CN101287990A - 通过检测细胞/组织中galnac-t14的表达判定对apo2l/trail的凋亡敏感性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检验哺乳动物组织或细胞样品中一种或多种生物标志物的表达的方法和测定法。依照本发明所公开的方法和测定法，检测到GalNac－T相关分子(诸如GalNac－T14或GalNac－T3)的表达则预示或指示该组织或细胞样品将对凋亡诱导剂(诸如Apo2L/TRAIL和抗DR5激动剂抗体)是敏感的。本发明还提供了试剂盒和制品。

Description

通过检测细胞/组织中GALNAC-T14的表达判定对APO2L/TRAIL的凋亡敏感性
相关申请
本申请要求2005年8月16日提交的美国临时申请60/708,677和2006年5月24日提交的美国临时申请60/808,076的优先权，将其内容收入本文作为参考。
发明领域
本文所描述的发明涉及检测预示哺乳动物细胞对Apo2L/TRAIL和/或死亡受体激动剂抗体敏感的生物标志物的方法和测定法。更具体的说，本发明涉及检测与GalNac-T蛋白质家族有关的分子的方法和测定法，其中GalNac-T蛋白质家族预示哺乳动物癌细胞对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体(诸如DR4或DR5激动剂抗体)的敏感性。
发明背景
本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多种配体和受体。在这些配体中有肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、4-1BB配体、LIGHT、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)(参见例如Ashkenazi，Nature Review，2：420-430(2002)；Ashkenaziand Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.CellBiol.，11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley et al.，Cell，104：487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)；Schmid etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：1881(1986)；Dealtry et al.，Eur.J.Immunol.，17：689(1987)；Pitti et al.，J.Biol.Chem.，271：12687-12690(1996)；Wiley et al.，Immunity，3：673-682(1995)；Browning et al.，Cell，72：847-856(1993)；Armitage et al.，Nature，357：80-82(1992)；WO 97/01633，公开于1997年1月16日；WO 97/25428，公开于1997年7月17日；Marsters et al.，Curr.Biol.，8：525-528(1998)；Chicheportiche et al.，Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Hahne et al.，J.Exp.Med.，188：1185-1190(1998)；WO 98/28426，公开于1998年7月2日；WO 98/46751，公开于1998年10月22日；WO 98/18921，公开于1998年5月7日；Moore et al.，Science，285：260-263(1999)；Shu et al.，J.Leukocyte Biol.，65：680(1999)；Schneider et al.，J.Exp.Med.，189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al.，J.Biol.Chem.，274：15978-15981(1999))。
由这些TNF家族配体介导的多种细胞应答的诱发通常是通过它们与特定细胞受体结合而开始的。有些但非所有TNF家族配体结合细胞表面“死亡受体”，并由此诱发多种生物学活动以激活胱天蛋白酶或者执行细胞死亡或凋亡途径的酶(Salvesen et al.，Cell，91：443-446(1997))。在迄今为止已经鉴定的TNF受体超家族成员中包括TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也称作Apo-1或CD95)、DR4(也称作TRAIL-R1)、DR5(也称作Apo-2或TRAIL-R2)、DcR1、DcR2、护骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也称作DR3或TRAMP)(参见例如Ashkenazi，Nature Reviews，2：420-430(2002)；Ashkenazi and Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley et al.，Cell，104：487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)；Hohman et al.，J.Biol.Chem.，264：14927-14934(1989)；Brockhaus et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：3127-3131(1990)；EP417,563，公开于1991年3月20日；Loetscher et al.，Cell，61：351(1990)；Schall etal.，Cell，61：361(1990)；Smith et al.，Science，248：1019-1023(1990)；Lewis etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：2830-2834(1991)；Goodwin et al.，Mol.Cell.Biol.，11：3020-3026(1991)；Stamenkovic et al.，EMBO J.，8：1403-1410(1989)；Mallett et al.，EMBO J.，9：1063-1068(1990)；Anderson et al.，Nature，390：175-179(1997)；Chicheportiche et al.，J.Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Pan et al.，Science，276：111-113(1997)；Pan et al.，Science，277：815-818(1997)；Sheridan et al.，Science，277：818-821(1997)；Degli-Esposti et al.，J.Exp.Med.，186：1165-1170(1997)；Marsters et al.，Curr.Biol.，7：1003-1006(1997)；Tsudaet al.，BBRC，234：137-142(1997)；Nocentini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：6216-6221(1997)；vonBulow et al.，Science，278：138-141(1997))。
大多数这些TNF受体家族成员都有细胞表面受体的典型结构，包括胞外区、跨膜区和胞内区，而其它成员则天然发现是缺少跨膜和胞内结构域的可溶性蛋白质。典型TNFR的胞外部分包含从NH2-末端起始的多个富含半胱氨酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列模式。
数年前，将称作Apo2L或TRAIL的配体鉴定为TNF细胞因子家族的成员(参见例如Wiley et al.，Immunity，3：673-682(1995)；Piti et al.，J.Biol.Chem.，271：12697-12690(1996)；WO 97/01633；WO 97/25428；美国专利5,763,223，授权于1998年6月9日；美国专利6,284,236，授权于2001年9月4日)。全长天然序列人Apo2L/TRAIL多肽是281个氨基酸的II型跨膜蛋白质。有些细胞能通过酶促切割多肽的胞外区来生成天然的可溶形式多肽(Mariani et al.，J.Cell.Biol.，137：221-229(1997))。对可溶形式Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF和其它相关蛋白质结构类似的同三聚体结构(Hymowitz et al.，Molec.Cell，4：563-571(1999)；Cha et al.，Immunity，11：253-261(1999)；Mongkolsapaya et al.，Nature Structural Biology，6：1048(1999)；Hymowitz et al.，Biochemistry，39：633-644(2000))。但是，与其它TNF家族成员不同，发现Apo2L/TRAIL具有独特的结构特征，即三个半胱氨酸残基(同三聚体中各个亚基的第230位)一起与锌原子配位，而且锌结合对于三聚体稳定性和生物学活性来说是重要的(Hymowitz et al.，见上文；Bodmer et al.，J.Biol.Chem.，275：20632-20637(2000))。
文献中已有报道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系统的调节中起作用，包括自身免疫病，诸如类风湿性关节炎(参见例如Thomas et al.，J.Immunol.，161：2195-2200(1998)；Johnsen et al.，Cytokine，11：664-672(1999)；Griffith et al.，J.Exp.Med.，189：1343-1353(1999)；Song et al.，J.Exp.Med.，191：1095-1103(2000))。
还有报道，可溶形式的Apo2L/TRAIL在多种癌细胞中诱导凋亡，包括结肠、肺、乳房、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑肿瘤，以及黑素瘤、白血病和多发性骨髓瘤(参见例如Wiley et al.，见上文；Piti et al.，见上文；美国专利6,030,945，授权于2000年2月29日；美国专利6,746,668，授权于2004年6月8日；Rieger et al.，FEBS Letters，427：124-128(1998)；Ashkenazi et al.，J.Clin.Invest.，104：155-162(1999)；Walczak et al.，Nature Med.，5：157-163(1999)；Keane etal.，Cancer Research，59：734-741(1999)；Mizutani et al.，Clin.Cancer Res.，5：2605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，13：1817-1824(1999)；Yu et al.，CancerRes.，60：2384-2389(2000)；Chinnaiyan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：1754-1759(2000))。鼠肿瘤模型的体内研究还表明，单独使用Apo2L/TRAIL或者与化疗或放疗联合能发挥实质性的抗肿瘤作用(参见例如Ashkenazi etal.，见上文；Walzcak et al.，见上文；Gliniak et al.，Cancer Res.，59：6153-6158(1999)；Chinnaiyan et al.，见上文；Roth et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，265：1999(1999)；PCT申请US/00/15512；PCT申请US/01/23691)。与许多类型的癌细胞相反，大多数正常人细胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL诱导的凋亡有抗性(Ashkenazi et al.，见上文；Walzcak et al.，见上文)。Jo等人报道，多组氨酸标记的可溶形式Apo2L/TRAIL在体外在分离的正常人肝细胞中诱导凋亡，非人源的则不然(Jo et al.，Nature Med.，6：564-567(2000)；Nagata，Nature Med.，6：502-503(2000))。认为，某些重组Apo2L/TRAIL制备物在生物化学特性和生物学活性方面对患病细胞和正常细胞可有所变化，这取决于例如标签分子的存在与否、锌含量和三聚体含量百分比(参见Lawrence et al.，Nature Med.，Letter to the Editor，7：383-385(2001)；Qin et al.，Nature Med.，Letter to the Editor，7：385-386(2001))。
已经发现Apo2L/TRAIL结合至少五种不同受体。至少两种结合Apo2L/TRAIL的受体包含功能性胞质死亡结构域。一种这样的受体称作“DR4”(或称作TR4或TRAIL-R1)(Pan et al.，Science，276：111-113(1997)；WO 98/32856，公开于1998年7月30日；WO 99/37684，公开于1999年7月29日；WO 00/73349，公开于2000年12月7日；US 2003/0036168，公开于2003年2月20日；US 6,433,147，授权于2002年8月13日；US 6,461,823，授权于2002年10月8日；US 6,342,383，授权于2002年1月29日)。
另一种这样的Apo2L/TRAIL受体称作DR5(或称作Apo-2、TRAIL-R或TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2、或KILLER)(参见例如Sheridanet al.，Science，277：818-821(1997)；Pan et al.，Science，277：815-818(1997)；WO 98/51793，公开于1998年11月19日；WO 98/41629，公开于1998年9月24日；Screaton et al.，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak et al.，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu et al.，Nature Genetics，17：141-143(1997)；WO98/35986，公开于1998年8月20日；EP 870,827，公开于1998年10月14日；WO98/46643，公开于1998年10月22日；WO 99/02653，公开于1999年1月21日；WO 99/09165，公开于1999年2月25日；WO 99/11791，公开于1999年3月11日；WO 03/042367，公开于2003年5月22日；WO 02/097033，公开于2002年12月5日；WO 03/038043，公开于2003年5月8日；US 2002/0072091，公开于2002年8月13日；US 2002/0098550，公开于2001年12月7日；US 6,313,269，授权于2001年12月6日；US 2001/0010924，公开于2001年8月2日；US 2003/01255540，公开于2003年7月3日；US 2002/0160446，公开于2002年10月31日；US2002/0048785，公开于2002年4月25日；US 2004/0141952，公开于2004年7月22日；US 2005/0129699，公开于2005年6月16日；US 2005/0129616，公开于2005年6月16日；US 6,342,369，授权于2002年2月；US 6,569,642，授权于2003年5月27日；US 6,072,047，授权于2000年6月6日；US 6,642,358，授权于2003年11月4日；US 6,743,625，授权于2004年6月1日)。像DR4一样，DR5据报道包含胞质死亡结构域且能够通过配体结合(或者通过结合诸如模拟配体活性的激动性抗体等分子)发出凋亡信号。Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构描述于Hymowitz et al.，Molecular Cell，4：563-571(1999)。
配体结合后，DR4和DR5都能经由称作FADD/Mort1的含死亡结构域的衔接物(adaptor)分子通过募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶-8而独立引发凋亡(Kischkel et al.，Immunity，12：611-620(2000)；Sprick et al.，Immunity，12：599-609(2000)；Bodmer et al.，Nature Cell Biol.，2：241-243(2000))。
Apo2L/TRAIL据报道还结合那些称作DcR1、DcR2和OPG的受体，认为这些受体发挥信号传递的抑制物而非转换器的功能(参见例如DCR1(也称作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Pan et al.，Science，276：111-113(1997)；Sheridanet al.，Science，277：818-821(1997)；McFarlane et al.，J.Biol.Chem.，272：25417-25420(1997)；Schneider et al.，FEBS Letters，416：329-334(1997)；Degli-Esposti et al.，J.Exp.Med.，186：1165-1170(1997)；Mongkolsapaya et al.，J.Immunol.，160：3-6(1998))；DCR2(也称作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsterset al.，Curr.Biol.，7：1003-1006(1997)；Pan et al.，FEBS Letters，424：41-45(1998)；Degli-Esposti et al.，Immunity，7：813-820(1997))；和OPG(Simonet etal.，见上文))。与DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受体不发出凋亡信号。
文献中已经报道了某些与DR4和/或DR5受体结合的抗体。例如，针对DR4受体且在某些哺乳动物细胞中具有激动或凋亡活性的抗DR4抗体描述于例如WO 99/37684，公开于1999年7月29日；WO 00/73349，公开于2000年7月12日；WO 03/066661，公开于2003年8月14日。还可参见例如Griffith et al.，J.Immunol.，162：2597-2605(1999)；Chuntharapai et al.，J.Immunol.，166：4891-4898(2001)；WO 02/097033，公开于2002年12月2日；WO 03/042367，公开于2003年5月22日；WO 03/038043，公开于2003年5月8日；WO 03/037913，公开于2003年5月8日；US 2003/0073187，公开于2003年4月17日；US2003/0108516，公开于2003年6月12日。同样已经描述了某些抗DR5抗体，参见例如WO 98/51793，公开于1998年11月8日；Griffith et al.，J.Immunol.，162：2597-2605(1999)；Ichikawa et al.，Nature Med.，7：954-960(2001)；Hylander etal.，“An Antibody to DR5(TRAIL-Receptor 2)Suppresses the Growth of PatientDerived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”，Abstract，2dInternational Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers，Aug.29-Sept.1，2002，Banff，Alberta，Canada；WO 03/038043，公开于2003年5月8日；WO03/037913，公开于2003年5月8日；US 2003/0180296，公开于2003年9月25日。另外，已经描述了某些对DR4和DR5受体都具有交叉反应性的抗体(参见例如美国专利6,252,050，授权于2001年6月26日)。
