CN1179469A - 对甲基苯丙胺具有特异性之单克隆抗体,产生该抗体之杂交瘤,含此单克隆抗体之试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种对甲基苯丙胺(Ma,methamphe-tamine)具有特异性之单克隆抗体,产生该抗体之杂交瘤,含此单克隆抗体之试剂盒,及利用此单克隆抗体、杂交瘤及试剂盒侦测甲基苯丙胺滥用之用途。
Description
本发明是关于一种特异于甲基苯丙胺(methamphetamine,甲基安非他命)的单克隆抗体,产生该抗体的杂交瘤,含此单克隆抗体之试剂盒,以及利用此抗体、杂交瘤(hybridoma)及试剂盒检测甲基苯丙胺滥用之用途。
苯丙胺(安非他命)药物是一群合成的麻黄素类衍生物之总称。由于其构造上与神经传送物质(如多巴胺及肾上腺素等)非常类似,属中枢神经兴奋剂,可刺激中枢及周边交感神经之α及β受体,表现出神经及心脏血管系统之亢奋作用。其中最常见的为(+)-及(-)-苯丙胺,及(+)-及(-)-甲基苯丙胺。
在美国(-)-甲基苯丙胺(Vicks Inhaler)即用于鼻充血、鼻塞之吸入治疗剂(J.Anal.Tox.17:284,1993),并应用于治疗昏睡症病人、过动孩童及减肥用药。因此药具有提神、减低食欲、产生欣快感等作用,故滥用情形日渐严重。久用此药后,会造成此药物之成瘾性及耐药性。长期滥用会影响情绪、思考,中毒深者导致苯丙胺分裂症,产生暴力行为,危及社会治安。
依据本地卫生署及法务部调查局调查统计显示,自1990年以来台湾地区查获及送检的毒品数量已暴增40至50倍。毒品迅速蔓延及吸毒人口的迅速增加已成为当前社会治安的最大隐患,而本地吸食者又以苯丙胺类之甲基苯丙胺(中华医志48:305-9,1991)及海洛因占最大部分(94%)(药物食品简讯158期1993年10月20日)。
甲基苯丙胺,在正常情况下,有43%以原形在24小时内由尿中排出,仅有4-7%以苯丙胺形态排出,而约有15%以对-羟甲基苯丙胺及其他形态排出。因此,检验尿液中甲基苯丙胺及代谢物之含量,便可反应有无吸收甲基苯丙胺。有鉴于日渐增加之药物滥用问题,故有扩大施行全面滥用药物筛检的必要。
滥用药物检查主要包括两大步骤:初步的筛检及进一步的确认(Drugs ofAbuse Testing Market,Theta Corp.1991)。初步筛检需具有高敏感度,使用方便,并适合处理大量样品的特性。经筛选测试呈阳性样品,再经具有高特异性及精确性的方法,如气相层析/质谱仪(J.Anal.Tox.16:109,1992)或气相层析/付立叶转换红外线光谱仪(J.Anal.Tox.17:359,1993),加以确认。目前市售用来筛检苯丙胺药物滥用的分析方法包括薄层层析(TLC),高压液相层析(HPLC)及免疫分析(Immunoassay)。其中又以利用多株或单克隆抗体发展出的免疫试剂较佳,除具高特异及敏感度外,使用方便,反应快速,且样品不需前处理,非常便于进行大量检体的筛选之用。惟目前所使用的免疫试剂盒皆采整组进口,成本昂贵,同时品质上常会受到麻黄素及苯基丙醇胺(phenylpropanolamine)干扰,而产生伪阳性(药物食品简讯158期1993年10月)。为了要降低检验成本及提升试剂品质,发明人乃自行开发对(+)-甲基苯丙胺具高特异性及敏感性之单克隆抗体,并自行配组完成检验试剂。
本发明之一目的为提供一种对甲基苯丙胺具特异性之单克隆抗体。
本发明之另一目的为提供一种分泌该单克隆抗体之杂交瘤。
本发明尚有另一目的为提供一种包括该单克隆抗体以检测甲基苯丙胺滥用之试剂盒。
本发明更有另一目的为提供一种利用该单克隆抗体、杂交瘤及试剂盒以检测甲基苯丙胺滥用之用途。
本发明之目的、优点及特征可由下列之说明而更为明了。
附图之简单说明如下:
图1为甲基苯丙胺直接竞争型ELISA之标准抑制曲线。
图2为甲基苯丙胺简易层析免疫测试片于不同浓度甲基苯丙胺之测试结果。
本发明包括对甲基苯丙胺具特异性之杂交瘤细胞株,及其产生的抗体与抗体片段。本发明亦包括应用此抗体配制出之试剂盒,直接竞争型酵素免疫分析试剂盒及简易层析式免疫分析试剂盒。本发明另包括利用此抗体及试剂盒检测甲基苯丙胺滥用之方法。
本发明是利用已知技术,以B细胞融合方式制得对甲基苯丙胺具特异性的B细胞杂交瘤。其方法为利用已知之细胞融合剂,如聚乙二醇(PEG),将鼠源骨髓瘤细胞株与产生对抗甲基苯丙胺抗体的B淋巴细胞融合,以HAT筛选杂交瘤细胞株,再用间接酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)及竞争型ELISA分析杂交瘤培养基液中抗体之专一性,再选取对甲基苯丙胺具特异性之单克隆杂交瘤细胞株。然后将该杂交瘤细胞株注入小白鼠腹腔中以产生腹水,利用蛋白质纯化技术将单克隆抗体由腹水中回收。然后利用该单克隆抗体配制发展出直接竞争型酵素免疫分析试剂盒(Direct Competative ELISA Kit)及简易层析式免疫分析检验片(One Step Chromatographic Dip Stick),以检测尿甲基苯丙胺。
免疫分析的特异性及敏感性取决于抗体的特性,而是否能产生特异性抗体,免疫原的设计及制备关键至极。尤其是分子量小于1000道耳顿的药物如甲基苯丙胺,由于其分子量小,在免疫原上属于半抗原,即单独存在时不会刺激免疫系统产生免疫反应。传统上,为了要产生对抗小分子半抗原的免疫反应,一般需将小分子半抗原物质与大分子量具免疫原性的载体蛋白质结合,借助载体的免疫原性协助半抗原产生免疫力。故小分子半抗原与载体结合物的设计、结合及制备法等均会影响抗体的品质及特异性。
美国专利5,026,827使用N-(4-胺丁基)苯丙胺与蛋白质之结合物产生能与甲基苯丙胺结合的抗体。美国专利5,135,863应用烷氧基硫醇烷酰胺-苯丙胺/甲基苯丙胺制作抗体及酵素结合物以检测苯丙胺及甲基苯丙胺之存在。Kuroiwa等利用对-及邻-胺基甲基苯丙胺-BSA当作免疫原以制备抗甲基苯丙胺的单克隆抗体(Forensic Science International 44:245-255,1990;J.of Immunoassay12(2):277-292.(1991))。由于所应用的甲基苯丙胺衍生物具差异性,故所产生抗体的特异性均不相同。
其中
n为1-4;
R1为C1-4烷基,未经取代或经卤素取代;C1-4烷氧基;-OCH2Ph;或-OC(C1-4烷基)3;
R2为=O,=S或-H;
R3及R4各自为-H,C1-4烷基或二(C1-4烷基);
R5及R6各自为-H,或R5及R6一起表-(CH2)4-;
举例而言,R1可为-CF3,-CCl3,-CH3,-OCH3,-OC2H5,-OCH2Ph或-OC(CH3)3;R3及R4可为-H,-CH3或-(CH3)2。载体蛋白质可使用例如白蛋白、球蛋白、血蓝质、铁蛋白质等等。
在本发明之一具体实施例中,是应用N-三氟-甲基苯丙胺-对-丁酸-N-羟基琥珀酸二酰亚胺酯与牛血清白蛋白之结合物当作免疫原,所产生单克隆抗体的特异性详如下列实例所述。利用本发明抗体研制出的ELISA试剂盒与GC/MS的相关性较市售MicrozymeTM(Immunotech Corp,U.S.A)佳,表示本发明之抗体较先前技术已有的抗甲基苯丙胺的抗体具显著的进步性。
直接竞争型免疫分析法是将抗甲基苯丙胺的单克隆抗体粘附在固相支持物之表面。测试时,不同标准浓度之甲基苯丙胺或待测样品,与已连接有讯号(如酶,萤光剂,放射元素等)的甲基苯丙胺复合物,一起置入反应。由于甲基苯丙胺会与甲基苯丙胺-讯号复合物相互竞争有限的抗甲基苯丙胺抗体,故藉已知标准浓度的甲基苯丙胺所产生讯号强弱所建立之一条甲基苯丙胺抑制标准曲线,可检测待测尿液样品中的甲基苯丙胺是否存在及其含量。
