GALNT2作为生物标志物在胶质瘤诊断和/或治疗中的应用
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及GALNT2作为生物标志物在胶质瘤治疗和/或预后中的应用。
背景技术
神经胶质瘤占80%的颅内原发性瘤,是最普遍的和致命的原发中枢神经系统肿瘤。目前的多模态治疗手段包括最大手术切除,放疗和化疗。然而,以总生存率和生存质量来衡量的治疗结果仍不能令人满意。1p/19q的共缺失、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)基因启动子的甲基化、表皮生长因子受体(EGFR)的突变/扩增、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因的突变等基因组改变已被证实与胶质瘤的肿瘤发生密切相关。然而,目前仍缺乏对神经胶质瘤有效的治疗手段及预后标志物。因此,挖掘新的与胶质瘤相关的生物标志物,探究其分子作用及预后机制,可为胶质瘤患者提供更好的治疗策略。
GALNT2是调节粘蛋白O型糖基化起始步骤的酶。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最常见的过程之一,糖基化异常可能影响细胞的多种特性,包括细胞增殖、转化、分化、凋亡、迁移和侵袭。糖基化主要有两种类型,即N型糖基化和O型糖基化。粘蛋白糖基化是O型糖基化最常见的类型。
GALNT2的异常表达已经被报道可以影响多种癌症的恶性进展。例如,GALNT2可以改变EGFR糖基化和活性,从而调控肝癌细胞的恶性行为。GALNT2的下调通过增加MET磷酸化,影响EGFR的糖基化和活化来调节胃癌的恶性进展。然而,GALNT2的功能在胶质瘤细胞中从未被报道过。
发明内容
针对以上所述技术问题,本公开提供GALNT2作为生物标志物在胶质瘤治疗和/或预后中的应用。本公开首次发现GALNT2的表达量与胶质瘤的预后相关,并且通过调控GALNT2的表达可控制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。
本公开采用以下技术方案:
本公开第一个方面,提供检测GALNT2表达水平的试剂在制备胶质瘤诊断和/或预后评估产品中的用途。
进一步地,GALNT2在胶质瘤组织中的表达高于正常脑组织,并随着胶质瘤级别的升高,GALNT2表达量也明显升高;GALNT2高表达的预后明显比GALNT2低表达的预后差。
本公开首次发现人胶质瘤中GALNT2表达水平升高与肿瘤级别升高及预后不良有关。实验结果显示GALNT2能促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。
本公开第二个方面,提供一种胶质瘤诊断和/或预后评估的试剂盒,所述试剂盒包括扩增GALNT2的引物,所述GALNT2正向引物序列为:5’-TGTGCCTTACTGTGGTGGAC-3’;述GALNT2反向引物序列为:5’-GTTCCCATTTCTGTCTGCTGTC-3’;还包括扩增GAPDH所用正向引物:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’;反向引物:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGA-3’。本公开所用引物特异性强、灵敏度高,提高了检测的准确性。以GAPDH作为内参基因,并采用以上引物进行实时荧光定量PCR扩增,以此作为对照,用于GALNT2表达量的分析,所得结果更为准确。本发明试剂盒可用于胶质瘤的快速、准确诊断和/或预后评估。
本公开第三个方面,提供GALNT2在制备产品中的应用;所述产品功能为如下A1)至A8)中的至少一种:
A1)促进细胞EGFR磷酸化和O型糖基化修饰;A2)促进PI3K表达;A3)促进Akt表达;A4)促进细胞中p-Akt表达;A5)促进细胞中p-mTOR表达;A6)促进细胞周期调节因子表达增加;A7)促进细胞增殖;A8)促进细胞迁移。
本公开第四个方面,提供GALNT2抑制剂在制备产品中的应用,所述产品功能为如下B1)至B8)中的至少一种:B1)抑制细胞EGFR磷酸化和O型糖基化修饰;B2)抑制PI3K表达;B3)抑制Akt表达;B4)抑制细胞中p-Akt表达;B5)抑制细胞中p-mTOR表达;B6)抑制细胞周期调节因子表达增加;B7)抑制细胞增殖;B8)抑制细胞迁移。