发明概述
本文所公开的方法提供了检验哺乳动物组织或细胞样品中一种或多种生物标志物的表达的方法和测定法，其中一种或多种所述生物标志物的表达预示该组织或细胞样品是否将对诸如Apo2L/TRAIL或抗DR5激动剂抗体的药剂是敏感的。在本发明的各种实施方案中，所述方法和测定法检验GalNac-T蛋白质家族中的分子(尤其是GalNAc-T14或GalNAc-T3)的表达。
如上所述，大多数正常人细胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL的凋亡诱导作用有抵抗性(Ashkenazi et al.，supra；Walzcak et al.，supra)。还观察到有些患病人细胞类型群体(诸如某些癌细胞群体)对某些重组形式Apo2L/TRAIL的凋亡诱导作用有抵抗性(Ashkenazi et al.，J.Clin.Invest.，1999，supra；Walczak et al.，Nature Med.，1999，supra)。因此，通过某种测定法对哺乳动物组织或细胞样品检验选定的生物标志物的表达，可以方便且有效的得到可用于评估治疗患者的适宜或有效疗法的信息。例如，自检测哺乳动物组织或细胞样品中GalNac-T14表达的测定法得到的信息可以为内科医师提供有用数据，用于为患有诸如癌症或免疫相关疾病(诸如自身免疫病)的病症的患者确定最佳治疗方案(使用Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体)。
本发明提供了用于预测哺乳动物组织或细胞样品(诸如癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体的敏感性的方法。在某些实施方案中，所述方法包括获取哺乳动物组织或细胞样品，并对该组织或细胞检验GalNac-T14的表达。所述方法可以以多种测定法格式来进行，包括检测mRNA和/或蛋白质表达的测定法、酶活性测定法和本文讨论的其它测定法。测定出所述组织或细胞中GalNac-T14的表达则预示所述组织或细胞将对Apo2L/TRAIL和/或死亡受体抗体的凋亡诱导活性是敏感的。在任选的实施方案中，还可以对所述组织或细胞检验DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
本发明的其它方法包括在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括以下步骤：获取哺乳动物组织或细胞样品；对该组织或细胞样品检验GalNac-T14的表达；并在测定出所述组织或细胞表达GalNac-T14之后，将所述组织或细胞样品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体。所述方法中用于检验GalNac-T14表达的步骤可以以多种测定法格式来进行，包括检测mRNA和/或蛋白质表达的测定法、酶活性测定法、和本文讨论的其它测定法。在任选的实施方案中，所述方法还包括对所述组织或细胞样品检验DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。任选的是，所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。任选的是，所述组织或细胞样品包括非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或非何杰金氏淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma)细胞。
本发明的其它方法还包括治疗哺乳动物中的病症诸如免疫相关病症或癌症的方法，包括以下步骤：自所述哺乳动物获取组织或细胞样品；对该组织或细胞样品检验GalNac-T14的表达；并在测定出所述组织或细胞样品表达GalNac-T14之后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体。所述方法中用于检验一种或多种生物标志物表达的步骤可以以多种测定法格式来进行，包括检测mRNA和/或蛋白质表达的测定法、酶活性测定法、和本文讨论的其它测定法。在任选的实施方案中，所述方法还包括对所述组织或细胞样品检验DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。任选的是，所述方法包括治疗哺乳动物中的癌症。任选的是，在施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受体激动剂抗体之外，所述方法包括对所述哺乳动物施用化疗剂或放疗。
在本发明的其它实施方案中，上述方法可以包括对哺乳动物组织或细胞检验其它GalNac-T分子(诸如GalNac-T3)的表达。
其它实施方案还例示为例如以下权利要求：
1.用于预测哺乳动物组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括以下步骤：
获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达，其中所述GalNac-T14的表达预示所述组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL的凋亡诱导活性是敏感的。
2.权利要求1的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
3.权利要求1的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
4.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
5.权利要求1的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
7.用于在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括以下步骤：
获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并
在检测到所述GalNac-T14的表达之后，将所述组织或细胞样品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。
8.权利要求7的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的
9.权利要求7的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
10.权利要求7的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
11.权利要求7的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
13.权利要求7的方法，其中将所述细胞暴露于有效量的包含图1氨基酸114-281的Apo2L/TRAIL多肽。
14.治疗哺乳动物中的病症诸如免疫相关病症或癌症的方法，包括以下步骤：
自所述哺乳动物获取组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并
在检测到所述GalNac-T14的表达之后，对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
15.权利要求14的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
16.权利要求14的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
17.权利要求14的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
18.权利要求14的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
20.权利要求14的方法，其中对所述哺乳动物施用有效量的包含图1氨基酸114-281的Apo2L/TRAIL多肽。
21.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用化疗剂或放疗。
22.权利要求14的方法，其中还对所述哺乳动物施用细胞因子、细胞毒剂或生长抑制剂。
23.权利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接有聚乙二醇分子。
24.权利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽连接有聚乙二醇分子。
25.用于预测哺乳动物组织或细胞样品对死亡受体抗体的敏感性的方法，包括以下步骤：
 获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达，其中所述GalNac-T14的表达预示所述组织或细胞样品对死亡受体抗体的凋亡诱导活性是敏感的。
26.权利要求25的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
27.权利要求25的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
28.权利要求25的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
29.权利要求25的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
31.权利要求25的方法，其中所述死亡受体抗体是激动性抗DR4抗体或激动性抗DR5抗体。
32.用于在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括以下步骤：
获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并
在检测到所述GalNac-T14的表达之后，将所述组织或细胞样品暴露于有效量的死亡受体抗体。
33.权利要求32的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的
34.权利要求32的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
35.权利要求32的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
36.权利要求32的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
37.权利要求36的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
38.权利要求32的方法，其中将所述细胞暴露于有效量的激动性抗DR4抗体或激动性抗DR5抗体。
39.权利要求38的方法，其中将所述细胞暴露于有效量的能与图3A所示DR5受体结合的激动性抗DR5抗体。
40.治疗哺乳动物中的病症诸如免疫相关病症或癌症的方法，包括以下步骤：
自所述哺乳动物获取组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并
在检测到所述GalNac-T14的表达之后，对所述哺乳动物施用有效量的死亡受体抗体。
41.权利要求40的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
42.权利要求40的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
43.权利要求40的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
44.权利要求40的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小细胞肺癌组织或细胞。
46.权利要求40的方法，其中对所述哺乳动物施用有效量的抗DR4或DR5抗体。
47.权利要求40的方法，其中还对所述哺乳动物施用化疗剂或放疗。
48.权利要求40的方法，其中还对所述哺乳动物施用细胞因子、细胞毒剂或生长抑制剂。
附图简述
图1显示了人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。核苷酸第447位处的“ N”用于指示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图2A和2B显示了全长人DR4 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。人DR4的相应核苷酸和氨基酸序列还报导于Pan et al.，Science，276：111(1997)。
图3A显示了人DR5 411个氨基酸的序列(SEQ ID NO：5)，披露于1998年11月19日公开的WO 98/51793。本领域已知人DR5的一种转录剪接变体。该DR5剪接变体编码人DR5 440个氨基酸的序列(SEQ ID NO：6)，如图3B和3C所示，披露于1998年8月20日公开的WO 98/35986。
图3D显示了全长人DcR1 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。人DcR1(及其具体结构域)的相应核苷酸和氨基酸序列还显示和披露于WO 98/58062。
图3E显示了全长人DcR2 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。人DcR2(及其具体结构域)的相应核苷酸和氨基酸序列还显示于WO 99/10484。
图4A显示了人GalNac-T14的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。这些序列还披露于Wang et al.，BBRC，300：738-744(2003)。
图4B显示了人GalNac-T3的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。这些序列还披露于Bennett et al.，J.Biol.Chem.，271：17006-17012(1996)。
图5提供了在对非小细胞肺癌(“NSCLC”)细胞系分析对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“DR5 ab”(交联的“XL”或非交联的)(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50汇总表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图6提供了在对胰腺癌细胞系分析对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“DR5 ab”(交联的“XL”或非交联的)(+0.5％胎牛血清“ FBS”或10％FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50汇总表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图7提供了在对非何杰金氏淋巴瘤(“NHL”)细胞系分析对Apo2L(+10％胎牛血清“FBS”)或DR5单克隆抗体“DR5 ab”(交联的“XL”或非交联的)(+10％胎牛血清“FBS”)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50简表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图8提供了选出的NSCLC、胰腺癌和NHL细胞系对DR5抗体的敏感性(sensitivity)(“sen”)或抵抗性(resistance)(“RES”)的比较及其与GalNac-T14表达的相关性，所述GalNac-T14表达是通过GalNac-T14 mRNA表达来测量的。
图9提供了根据GalNac-T14 mRNA表达模式水平排列(降序)的各种NSCLC、胰腺癌和NHL细胞系的柱形图。
图10A-D图示了特定O-糖基化酶在Apo2L/TRAIL敏感性和抵抗性癌细胞系中的差异表达：(A)在与不同剂量的Apo2L/TRAIL一起温育后测量细胞存活力。每种细胞系的IC50计算为引起存活力丧失50％的Apo2L/TRAIL浓度。每个细胞存活力实验在存在低(0.5％)和高(10％)胎牛血清时重复至少3次。黑色、灰色或空心符号分别描绘对Apo2L/TRAIL高度敏感、中等敏感或耐受的细胞系。(B)胰腺癌和恶性黑素瘤细胞系中的ppGalNAcT-14mRNA表达水平(探针组219271_at)。细胞系是根据组织类型和对Apo2L/TRAIL的敏感性而排列的。黑色、灰色或空心柱像A一样描绘细胞系。(C)结肠直肠癌细胞系中的Fut-6(顶图，探针组211885_x_at)和ppGalNAcT-3(底图，探针组203397_s_at)mRNA表达水平。细胞系像B一样排列。小图B和C中的P值基于细胞系敏感性(包括高度的和中等的)与高于截留值的mRNA表达之间相关性的Fisher检验。(D)Apo2L/TRAIL对已建立的肿瘤异种移植物生长的影响。携带GalNAcT-3/Fut-6-阳性(左小图)或GalNAcT-3/Fut-6-阴性(右小图)肿瘤的无胸腺裸鼠接受媒介物(vehicle)或Apo2L/TRAIL(60mg/kg/天，i.p.，第0-4天)并监测肿瘤体积(均值±SE，N＝10只小鼠/组)。
图11图示了特定O-糖基化酶改变对Apo2L/TRAIL的敏感性的调控。(A)将Colo205细胞与泛O-糖基化酶抑制剂苄基-GalNAc(bGalNAc)一起预温育，用Apo2L/TRAIL处理24小时，并测定细胞存活力(DMSO＝媒介物对照)。(B)将PSN-1(胰腺癌)和Hs294T(黑素瘤)细胞用胱天蛋白酶-8或ppGalNAcT-14siRNA转染48小时，与Apo2L/TRAIL一起再温育24小时，并测定细胞存活力。使用针对非靶向序列的siRNA双链体(Dharmacon)作为对照(NTC)。(C)将DLD-1结肠直肠癌细胞通过siRNA用ppGalNAcT-3或Fut-6转染并像B一样测试。(D)将HEK293细胞用编码指定基因及ppGalNAcT-14的质粒或载体对照共转染。在24小时时通过膜联蛋白V染色(左小图)测量凋亡。将H1569黑素瘤细胞用指导ppGalNAcT-14表达的逆转录病毒或对照逆转录病毒转导；将所得细胞系集合用Apo2L/TRAIL处理24小时并测定细胞存活力(右小图)。通过使用抗FLAG抗体的Western印迹分析来验证有表位标签的ppGalNAcT-14的表达。
图12图示了(A)由Apo2L/TRAIL诱导的胱天蛋白酶级联的分析。将PSN-1和DLD-1细胞分别用针对ppGalNAcT-14或Fut-6的siRNA转染48小时。将细胞用Apo2L/TRAIL处理4或8小时，并通过使用胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3或肌动蛋白(作为加载对照)特异性抗体的免疫印迹分析溶胞物。(B)将PSN-1细胞像A一样用ppGalNAcT-14 siRNA转染，用Apo2L/TRAIL处理4小时，并测定溶胞物中的胱天蛋白酶-3/7酶活性。(C)Apo2L/TRAIL DISC的分析。将PSN-1细胞像A一样用ppGalNAcT-14 siRNA转染。添加FLAG-Apo2L/TRAIL(1mg/ml)达0-60分钟，将细胞溶解，并用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。通过免疫印迹检测DISC相关FADD、胱天蛋白酶-8、DR4。(D)将PSN-1细胞像C一样进行转染、处理、和DISC免疫沉淀，并如文献所述测量DISC相关胱天蛋白酶-8酶活性(Sharp et al.，J.Biol.Chem.，280：19401(2005))。