直接竞争型免疫分析试剂盒包括(1)固相支持物,(2)抗甲基苯丙胺单克隆抗体,(3)甲基苯丙胺标准品,(4)甲基苯丙胺-讯号复合物,及(5)呈色物质。固相支持物可为微滴盘(microtiter plate)、微球体(beads)及纸(paper),是由适宜蛋白质固定的材料构成,适用之材料可为例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、硝化纤维、耐龙等。讯号可使用例如萤光物,如镧系萤光物;冷光标记物(luminescents),如生物冷光标记物及化学冷光标记物;放射性元素;及酵素,如过氧化氢酶、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶等。该分析方法及反应条件是利用已知技术(Antibody:A Laboratory Manual,Ed.Harlow &Dayid Lane,1988)。
简易层析式免疫检验法是利用抗原与抗体之特异性结合并配合色层分析法所发展出来的一种简便、快速、肉眼即可判读结果之免疫检验法,适用于个人,不需特殊经验即可操作使用。
简易层析式免疫分析检验片包括(1)样品接触区,(2)抗甲基苯丙胺-指示剂区,(3)反应测试区,及(4)液体回收区。该检验片是由可提供毛细现象并吸附液体之材质之多孔性载体物质所构成,例如滤纸、硝化纤维膜、耐龙膜、玻璃纤维膜等。指示剂可使用例如有颜色乳胶颗粒(colored latex particles),例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯甲苯(polyvinyltoluene)、聚苯乙烯-丙烯酸(polystyrene-acrylic acid)及聚丙烯醛(polyacrolein)等材料的聚合物;金属胶质溶液(metallic colloidal sol),例如金胶质溶液(gold sol);非金属胶溶液(nonmetallic sol),例如硅胶溶液(colloidal silica particles),及染料胶质溶液(dye sol),该等原料皆是商业化之产品。
样品接触区位于检验片之一端,与待测样品相接触,将吸附之样品依毛细现象向另一端移动,以致湿透整个检验片。指示剂区接近样品接触区,该区以干燥形式聚集有抗甲基苯丙胺的单克隆抗体与具高稳定性、不需特殊仪器、用肉眼即可判读的指示剂的结合物。测试区位于指示剂区之上方,该区固定有颜色反应物,如甲基苯丙胺-载体抗原结合物,可与抗甲基苯丙胺抗体-指示剂发生反应,而显现出一肉眼判读之讯号变化。该载体抗原可为例如白蛋白、球蛋白、血蓝质、铁蛋白质等。
反应测试时,将检验片之样品接触区端与已知标准浓度之甲基苯丙胺尿液及待测样品相接触。尿液依毛细现象向上浸湿,并回溶抗体-指示剂结合物。若尿液中含有甲基苯丙胺,则会与测试区上的甲基苯丙胺-载体抗原相互竞争有限的抗甲基苯丙胺-指示剂结合物,故样品中甲基苯丙胺含量愈高,测试区阳性讯号愈弱。由测试区反应之有无及强弱,可判定尿液中是否含有甲基苯丙胺及其含量。
为了使本发明的目的、方法、特征及原理更清楚明了,兹以下列实例配合附图作详细叙述,但此等实便并不对本发明范围作任何局限。本说明书中之英文简写名词系如下定义:
HAT:次黄嘌呤(Hypoxanthine)/胺基蝶呤(Aminopterin)/胸腺核苷
Tg:牛甲状腺球蛋白
FCS:胎牛血清
DMSO:二甲亚砜
PBS:磷酸盐缓冲溶液
TMB:四甲基联苯胺(Tetramethyl benzydine)
BSA:牛血清白蛋白
实施例1:杂交瘤(2602-16.2)的制备
(+)-甲基苯丙胺-对-丁酸-牛血清白蛋白之制备方法