进一步地,所述GALNT2抑制剂为靶向GALNT2的小干扰RNA;所述小干扰RNA核酸序列为si-GALNT2-1:
5’-CACCCAUCAUCGAUGUCAUTT-3’,或
si-GALNT2-2:5’-GCCUUCUGCUAGAAACGUUTT-3’。本公开所用小干扰RNA抑制GALNT2表达效率高。
进一步地,以上所述细胞为胶质瘤细胞。
本公开通过Western blot和凝集素pull down分析显示,敲除GALNT2降低了活化表皮生长因子受体(EGFR)水平和Tn抗原在EGFR上的表达,并通过PI3K/Akt/mTOR通路影响p-mTOR、P21、CDK4、cyclinD1、MMP2和MMP9的表达水平。过表达GALNT2达到了相反的效果。在体内实验中,GALNT2稳转敲除明显抑制裸鼠异种原位胶质瘤生长,且肿瘤侵袭性明显减弱,免疫组化示Ki67和MMP2表达减少。
本公开第五个方面,提供一种治疗胶质瘤的药物组合物,所述药物组合物包括GALNT2表达抑制剂所述抑制剂为靶向GALNT2的小干扰RNA,其核酸序列为si-GALNT2-1:
5’-CACCCAUCAUCGAUGUCAUTT-3’,或
si-GALNT2-2:5’-GCCUUCUGCUAGAAACGUUTT-3’。本公开采用以上小干扰RNA干扰GALNT2表达后,抑制胶质瘤增殖、迁移和侵袭效果明显。因此,以此可作为有效治疗胶质瘤的药物。
进一步地,所述药物组合物还包括及与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步地,所述药物组合物通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制胶质瘤恶化,并降低EGFR磷酸化和O型糖基化修饰。
本公开取得的有益效果:
本公开首次GALNT2通过影响EGFR的O型糖基化和磷酸化,并影响下游PI3K/Akt/mTOR通路,从而促进胶质瘤的恶性进展。因此,GALNT2可作为一种新的生物标志物和未来胶质瘤治疗的潜在靶点。
本公开采用实时荧光定量PCR对GALNT2表达量进行分析,所用GALNT2扩增引物特异性强、灵敏度高;并且以GAPDH作为内参基因,确保了检测结果的准确性和稳定性。
本公开所用小干扰RNA可充分抑制GALNT2的表达,进而可有效抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,可作为一种有效的药物用于预防和/或治疗胶质瘤。
本公开为胶质瘤的诊断、预后评估分析提供了更为有利的手段,这对于胶质瘤的研究、治疗具有重要的意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解,本公开的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1在TCGA数据库中分析GALNT2表达对LGG和GBM患者预后的影响图;
图2定量分析不同级别和亚型胶质瘤在TCGA中的GALNT2 mRNA表达水平图;
图3 GALNT2免疫组化染色在不同级别胶质瘤和正常脑标本中的代表性图像;
图4 GALNT2免疫组化染色在肿瘤和瘤周组织标本中的代表性图像;
图5 GSEA显示GALNT2高表达水平与癌症通路、EMT、糖酵解、O糖原合成、EGFR和PI3K-Akt-mTOR信号通路呈正相关;
图6a:qRT-PCR检测转染GALNT2 siRNA或对照的U87MG和U251细胞的GALNT2mRNA表达水平;b:western blot检测蛋白表达情况;采用GAPDH作为对照;
图7 EDU及CCk-8显示敲除GALNT2对细胞增殖及活性的影响图;
图8流式细胞术显示干扰GALNT2后细胞周期在G1期阻滞图;
图9克隆实验显示稳转干扰GALNT2后细胞增殖能力下降图;
图10 Western blot检测细胞周期调控因子的表达水平变化;
图11细胞微侵袭实验显示敲除GALNT2后细胞侵袭能力下降图;
图12 Transwell显示敲除GALNT2后肿瘤细胞侵袭迁移能力下降图;
图13划痕实验显示敲除GALNT2后细胞迁移能力下降图;