图13图示了(A)CHO细胞中生成的重组人DR5(长剪接变体)的单糖分析，通过HPAEC-PAD(高效阴离子交换层析-脉冲电流测定)进行。(B)人Apo2L/TRAIL受体(440个氨基酸的长型人DR5“hDR5L”、411个氨基酸的短型人DR5“hDR5S”和hDR4)、鼠DR5(mDR5)、人Fas(hFas)和人TNFR1(hTNFR1)的序列比较。框指示推定的O-糖基化位点。(C)对应于D的总溶胞物的免疫印迹分析。DR5L-5T和DR5S-5T是包含5个苏氨酸变成丙氨酸替代的构建物，DR5L-5T3S和DR5S-5T3S是包含5个苏氨酸变成丙氨酸和3个丝氨酸变成丙氨酸替代的构建物，所述残基位于潜在O-糖基化位点内。(D)将HEK293细胞用指定的DR5构建物及载体或ppGalNAcT-14质粒共转染48小时，并通过膜联蛋白V染色测量凋亡。(E)来自皮肤癌(SCC＝鳞状细胞癌)、肺癌、胰腺癌(Panc)、乳腺癌、卵巢癌(Ov)、子宫内膜癌(Endo)、膀胱癌(Bla，TCC＝移行细胞癌)和NHL(FL＝滤泡性淋巴瘤，DLBCL＝弥漫性大B细胞性淋巴瘤)的原代人肿瘤样品中ppGalNAcT-14mRNA表达水平(Affymetrix芯片，探针组219271_at)。每一类样品的中值表达表示为灰色水平条。显示了对应于来自图10B的细胞系数据的500和200的截留值(黑素瘤)。
图14图示了(A)siRNA敲低后48小时后PSN-1或DLD-1细胞中ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3mRNA表达的降低，通过Taqman分析测量。(B)通过在siGalNAcT-14(1)介导的ppGalNAcT-14敲低之后转染空质粒(空的)、野生型GalNAcT-14(GalNAcT-14)或含siRNA沉默突变的GalNAcT-14(GalNAcT-14 si(1)Mut)，在PSN-1细胞中重建GalNAcT-14表达。(C)C170(结肠直肠癌)细胞中干扰RNA对ppGalNAcT-3或Fut-6的下调抑制Apo2L/TRAIL诱导的细胞死亡。实验规程像11C一样。表1A)siRNA敲低表型汇总表。标示了其中GalNAcT-14或ppGalNAcT-3和Fut-6下调导致针对Apo2L/TRAIL的保护的细胞系，指示至少一种所测试的siRNA寡核苷酸引起小于50％的保护作用(+)或大于50％的保护作用(++)。(0)指示不存在针对Apo2L/TRAIL的保护作用。(D)，(E)在用指定siRNA敲低48小时之后，将细胞用渐增剂量的依托泊苷(etoposide)或十字孢碱(staurosporine)(STS)处理24小时并进行细胞存活力测定法。(F)在Apo2L/TRAIL处理之后，将过表达ppGalNAcT-14的逆转录病毒PA-TU-8902和PL-45细胞系集合进行细胞存活力测定法。使用抗FLAG抗体的Western印迹分析指示这些细胞中有逆转录病毒表达的ppGalNAcT-14。
图15(A)Apo2L/TRAIL敏感性Colo205和抵抗性结肠直肠癌细胞系RKO和SW1417中Apo2L/TRAIL诱导的胱天蛋白酶激活级联的Western印迹分析。将细胞用1000ng/ml Apo2L/TRAIL处理8和24小时，并将总的溶胞物进行使用胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和肌动蛋白(作为加载对照)特异性抗体的western印迹分析。(B)DLD-1细胞中Apo2L/TRAIL DISC处Fut-6降低的胱天蛋白酶-8募集和激活的敲低。实验规程依照12D。(C)通过FACS分析在用指定基因进行了siRNA敲低的细胞中测量DR4和DR5的细胞表面表达。
发明详述
本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法，诸如例如广泛应用的分子克隆方法，记载于Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y。适当时，涉及使用市售试剂盒和试剂的规程一般依照制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有说明。
在描述本发明的方法和测定法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂，因为它们当然可以有所变化。还应当理解本文中所使用的术语只是为了描述具体实施方案，并非意图限制本发明的范围，只通过所附权利要求才对本发明范围进行限制。
必须注意的是，在用于本文及所附权利要求时，单数形式“一个/种”、“该”和“所述”等包括复数所指物，除非另有明确规定。如此，例如，提到“遗传改变”包括一处或多处此类改变，提到“探针”包括一种或多种探针及其本领域技术人员知道的等效物，诸如此类。
将本文中提到的所有出版物收入本文作为参考，以披露和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因为它们是在本申请的提交日之前公开的。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明的发明人没有资格凭借更早的优先权日或在先发明日而早于所述出版物。此外，实际发表日可能与所显示的有所不同，需要独立查证。
I.定义
术语“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”在本文中用于指包含图1所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281(含端点)、残基95-281(含端点)、残基92-281(含端点)、残基91-281(含端点)、残基41-281(含端点)、残基15-281(含端点)或残基1-281(含端点)的多肽序列，以及上述序列的生物学活性片段、删除、插入或替代变体。在一个实施方案中，多肽序列包含图1的残基114-281。并且任选由图1的残基114-281组成。任选的是，多肽序列包含图1的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图1所示天然核苷酸序列编码。任选的是，编码残基Pro119(图1)的密码子可以是“CCT”或“CCG”。在其它实施方案中，所述片段或变体具有生物学活性，且与任一上文所述Apo2L/TRAIL序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少约90％的序列同一性，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。任选的是，Apo2L/TRAIL多肽由在严格条件下与图1所提供的编码多核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列编码。该定义涵盖Apo2L/TRAIL的替代变体，其中其至少一个天然氨基酸用丙氨酸残基替代。Apo2L/TRAIL的具体替代变体包括那些其中至少一个氨基酸用丙氨酸残基替代的变体。这些替代变体包括那些鉴定为例如“D203A”、“D218A”和“D269A”的变体。使用这种命名法来鉴定其中第203、218和/或269位(使用图1所示编号方式)天冬氨酸残基用丙氨酸残基替代的Apo2L/TRAIL变体。任选的是，Apo2L变体可以包含已公开的PCT申请WO 01/00832的表I中所描述的一处或多处丙氨酸替代。替代变体包含2001年1月4日公开的WO 01/00832的表I中所鉴定的一处或多处残基替代。该定义还涵盖从Apo-2L/TRAIL来源分离的或者通过重组或合成方法制备的天然序列Apo-2L/TRAIL。本发明的Apo-2L/TRAIL包括PCT出版物WO97/01633和WO97/25428中披露的称作Apo-2L/TRAIL或TRAIL的多肽。术语“Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”通常用于指Apo-2L/TRAIL的各种形式，包括多肽的单体、二聚体或三聚体形式。除非另有说明，Apo-2L序列中提及的所有氨基酸残基编号采用依照图1的编号。例如，“D203”或“Asp203”指图1提供的序列中第203位的天冬氨酸残基。
术语“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”指基本上不含跨膜域和胞质域的Apo2L/TRAIL形式。通常，ECD具有少于1％的此类跨膜域和胞质域，且优选具有少于0.5％的此类结构域。应当理解，对本发明多肽所鉴定的任何跨膜域是依照本领域常规用于鉴定那种类型的疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜域的精确边界可以变化，但最有可能是最初鉴定的结构域的任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD由该多肽的可溶性胞外域序列组成，不含跨膜域和胞质或胞内域(且不与膜结合)。具体的Apo-2L/TRAIL胞外域序列记载于PCT公开号WO 97/01633和WO97/25428。
术语“Apo2L/TRAIL单体”或“Apo2L单体”指Apo2L的胞外域序列的共价链。
术语“Apo2L/TRAIL二聚体”或“Apo2L二聚体”指通过二硫键以共价连接相连的两个Apo-2L单体。该术语在用于本文时包括游离存在的Apo2L二聚体和Apo2L三聚体形式内的Apo2L二聚体(即与另一个、第三个Apo2L单体结合)。
术语“Apo2L/TRAIL三聚体”或“Apo2L三聚体”指非共价结合的三个Apo2L单体。
术语“Apo2L/TRAIL聚集体”用于指自结合的较高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL，诸如Apo2L/TRAIL三聚体，它们形成例如六聚体和九聚体形式的Apo2L/TRAIL。可采用本领域知道的方法和测定法(并使用商品化材料)，诸如天然大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸钠的变性大小排阻(“SDS-SEC”)、反相HPLC和毛细管电泳来测定Apo2L/TRAIL单体、二聚体或三聚体(或其它聚集体)的存在和数量。
“Apo-2配体受体”包括本领域称作“DR4”和“DR5”的受体，其多核苷酸和多肽序列分别显示于图2和3。Pan等人描述了称作“DR4”的TNF受体家族成员(Pan et al.，Science，276：111-113(1997)；WO 98/32856，公开于1998年7月30日；WO 99/37684，公开于1999年7月29日；WO 00/73349，公开于2000年12月7日；US 6,433,147，授权于2002年8月13日；US 6,461,823，授权于2002年10月8日；US 6,342,383，授权于2002年1月29日)。Sheridan等人(Science，277：818-821(1997))和Pan等人(Science，277：815-818(1997))描述了Apo2L/TRAIL的另一种受体(还可参见WO 98/51793，公开于1998年11月19日；WO 98/41629，公开于1998年9月24日)。此受体称作DR5(该受体还可称作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER；Screatonet al.，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak et al.，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu et al.，Nature Genetics，17：141-143(1997)；WO 98/35986，公开于1998年8月20日；EP 870,827，公开于1998年10月14日；WO 98/46643，公开于1998年10月22日；WO 99/02653，公开于1999年1月21日；WO99/09165，公开于1999年2月25日；WO 99/11791，公开于1999年3月11日；US 2002/0072091，公开于2002年8月13日；US 2002/0098550，公开于2001年12月7日；US6,313,269，授权于2001年12月6日；US 2001/0010924，公开于2001年8月2日；US 2003/01255540，公开于2003年7月3日；US 2002/0160446，公开于2002年10月31日；US 2002/0048785，公开于2002年4月25日；US 6,569,642，授权于2003年5月27日；US 6,072,047，授权于2000年6月6日；US 6,642,358，授权于2003年11月4日)。如上所述，Apo-2L的其它受体包括DcR1、DcR2和OPG(参见Sheridan et al.，见上文；Marsters et al.，见上文；Simonet et al.，见上文)。术语“Apo-2L受体”在用于本文时涵盖天然序列受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物包括人中表达的Apo-2L受体。Apo-2L受体可以是内源表达的，如在多种人组织谱系中天然发生的，或者可以是通过重组或合成方法表达的。“天然序列Apo-2L受体”包括与衍生自自然界的Apo-2L受体具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列Apo-2L受体可以具有来自任何哺乳动物的天然存在Apo-2L受体的氨基酸序列。此类天然序列Apo-2L受体可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段生产。术语“天然序列Apo-2L受体”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的受体(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。受体变体可包括天然序列Apo-2L受体的片段或删除突变体。图3A显示了1998年11月19日公开的WO 98/51793中披露的411个氨基酸的人DR5序列。本领域知道人DR5的一种转录剪接变体。此DR5剪接变体编码图3B和3C所示1998年8月20日公开的WO 98/35986中披露的440个氨基酸的人DR5序列。
“死亡受体抗体”在用于本文时通常指针对肿瘤坏死因子受体超家族中的、包含能够发出凋亡信号的死亡结构域的受体的抗体，这样的抗体包括DR5抗体和DR4抗体。
“DR5受体抗体”、“DR5抗体”或“抗DR5抗体”以广义使用，指结合至少一种形式的DR5受体(诸如图3A所示1-411序列或图3B-3C所示1-440序列)或其胞外域的抗体。任选的是，DR5抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是，异源序列容许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。任选的是，DR5抗体结合DR5受体但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR4、DcR1或DcR2)结合或发生交叉反应。任选的是，该抗体是DR5信号活性的激动剂。
任选的是，根据BIAcore结合测定法的测量，本发明的DR5抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR5受体。任选的是，根据BIAcore结合测定法的测量，本发明的DR5抗体呈现出约0.6nM到约18mM的Ic50值。
“DR4受体抗体”、“DR4抗体”或“抗DR4抗体”以广义使用，指结合至少一种形式的DR4受体或其胞外域的抗体。任选的是，DR4抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是，异源序列允许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。任选的是，DR4抗体结合DR4受体但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR5、DcR1或DcR2)结合或发生交叉反应。任选的是，该抗体是DR4信号活性的激动剂。
任选的是，根据BIAcore结合测定法的测量，本发明的DR4抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR4受体。任选的是，根据BIAcore结合测定法的测量，本发明的DR4抗体呈现出约0.6nM到约18mM的Ic50值。
术语“激动剂”以最广义使用，包括在体外、原位或在体内部分或完全增强、刺激或激活Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一种或多种生物学活性的任何分子。此类生物学活性的例子有Apo2L/TRAIL结合DR4或DR5，包括凋亡以及文献中报道的其它活性。激动剂可以直接或间接方式起作用。例如，激动剂可以在体外、原位或在体内由于其直接结合DR4或DR5从而引起受体活化或信号转导的结果，从而部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。激动剂还可以在体外、原位或在体内由于例如刺激另一种效应分子继而引起DR4或DR5活化或信号转导的结果而间接地部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。设想了激动剂可作为间接起作用的分子来增强或提高DR4或DR5活化或活性的增强分子。例如，激动剂可增强哺乳动物中内源Apo-2L的活性。这可通过例如预复合DR4或DR5或者通过稳定各自配体与DR4或DR5受体的复合物(诸如稳定Apo-2L与DR4或DR5之间形成的天然复合物)来实现。
术语“生物标志物”作用于本申请时一般指其在哺乳动物组织或细胞中/上的表达可以通过标准方法(或本文所披露的方法)来检测且预示哺乳动物组织或细胞对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的敏感性的分子，包括基因、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。本发明所设想的此类生物标志物包括但不限于GalNac-T蛋白质家族中的分子。人N-乙酰半乳糖胺基转移酶(“GalNac-T”)基因和蛋白质家族的成员已有记载(参见例如Hang等，“The chemistry andbiology of mucin-type O-linked glycosylation initiated by the polypeptideN-acetyl-_-galactosaminyltransferases”，Bioorganic & Medicinal Chemistry(available May 2005 at www.sciencedirect.com)及其引用的参考文献；Wang etal.，BBRC，300：738-744(2003)及其引用的参考文献)，而且认为它在决定蛋白质中O-连接糖链的数目和位置中起作用。任选的是，此类生物标志物的表达测定出高于在对照组织或细胞样品中所观察到的。任选的是，例如，此类生物标志物的表达将使用基因表达微阵列、定量PCR或免疫组织化学(IHC)测定法来测定。任选的是，在测试组织或细胞样品中检测出的GalNac-T生物标志物(诸如GalNac-T14或GalNac-T3)表达水平比在对照组织或细胞样品中所观察到的高至少750倍(通过Affymetrix U133P微阵列分析来测量)或者高500倍或优选至少1000倍(使用定量PCR来检测生物标志物的表达)。
“UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶-T14”、“pp-GalNac-T14”、“GalNac-T14”、“GALNT14”在本文中用于指具有包含N-端胞质结构域、跨膜结构域、主干区(stem region)和催化域的GalNac-T分子家族的特征性特征的II型成员蛋白质。在一个任选的实施方案中，人GalNac-T14分子包含1659个碱基对，编码552个氨基酸的蛋白质，如图4A所示。全长人cDNA已经保藏于GenBank，编号AB078144。如文献中所披露的(Wang et al.，BBRC，300：738-744(2003))，已经鉴定了包含(或不包含)特定外显子(诸如外显子2、3和/或4)的GalNac-T14剪接异构体。本申请设想了检验GalNac-T14的任何所述各种异构体的表达，而任何一种所述异构体的表达预示哺乳动物组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的敏感性。
“UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶-T3”、“pp-GalNac-T3”、“GalNac-T3”、“GALNT3”在本文中用于指具有包含N-端胞质结构域、跨膜结构域、主干区和催化域的GalNac-T分子家族的特征性特征的II型成员蛋白质。在一个任选的实施方案中，人GalNac-T3多肽包含图4B所示氨基酸序列。GalNac-T3进一步记载于Bennett et al.，J.Biol.Chemistry，271：17006-17012(1996)。