取14mg N-三氟-甲基苯丙胺-对-丁酸-N-羟基琥珀酸二酰亚胺酯溶于2.8mlDMSO中。取2.55ml溶液加入20ml牛血清白蛋白(100mg/0.5M碳酸钠溶液)中,于冰浴中搅拌反应。隔夜后,反应物用0.1M pH11的碳酸钠溶液充分透析后,再置换于pH7.4的磷酸缓冲液中,冻晶保存。
取(+)-甲基苯丙胺-对-丁酸-牛血清白蛋白之结合物(MA-BSA)(MA/BBSA之摩尔比为2.6)与Freunds佐剂(第一次免疫用完全佐剂,之后用不完全佐剂)之1∶1(v/v)乳化液经皮下注射入BALB/C小鼠(每只使用125μg BSA),一周一次,连续4次。然后再每四周补强一次(每只40μg),共进行5次。进行细胞融合的前三天,再用静脉注射(不含佐剂)追加一次。三天后,将脾脏细胞与鼠源骨髓瘤细胞FO细胞株(ATCC CRL 1646),用50%之聚乙二醇-400(PEG400),以1∶3比例,进行融合。融合后,将细胞悬浮于RPMI培养基(HAT,20%FCS)中,稀释成1×105FO细胞,种入96孔培养基中(0.2ml/孔)。10天后,以吸附有(+)-MA-牛甲状腺蛋白结合物(MA-Tg)(MA/Tg之摩尔比为5.8)之ELISA盘测试细胞培养上清液。选取与(+)-甲基苯丙胺(MA)具特异性的杂交瘤,以限制稀释法予以单克隆化。用此方法选出单克隆细胞之杂交瘤2602-16.2,测其分泌的单克隆抗体,知其为IgG2m,Kappa轻键,其等电点为6.7-7.0。此株杂交瘤(于含10%DMSO及90%FCS中)可以储存于-70℃及液态氮中,及使用标准之哺乳动物细胞培养技术(含10%胎牛血清之RPMI 1640补充以200mM谷胺酰胺及5μM 2-琉基乙醇)予以培养。此株杂交瘤已于1994年7月13日寄存于食品工艺发展研究所之菌种保存及研究中心,经编号为960003。
实施例2:检测甲基苯丙胺滥用的直接竞争ELISA法抗体附着盘的制作方法
将2602-16.2单克隆抗体用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)稀释成2.5μg/ml。取200微升,附着于96孔聚苯乙烯微孔盘之每孔表面上,于4℃过夜培养。用0.05%Tween 20-PBS冲洗4次,然后拍干。每一微孔中加250μl的0.1%脱脂奶粉-PBS,于37℃阻断30分钟。用0.05%Tween 20-PBS洗三次,拍干后备用。甲基苯丙胺-过氧化氢酵素结合物之制备方法
先将过氧化氢酵素(5mg/ml)于pH=4.5,50mM醋酸钠中,用10mM之过碘酸钠于室温下氧化30分钟。然后用50mM醋酸钠溶液透析除去过碘酸钠。然后加入15μl的N-三氟甲基苯丙胺-对-丁酸-联氨。于室温反应1小时后,再用pH11.5之0.5M碳酸钠溶液调反应物之pH至9.5。然后再加入20mM硼氢化钠,于4℃过夜还原。将反应物用0.1M碳酸钠(pH=11)透析2小时。再将缓冲液置换成0.1M pH=8.0的醋酸钠,分装储存于-70℃备用。
测试时,分别取50μl配制于阴性尿液中的(+)-甲基苯丙胺标准品(0,50,100,200,300,500,750及1000ng/ml)及表二及表三所列药物(浓度详见表二及表三),加入附着有抗体2602-16.2的微孔中,再加入150μl甲基苯丙胺-过氧化氢酵素结合体(稀释4200倍)。混合后,置于室温下反应10分钟。然后将反应液丢弃,以0.05%Tween 20-PBS充满,然后丢弃。重复洗5次后,加入100μl过氧化氢酵素受质TMB,于室温下反应10分钟后,加入50μl的2N HCl以中止反应。测定OD450/650值。