图14 Western显示敲除GALNT后MMP2及MMP9蛋白表达水平明显下降;
图15 Western显示过表达GALNT2后相应细胞周期调控因子及MMP2、MMP9表达水平变化;
图16 EDU及CCk-8显示过表达GALNT2对细胞增殖及活性的影响图;
图17流式细胞术显示过表达GALNT2后位于G1期细胞数明显减少图;
图18 Transwell显示过表达GALNT2后肿瘤细胞侵袭迁移能力增加;
图19 Western显示敲除GALNT2后磷酸化EGFR表达水平下降图;
图20凝集素下拉实验显示敲除GALNT2后其O型糖基化水平下降图;
图21 Western显示加入Akt增强剂后各蛋白表达水平较敲除组明显增加图;
图22 CCK-8显示加入增强剂后细胞活性较敲除组明显增加图;
图23划痕实验显示加入增强剂后细胞迁移能力较敲除组明显增加图;
图24 Western显示加入PI3K抑制剂后各蛋白表达水平较GALNT2过表达组明显减少图;
图25 CCK-8显示加入抑制剂后细胞活性较GALNT2过表达组明显降低图;
图26划痕实验显示加入抑制剂后细胞迁移能力较过表达组明显降低图;
图27小动物成像显示敲除GALNT2后肿瘤生长速度明显减慢图;
图28敲除GALNT2后生存期明显延长图;
图29敲除GALNT2后体重降低速度明显减缓图;
图30 HE染色显示图:敲除GALNT2后肿瘤明显减小,侵袭性减弱图;
图31 HE显示敲除GALNT2后GALNT2表达量明显减少图;
图32 HE显示敲除GALNT2后Ki67及MMP2表达量明显减少图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
胶质瘤分级是根据其恶性程度进一步分级,通用WHO分级是根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级:
WHO I级、一般为良性,以毛细胞型星形细胞瘤为主,占胶质瘤5%左右是可以很好的治疗;
WHO II级、一般为星形细胞瘤或星形-少突细胞瘤,占胶质瘤的30~40%左右;
WHO III级、一般为间型星形细胞瘤,占胶质瘤的15~25%左右,一般由2级演变而来;
WHO IV级、一般为胶质母细胞瘤(GBM),占胶质瘤的1/3左右。
目前对胶质母细胞瘤(GBM)进行了基因水平的分类,将GBM分为四种亚类:
经典型(classical):7号染色体EGFR扩增/突变和10号染色体缺失;
间充质型(mesenchymal):NF1低表达伴有TNF和NF-κB信号通路高表达;
神经元型(neural):有神经元分化表现,表现出原神经元亚类和间充质亚类之间的特性。
前神经元型(proneural):主要特点为IDH1和IDH2以及p53基因突变。IDH突变型的GBM有独有的DNA甲基化即CIMP(CpG island methylator phenotype)。但不是所有的原神经元亚类GBM都有CIMP。具有CIMP的原神经元亚类GBM是所有GBM中预后最好的。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
(一)材料和方法
1.临床标本和TCGA数据库
临床标本来自山东大学齐鲁医院神经外科手术患者(n=30)胶质瘤标本(WHOII级-IV级),石蜡包埋。收集重型颅脑损伤部分切除减压治疗患者的正常脑组织样本(n=5)。肿瘤基因组图谱中样本的mRNA表达微阵列数据及伴随的临床信息(n=631)采用TCGA进行分析。
2.Cox比例危险模型
使用Cox比例危险模型来选择与患者生存相关的基因,并为未来的预测建立一个预测模型。结果时间定义为总生存期和无病生存期。选取N个基因构建Cox回归模型,每个基因Gj(j=1,2,…,N),建立了以下Cox模型。
其中为基因Gj的基线危险函数,X1、X2、…、XP为协变量。本实施例调整的协变量包括种族、年龄、性别、KPM(Karnofsky performance)评分、肿瘤形态和有无辅助治疗病史。
3.免疫组织化学(IHC)