“受试者”或“患者”指需要治疗的任何单个受试者，包括人。还意图作为受试者包括的有参加临床研究试验而没有显示出任何疾病临床体征的任何受试者、参加流行病学研究的受试者、或作为对照的受试者。
术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何哺乳动物，包括人、牛、马、犬和猫。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物指人。
“组织或细胞样品”指从受试者或患者的组织得到的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品还可以是原代的或培养的细胞或细胞系。任选的是，组织或细胞样品是从原发性或转移性肿瘤得到的。组织样品可能包含在自然界中天然不与所述组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析，前提是应当了解，本发明包括将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。
“相关(correlate)”或“关联”指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。就本发明的各个实施方案而言，可以使用分析性测定法(诸如mRNA表达或IHC)的结果来决定是否应当实施使用Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的特定治疗方案。
“核酸”意图包括任何DNA或RNA，例如组织样品中存在的染色体、线粒体、病毒和/或细菌核酸。术语“核酸”涵盖双链核酸分子的两条链或其中之一，并且包括完整核酸分子的任何片段或部分。
“基因”意指在编码或转录蛋白质或调控其它基因表达方面具有功能性作用的任何核酸序列或其部分。所述基因可以完全由负责编码功能性蛋白质的核酸组成，或者只有负责编码或表达蛋白质的部分核酸。核酸序列可以在基因的外显子、内含子、起始或终止区、启动子序列、其它调控序列或独特邻近区中包含遗传异常。
术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)，及抗体片段，只要它们展现所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，而另一端是一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区或互补决定区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区而连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据抗体重链恒定区氨基酸序列，可将其归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。另外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在它们是通过杂交瘤培养合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现所需生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒(baboon)、恒河猴(rhesus)或猕猴(cynomolgus monkey)等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
“结合”目的抗原的抗体指能够以足够亲和力和/或亲合力结合抗原的抗体，使得该抗体可作为治疗剂或诊断剂用于靶向表达该抗原的细胞。
为了本发明，“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法，其中抗体可以是未偶联的或“裸的”抗体，或者抗体可以偶联或融合有异源分子或试剂，诸如一种或多种细胞毒剂，由此产生“免疫偶联物”。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
表述“有效量”指有效预防、改善或治疗所讨论疾病或状况的药剂(例如Apo2L/TRAIL、抗DR4或DR5抗体等)的量。
术语“处理”、“治疗”和“疗法”在用于本文时指治疗性处理、预防性处理、和防范性处理。连续治疗或施用指以至少每天一次为基础、期间没有中断一天或多天的处理。间歇治疗或施用或者间歇方式的治疗或施用指本质上并非连续而是循环的处理。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ΦI1，参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；dynemicin包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(AdriamycinTM)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL
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，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他塞(docetaxel)(TAXOTERE Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GemzarTM)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)(NavelbineTM)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FarestonTM)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaceTM)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RivisorTM)、来曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿那曲唑(anastrozole)(ArimidexTM)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是过表达本文中所鉴定的任何基因的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂是显著降低处于S期的过表达所述基因的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami et al.，WB Saunders，Philadelphia(1995)，尤其是第13页。
术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用，指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡，通常伴随着一种或多种特征性细胞变化，包括细胞质浓缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失。例如可以通过本领域已知的细胞存活力测定法(例如Alamar蓝测定法或MTT测定法)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(参见例如Nicoletti et al.，J.Immunol.Methods 139：271-279(1991))、及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、切割测定法来测定和测量这种活性。
在用于本文时，术语“病症”一般指将会从使用本文中所描述的组合物进行的处理中获益的任何疾患，包括可以用有效量的Apo2L/TRAIL、抗DR4抗体和/或抗DR5抗体来治疗的任何疾病或病症。这包括慢性和急性病症，以及那些使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。待治疗病症的非限制性例子包括良性和恶性癌症；炎性、血管发生性和免疫学病症、自身免疫性病症、关节炎(包括类风湿性关节炎)、多发性硬化及HIV/AIDS。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性肿瘤”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、胃肠(道)癌、肾的癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、及头和颈癌。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、和免疫缺陷病。在可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子中，有些是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏反应性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。感染性疾病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌感染、原虫感染和寄生虫感染。
“自身免疫病”在本文中以广义、一般意义使用，指哺乳动物中因哺乳动物个体对其自身组织组分的体液或细胞免疫应答而破坏正常或健康组织的病症或疾患。例子包括但不限于红斑狼疮、甲状腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、自身免疫性糖尿病和炎性肠病(IBD)。
术语“标记的”和“带标签的”在用于本文时指包含抗体或多肽且其与“标签多肽”融合的嵌合分子。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体或者提供一些其它功能诸如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉链结构域的肽所发生的)，但又足够短使得其不干扰所述抗体或多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得标签特异性抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常约8个到约50个氨基酸残基之间(优选约10个到约20个残基之间)。
术语“二价金属离子”指具有两个正电荷的金属离子。二价金属离子的例子包括但不限于锌、钴、镍、镉、镁和锰。可采用的此类金属的具体形式包括盐形式(例如药学可接受盐形式)，诸如上述二价金属离子的氯化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐形式。任选的是，用于本发明的二价金属离子是锌，优选盐形式，硫酸锌或氯化锌。
“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种肽或蛋白质时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的成分分开和/或回收的肽或蛋白质。肽或蛋白质的天然环境的污染性成分指通常会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将肽或蛋白质纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质，或(3)根据质谱或肽作图技术，达到同质。既然肽或蛋白质的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的物质包括重组细胞内的原位肽或蛋白质。然而，分离的肽或蛋白质通常通过至少一个纯化步骤来制备。
关于本文中所鉴定的序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性。本领域技术人员可决定测量序列对比的适宜参数，包括指派对所比较的全长序列获得最大对比所需的算法。为了本发明，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得百分比氨基酸序列同一性值，ALIGN-2程序由Genentech公司编写，其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington，DC，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易地确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers(1995)。
“高严格性条件”，如本文中所定义的，通过如下各项定义：(1)采用低离子强度和高温进行清洗；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂；50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中清洗，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。
“中等严格条件”可以如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York，Cold Spring Harbor Press(1989)中所述鉴定，包括于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“引物”指与互补RNA或DNA靶多核苷酸杂交并充当通过核苷酸转移酶的作用从单核苷酸逐步合成多核苷酸的起点(如例如聚合酶链反应中所发生的)的寡核苷酸序列。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导序列(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。活化受体FcγRIIA在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
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Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(neonatal receptor)，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)；Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。FcR在本文中包括多态性，诸如编码FcγRIIIa的基因中的遗传二态性，它导致位于受体结合IgG1的区域中的氨基酸第158位为苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。纯合缬氨酸FcγRIIIa(FcγIIIa-158V)已经在体外显示出相对于纯合苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合(FcγIIIa-158F/V)受体具有更高的对人IgG1的亲和力且介导提高的ADCC。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的。
II.本发明的例示方法和材料
本文所公开的方法和测定法涉及检验哺乳动物组织或细胞样品中一种或多种生物标志物的表达，其中一种或多种所述生物标志物的表达的确定预示或指示所述组织或细胞样品是否将对药剂诸如Apo2L/TRAIL和/或死亡受体抗体诸如抗DR5激动剂抗体或抗DR4激动剂抗体敏感。所述方法和测定法包括那些检验GalNac-T分子家族成员(包括GalNac-T14和GalNac-T3)的表达的方法和测定法。
如上文所讨论的，一些患病人类细胞类型的群体(诸如某些癌细胞群体)对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的细胞死亡诱导效应耐受。因此相信本文所公开的方法和测定法可提供方便、高效且潜在经济的(cost-effective)手段，来获得有用的数据和信息用于评估治疗患者的适宜的或有效的疗法。例如，已经诊断为患有癌症或免疫相关疾患的患者可以进行活检以获得组织或细胞样品，然后通过多种体外测定法检验该样品以确定该患者的细胞是否会对治疗剂诸如Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体敏感。
本发明提供了预测哺乳动物组织或细胞样品(诸如癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体的敏感性的方法。任选的是，获得哺乳动物组织或细胞样品并检验GalNac-T14表达。这些方法可使用多种测定法格式进行，包括检测mRNA表达的测定法、检测蛋白质表达的测定法(诸如免疫组织化学测定法)、和检测酶UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶活性的生化测定法。所述组织或细胞中/上所述GalNac-T14生物标志物表达的确定预示所述组织或细胞将对Apo2L/TRAIL和/或死亡受体抗体的生物学效应敏感。申请人惊讶的发现，GalNac-T14的表达与这些组织和细胞对Apo2L/TRAIL和死亡受体激动剂抗体的敏感性相关。
如下所述，样品中多种生物标志物诸如GalNac-T14的表达可以用多种方法来分析，其中很多是本领域已知并为本领域技术人员所理解的，包括但不限于免疫组化和/或Western分析、定量的基于血液的测定法(例如血清ELISA)(例如用来检验蛋白质表达水平)、生化酶活性测定法、原位杂交、mRNA的Northern分析和/或PCR分析、和基因组Southern分析(例如用来检验基因缺失或扩增)，以及多种可通过基因和/或组织阵列分析进行的测定法中的任何一种。评估基因和基因产物状况的典型规程可见例如Ausubel等人编，1995，Current Protocols In Molecular Biology，第2单元(Northern印迹)、第4单元(Southern印迹)、第15单元(免疫印迹)和第18单元(PCR分析)。
为了举例说明，下面提供了涉及样品中GalNac-T14检测的规程。
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本发明的任选方法包括检验或测试哺乳动物组织或细胞样品中GalNac-T14存在的规程。可以采用多种方法来检测GalNac-T14，包括例如免疫组化分析、免疫沉淀、Western印迹分析、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选术(FACS)、和免疫沉淀接着MS、单糖分析。例如，检测组织或细胞样品中GalNac-T14表达的任选方法包括将样品与抗GalNac-T14抗体接触，然后检测该抗体对样品中GalNac-T14的结合。
在本发明的具体实施方案中，使用免疫组化和染色规程来检验样品中GalNac-T14的表达。组织切片的免疫组化染色已经证明是评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组化(IHC)技术利用抗体来原位探查和显现细胞抗原，通常利用生色或荧光方法。
样品的制备可以使用来自哺乳动物(通常为人类患者)的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于癌细胞，诸如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤和白血病的细胞。任选的是，样品包括非小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞或非何杰金氏淋巴瘤细胞。样品可以通过本领域已知的多种规程获得，包括但不限于手术切除、穿刺抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品固定和包埋在石蜡等中。
组织样品可以用常规方法固定(即保存)(见例如“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，第3版(1960)LeeG.Luna，HT(ASCP)编，The Blakston Division McGraw-Hill Book Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology Advanced LaboratoryMethods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel编，Armed ForcesInstitute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.)。本领域技术人员将理解，固定剂的选择取决于对该样品作组织学染色或其它分析的目的。本领域技术人员还将理解，固定的时间长短依赖于组织样品的大小和所用的固定剂。举例而言，中性缓冲的福尔马林、布安固定液(Bouin’s)或低聚甲醛都可以用来固定样品。