表一为(+)-甲基苯丙胺标准浓度的吸光值,及6个重复测试的变异系数(coefficient of variation,cv)及抑制百分比。可知每一浓度的cv均小于10%。抑制百分比代表抗体对特定物质的相对敏感度,其计算方法为(1-OD测试/ODOMA),其中ODOMA为不含MA的阴性控制液的OD,而OD测试为含有不同浓度的MA或其他非MA药物(详见表二及表三)的OD。图1为使用本发明直接竞争ELISA,(+)-MA所产生的标准抑制曲线(γ=0.993)。如用不含MA阴性对照组变异系数10%的2倍标准偏差>20%代表明显差异的话,则MA直接竞争免疫试剂盒的敏感度可达50ng/ml。
表二所列的94种非(+)-甲基苯丙胺的药物,于100μg/ml测试时均不会产生>20%抑制。添加不同浓度表三所列药物时,由所测得的浓度计算交叉反应百分比,发现除(+)甲基苯丙胺外,2602-16.2单克隆抗体亦可检测到甲基安非的代谢物对-羟甲基苯丙胺及会产生幻觉的苯丙胺类似物3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(J.Anal.Tox.14:146-150,1990)。(+)-伪麻黄素会产生平均36%的交叉反应性。对二苯安明、苯乙肼(phenelzine)及糠硝烯二胺(Ranitidine)的交叉反应率均小于1%。
由于过碘酸钠会将氢胺类(hydroamine)药(如麻黄素及伪麻黄素)分解成小片断(J.Anal.Tox.17:125-126,1993),故本发明乃设计将过碘酸钠(125mM)附着于96微孔盘中干燥,然后做疑含(+)伪麻黄素引起阳性尿液的前处理用。表四为尿液中含有不同浓度的(+)伪麻黄素或(+)甲基苯丙胺于室温下反应10分钟后的效果。此处理可有效降低(+)伪麻黄素的干扰,将交叉反应性由原36%降至平均5%。同时,此处理不影响(+)-甲基苯丙胺抑制曲线。
利用本发明的直接竞争ELISA试剂盒测试213个样品,其中80个气相层析/质谱仪确认为阳性,3个确认为阴性,及130个为一般尿液。若ELISA用≥300ng/ml判为阳性,则本试剂与气相层析/质谱仪所得结果的符合率、敏感性及特异性均高,其结果详见表五。
为了证明本发明的进步性,利用市售MicrozymeTM甲基苯丙胺/苯丙胺酵素免疫分析(Immunotech Corp.,U.S.A)。测试106个样品,其中52个气相层析/质谱仪确认为阳性,3个确认为阳性,及51个为一般尿液。若依试剂规定≥300ng/ml判为阳性,则此市售ELISA试剂与气相层析/质议依所得结果如表六所示。结果可知,利用本发明的单克隆抗体研制出的连接酶检验试剂的符合率,Kappa及特异性均有显著的进步性。表一、甲基苯丙胺各种浓度标准品之吸光值及六次重复测试之变异系数及抑制百分比
表二、抑制百分比小于20%之药物(100μg/ml)
表三、具交叉反应性之非(+)甲基苯丙胺药物
表四、过碘酸钠对(+)甲基苯丙胺及(+)伪麻黄素之影响
表五、(+)甲基苯丙胺直接竞争ELISA与气相层析/质谱样品比对结果。
MA浓度(ng/ml) | OD 450/650 | SD | CV% | 抑制% | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | ||||
1000 | 0.317 | 0.335 | 0.289 | 0.282 | 0.301 | 0.285 | 0.302 | 0.021 | 6.9 | 82.6 |
750 | 0.375 | 0.370 | 0.318 | 0.317 | 0.362 | 0.325 | 0.345 | 0.027 | 7.9 | 80.1 |
500 | 0.462 | 0.482 | 0.418 | 0.442 | 0.403 | 0.399 | 0.434 | 0.033 | 7.7 | 74.9 |
