDS-PAGE检测，结果见图4，采用实施例1中HPLC方法检测多肽SEQ ID NO.1的纯度，结果大于98％。
实验例4多肽SEQ ID NO.1生物活性检测
通过微量稀释法测定实施例9得到的多肽SEQ ID NO.1对于大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，对其进行抑菌活性评价。
具体实验步骤如下：使用MH肉汤培养基将大肠杆菌制备成1×106CFU/mL的菌液，分别加入96孔细胞培养板内，每孔50μL。使用超纯水将实施例9得到的多肽SEQ ID NO.1溶液分别稀释成24、12、6、3、1.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.036、0.018μg/mL，将上述浓度的多肽SEQ ID NO.1依次加入96孔细胞培养板内，每孔50μL。共设置两个平行。35℃孵育17h，观测记录OD600值，结果如下表所示：
多肽SEQ ID NO.1浓度为1.25μg/mL时，OD600为0.1522、0.1357，与更高浓度SEQ IDNO.1相比OD600基本一致，而多肽SEQ ID NO.1浓度为0.625μg/mL时，OD600为0.5061、0.4299，此时细菌已经开始生长。因此SEQ ID NO.1对大肠杆菌的最低抑菌浓度为1.25μg/mL。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 杭州长龄生物科技有限公司
<120> 一种多肽及其制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Arg Lys Lys Leu Arg Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Arg Ser
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Gly His Lys Lys Leu His Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr His Ser
20
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Arg Lys Lys Leu Arg Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Ser
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Lys Leu His Ser Lys Gly Arg His Lys Leu His Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr His Ser
20
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Gly His Lys Lys Leu His Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Ser
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gly Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Thr Leu Arg Ala Trp Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Arg Ile Gly Ser
20
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gly Gly Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gly Gly Leu Arg Ser Leu Gly Arg Lys Ile Leu Arg Ala Trp Lys
1 5 10 15
Lys Tyr
<210> 9
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatggatgg gaaatctccg ctccaatgga cgcaataatc tccgcgcttg gaataattat 60
cgctcctgat gactcgag 78
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgggaaatc tccgatccaa tggacgaaat aatctccgag cttggaataa ttatcgatcc 60
tga 63
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgggaaaac tccgatccaa aggacgaaaa aaactccgag cttggaaaaa atatcgatcc 60
tga 63

Claims (8)

1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示。
2.一种编码权利要求1所述的多肽的核酸。
3.一种基因工程载体，其特征在于，所述的基因工程载体包含权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞具有表达权利要求1所述的多肽和/或复制权利要求2所述的核酸的功能。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的基因工程载体。
6.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、人工合成或基因克隆编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的核酸；
S2、将步骤S1中得到的核酸与表达载体相连接，转化和/或转染进宿主细胞，筛选阳性克隆；
S3、培养步骤S2得到的阳性克隆，诱导多肽表达；
S4、破碎宿主细胞，进行蛋白纯化，即得到所述的多肽。
7.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的基因工程载体和/或权利要求4-5任一项所述的宿主细胞在制备用于抑制大肠杆菌和/或白色念珠菌的产品中的应用。
8.一种用于抑制大肠杆菌和/或白色念珠菌的产品，其特征在于，所述的产品通过权利要求1所述多肽、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的基因工程载体和/或权利要求4-5任一项所述的宿主细胞进行制备。
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