一般而言，首先将样品固定，然后通过递增系列浓度的醇脱水，用石蜡或其它切片介质浸润和包埋，使组织样品可切片。或者，可以将组织切片，并固定所得的切片。举例而言，可以通过常规方法将组织样品在石蜡中包埋和加工(见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology”，同上)。可使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，则可用切片机等将样品切片(见例如“Manual of Histological Staining Method ofthe Armed Forces Institute ofPathology”，同上)。举例而言，对于这种规程，切片厚度的范围可以为约3微米到约5微米。一旦切片，即可使用多种标准方法将切片附着至载玻片。载玻片粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸等。例如，石蜡包埋切片可以附着于带正电荷的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。
如果包埋材料使用的是石蜡，那么组织切片通常脱石蜡并用水重新水化。组织切片可以用数种常规标准方法脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐降低的系列浓度的醇(见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，同上)。或者，可以使用市售的非有机脱石蜡剂，诸如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。
任选的是，制备样品以后，可使用IHC分析组织切片。IHC可以与别的技术诸如形态学染色和/或荧光原位杂交联合使用。可用的IHC一般方法有两种：直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原(例如GalNac-T14)的结合。该直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标记或酶标记的一抗(primary antibody)，其无需进一步抗体相互作用即可显现。在典型的间接测定法中，未偶联的一抗结合至抗原，然后经过标记的二抗(secondary antibody)结合至该一抗。在二抗与酶标记物偶联的情况下，加入生色或荧光底物以显现抗原。由于数个二抗可与一抗上的不同表位反应，产生信号的放大。
免疫组化所用的一抗和/或二抗通常用可检测的成分(moiety)标记。可用的标记物很多，通常可以分为下面几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可以使用CurrentProtocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等人编，Wiley-Interscience，NewYork，New York，Pubs.(1991)中描述的技术用放射性同位素标记抗体，放射性可以用闪烁计数法测量。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记物，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹磺酰、丽丝胺(Lissamine)、伞形酮、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻蓝蛋白、或市售的荧光团诸如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述一种或多种的衍生物。荧光标记物可以使用例如Current Protocols in Immunology，同上中公开的技术与抗体偶联。荧光可以用荧光计定量。
(d)可用的酶底物标记物有很多，美国专利4,275,149综述了其中的一些。酶通常催化生色底物发生可以用多种技术测量的化学改变。例如，酶可催化底物中的颜色变化，该变化可以用分光光度法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应成为电子激发状态，然后可发射可测量(例如使用化学发光测量仪)的光，或者将能量供给荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶偶联到抗体的技术见O′Sullivan等人，Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，于Methods in Enzym.中(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press，NewYork，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)及底物过氧化氢，其中过氧化氢氧化染料前体(例如正苯二胺(OPD)或盐酸3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)及生色底物对-磷酸硝基苯酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
对本领域技术人员而言可用的其它酶-底物组合有很多。关于这些的一般性综述可参见美国专利4,275,149和4,318,980。有时，标记物和抗体是间接偶联的。本领域技术人员可知道多种实现此目的的技术。例如，可以将抗体和生物素偶联，并将上述四大类标记物中的任意标记物与亲合素偶联，反之亦然。生物素选择性的与亲合素结合，这样所述标记物就可以间接的与所述抗体偶联。或者，为了实现标记物和抗体的间接偶联，将抗体与小的半抗原偶联，将上述不同类型标记物中的一种与抗半抗原抗体偶联。这样，可实现所述标记物与抗体的间接偶联。
除了上面讨论的样品制备方法，可能需要在IHC之前、之中或之后进一步处理组织切片。例如，可进行表位修复(epitope retrieval)方法，诸如在柠檬酸缓冲液中加热组织样品(见例如Leong等人，Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适的条件下以充分的时间暴露于一抗，使得一抗结合组织样品中的靶蛋白质抗原。实现这一点的适宜条件可以通过常规实验来确定。通过使用上述任一种可检测标记物来测定抗体结合样品的程度。优选的是，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生色底物诸如3，3’-二氨基联苯胺生色团的化学变化。优选的是，所述酶标记物与特异性结合一抗的抗体偶联(例如，一抗是兔多克隆抗体，二抗是山羊抗兔抗体)。
任选的是，IHC分析中用来检测GalNac-T14表达的抗体是抗GalNac-T14抗体。或者，可以采用与GalNac-T14具有交叉反应性的其它GalNac-T抗原的抗体。任选的是，所述抗GalNac-T14抗体是单克隆抗体。
这样制备的标本可以封固并加盖玻片。然后对样品进行评估，例如使用显微镜，而且可以使用本领域常规使用的染色强度标准。可以如下评估染色强度标准：
表1
染色情况 得分
细胞中未观察到染色 0
在多于10％的细胞中检测到微弱/几乎无法察觉的染色 1+
在多于10％的细胞中观察到微弱到中等的染色 2+
在多于10％的细胞中观察到中等到强烈的染色 3+
典型地，在这样的IHC测定法中，2+左右或更高的染色得分被认为预示或指示哺乳动物细胞(诸如哺乳动物癌细胞)对Apo2L/TRAIL或死亡受体激动剂抗体敏感。
在备选的方法中，可以使样品与所述生物标志物特异性的抗体在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下接触，然后检测所述复合物。生物标志物的存在可以通过多种方式检测，诸如通过Western印迹(有或无免疫沉淀)和ELISA规程来测定多种组织和细胞样品，包括血浆或血清。使用这样的测定法格式的免疫测定技术有很多，参见例如美国专利4,016,043；4,424,279和4,018,653。上述这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法还包括经过标记的抗体直接结合靶生物标志物。
夹心测定法是最有用和最常用的测定法之一。夹心测定技术存在多种变化形式，本发明意图涵盖所有这些变化形式。简言之，在典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定在固相支持物上，将待测试的样品与所结合的分子接触。在一段合适时间的温育后，其中温育时间足以允许抗体-抗原复合物的形成，加入对所述抗原特异性的、且已用能够产生可检测信号的报道分子标记的二抗，并温育，提供充分的时间供另一抗体-抗原-标记抗体的复合物形成。洗去任何未反应的物质，然后通过观察报道分子所产生的信号来测定抗原的存在。这些结果可以是通过简单观察可视信号而得到的定性结果，也可以是通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较而定量得到的结果。
正向测定法的变化形式包括同时测定法(simultaneous assay)，其中将样品和经过标记的抗体同时施加于所结合的抗体。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的，包括显而易见的任何微小变化。在典型的正向夹心测定法中，对生物标志物具有特异性的一抗共价或被动结合至固相表面。固相表面通常是玻璃或聚合物，其中最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物的形式可以是管、珠、微量培养板的盘、或任何其它适于实施免疫测定法的表面。结合过程是本领域众所周知的，一般由交联共价结合或物理吸附组成，在制备测试样品的过程中洗涤聚合物-抗体复合物。然后将等份待测样品施加于固相复合物并在合适的条件下(例如从室温到40℃，诸如25℃到32℃之间(含二端点))温育足够的时间(例如2-40分钟或者过夜，如果更方便的话)以允许抗体中存在的任何亚基的结合。温育阶段以后，将抗体亚基固相洗涤并干燥，并与所述生物标志物的一部分特异的二抗温育。二抗与报道分子连接，报道分子用来表征该二抗与该分子标志物的结合。
一种备选方法涉及将样品中的靶生物标志物固定，然后将所固定的靶暴露于特异性的抗体，该抗体可以用也可以不用报道分子标记。依赖于靶的量和报道分子信号的强度，所结合的靶可通过用抗体直接标记而得以检测。或者，将经过标记的、对一抗特异性的二抗暴露于靶-一抗复合物，形成靶-一抗-二抗三元复合物。通过报道分子发出的信号来检测该复合物。“报道分子”在用于本说明书时指这样的分子，其由于自身化学性质而提供可分析鉴定的信号，该信号使结合抗原的抗体能够被检测。在这种类型的测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)、和化学发光的分子。
在酶免疫测定法的情况中，酶与二抗偶联，一般是通过戊二醛或高碘酸盐偶联。但是很容易认识到，存在本领域技术人员容易得到的多种不同的偶联技术。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。通常，选择在特定酶水解时产生可检测的颜色变化的底物来与相应的酶一起使用。合适的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述的生色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体施加于一抗-分子标志物复合物，让其结合，然后洗去多余的试剂。然后向抗体-抗原-抗体复合物施加含有合适底物的溶液。底物将与二抗所连接的酶反应，产生定性的可视信号，该信号可以进一步定量，通常通过分光光度法，用来指示样品中存在的生物标志物的量。或者，可以将荧光化合物，诸如荧光素和罗丹明，化学偶联到抗体上，而不影响其结合能力。当受特定波长的光照射而被活化时，荧光团标记的抗体吸收光能，诱导分子的激发状态，然后发射可以用光学显微镜视觉检测的特征性颜色的光。如酶免疫测定法(EIA)中那样，让荧光标记的抗体与一抗-分子标志物复合物结合。洗去未结合的试剂后，再将余下的三元复合物暴露于合适波长的光，观察到的荧光指示目的分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域都是非常成熟的。然而，其它的报道分子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子，也可以使用。
设想了上述技术也可以用来检测GalNac-T14的表达。
本发明的方法还包括检验组织或细胞样品中GalNac-T14 mRNA的存在和/或表达的规程。评估细胞中mRNA的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经过标记的GalNac-T14核糖核酸探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和多种核酸扩增测定法(诸如使用GalNac-T14特异性的互补引物的RT-PCR和其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等)。
可以使用Northern、斑点印迹或PCR分析方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定例如GalNac-T14 mRNA。例如，RT-PCR测定法诸如定量PCR测定法是本领域众所周知的。在本发明的一个说明性实施方案中，一种检测生物学样品中GalNac-T14 mRNA的方法包括：使用至少一种引物通过逆转录从该样品产生cDNA；使用GalNac-T14多核苷酸作为有义和反义引物扩增所产生的cDNA以扩增其中的GalNac-T14 cDNA；并检测所扩增的GalNac-T14cDNA的存在。另外，这样的方法可包括一个或多个可确定生物学样品中GalNac-T14 mRNA水平的步骤(例如通过同时检验比较性对照“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的mRNA序列水平)。任选的是，可以测定所扩增的GalNac-T14 cDNA的序列。
本发明的这个方面的材料实例包括GalNac-T14引物和引物对(其允许特异性扩增本发明的多核苷酸或其任意特定的部分)以及选择性的或特异性的与本发明的核酸分子或其任意部分杂交的探针。探针可以用可检测的标志物例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或酶来标记。这样的探针和引物可以用来检测样品中GalNac-T14多核苷酸的存在，及作为检测表达GalNac-T14蛋白的细胞的手段。如本领域技术人员了解的，基于本文提供的序列可以制备很多种不同的引物和探针，用来有效扩增、克隆和/或测定GalNac-T14 mRNA的存在和/或水平。
本发明的任选方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中的mRNA，诸如GalNac-T14 mRNA的规程。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品进行逆转录和标记，以生成cDNA探针。然后将这些探针与固定在固相支持物上的核酸阵列杂交。该阵列这样配置，使阵列的每个成员的序列和位置都是已知的。例如，可以用一组选定的可能在某些疾病状态中表达的基因在固相支持物上形成阵列。经过标记的探针与特定的阵列成员发生杂交表明衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达的分析可提供有价值的信息。微阵列技术使用核酸杂交技术和计算技术在单次实验中评估数以千计的基因的mRNA表达序型(profile)(参见例如2001年10月11日公开的WO 01/75166；制备阵列的讨论可参见例如美国专利5,700,637；美国专利5,445,934和美国专利5,807,522；Lockart，NatureBiotechnology，14：1675-1680(1996)；Cheung，V.G.等人，Nature Genetics21(Suppl)：15-19(1999))。DNA微阵列是含有基因片段的微型阵列，这些基因片段或是直接合成到玻璃或其它支持物上，或是点样到玻璃或其它支持物上。单个阵列中通常呈现数以千计的基因。典型的微阵列实验涉及下面的步骤：1.由从样品分离的RNA制备荧光标记的靶物，2.经过标记的靶物与微阵列杂交，3.洗涤，染色，并扫描阵列，4.分析扫描的图像，和5.生成基因表达序型。目前有两种类型的DNA微阵列在使用：寡核苷酸(通常是25聚物至70个核苷酸的寡聚物)阵列和含有从cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列。形成阵列时，寡核苷酸可以预先合成再点样到表面上，或者直接在表面上(原位)合成。
Affymetrix GeneChip系统是一种市售的微阵列系统，其包含通过直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制造的阵列。探针/基因阵列：通过联合基于半导体的光刻和固相化学合成技术，将通常为25聚物的寡核苷酸直接合成在玻璃晶片上。每个阵列含有多达400,000种不同的寡聚物，每种寡聚物以数以百万计的拷贝数存在。由于寡核苷酸探针是在阵列上的已知位置合成的，使用Affymetrix Microarray Suite软件，杂交样式和信号强度可以在基因的身份和相对表达水平方面进行解析。每种基因在该阵列上由一系列的不同寡核苷酸探针所代表。每个探针对由一完全匹配的寡核苷酸和一错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有与特定基因完全互补的序列，由此测量该基因的表达。错配的探针和完全匹配的探针的不同之处在于中心碱基位置有单个碱基的替代，干扰了靶基因转录物的结合。这有助于确定对完全匹配的寡聚物测得的信号有影响的背景和非特异性杂交。该Microarray Suite软件从完全匹配的探针的杂交强度中减去错配探针的杂交强度，以确定每个探针组的绝对强度或比强度值(specific intensity value)。探针是基于Genbank和其它核苷酸库的现有信息来选择的。这些序列被认为识别基因3’端的独特区域。使用GeneChip杂交炉(“rotisserie”炉)进行一次多达64个阵列的杂交。射流工作站(fluidics station)执行探针阵列的洗涤和染色。它是完全自动化的，包括四个组件，每个组件持有一个探针阵列。每个组件通过Microarray Suite软件使用预编程的射流规程进行独立控制。扫描装置是共聚焦激光扫描仪，其测量与探针阵列结合的标记cDNA所发射的荧光的强度。配备Microarray Suite软件的计算机工作站控制所述射流工作站和扫描仪。Microarray Suite软件使用为探针阵列预编程的杂交、洗涤和染色规程可控制多达8个射流工作站。该软件还采集杂交强度信号并通过合适的算法将其转换为每个基因的有/无判定。最后，该软件通过比较分析检测实验之间基因表达的变化，并以.txt文件的格式输出，该文件可以供其它软件程序用来进行进一步的数据分析。
荧光原位杂交(FISH)测定法还可用于使用经标记探针来检测生物标志物mRNA的表达。这样的测定法是本领域已知的(参见例如Kallioniemi et al.，1992；美国专利6,358,682)。
所选的生物标志物的表达也可以通过检验基因缺失或基因扩增来评估。基因缺失或扩增可以通过本领域已知的多种规程中的任一种来测量，例如通过使用合适标记探针进行的常规Southern印迹、Northern印迹以定量mRNA的转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交(例如FISH)、使用合适标记探针进行的比较基因组杂交(CGH)或细胞遗传学方法。例如，可以使用这些方法来检测GalNac-T14基因的缺失或扩增。
另外，可以检验组织或细胞样品中生物标志物诸如GalNac-T14基因的甲基化状态。永生化和转化细胞中基因5’调控区经常发生CpG岛的异常去甲基化和/或过度甲基化，并可能造成多种基因的表达改变。本领域中有很多检验基因甲基化状态的测定法是众所周知的。例如，在Southern杂交方法中，可以使用甲基化敏感的限制酶来评估CpG岛的甲基化状态，该酶不能切割含甲基化CpG位点的序列。另外，MSP(甲基化特异PCR)可以容易地描述给定基因的CpG岛中的所有CpG位点的甲基化状态。该方法包括首先用亚硫酸氢钠修饰DNA(这将把所有非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶)，然后用甲基化DNA特异性(相对于非甲基化DNA)的引物扩增。涉及甲基化干扰的规程还可以参见例如下列文献：Current Protocols In Molecular Biology，第12单元，Frederick M.Ausubel等人编，1995；De Marzo等人，Am.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999)；Brooks等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7：531-536)；及Lethe等人，Int.J.Cancer 76(6)：903-908(1998)。