300 | 0.651 | 0.641 | 0.656 | 0.614 | 0.563 | 0.561 | 0.614 | 0.043 | 7.0 | 64.5 |
200 | 0.829 | 0.848 | 0.763 | 0.767 | 0.819 | 0.731 | 0.793 | 0.046 | 5.8 | 54.2 |
100 | 1.131 | 1.075 | 1.047 | 1.103 | 1.126 | 1.034 | 1.086 | 0.041 | 3.7 | 37.3 |
50 | 1.441 | 1.386 | 1.444 | 1.248 | 1.332 | 1.328 | 1.363 | 0.076 | 5.5 | 21.3 |
0 | 1.773 | 1.624 | 1.909 | 1.709 | 1.721 | 1.653 | 1.732 | 0.102 | 5.9 | 0.0 |
扑热息痛 | 那可丁 |
乙酰基吗啡 | 纳洛酮 |
aminophylline | 环丙甲羟二羟吗啡酮 |
阿米替丁 | 去甲吗啡 |
1-苯丙胺 | 烯丙吗啡 |
d-苯丙胺 | 罂粟碱 |
抗坏血酸 | 镇痛新 |
天冬胺酸 | 非那西丁 |
阿托品 | 苯巴比妥 |
巴比妥 | 苯丁胺 |
苯甲酸 | 苯福林 |
(+)马来酸溴苯吡胺 | 苯基乙胺 |
咖啡因 | 苯基丙醇酸 |
利眠宁 | 强的松 |
扑尔敏 | 扑痫酮 |
甲氰咪胍 | 普鲁卡因胺 |
可待因 | 普鲁卡因 |
柠檬酸 | 异丙嗪 |
可卡因 | 丙氧芬 |
二乙胺苯丙酮 | (-)伪麻黄素 |
4-氨基比林 | 青霉素G |
美沙芬 | 苯环己哌啶 |
去甲安定 | 奎宁 |
(+)2,5-二甲氧基-4-甲基苯丙胺 | 水杨酸 |
麻黄素 | 磺胺醋酰 |
肾上腺素 | 磺胺嘧啶 |
红霉素 | 磺胺间二甲氧嘧啶 |
乙基-对-氨基苯甲酸酯 | 磺胺甲基嘧啶 |
EDTA二钠盐 | 磺胺二甲嘧啶 |
苯氧苯丙酸 | 磺胺甲噻二唑 |
庆大霉素 | 磺胺异噁唑 |
D-(+)-葡萄糖 | 磺胺甲基吡嗪 |
homotropine | 磺胺间甲氧嘧啶 |
DL-β-羟苯乙胺 | 氨基磺胺 |
盐酸丙咪嗪 | 乙酰磺胺硝苯 |
消炎痛 | 磺胺喹噁啉 |
氯胺酮 | 磺胺噻唑 |
labetalol | 苯磺唑酮(sulfinpirazone) |
利多卡因 | 磺胺异噁唑 |
氯羟去甲安定 | 链霉素 |
(-)甲基苯丙胺 | 蔗糖 |
甲基麻黄素 | 士的宁 |
甲苯丁胺 | 叔丁喘宁 |
盐酸噻吡二胺 | 四环素 |
(-)美沙酮 | 四氢萘唑啉 |
吗啡 | 蒂巴因 |
(+)3,4-亚甲基二氧基苯丙胺 | 茶碱 |
(+)尼古丁 | 苄吡二胺 |
去甲替林 | 酪胺 |
测试化合物 | 所加浓度(μg/ml) | 所测浓度(μg/ml) | 交叉反应性% |
对二苯安明 | 2001007550 | 0.2310.1520.0950.064 | 0.10.20.10.1 |
对-羟甲基苯丙胺 | 10.75 | 0.8310.718 | 83.195.7 |
0.50.30.10.05 | 0.4810.3010.0800.046 | 96.2100.380.092.0 | |
3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA) | 10.750.50.30.10.05 | 0.9800.8310.5920.3690.1050.061 | 98.0110.8118.4123.0105.0122.0 |
苯乙肼 | 2001007550251051 | 0.9920.3010.1720.0810.0210.0140.0120.012 | 0.50.30.20.20.10.10.21.2 |