从石蜡包埋组织获取不同级别的胶质瘤。病理切片在柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸提取抗原,3%H2O2阻断内源性HRP活性。用10%正常山羊血清阻断载玻片,用一抗(兔抗GALNT2单克隆抗体);(兔抗ki67和抗mmp2抗体)4℃过夜。使用horseradish-peroxidase-conjugated二抗和DAB。阴性对照,切片用正常家兔血清而非原抗体孵育。用苏木精染色,用莱卡DM 2500显微镜获得代表性图像。
4.基因集富集分析(GSEA)
为了深入了解胶质瘤中GALNT2表达相关的生物学过程和信号通路,使用BroadInstitute GSEA version 4.0软件进行。下载了TCGA数据库。富集分析所用的基因集从MsigDB(MsigDB,http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下载。
5.细胞培养
U87MG和U251人胶质瘤细胞株购自中科院(中国上海),在DMEM加入10%胎牛血清中培养。细胞在37℃含5%二氧化碳培养箱中培养。SC79(Abcam,ab146428)作为Akt激活剂,LY294002(Abmole,M1925)作为PI3K抑制剂。
6.GALNT2的下调和过表达
合成了靶向GALNT2的小干扰RNA(siRNA)(GenePharma;中国上海)。转染应用lipo3000试剂。通过qRT-PCR评价转染24h的敲除效率和western blot评价转染48h的敲除效率。同时,GALNT2过表达应用pENTER-GALNT2,阴性对照为pENTER-empty(2μ)。小干扰RNA序列(n=2)干扰有效:si-GALNT2 1:5′-CACCCAUCAUCGAUGUCAUTT-3′(SEQ ID NO.1)和si-GALNT22:5′-GCCUUCUGCUAGAAACGUUTT-3′(SEQ ID NO.2)。第二序列siRNA用于体外实验和稳定敲除。
7.实时定量PCR
采用Trizol试剂(Invitrogen,Life Technologies)从胶质瘤细胞中提取RNA。并进行逆转录。GALNT2的引物为正向引物:5’-TGTGCCTTACTGTGGTGGAC-3’(SEQ ID NO.3);反向引物:5’-GTTCCCATTTCTGTCTGCTGTC-3’(SEQ ID NO.4)。GAPDH引物为正向引物:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(SEQ ID NO.5);反向引物:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGA-3’(SEQ IDNO.6)。使用GraphPad Prism 6软件对进行分析。
8.Westernblot
收获的细胞在RIPA细胞裂解缓冲液中用热变性进行裂解。蛋白溶解产物(20μg)进行分析,把蛋白质转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。孵化主要抗体GALNT2(兔子anti-GALNT2抗体,0.4μg/ml),EGFR,pEGFR(Py1068)、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、p21、CDK4、cyclinD1、MMP-2、MMP-9、GAPDH(CST)。通过增强化学发光(ECL,Millipore,Bredford,USA)检测特异蛋白。
9.凝集素下拉试验
应用豌豆凝集素(VVA)琼脂糖珠(Vector Laboratories)检测糖蛋白中的Tn抗原。细胞溶解产物(0.5毫克)使用30μl VVA-conjugated琼脂糖珠4℃孵化16小时。通过离心(10000rpm,1min)收集凝集素/糖蛋白复合物。糖蛋白复合物煮沸5分钟。沉淀蛋白进行western blot检测EGFR的含量。EGFR总裂解量作为对照。
10.细胞增殖实验
细胞增殖采用细胞计数CCK-8。U87MG或U251(2×103/孔)细胞孵育24h,48h和72h。CCK-8 10μl加入,37℃孵育1小时,使用微型板块阅读器(Bio-Rad)测量OD450。EdU测定,细胞在200μL 5-ethynyl-20-deoxyuridine中孵育2h 37℃。使用4%多聚甲醛细胞固定20分钟,阿波罗试剂(100μL)孵育30分钟。细胞核与DAPI染色,代表图像获得使用尼康荧光显微镜。菌落形成实验将细胞播种到密度为500个细胞/孔的6孔板中。含有10%胎牛血清的DMEM每三天更换一次。15天后,菌落固定,用结晶紫染色15分钟,并拍照。每个试验重复3次。