GalNac-T14在组织或细胞样品中的表达也可以通过基于功能或活性的测定法来检验。例如，可以进行本领域已知的测定法来测定或检测组织或细胞样品中特定酶N-乙酰半乳糖胺基转移酶活性的存在(参见例如Bennett et al.，J.Biol.Chem.，271：17006-17012(1996)；Wang et al.，BBRC，300：738-744(2003)；Hang et al.，supra，available May 2005 at www.sciencedirect.com)。
在本发明的方法中，设想了还可以检验组织或细胞样品中Apo2L/TRAIL的表达或结合Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的受体的表达。如上所述和本领域已知的，目前认为Apo2L/TRAIL结合至少五种不同的受体：DR4、DR5、DcR1、DcR2和OPG。使用本领域已知的方法，包括本文描述的方法，可以在mRNA水平和蛋白质水平检测Apo2L/TRAIL、DR4、DR5、DcR1、DcR2和/或OPG的表达。例如，可以使用上面描述的IHC技术来检测样品中一种或多种所述分子的存在。设想了对于不但检验组织或样品中GalNac-T14标志物的存在，还检验例如DR4、DR5或DcR1的存在的方法，可以从相同的组织或样品制备不同的玻片，并用对各种特定的生物标志物或受体特异性的试剂来测试各个玻片。或者，可以从组织或细胞样品制备单个玻片，并使用针对各种生物标志物或受体的抗体进行多色染色程序(multi-color staining protocol)，从而得以显现和检测各种生物标志物或受体。
设想了，在确定了组织或细胞样品表达指示该组织或细胞样品对Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体敏感的GalNac-T14以后，可以对哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体来治疗病症，诸如该哺乳动物正患有的癌症或免疫相关病症。哺乳动物中本文所述的多种病理状态的诊断可以由熟练从业人员进行。诊断技术是本领域已知的，其允许例如诊断或检测哺乳动物中的癌症或免疫相关疾病。例如，癌症可以通过包括但不限于扣诊、血液分析、x射线、NMR等技术来鉴定。免疫相关疾病也可以容易地鉴定。
Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体可以根据已知方法来施用，诸如推注(bolus)或一段时间连续输注形式的静脉内施用、经由肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。任选的是，施用可以使用多种市售装置通过微型泵(mini-pump)进行。
施用Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的有效剂量和方案可以凭经验确定，做出这样的决定在本领域技术范围之内。可以使用单个或多个剂量。目前认为，单独使用的Apo2L/TRAIL的有效剂量或量的范围可以为每日约1μg/kg到约100mg/kg体重或更高。剂量的种间缩放(interspecies scaling)可以以本领域已知方式进行，例如Mordenti et al.，Pharmaceut.Res.，8：1351(1991)所公开的。
当采用Apo2L/TRAIL体内施用时，正常剂量的范围可以为每日约10ng/kg到100mg/kg哺乳动物体重或更高，优选约1μg/kg/日到10mg/kg/日，依赖于施用路径。文献中提供了具体的剂量和投递方法的指导，见例如美国专利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。本文预期，不同剂型将对不同治疗化合物和不同病症有效，例如以一种器官或组织为目标的施用可能需要与以另一种器官或组织为目标的施用不同的递送方式。
还设想了所述方法中还可以采用其它疗法。所述一种或多种其它疗法可包括但不限于施用放射疗法、细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法尼基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂、和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，这些是本领域已知的，并且上文有进一步具体限定。设想了所述其它疗法可以作为与Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体分开的药剂使用。另外，还可使用基于靶向肿瘤抗原的治疗性抗体，诸如RituxanTM或HerceptinTM，以及抗血管发生抗体，诸如抗VEGF。
化疗剂的配制和剂量给药方案可以根据制造商的指示或者如熟练从业人员凭经验决定的使用。所述化疗的配制和剂量给药方案还可参见Chemotherapy Service，M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可在Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体施用之前或之后，或与之同时施用。
可能希望还施用针对其它抗原的抗体，诸如结合CD20、CD11a、CD18、CD40、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管内皮生长因子(VEGF)、或其它TNFR家族成员(诸如OPG、TNFR1、TNFR2、GITR、Apo-3、TACI、BCMA、BR3)的抗体。或者/并且，可以对患者共施用结合相同抗原或两种或多种不同抗原的两种或多种抗体。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。施用后，可以分析体外处理的细胞。如果进行了体内处理，可以使用熟练从业人员众所周知的多种方法监测所处理的哺乳动物。例如，可对肿瘤细胞进行病理学检验以测定坏死，或者分析血清以测定免疫系统应答。
本发明还提供了用于上面描述或提示过的用途的试剂盒或制品。这样的试剂盒可包含载体装置，其被分为区室以密闭的容纳一种或多种容器装置，诸如小瓶、管等等。每个容器装置包含上述方法中要使用的不同成分中的一种。例如，容器装置中的一个可包含探针，该探针是或可以是可检测标记的。这样的探针可以是分别对GalNac-T14蛋白或GalNac-T14基因或信使RNA特异性的抗体或多核苷酸。在试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，该试剂盒还可以具有含有核苷酸的容器，该核苷酸用于扩增靶核酸序列，和/或具有包含报道工具的容器，所述报道工具诸如生物素结合蛋白，诸如亲合素或链霉亲合素，其与报道分子诸如酶、荧光或放射性同位素标记物结合。
本发明的试剂盒通常将包括上面描述的容器，和一种或多种其它的容器，这些其它的容器包含从商业和使用者观点看来需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和带使用说明书的包装插页。容器上可能有标签，指示该组合物用于特定的疗法或非治疗性应用，还可以指示体内或体外用途的指导，诸如上面描述的那些用途。
本发明的试剂盒有多个实施方案。一个典型的实施方案是：一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标签、及所述容器内含有的组合物，其中所述组合物包括结合GalNac-T14多肽序列的一抗，所述容器上的标签指示该组合物可用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞中GalNac-T14蛋白的存在，以及使用GalNac-T14抗体评估至少一种类型的哺乳动物细胞中蛋白质存在的指导。该试剂盒可进一步包括用于制备组织样品和将抗体和探针施加于组织样品的相同切片的一套指导和材料。该试剂盒可包括一抗和二抗，其中二抗与标记物偶联，例如酶标记物。
另一个实施方案是：一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标签、及所述容器内含有的组合物，其中所述组合物包括在严格条件下与GalNac-T14多核苷酸互补物(complement)杂交的多核苷酸，所述容器上的标签指示该组合物可用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞中GalNac-T14的存在，以及使用GalNac-T14多核苷酸评估至少一种类型的哺乳动物细胞中GalNac-T14 RNA或DNA存在的指导。
该试剂盒中其它任选组分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等等)、其它试剂诸如被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照玻片等。
实施例
通过下面的实施例进一步描述和例示本发明的各个方面，它们并非意图限制本发明的范围。
方法和材料
细胞培养物和细胞系
以下人细胞系：非小细胞肺癌(NSCLC)系：H2122、A427、H647、SK-MES-1、H838、H358、H2126、H460、H1703、H2405、H650、H1568、H1666、H322T、SW1573、H292、H1650、H522、EKVX、H661、H23、LXFL529、H226、A549、H1781、H1299、HOP 62、H2009、HOP 92、H1793、H1975、H1651、calu-1、H1435、HOP 18、H520、H441、H2030、H1155、H1838、H596、HLFa；胰腺癌系：Panc 05.04、BxPC3、HPAC、SU.86.86、HuP-T3、PSN1、Panc 08.13、MiaPaCa-2、PA-TU-8988T、Panc 03.27、Capan-1、SW 1990、CFPAC-1、PA-TU-8902、Panc 02.03、Panc 04.03、PL45、Aspc-1、Hs766T、Panc 10.05、Panc1、Capan-2、HPAF-II；和NHL：JEKO-1、SU-DHL-4、OCI-LY-19、SR、Farage、DOHH-2、Toledo、WSU-NHL、KARPAS-422、GRANTA-519、Pfeiffer、HT、SC-1、DB。各细胞系来自ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia))、DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganismsand Cell Cultures))、JCRB(日本细胞资源库(Japanese Cell Resources Bank))或ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures))，并在补充有10％热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES的RPMI-1640培养基中培养。
细胞毒性测定法
MTT测定法(CellTiter96
Figure A20068003796000521
非放射性细胞增殖测定法，Promega)是基于可存活细胞将可溶性黄色四唑盐(MTT)还原成蓝色甲(formazan)晶体的能力的一种比色测定法，将其用于测定用Apo2L/TRAIL或DR5抗体处理后可存活细胞的量。为了进行MTT测定法，将预先混合的经优化的染料溶液加至装有各种浓度(0-1000ng/ml)Apo2L/TRAIL或DR5抗体的96孔板的培养孔。在4小时温育期间，活细胞将染料溶液的四唑化合物转变成甲
Figure A20068003796000523
产物。然后将增溶/终止液加至培养孔以溶解甲
Figure A20068003796000524
产物，并使用96孔读板仪(SpectraMax)记录570nm吸光度。570nm吸光度读数与增殖测定法中通常使用的细胞数成正比。尽管甲
Figure A20068003796000525
产物的最大吸光度位于570nm而且纯溶液表现为蓝色，然而测定结束时的颜色可能不是蓝色，取决于培养物培养基中甲
Figure A20068003796000526
相对于其它成分(包括血清、酸化的酚红和未还原的MTT)的存在数量。
通过实施细胞滴定来优化细胞数，用以在测定法线性范围的高末端附近产生测定信号。由于不同细胞类型具有不同代谢活性水平，因此为每种细胞系分开进行。对所检验的大多数肿瘤细胞，使用5,000-20,000个细胞/孔。
下面是所采用的测定法的逐步描述：
1.用于生物测定法的细胞来自原种(stock)培养物。
2.测定细胞数和锥虫蓝存活力，并将细胞悬浮至最终数目为5,000-20,000个细胞/孔。
3.将50μl细胞悬浮液分发入96孔板。
4.将板在增湿的5％CO2气氛中于37℃温育过夜。
5.将50μl含有范围为0-1000ng/ml的各种浓度Apo2L/TRAIL或DR5抗体的培养基加至96孔板。对照是50μl培养基(不含Apo2L/TRAIL或DR5抗体)和100μl培养物培养液(不含细胞)。每项实验在一组3个孔中且在3天进行。各孔的总体积是100μl/孔。
6.将板在增湿的5％CO2气氛中于37℃温育72小时。
7.将15μl染料溶液加至每个孔。
8.将板在增湿的5％CO2气氛中于37℃温育可长达4小时。
9.将100μl增溶/终止液加至每个孔。
10.将板于37℃温育过夜。
11.使用96孔读板仪记录570nm波长处的吸光度。使用参比波长750nm来降低由细胞碎片、指纹和其它非特异性吸收引起的背景。
12.使用阴性对照的吸光度平均值作为空白值并从所有其它读数中扣除。将每种浓度Apo2L/TRAIL或DR5抗体的吸光度平均值除以阳性对照(100％存活细胞-未处理)的吸光度平均值，用以计算存活细胞的量(以％表述)。
13.百分比存活细胞(Y轴)对Apo2L/TRAIL或DR5抗体浓度(X轴，log刻度)绘图，并通过查找对应于50％存活细胞的X轴数值(ng/ml)来确定IC50值。
Affymetrix标记方案
对所有样品采集OD260/280读数，并在BioAnalyzer上运行样品。使用5μg高品质总RNA。
A.cDNA第一条链的合成：
1.引物杂交
DEPC-H2O                                xμl  25旋涡震荡混匀。快速旋转。
RNA(5μg)                               yμl  于70℃温育10分钟。
掺入物(spike)(1∶4稀释原液(stock)，5μg)1μl  快速旋转并置于冰上。
T7-(dT)24引物                           1μl
体积                                    12μl
2.温度调节
5X cDNA第一条链缓冲液4μl  向每份样品中添加7μl(混合液)。
0.1M DTT             2μl  35通过旋涡震荡混匀。快速旋转。
10mM dNTP混合液      1μl  于42℃温育2分钟。
体积                 7μl
3.第一条链合成
SSII RT 1μl    向每份样品中添加1μl SSII RT。
总体积  20μl   通过用移液器吸入和推出或者通过轻微旋涡震荡来混匀。
快速旋转。
于42℃温育1小时。
B.cDNA第二条链的合成：
1.将第一条链反应液置于冰上。简短离心以使凝聚物沉降在管壁上。
2.配制如下第二条链混合液母液(master-mix)。
DEPC处理的H2O           91μl
5X第二条链反应缓冲液    30μl
10mM dNTP混合液         3μl
10U/μl DNA连接酶       1μl
10U/μl DNA聚合酶I      4μl
2U/μl RNA酶H           1μl
总体积                  130μl
3.将130μl第二条链混合液母液加至20μl cDNA第一条链(终体积＝150μl)。
4.通过用移液器吸入和推出或者通过轻微旋涡震荡来混匀。快速旋转。
5.在冷却水浴中于16℃温育2小时。
6.添加2μl[10U]T4 DNA聚合酶。通过用移液器吸入和推出或者通过轻微旋涡震荡来混匀。快速旋转。
7.于16℃温育5分钟。
8.添加10μl 0.5M EDTA。轻微旋涡震荡。快速旋转。
9.对cDNA进行清洁规程或者保存于-20℃供以后使用。
双链cDNA的清洁(GeneChip样品清洁模块(GeneChip Sample CleanupModule))
1.将600μl cDNA结合缓冲液加至162μl最终的双链cDNA合成制备物。
通过旋涡震荡混合3秒钟。
2.检查混合液的颜色是黄色的(与不含cDNA合成运行物的cDNA结合缓冲液相似)。
若混合液的颜色是橙色或紫罗兰色，则添加10μl 3M乙酸钠pH5.0并混匀。
混合液的颜色将变成黄色。
3.将500μl样品施加至安置在2ml收集管中的cDNA清洁旋转柱(CleanupSpin Column)。
以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心1分钟。
丢弃流出液作为*危险性废液。
4.给旋转柱再次加载剩余混合液(262μl)并如上离心。
丢弃流出液作为*危险性废液并丢弃收集管。
5.将旋转柱转移入新的2ml收集管(提供的)。将750μl cDNA清洗缓冲液施加至旋转柱。以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心1分钟。
丢弃流出液。
6.打开旋转柱的盖并以最大速度(≤25,000xg)离心5分钟。将旋转柱放入离心机中，使用间隔的吊桶。将盖安置到邻接的吊桶上，使得它们的取向与旋转方向相反，即如果旋转是顺时针方向的，那么以逆时针方向确定盖的方向。这避免了对盖的损害。
丢弃流出液和收集管。
7.将旋转柱转移入1.5ml收集管。将10μl cDNA洗脱缓冲液直接施加至旋转柱膜。确保将cDNA洗脱缓冲液直接分散到膜上。
于室温温育1分钟并以最大速度(≤25,000xg)离心1分钟以洗脱。
IVT反应的设置和运行
Enzo：生物阵列高产量RNA转录物标记试剂盒(Bioarray High Yield RNATranscript labeling kit)(Part No.900182)
1.使用10μl清洁后的双链cDNA。
2.配制如下IVT混合液母液：
蒸馏水或去离子水            12μl
10X HY反应缓冲液            4μl
10x生物素标记的核糖核苷酸   4μl
10X DTT                     4μl
10X RNA酶抑制剂混合液    4μl
20X T7 RNA聚合酶         2μl
总体积：                 30μl
3.将30μl IVT混合液母液(master-mix)加至10μl双链cDNA(总体积＝40μl)。
4.通过用移液器吸入和推出或者通过轻微旋涡震荡来混匀。快速旋转。
5.立即将管置入37℃水浴。温育5小时。
6.保存于-20℃，如果不立即纯化RNA的话。
生物素标记的cRNA的清洁(GeneChip样品清洁模块)
1.将60μl H2O加至IVT反应液并通过旋涡震荡混合3秒钟。
2.将350μl IVT cRNA结合缓冲液加至样品并通过旋涡震荡混合3秒钟。
3.将250μl乙醇(96-100％)加至裂解液并用移液器混匀。不要离心。
4.将样品(700μl)施加至安置在2ml离心管中的IVT cRNA清洁旋转柱。以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒钟。
5.使洗脱液再一次流过柱。
以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒钟。
丢弃流出液作为**危险性废液并丢弃收集管。
6.将旋转柱转移入新的2ml收集管(提供的)。
7.施加500μl IVT cRNA清洗缓冲液并以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒钟以清洗。
丢弃流出液。
8.将500μl 80％(v/v)乙醇施加至旋转柱，并以≥8,000xg(≥10,000rpm)离心15秒钟。丢弃流出液。