(+)伪麻黄素 | 510.750.50.30.1 | 1.0720.3750.2930.1980.0920.032 | 21.437.539.139.630.732.0 |
糠硝烯二胺 | 2001007550 | 0.2000.0920.0640.046 | 0.10.10.10.1 |
测试化合物 无NaIO 4 有NaIO 4浓度 抑制 交叉反应性 抑制 交叉反应性μg/ml % % % % |
(+)伪麻黄素 5.00 89.6 21.4 0.0 0.31.00 68.7 37.5 0.0 1.50.75 6 3.8 39.1 0.0 2.00.50 56.0 39.6 1.8 3.60.30 40.7 30.7 0.9 5.70.10 19.9 32.0 0.4 17.0 |
(+)甲基苯丙胺 1.00 84.8 78.00.75 82.1 75.50.50 74.7 69.7 |
0.30 70.7 68.20.10 41.5 33.50.05 26.7 20.30.00 0.0 0.0 |
无NaIO4 有NaIO4GC/MS(+) 79 80ELISA(+)GC/MS(-) 129 131ELISA(-)GC/MS(+) **1 0ELISA(-)GC/MS(-) ***4 2ELISA(+)总共 213 213符合率 0.976 0.99Kappa 0.95 0.98敏感性 0.99 1.00特异性 0.97 0.985*ELICA(+):>300ng/ml(+)甲基苯丙胺GC/MS(+):>50ng/ml甲基苯丙胺及苯丙胺**使用ELISA之三个个别实验之平均(+)苯丙胺之浓度为277ng/ml***4个样品中有1个样品经GC/MS证实为阴性。Kappa:机率校正的比例符合率(Chance-corrected Proportional Agreement)(Practical Statistics for Medical Resarch,Douglas G.,Altman &Chapman & Hall.1991,p.403)敏感性(能正确判定为阳性的百分比)特异性(能正确判定为阴性的百分比)
真正的阴性数+假阳性数表六、市售MicrozymeTM酵素免疫分析法与气相层析/质谱样品对比结果
*GC/MS(+) 52
ELISA(+)
GC/MS(-) 48
ELISA(-)
GC/MS(+) 0
ELISA(-)
GC/MS(-) **6
ELISA(+)
总共 106
符合率 0.943
Kappa 0.886
敏感性 1.0
特异性 0.889
*ELISA(+):>300ng/ml(+)甲基苯丙胺及苯丙胺
GC/MS(+):>50ng/ml甲基苯丙胺及苯丙胺
**6个样品中有3个样品经GC/MS证实为阴性。实施例3:检测甲基苯丙胺滥用的简易层析式免疫分析法抗甲基苯丙胺(2602-16.2)-蓝色乳胶结合体的制备方法
于1.5ml的小离心管中,逐步加入200μg混合均匀的蓝色乳胶(羧基修饰的聚苯乙烯,10%solid,0.284μM,Seradyn,U.S.A),650μl硼酸盐缓液(50mM,pH=8.5),1mg 2602-16.2抗体,再加水至1ml。混合均匀后,放在回转式振荡器上,于室温下反应18小时。然后使用12,000xg于4℃下离心15分钟,将上清液除去。将沉淀颗粒(pellet)用1ml之50mM硼酸盐缓冲液(pH:8.5)再悬浮。然后以12,000xg离心,将上清液除去。如此重复清洗3次后,将抗体-乳胶颗粒(pellet)悬浮于1ml的10%BSA-硼酸盐缓冲液(50mM,pH=8.5),置于回转式振荡器中于室温反应2小时。然后用1,200xg离心15分钟。最后将抗体-乳胶颗粒悬浮于1ml的含有15%Trehalose,0.01%NaN3的硼酸盐缓冲液(50mM pH=8.5)中,置于4℃保存。