11.流式细胞术
通过碘化丙酸(PI)染色测定DNA含量,进行细胞周期分析。U87MG和U251胶质瘤细胞,冲悬,并用碘化丙酸(PI)染色20分钟。使用流式细胞仪(BD Biosciences)对细胞进行分析。
12.3D肿瘤成球侵袭试验
胶质瘤成球是将细胞在球状形成基质中孵育72小时,将直径为>200mm的球状体植入96孔板中,加入侵袭胶。胶质瘤球状体每24小时用尼康显微镜拍摄一次。0h时的椭球体作为测量侵袭细胞侵袭面积的参考点。
13.Transwell侵入和迁移分析
为了进一步评估侵袭性,过滤器被预先涂上基质凝胶;将转染siRNA或质粒载体的U87MG和U251细胞在无血清培养基中加入顶室。底腔填充10%FBS DMEM。孵育24h后,将上层小试固定于4%甲醇中15min,用0.5%结晶紫溶液染色20min。并进行拍照。为了测量迁移,进行了同样的实验,但是过滤器没有预先涂上基质凝胶。
14.伤口愈合实验
此外,还使用伤口愈合试验评估细胞迁移。将转染siRNA或质粒载体的细胞用枪头划开,在无血清培养基中培养24小时,在显微镜下观察五个随机选取的病灶边界区域。
15.小鼠体内实验
建立颅内神经胶质瘤,U87MG荧光细胞(1×106)转染了Lenti-sh-GALNT2(序列和si-GALNT2 2相同)或Lenti-Control病毒,然后立体定向植入小鼠脑内。应用生物发光成像技术检测颅内肿瘤在第7、10、14、21、28天的生长情况。Kaplan-Meier生存曲线用于描述生存时间和体重。肿瘤组织14天后,福尔马林固定,使用GALNT2、Ki-67、MMP2行免疫组化。
16.统计分析
使用GraphPad Prism 6软件,应用ANOVA或t检验。所有实验重复3次,取平均值±标准误差。使用GraphPad Prism 6软件通过log-rank检验分析Kaplan-Meier生存曲线。应用卡方检验和费舍尔的确切分析用于确定GALNT2表达和临床病理之间的关系。p<0.05为差异有统计学意义。
(二)试验结果
1.GALNT2的表达与预后明显相关
采用Cox比例危险模型进行分析,结果如下Table 1所示。
Table 1 Cox危险模型分析GALNT2表达量与生存期的相关性
由上述Table 1结果表明GALNT2高表达组与低表达组相比,无论整体生存还是无病生存期均有统计学意义。在TCGA数据库中,所有胶质瘤患者中,GALNT2高表达的预后明显比GALNT2低表达的预后差(P<0.0001)。然而,在单独的GBM患者中,无明显统计学意义(P=0.103)(如图1所示)。
2.GALNT2表达的增加与胶质瘤肿瘤级别的增加和亚型有关
从TCGA数据库中分析了GALNT2在GBMs和LGGs中的基因表达水平,以及在正常脑组织中的表达水平。与正常脑组织和LGGs相比,GBMs中GALNT2mRNA水平显著升高。GALNT2表达量随着肿瘤级别升高而升高(如图2所示)。此外,有证据表明间充质亚型与前神经元亚型相比预后更差。本试验发现GALNT2在间充质亚型中的表达明显高于前神经元亚型。本试验还发现GALNT2高表达与患者临床病理特征有关,如患者年龄(≥45岁;P=0.001)。在胶质瘤中,IDH突变、MGMT启动子甲基化和1p/19q共缺失等分子遗传学特征已被证实与更好的预后相关。本申请人通过研究表明GALNT2的低表达与这些特征相关(P<0.001;)(如Table 2所示)。
Table 2 GALNT2表达水平与临床病理特征的相关性分析
本实施例采用免疫组织化学方法检测各级别胶质瘤和正常脑组织的GALNT2蛋白水平。与mRNA检测结果一致,在GBMs中,GALNT2蛋白的表达高于LGGs或正常脑组织。随着肿瘤级别升高,GALNT2表达量明显升高,如图3所示。此外,在特定标本中,肿瘤组织中GALNT2的表达明显高于瘤周组织,如图4所示。因此,无论是在数据库中还是以上所示临床数据中,GALNT2表达量均与肿瘤级别呈正相关。
3.GALNT2潜在的生物学功能和通路分析