9.打开旋转柱的盖并以最大速度(≤25,000xg)离心5分钟。
丢弃流出液和收集管。
10.将旋转柱转移入新的1.5ml收集管。
11.将11μl不含RNA酶的水直接施加至旋转柱膜。静置1分钟。
以最大速度(≤25,000xg)离心1分钟以洗脱。
12.将10μl不含RNA酶的水直接施加至旋转柱膜。静置1分钟。
以最大速度(≤25,000xg)离心1分钟以洗脱。
cRNA(IVT产物)的定量
使用分光光度法分析来测定RNA产量。适用如下规则：1OD260nm＝40μg/mlRNA。
检查260nm和280nm处的OD以测定样品浓度和纯度。
纯的RNA维持A260/A280比率接近2.0(1.9与2.1之间的比率是可接受的)。为了在使用总RNA作为起始材料时对cRNA定量，调整后的cRNA产量必须计算以反映未标记总RNA的遗留物(carryover)。在使用估算值100％遗留物时，使用如下公式来测定调整后的cRNA产量：
调整后的cRNA产量＝RNAm-(总RNAi)(y)
RNAm＝IVT后测得的cRNA量(μg)
总RNAi＝总RNA的起始量(μg)
y＝IVT中所使用的cDNA反应的分数
断裂cRNA供靶物制备
为了断裂，使用调整后的cRNA浓度。
1.向每8μl RNA加H2O中添加2μl 5x断裂缓冲液。
20μg cRNA          1-32μl
5X断裂缓冲液        8μl
不含RNA酶的水加至   40μl
总体积：            40μl
2.于94℃温育30分钟。温育后立即置于冰上。
制备杂交靶物
1.将20X真核杂交对照和寡聚物B2于65℃加热5分钟。
Affymetrix基因芯片真核杂交对照试剂盒，Part#900362(150份包装)
2.轻微旋涡震荡，旋转沉降。
3.混合液母液(假设断裂后的cRNA浓度为0.5μg/μl)：
标准阵列               (μl)         终浓度
断裂后的cRNA 15μg     30            0.05μg/μl
寡聚物B2(3nM)          5             50pM
20x对照掺入物          15            1.5，5，25，100pM
(Bio B，C，D，Cre)
鲱精(Herring Sperm)DNA    3      0.1mg/ml
乙酰化BSA                 3      0.5mg/ml
Hu cot-1 DNA(1mg/ml)      30     0.1mg/ml
2X MES杂交缓冲液          150    1X
H2O                       64
终体积                    300
4.将270μl混合液母液等分入管并向每管中添加30μl断裂后的cRNA。这就是杂交混合液。
5.临使用才使探针阵列平衡至室温。
6.将探针阵列充满1x MES杂交缓冲液，并电转杂交炉中以45℃，60rpm温育10分钟。
7.将杂交混合液在99℃水浴中加热5分钟。
8.将杂交混合液转移入45℃水浴达5分钟。
9.将杂交混合液以最大速度离心5分钟。
10.从杂交阵列中除去1x MES杂交缓冲液。
11.将探针阵列充满上述的200μl杂交混合液。
12.用Tough-Spots密封隔片。
13.将探针阵列以45℃，60 RPM杂交19小时。
14.依照Affymetrix的方案清洗、染色和扫描探针阵列。
Affymetrix材料
项目     卖主  目录号
T7-(dT)24引物  Biosearch Technolgies定制
对照掺入物  自制  -
Superscript II/5X第一条链缓冲液/0.1 M DTT Invitrogen 18064-014
5X第二条链缓冲液 Invitrogen 10812-014
10mM dNTP Invitrogen 18427-088
10U/μl大肠杆菌DNA连接酶  Invitrogen  18052-019
10U/μl大肠杆菌DNA聚合酶I Invitrogen  18010-025
2U/μl RNA酶H  Invitrogen  18021-071
10U/μl T4 DNA聚合酶    Invitrogen  18005-025
0.5 M EDTA Sigma  E-7889
ENZO高产量RNA转录物标记试剂盒Affymetrix或ENZO    900182(ENZO)
基因芯片样品清洁模块 Affymetrix  900371
乙酰化牛血清清蛋白 Invitrogen  15561-020
山羊IgG-试剂级 Sigma  I-5256
抗链霉亲合素抗体(山羊)，生物素化的Vector Labs  BA-0500
R-藻红蛋白链霉亲合素  Molecular Probes S-866
20X SSPE  BioWhittaker 51214
真核对照试剂盒Affymetrix  900362
水，分子生物学级  Ambion 9934
人Cot-1 DNA  Roche  1-581-074
5M NaCl，不含RNA酶、不含DNA酶  Ambion 9760
防沫剂0-30 Sigma A-8082
10％Tween-20 Pierce Chemical 28320
MES游离酸单水合物 Sigma M5287
MES钠盐  Sigma M3885
EDTA二钠盐，0.5M溶液 Sigma E7889
Tough Spots，Label Dots USA Scientific 9902
基因芯片杂交炉640  Affymetrix  800139
基因芯片扫描仪3000，配有工作站Affymetrix 00-0074
Fluidics Station  Affymetrix 00-0081
自动加样仪，配有外部条形码读码器  Affymetrix  00-0129
定量PCR
cDNA合成：
 成分 体积(μL)
 10X RT缓冲液 10
 25X dNTP混合液 4
 10X随机引物 10
 MultiScribe RT(50U/μL) 5
不含RNA酶的H2O  21
RNA(100ng) 50
终体积 100
温育条件：
25℃ 10分钟
37℃ 2小时
TaqMan反应，使用ABI Prism 7700测序检测仪：
成分 体积(μL)
TaqMan通用PCR混合液母液(2X) 25
TaqMan探针(20X)(Assays-on-DemandTM) 2.5
cDNA(100ng) 2
H2O 20.5
终体积 50
热循环条件：
95℃ 10分钟
40个循环：95℃ 15秒钟
          60℃ 1分钟
TaqMan探针：Assays-on-DemandTM(TaqMan
Figure A20068003796000601
MGB探针，FAMTM染料标记的)
进行内源对照GAPDH(探针浓度100nM，正向和反向引物浓度200nM)的扩增以标准化加至每项反应的样品RNA(cDNA)的量。
使用标准曲线法进行相对定量。为了相对于内源对照标准化的定量，为靶物和内源参考物绘制标准曲线。为每份实验样品，根据适宜的标准曲线确定靶物和内源参考物的量。然后，将靶物的量除以内源参考物的量，得到标准化靶物数值。使用实验样品之一作为校准物，或1x样品。然后将每个标准化靶物数值除以校准物标准化靶物值，产生相对表达水平。
实验结果：
使用上文所述方法和材料进行了实验。这些实验的结果图示于图5-9，见下文讨论。
图5提供了在对非小细胞肺癌(“NSCLC”)细胞系分析对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“mab”(交联的“XL”或非交联的)(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50汇总表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图6提供了在对胰腺癌细胞系分析对Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5单克隆抗体“mab”(交联的“XL”或非交联的)(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50汇总表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图7提供了在对非何杰金氏淋巴瘤(“NHL”)细胞系分析对Apo2L(+10％胎牛血清“FBS”)或DR5单克隆抗体“mab”(交联的“XL”或非交联的)(+0.5％胎牛血清或10％胎牛血清“FBS”)凋亡活性的敏感性或抵抗性时得到的数据的IC50简表，所述数据是在MTT细胞毒性测定法中测得的。
图8提供了选出的NSCLC、胰腺癌和NHL癌细胞系对DR5抗体的敏感性(“sen”)或抵抗性(“RES”)的比较及其与GalNac-T14表达的相关性，所述GalNac-T14表达是通过GalNac-T14 mRNA表达来测量的。
图9提供了根据GalNac-T14 mRNA表达样式水平排列(降序)的各种NSCLC、胰腺癌和NHL细胞系的柱形图。
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凋亡性细胞死亡程序在多细胞生物体的发育和(体内)稳态中发挥重要作用(Danial et al.，Cell，116：205(2004))。胞内刺激可以经由细胞内在途径来触发凋亡，该途径依赖于Bcl-2基因超家族的成员来激活凋亡性胱天蛋白酶机制(Cory et al.，Nat.Rev.Cancer，2：647(2002))。属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的某些细胞因子可以经由细胞外在途径来激活凋亡，通过与包含功能性凋亡诱导性“死亡域”(DD)的一些受体相互作用(Ashkenazi et al.，Science，281：1305(1998))。Fas配体(FasL)经由Fas(Apo1/CD95)来刺激凋亡，而Apo-2配体/TNF相关凋亡诱导性配体(Apo2L/TRAIL)经由DR4(TRAIL-R1)和/或DR5(TRAIL-R2)来触发凋亡(LeBlanc et al.，Cell Death Differ.，10：66(2003))。在与它们的关联配体结合后，这些受体与衔接物(adaptor)分子FADD(Fas相关死亡域)结合，后者募集凋亡起动剂胱天蛋白酶-8来形成诱导死亡的信号复合物(DISC)(参见例如Kischkel et al.，EMBO J.，14：5579(1995)；Kischkel etal.，Immunity，12：611(2000))。DISC的结合刺激胱天蛋白酶-8，后者继而切割和激活效应物蛋白酶诸如胱天蛋白酶-3、6和7来执行凋亡性死亡程序。在许多细胞类型中，与细胞内在途径的沟通可进一步放大细胞外在死亡信号(Scaffidi et al.，J.Biol.Chem.，274：1541(1999))。Apo2L/TRAIL在多种肿瘤细胞类型中诱导凋亡，对正常组织的影响很小或没有影响，提示它可用于癌症治疗(参见例如Ashkenazi，Nat.Rev.Cancer，2：420(2002)；Kelley et al.，Curr.Opin.Pharmacol.，4：333(2004))。凋亡途径各种成分的改变在特定癌细胞系中可降低Apo2L/TRAIL敏感性(Igney et al.，Nat.Rev.Cancer，2：277(2002))。
依照下文所列方法和方案进行了各种实验，数据示于图10-15。
为了检验对受体激活的敏感性，作为Apo2L/TRAIL浓度的函数，测试了一组人癌细胞系中的细胞存活力，包括23种胰腺癌、18种恶性黑素瘤和36种结肠直肠腺癌(图10A和未显示的数据)。此项分析将29/77种(38％)细胞系归入对Apo2L/TRAIL高度或中等敏感的。在这29种细胞系中实现50％细胞死亡所需要的Apo2L/TRAIL浓度的范围为3-800ng/mL，均值为250ng/mL。
还通过基因表达序型分析对这组细胞系进行了检验，使用54,613种基因-探针(组)的微阵列。虽然有些例外，但是展现出对Apo2L/TRAIL的强烈或中等敏感性的胰腺癌和黑素瘤细胞系比相应的抵抗性细胞系表达显著更高水平的O-糖基化酶ppGalNAcT-14 mRNA(p＝0.5x10-4，Fisher精确检验，为胰腺癌迭代(iteratively)指派截留值为750，为黑素瘤迭代指派截留值为300)(图10B)。大多数Apo2L/TRAIL敏感性结肠直肠癌细胞系显示出相关O-糖基化酶ppGalNAcT-3的高mRNA表达，尽管数种抵抗性细胞系也表达这种基因，导致更微弱但显著的差异(p＝0.026，截留值指派为2000)(图10C，底部)。整组中的例外是：(a)5/29种(17％)敏感性细胞系表达的ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3低于截留值；(b)16/48种(33％)抵抗性细胞系具有高于截留的ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3水平。通过检验结肠直肠癌细胞系中其它O-糖基化酶的mRNA表达，在10/12种(83％)敏感性细胞系中较之在6/24种(25％)抵抗性细胞系中检测到更高水平的Fut-6(p＝0.013；截留值指派为200)(图10C，顶部)。ppGalNAcT-14在胰腺癌和黑素瘤细胞系中的表达与Fut-6在结肠直肠癌细胞系中的表达结果与Apo2L/TRAIL敏感性高度相关(p＝1.83x10-7，N＝77)。这组基因分别为23/32种(72％)标志物阳性细胞系和39/45种(87％)标志物阴性细胞系正确预测了敏感性或抵抗性。
还使用肿瘤异种移植物在体内检验了Apo2L/TRAIL敏感性。对携带衍生自Fut-6阳性结肠直肠癌细胞系Colo205和DLD-1的肿瘤的小鼠进行5天Apo2L/TRAIL处理，引起肿瘤消退，接着肿瘤进展(progression)大大延迟(图10D)。相反，衍生自Fut-6阴性结肠直肠癌细胞系Colo320和RKO的肿瘤不响应这种治疗。
ppGalNAcT-3/Fut-6阳性Colo205细胞系与泛O-糖基转移酶抑制剂苄基-GalNAc(Delannoy et al.，Glycoconj.，13：717(1996))的预先温育显著降低对Apo2L/TRAIL的敏感性(图11A)，提示O-糖基化与Apo2L/TRAIL信号传导之间有功能性联系。为了进一步检验这一点，使用靶向ppGalNacT-14、ppGalNacT-3或Fut-6 mRNA的特异性小干扰(si)RNA寡核苷酸。为了排除脱靶(off-target)效应，为每种基因合成了多重、非交叠的siRNA并通过定量RT-PCR验证了它们降低靶物表达的能力(图14A)。我们用在siRNA靶向区内包含6处“沉默”核苷酸变化的突变型ppGalNacT-14质粒进一步证实了siRNA特异性(Editorial，Nat.Cell.Biol.，5：489(2003))(图14B)。使用ppGalNAcT-14siRNA转染ppGalNAcT-14阳性PSN-1胰腺癌细胞系和Hs294T黑素瘤细胞系实质性降低了对Apo2L/TRAIL的敏感性，而胱天蛋白酶-8siRNA，如预期的，提供了基本上完全的保护(图11B)。类似的，使用GalNAcT-3或Fut-6siRNA转染DLD-1或C170结肠直肠癌细胞显著消除减弱了对Apo2L/TRAIL的敏感性(图11C和图14C)。总之，GalNAcT-14siRNA在4/5种胰腺癌细胞系和2/2种黑素瘤细胞系中降低了对Apo2L/TRAIL的敏感性，而ppGalNAcT-3或Fut-6siRNA各自在2/3种结肠直肠癌细胞系中降低了敏感性。相反，用GalNAcT-14siRNA转染PSN-1或Hs294T细胞不改变对拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷(etoposide)的敏感性(图14D)。类似地，用GalNAcT-14或GalNAcT-3 siRNA转染PSN-1或C170细胞不影响对广谱蛋白质激酶抑制剂十字孢碱(staurosporine)的敏感性(图14E)。因为依托泊苷和十字孢碱二者都经由细胞内在途径来刺激凋亡(Wei et al.，Science，292：727(2001))，这些研究提示O-糖基化酶可能经由细胞外在途径来调控凋亡信号传导。
用ppGalNAcT-14转染HEK293细胞在与DR4或DR5共转染时揭示了细胞死亡，但是相关受体Fas和TNFRl或细胞内在途径激动剂Bax则不然(图11D)。此外，ppGalNAcT-14转染提高了抵抗性细胞系H1568黑素瘤(图11E)及PA-TU-8902和PL-45胰腺癌(图14F)对Apo2L/TRAIL的敏感性，但是不改变对依托泊苷的敏感性(数据未显示)。总之，GalNAcT-14过表达使4/7种细胞系对Apo2L/TRAIL敏感。
检验了ppGalNacT-14或Fut-6的siRNA敲低对Apo2L/TRAIL诱导的胱天蛋白酶加工的影响。在用对照siRNA转染的PSN-1和DLD-1细胞中，Apo2L/TRAIL诱导了基本上完全的胱天蛋白酶-8加工，导致对Bid、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3的切割(图12A)。胱天蛋白酶-8siRNA的转染防止了这些事件。PSN-1细胞中ppGalNAcT-14的敲低或DLD-1细胞中Fut-6的敲低还显著削弱了Apo2L/TRAIL诱导的胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3的加工(图12A)及胱天蛋白酶-3/7活性的刺激(图12B)。表达低水平ppGalNAcT-3和Fut-6的Apo2L/TRAIL抵抗性RKO和SW1417结肠直肠癌细胞系在胱天蛋白酶-8加工水平方面显示出相似的阻断(图15A)。如此，O-糖基化酶可调控导致胱天蛋白酶-8激活的Apo2L/TRAIL途径上游事件。
胱天蛋白酶-8激活需要DISC装配(Ashkenazi et al.，Science，281：1305(1998))。PSN-1和DLD-1细胞中对Apo2L/TRAIL DISC的分析(Kischkel et al.，Immunity，12：611(2000))指示，ppGalNAcT-14或Fut-6的敲低降低FADD和胱天蛋白酶-8募集至DISC、DISC所结合的胱天蛋白酶-8的加工、和DISC所结合的胱天蛋白酶-8酶活性的刺激(Sharp et al.，J.Biol.Chem.，280：19401(2005))(图12C、图12D和图15B)。ppGalNacT-14和Fut-6 siRNA都不实质性改变DISC中DR4和DR5的量或者Apo2L/TRAIL对表达DR4和DR5二者的PSN-1或DLD-1细胞的剂量依赖性结合(图12C、图15B和未显示的数据)。如此，ppGalNAcT-14和Fut-6未表现出通过影响细胞表面受体水平或Apo2L/TRAIL结合来调控凋亡。与此一致，一组77种细胞系中的Apo2L/TRAIL敏感性未显示出与关联信号受体DR4和DR5或诱饵受体DcR1和DcR2的细胞表面表达的显著相关性(数据未显示)。此外，针对ppGalNAcT-14、ppGalNacT-3或Fut-6的大多数siRNA不改变PSN-1、C170或DLD-1细胞上的DR4和DR5水平(图15C)。两种siRNA在某些细胞系中不引起可检测的DR4和DR5降低(图15C)。然而，针对相同酶的其它siRNA抑制Apo2L/TRAIL诱导的凋亡而不改变受体水平。
在中国仓鼠卵巢细胞中表达人DR5的胞外结构域(ECD)，纯化所分泌的蛋白质，进行酸水解，并分析所结合的单糖(图13A)。与DR5 ECD中所预测的N-糖基化位点的缺失一致，我们没有检测到N-连接的聚糖。然而，来自2次独立实验的2份样品展示出每摩尔DR5 ECD有3摩尔GalNAc和3摩尔Gal(图13A)，提示核心聚糖GalNAc-Gal对DR5上3个位点的O-连接修饰。