为了预测GALNT2在胶质瘤中的潜在生物学功能和可能的信号通路,本实施例基于TCGA数据库中GALNT2的表达进行了GSEA。结果表明,GALNT2在肿瘤通路中富集。此外,GALNT2的高表达与上皮间充质转化(epi-mesenchymal transition,EMT)、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)受体相互作用、O型糖基化和EGFR相关。在信号通路分析中,发现PI3K/Akt/mTOR信号通路与胶质瘤中GALNT2的高表达呈正相关,如图5所示。
4.敲除GALNT2可诱导胶质瘤细胞周期阻滞
通过qRT-PCR评价转染24h的敲除效率和western blot评价转染48h的敲除效率。由图6可知,进行敲除后GALNT2的mRNA及蛋白表达水平均显著下降。EdU以及CCK-8结果显示GALNT2的下调导致转染后U87MG和U251 48h的EDU阳性细胞百分比和OD450值下降均有统计学意义(如图7所示)。细胞周期分析还表明,敲除GALNT2增加了U87MG和U251细胞在G0/G1期的数量(如图8所示),并利用克隆试验评价sh-GALNT2对细胞增殖的长期影响。结果表明,与对照组相比,sh-GALNT2转染细胞形成的集落明显减少(如图9所示)。
接下来使用western blotting来研究影响细胞周期的GALNT2下游靶点。GALNT2的下调显著降低了磷酸化Akt和mTOR的水平,而总Akt和mTOR的表达没有明显变化(如图10所示)。GALNT2敲除后细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1表达降低。与此相反,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21被认为肿瘤抑制因子,在敲除组中升高(如图10所示)。综上所述,这些结果表明敲除GALNT2抑制了胶质瘤细胞的细胞周期进展。
5.GALNT2敲除抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭
通过GSEA分析结果提示GALNT2在EMT过程中具有重要作用,EMT在侵袭性和肿瘤转移中起着重要作用。为了探讨GALNT2下调对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,首先进行了3D成球侵袭实验。敲除GALNT2可以减少U87MG和U251的侵袭面积(如图11所示)。接下来进行Transwell迁移和侵袭实验和伤口愈合实验。Transwell迁移实验中,与对照组相比,GALNT2敲除后迁移胶质瘤细胞数量明显减少(图12所示)。Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,GALNT2下调显著减少了48h时胶质瘤细胞通过基质包覆膜侵袭的数量(如图12所示)。伤口愈合实验表明,si-GALNT2转染后胶质瘤细胞迁移能力明显受到抑制(如图13所示)。
MMP2和MMP9是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成员,在肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥重要作用。通过观察GALNT2对MMP2和MMP9表达水平的影响,发现GALNT2的下调导致U87MG和U251细胞中MMP2和MMP9蛋白下调(如图14所示)。这些结果表明,敲除GALNT2对胶质瘤细胞的迁移和侵袭有显著的抑制作用。
6.GALNT2过表达促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭
为了进一步研究GALNT2过表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响,将细胞转染pENTER-GALNT2过表达质粒载体。Western blot分析证实,GALNT过表达组中,p-Akt、MMP2、CDK4、cyclin D1的蛋白水平和表达增加,而P21的表达减少(如图15所示)。进行EdU和CCK-8测定。GALNT2的上调导致U87MG和U251细胞中EdU阳性细胞百分比增加,OD450值增加(图16所示)。细胞周期分析表明,过表达GALNT2的U87MG和U251细胞滞留在G0/G1期明显减少(如图17所示)。在Transwell迁移实验中,迁移的神经胶质瘤细胞的数量在GALNT2过表达组明显增加(如图18所示)。侵袭实验显示,与对照组相比,GALNT2上调显著增加了胶质瘤细胞在48h通过基质涂层膜侵袭的数量(如图18所示)。
7.抑制GALNT2降低EGFR磷酸化和O型糖基化修饰
通过GSEA通路分析预测,在胶质瘤中GALNT2表达水平的升高与O型糖基化和EGFR呈正相关(如图5所示)。此外,已有研究表明GALNT2可以修饰EGFR的O型糖基化,进而影响EGFR的磷酸化。为了研究GALNT2抑制对胶质瘤中EGFR磷酸化的影响,转染细胞无血清孵育6小时,再被EGF(100ng/ml)刺激10分钟。数据显示,GALNT2敲除降低了EGF诱导的EGFR在U87MG和U251细胞中的磷酸化。然而,没有EGF刺激,pEGFR在U87MG和U251细胞中的表达几乎是不可见的(如图19所示)。为了探究GALNT2是否会影响EGFR在胶质瘤中的O型糖基化,进行了VVA凝集素下拉实验。VVA琼脂糖珠可以检测Tn抗原在EGFR上的表达。结果显示,GALNT2的下调降低了VVA与EGFR的结合,说明GALNT2的下调降低了EGFR的O型糖基化(如图20所示)。
8.GALNT2通过PI3K/Akt信号通路促进胶质瘤恶性进展
鉴于GSEA通路分析,本实施例验证了GALNT2传递信号是否通过PI3K/Akt/mTOR通路(如图5所示)。用Akt增强剂(SC79)处理了敲除组。p-Akt、p-mTOR、细胞周期调节因子表达增加,P21表达减少(如图21所示)。此外,CCK-8检测显示,与DMSO处理组相比,Akt增强剂处理后的敲除组增殖能力增强(如图22所示)。伤口愈合实验表明,与DMSO相比,Akt激活剂处理的GALNT2敲除细胞的迁移能力也有所提高(图23所示)。然后用PI3K抑制剂(LY294002)处理过表达组。与无抑制剂组相比,p-Akt、p-mTOR、细胞周期调节因子表达降低,P21表达增加(如图24所示)。CCK-8和创伤愈合实验结果显示,PI3K抑制剂治疗后能显著抑制GALNT2过表达组的增殖和迁移能力(如图25-图26所示)。这些数据表明GALNT2通过PI3K/Akt/mTOR信号通路传递信号。
9.GALNT2敲除抑制胶质瘤细胞在体内成瘤及其侵袭性
为了进一步验证GALNT2在胶质瘤中的作用,我们对裸鼠行原位种瘤。稳转sh-GALNT2的U87luciferase细胞的动物通过生物发光成像显示肿瘤大小明显受抑制(如图27所示)。sh-GALNT2组较对照组生存期更长(如图28所示),体重减轻速度明显慢于对照组(如图29所示)。两组同时采集肿瘤HE染色(种瘤14天后),sh-GALNT2组肿瘤体积明显减小,sh-GALNT2细胞肿瘤边界明显更规则(如图30所示)。免疫组化再次验证稳转sh-GALNT2的胶质瘤细胞中GALNT2蛋白水平降低(如图31所示)。sh-GALNT2种瘤中的增殖指标Ki-67和侵袭性标志物MMP2也有所下降(如图32所示)。这些结果表明,GALNT2敲除导致胶质瘤细胞在体内生长速度减慢、侵袭性明显降低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> GALNT2作为生物标志物在胶质瘤诊断和/或治疗中的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacccaucau cgaugucaut t 21
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccuucugcu agaaacguut t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtgccttac tgtggtggac 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttcccattt ctgtctgctg tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggtgaagac gccagtga 18