蛋白质O-糖基化修饰丝氨酸或苏氨酸。使用先前为预测潜在O-糖基化位点而建立的生物信息学工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc)(Julenius et al.，Glycobiology，15：153(2005))，我们在人DR5长型(DR5-L)和短型(DR5-S)剪接变体共有ECD序列中鉴定出两个这样的区域，在可变剪接区中鉴定出第三个位点(图13B)。第一个氨基酸区段(74-77)包含3个丝氨酸；第二个(130-144)具有5个苏氨酸；而第三个具有4个苏氨酸和3个丝氨酸。鼠DR5具有与前2个区段相似的序列，分别有2个丝氨酸和4个苏氨酸，而人DR4具有2个相似序列，包含1个丝氨酸和5个苏氨酸。为了测试这些位点对于DR5的翻译后修饰是否是重要的，构建了一组DR5L和DR5S突变体，用丙氨酸替换区段130-144中的5个苏氨酸(DR5L-5T、DR5S-5T)或者这5个苏氨酸及区段74-77中的3个丝氨酸(DR5L-5T3S、DR5S-5T3S)。经DR5L或DR5S转染的HEK293细胞的溶胞物DR5抗体免疫印迹揭示了所预期的DR5L或DR5S条带的存在(图13C)。该抗体还检测出更高分子量(MW)的DR5条带，其在用DR5L或DR5S与ppGalNAcT-14共转染后与对照相比变得更丰富(图13C，星号)。与野生型构建物相比，这些更高MW条带的丰度及其由于ppGalNAcT-14的提升被DR5L-5T或DR5S-5T显著减小，而且被DR5L-5T3S或DR5S-5T3S几乎消除。这些结果提示，更高MW条带代表DR5的O-糖基化形式：ppGalNAcT-14促进它们的形成，而通过丙氨酸替代进行的对所预测O-糖基化位点的渐进消除逐渐逆转这种效应。用鼠DR5或人DR4、DR5L或DR5S转染HEK293细胞揭示了细胞死亡(图13D)；每一种DR5突变体都展示出比其相应野生型构建物更少的活性，其中DR5S-5T3S(其缺乏所有三个位点)具有最弱的活性。用ppGalNAcT-14转染显著增强由所有DR4和DR5构建物引起的细胞死亡，除了DR5S-5T3S，它显示出显著更小的活性。
大多数正常组织和来自皮肤癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和膀胱癌或者来自非何杰金氏淋巴瘤的肿瘤样品显示出低于截留值(对大多数癌确定为500，对皮肤癌确定为200，图13E)的ppGalNAcT-14mRNA表达。然而，显著比例的肿瘤样品，范围从小叶乳腺癌(lobular breastcancer)的10％到肺癌和弥漫性大B细胞性淋巴瘤的30％，显示出ppGalNAcT-14的过表达。有些癌样品具有比相应正常组织高1000倍以上的mRNA表达水平。癌中ppGalNAcT-14的动态表达提示，这种基因及可能的其它相关酶可能为鉴定对Apo2L/TRAIL具有更大敏感性的肿瘤提供了有用的生物标志物。
O-连接聚糖展示出广泛的结构多样性，而且它们调控质膜蛋白质生物学的多个方面，包括构象、聚集、运输、半衰期及细胞粘附和信号转导活性(Hanget al.，Bioorg.Med.Chem.，13：5021(2005)；Hanisch，Biol.Chem.，382：143(2001))。癌细胞常常展现出O-聚糖特征(profile)的显著改变，产生独特的肿瘤相关碳水化合物抗原(Brockhausen，Biochim.Biophys.Acta，1473：67(1999)；Dube et al.，Nat.Rev.Drug Discovery，4：477(2005)；Fuster et al.，Nat.Rev.Cancer，5：526(2005))。O-糖基化还在肿瘤细胞归巢至特定转移部位中发挥重要作用(Fuster et al.，Cancer Res.，63：2775(2003)；Ohyama et al.，EMBO J.，18：1516(1999)；Takada et al.，Cancer Res.，53：354(1993))。显著比例的来自多种人癌症的原发性肿瘤样品显示出升高的O-糖基化酶ppGalNAcT-14表达，包括结肠癌和结肠直肠癌细胞样品、黑素瘤细胞样品和软骨肉瘤细胞样品。
方法
材料
细胞培养试剂购自Gibco(Invitrogen/Gibco，Carlsbad，CA)，不带标签的可溶性Apo2L/TRAIL如先前所述制备(Lawrence et al.，Nat.Med.，7：383(2001))，O-连接的糖基化抑制剂苄基-a-GalNAc购自Calbiochem，而所有其它化学制品(包括依托泊苷和十字孢碱)购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
细胞培养物和细胞系
所有119种人癌瘤细胞系(名称和目录号参见补充资料)得自ATCC或DSMZ(Braunschweig，Germany)，并在补充有10％热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES不含抗生素像青霉素/链霉素的RPMI 1640中于37℃和5％CO2培养。293人胚肾细胞(目录号CRL-1573)也得自ATCC，并在补充有10％FBS的100％Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中培养。O-糖基化突变型CHO细胞系，ldlD CHO，得到了Monty Kreiger博士(MIT，Boston，MA)的许可。
细胞存活力测定法和凋亡测定法
为了测定Apo2L/TRAIL的IC50，将细胞一式三份铺入96孔板，让其粘附24小时，然后用浓度渐增直到1000ng/ml的重组人Apo2L/TRAIL处理。温育72小时后，对它们进行存活力测定法-MTT测定法(Pierce)或CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Promega)的测定，依照制造商的方案。每一项细胞存活力实验在低(0.5％)和高(10％FBS)血清中重复至少三次，而中等敏感性细胞系定义为独立实验的IC50之间的或者低和高血清之间的存活力。我们根据在1μg/ml的Apo2L/TRAIL浓度诱导至少50％的细胞凋亡来定义敏感性细胞系，根据独立实验中或者存在低(0.5％)较之高(10％)血清时所诱导的凋亡量的变化程度来定义中等敏感性。凋亡通过流式细胞计量术分析所收获细胞(贴壁的+漂浮在培养基中的)中被膜联蛋白V(BD Pharmingen)染上色的平均百分比来量化。
微阵列杂交和数据分析
使用RNeasy试剂盒(Quiagen)自未处理细胞(3x106)制备总细胞RNA。如先前所述(Hoffman et al.，Nat.Rev.Genetics，5：229(2004)；Yauch et al.，Clin.Cancer Res.，11：8686(2005))，制备经标记的cRNA并与寡核苷酸微阵列(U133P GeneChip；Affymetrix Incorporated，Santa Clara，CA)杂交。用GENECHIP 3.1(Affymetrix)、Spotfire、GenePattern和Cluster/TreeView分析扫描图像文件。为了鉴定敏感性和抵抗性细胞系间表达差异最大的基因，我们对基因表达值根据变化程度进行筛选，经筛选排除在所分析样品间具有最小变化的基因，这通过测试样品间的倍数变化和绝对变化、将最大值与最小值的比率(最大值/最小值)及最大值与最小值的差异(最大值-最小值)与预定值相比较、然后排除不符合这两项条件的基因来完成。
表达构建物和逆转录病毒转导
自Apo2L/TRAIL敏感性细胞系的合并cDNA克隆编码ppGalNAcT-14的DNA片段，并插入带N-末端Flag标签的表达质粒pcDNA3.1(Invitrogen)。然后将此构建物进行位点定向诱变(Quikchange Mutagenesis kit，Stratagene)以产生在与siRNA同源的序列中具有4-6个摆动碱基对改变但不改变蛋白质序列的siRNA沉默突变体。突变跨越19bp siRNA结合序列中央10bp的区域。自cDNA集合克隆DR5Long和DR5Short、DR4、鼠TRAIL受体、DR4、Fas(变体1)、TNFR1和Bax(β变体)的DNNA列并插入pRK表达载体(Genentech)。通过四个苏氨酸变成丙氨酸残基或者五个苏氨酸变成丙氨酸残基的位点特异突变产生DR5L和DR5S的O-糖基化突变体，分别为Mut4xTA(T130，T131，T132，T135)和Mut5xTA(T130，T131，T132，T135，T143)。在6孔板中进行促凋亡分子的表达构建物引入HEK293细胞的瞬时转染，促凋亡分子的浓度为0.5μg/孔，ppGalNAcT-14或载体对照为2.0μg。使用Lipofectamine 2000依照制造商的方案转染细胞。温育48小时后，将细胞进行凋亡分析。
为了构建逆转录病毒构建物，将ppGalNAcT-14和突变体克隆入pQCXIP逆转录病毒载体(Clontech)。使用ΦNX-Ampho辅助细胞系生成高滴度逆转录病毒上清液。使用磷酸钙(Invitrogen)转染包装细胞。转染后48小时分离上清液并与10μg/ml聚凝胺(polybrene)一起加至靶细胞，接着以2700rpm离心1小时以增强感染。转导后，将细胞用2μg/ml嘌呤霉素进行选择。
siRNA设计和转染方案
针对ppGalNAcT-14、ppGalNAcT-3、胱天蛋白酶-8和DR5的siRNA由Dharmacon(Lafayette，CO)使用他们专有的选择标准来设计。所选择的序列为：
siGalNAcT-14(1)：5′GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT 3′(＝14-4)(SEQ IDNO：15)
siGalNAcT-14(2)：5′ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT 3′(＝14-6)(SEQ IDNO：16)
siGalNAcT-3(1)：5′CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT 3′(＝3-2)(SEQ IDNO：17)
siGalNAcT-3(2)：5′GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT 3′(＝3-7)(SEQ IDNO：18)
siFut-6(1)5′GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT 3′(＝6-1)(SEQ ID NO：19)siFut-6(2)5′ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT 3′(＝6-2)(SEQ ID NO：20)siCaspase-8：5′GGACAAAGTTTACCAAATG-dTdT 3′(SEQ ID NO：21)
购买双链RNA寡核苷酸形式的siRNA并转染入各自细胞系，各siRNA的终浓度为25nM。使用针对非靶向序列的siRNA双链体(Dharmacon)作为对照。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)通过反向转染来转染细胞，其中将悬浮的细胞加至预先铺入的脂质-siRNA复合物。Lipofectamine2000的浓度依照制造商的方案。温育48小时后，收获细胞供mRNA分析，或者与重组人Apo2L/TRAIL、依托泊苷或十字孢碱一起再温育24-72小时供存活力分析或者4、8或24小时供Western印迹分析。
用苄基-a-GalNAc抑制O-糖基化
将Colo205细胞在存在苄基-a-GalNAc(2mM或4mM)的条件下培养72小时。此时将它们铺入96孔板，让其在仍然存在抑制剂的条件下粘附24小时。然后用所示的渐增浓度的Apo2L/TRAIL刺激它们并进行存活力测定法。
定量PCR
使用标准Taqman技术通过定量RT-PCR评估GalNacT-14和GalNacT-3转录物表达水平。将转录物水平相对于持家基因GAPDH进行标准化，并将结果表述为标准化表达值(＝2-DCt)。用于GalNacT-14(目录号：Hs00226180_m1_GT14)、GalNacT-3(目录号：Hs00237084_m1_GT3)和GAPDH(目录号：402869)的引物/探针组购自Applied Biosystems(Foster City，CA)。
免疫沉淀、Western印迹分析和抗体
IP：抗Apo2L(2E11；ATCC编号HB-12256)、抗DR4(3G1和4G7，ATCC编号PTA-99)和抗DR5(3H3，ATCC编号12534和5C7)单克隆抗体由Genentech公司产生，使用受体-Fc融合蛋白作为抗原。使用Pierce的免疫纯蛋白G IgG+定向试剂盒(目录号44990)将用于免疫沉淀Apo2L/TRAIL DISC的抗DR4(4G7)和抗DR5(5C7)单克隆抗体偶联至琼脂糖。使用Pierce的EZ-linkSulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(目录号21217)将用于免疫沉淀DISC中的DR4/5免疫检测的抗DR4(3G1)和抗DR5(3H3)单克隆抗体生物素化。制备带FLAG标签的Apo2L/TRAIL并与抗FLAG抗体M2(Sigma)交联，如文献所述(Kischkel，Immunity，12：611(2000))。这些实验如先前关于Apo2L/TRAIL-FLAG+抗FLAG DISC分析所述来进行(Kischkel，supra)。DR4/5 DISC免疫沉淀实验也如所述来进行，只是将抗DR4(4G7)和抗DR5(5C7)单克隆抗体直接偶联至琼脂糖供免疫沉淀(Sharp et al.，J.Biol.Chem.，280：19401(2005))。
WB：在6孔板中接种5x105个细胞/孔。对于RNAi敲低实验，将细胞用不同siRNA处理48小时，接着用Apo2L/TRAIL处理4、8或24小时。所示时间后，将细胞在冰冷的PBS中清洗并在含1％Triton X-100的低渗裂解缓冲液(20mMHEPES pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA和1mM DTT)中裂解。对于每份样品，在还原性条件下在10％或10-20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离40μg蛋白质。转移至硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell)后，将膜在10％脱脂奶粉中温育1小时，接着与以下一抗一起温育1小时：山羊抗胱天蛋白酶-3抗体(1∶1000，R&D)、兔抗胱天蛋白酶-8抗体(1∶1000，Pharmingen)、小鼠抗胱天蛋白酶-9抗体5B4(1∶1000，MBL)、兔抗Bid抗体(1∶1000，Pharmingen)、兔抗DR5抗体(1∶500，Cayman)或山羊抗肌动蛋白抗体(1∶200，Santa Cruz Biotechnology)。将膜用TBS/0.05％Tween清洗五次，然后与各自偶联有过氧化物酶、亲和力纯化的二抗(1∶5000，Biorad)一起温育30分钟。将膜再清洗五次，并使用增强型化学发光(ECL，Amersham)显影，对KodakBiomax胶片曝光。
流式细胞计量术/FACS分析
使用FACS Calibur流式细胞计量仪(Becton Dickinson ImmunocytometrySystem，San Jose，CA)通过荧光激活的细胞分拣(FACS)来测定TNF家族受体DR4和DR5的表面表达。将经所示siRNA转染48小时的C170和PSN-1细胞用10μg/ml一抗4G7(抗DR4)或3H3(抗DR5)或者小鼠IgG对照抗体于4℃染色1小时。然后将细胞用PBS清洗并与偶联有荧光素(FITC)的山羊抗小鼠二抗(Jackson Laboratories)于4℃温育30分钟。然后使用FACS Calibur流式细胞计量仪通过流式细胞计量术分析细胞。
胱天蛋白酶测定法
在40μl含100μM产荧光肽Ac-DEVD-AFC的胱天蛋白酶缓冲液(50mMHEPES pH7.4、100mM NaCl、10％蔗糖、1mM EDTA、0.1％CHAPS和10mMDTT)中于37℃测定胱天蛋白酶-3/-7活性。在所示时间里连续测量活性，通过使用Molecular Devices荧光计以动力学模式(kinetic mode)和使用405-510滤光片对测量自DEVD-AFC释放的AFC。为了评估胱天蛋白酶活性，在40μl胱天蛋白酶缓冲液(含100μM DEVD-AFC)中使用20μg总细胞蛋白质(TritonX-100提取物)。
CHO衍生的DR5的碳水化合物分析
在用4N TFA水解后得到了CHO细胞衍生的DR5的单糖组成。所释放的单糖的分析在Dionex BioLC HPLC系统上进行，该系统使用高效阴离子交换层析且偶联有脉冲电流检测仪。
动物和皮下异种移植物研究
在进行实验性研究前使雌性无胸腺裸鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME，USA)适应Genentech的动物饲养设施最少1周。所有实验规程得到了Genentech动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACAUC)的批准。给每只小鼠皮下接种5x106个Colo205、DLD-1和RKO细胞或者20x106个Colo320HSR人结肠癌细胞(American Type CultureCollection)。使用数字式测径器收集肿瘤测量结果并使用如下公式计算肿瘤体积：(A＝长度)(B＝宽度)2。一旦肿瘤体积达到大约150-200mm3，就将小鼠随机分组，并在第0-4天给予媒介物或Apo2L/TRAIL(60mg/kg/天)腹膜内(i.p)进行处理。

Claims (24)

1.用于预测哺乳动物组织或细胞样品对死亡受体抗体的敏感性的方法，包括以下步骤：
获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达，其中所述GalNac-T14的表达预示所述组织或细胞样品对死亡受体抗体的凋亡诱导活性是敏感的。
2.权利要求1的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
3.权利要求1的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
4.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
5.权利要求1的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述癌组织或细胞是胰腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤或软骨肉瘤组织或细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述死亡受体抗体是激动性抗DR4或抗DR5抗体。
8.用于在哺乳动物组织或细胞样品中诱导凋亡的方法，包括以下步骤：
获取哺乳动物组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并在检测到所述GalNac-T14的表达之后，将所述组织或细胞样品暴露于有效量的死亡受体抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检测的。
10.权利要求8的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检测的。
11.权利要求8的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
12.权利要求8的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述癌组织或细胞是胰腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤或软骨肉瘤组织或细胞。
14.权利要求8的方法，其中将所述细胞暴露于有效量的激动性抗DR4或抗DR5抗体。
15.权利要求14的方法，其中将所述细胞暴露于有效量的能与图3A所示DR5受体结合的激动性抗DR5抗体。
16.治疗哺乳动物中的病症诸如免疫相关病症或癌症的方法，包括以下步骤：
自所述哺乳动物获取组织或细胞样品；
检验该组织或细胞样品以检测GalNac-T14的表达；并
在检测到所述GalNac-T14的表达之后，对所述哺乳动物施用有效量的死亡受体抗体。
17.权利要求16的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过检测GalNac-T14mRNA的表达来检验的。
18.权利要求16的方法，其中所述GalNac-T14的表达是通过免疫组织化学来检验的。
19.权利要求16的方法，进一步包括以下步骤：
检验所述组织或细胞样品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受体的表达。
20.权利要求16的方法，其中所述组织或细胞样品包括癌组织或细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述癌组织或细胞包括胰腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤或软骨肉瘤组织或细胞。
22.权利要求16的方法，其中对所述哺乳动物施用有效量的抗DR4或抗DR5抗体。
23.权利要求22的方法，其中还对所述哺乳动物施用化疗剂或放疗。
24.权利要求22的方法，其中还对所述哺乳动物施用细胞因子、细胞毒剂或生长抑制剂。
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