简易层析式免疫检验测试片的制备。
将孔隙5μm的硝化纤维膜(Schleider & Schnell)剪成长宽为10公分×2.0公分的薄片(相当于20个0.5公分×2.0公分的测试片)。在距宽边(2.0公分)的顶端约0.6公分(控制区处)及1.2公分(测试区处),分别用喷枪(2kg/cm2的压力)将兔子抗老鼠IgG的抗体(1mg/ml及甲基苯丙胺-对-丁酸-牛甲状腺球蛋白(0.8mg/ml)喷于该二处,使成约1.5毫米宽度的线状。置于室温下风干30分钟后,再将其置于含有阻断缓冲液(0.25%酪素,0.01Triton X-100,3%Trehalose-PBS(20mM))中。于室温阻断30分钟后,取出置于20℃,30%湿度恒温湿室中干燥30分钟。
剪取一长宽为10公分×7公分,单面有胶的塑胶背板。在距宽边(7公分)顶端的3公分至5公分处,附着上述已制备好的硝化纤维膜。由顶端至3公分处,粘附10公分×3公分的滤纸(Whatman)。于下方样品接触区,粘附一张10公分×2公分的玻璃纤维膜。在玻璃纤维膜距硝化纤维膜底端1.5公分处,喷上总共8μl的抗甲基苯丙胺-蓝色乳胶结合物。于恒温(20℃)恒湿(30%)室过夜干燥后,切成0.5公分×7公分的小薄片。
测试时,使其下端的样品接触区浸泡于约200μl含有(+)-甲基苯丙胺浓度分别为1000,500,300,100ng/ml的尿液中,另有一不含MA的尿液作为对照组。5-10分钟后,若控制区及测试区均出现蓝色讯号,则反应为阴性,表示样品中不含所欲侦测的MA;若只有控制区显现蓝色讯号,而测试区未显现蓝色讯号或显现极弱的蓝色讯号,则反应为阳性,表示样品中含有欲检测的MA。测试结果如图2,显示此测试片的敏感度为300ng/ml。此外,于样品接触区的玻璃纤维膜上吸附过碘酸钠,可有效解决(+)伪麻黄素所引的交叉反应。
本发明可容许各种修改及变化形式,其特定具体实施例已藉实施例的方式例示并详细说明。然而,应了解,其并非用以限制本发明于所揭示的特定形式,而用以涵盖所附权利要求所定义的本发明的精神及范围内的所有的修饰、类似及改变。
Claims (29)
1、一种杂交瘤,其是骨髓瘤细胞与产生抗甲基苯丙胺抗体的B细胞融合的细胞株,产生对甲基苯丙胺具特异性的单克隆抗体。
2、根据权利要求1所述的杂交瘤,其中B细胞是得自以甲基苯丙胺衍生物与载体蛋白质结合物免疫的动物。
3、根据权利要求2所述的杂交瘤,其中甲基苯丙胺衍生物具有下通式其中
n为1-4;
R1为C1-4烷基,未经取代或经卤素取代;C1-4烷氧基;-OCH2Ph;或-OC(C1-4烷基)3-;
R2为=O,=S或-H;
R3及R4各自为-H,C1-4烷基或二(C1-4烷基);
R5及R6各自为-H,或R5及R6一起表-(CH2)4-。
4、根据权利要求3所述之杂交瘤,其中甲基苯丙胺衍生物是甲基苯丙胺-对-丁酸。
5、根据权利要求2所述的杂交瘤,其中载体蛋白质是白蛋白、球蛋白、血蓝质、铁蛋白质。
6、根据权利要求1所述的杂交瘤,其中骨髓瘤细胞为鼠源骨髓瘤细胞F0细胞株,B细胞是得自以甲基苯丙胺-对-丁酸-牛血清白蛋白免疫的鼠。
7、根据权利要求2所述的杂交瘤,其为鼠源B细胞杂交瘤2602-16.2。
8、一种单克隆抗体,其是对甲基苯丙胺具特异性的,是由权利要求1的杂交瘤所产生的。
9、一种制备根据权利要求1的杂交瘤的方法,其包括以B细胞融合方法融合骨髓瘤细胞与产生抗甲基苯丙胺抗体的B细胞,及选取对甲基苯丙胺具特异性的单克隆杂交瘤细胞株。
10、根据权利要求9所述的方法,其中B细胞是得自以甲基苯丙胺衍生物与载体蛋白质结合物免疫的动物。
11、根据权利要求10所述的方法,其中甲基苯丙胺衍生物具有下通式其中
n为1-4;
R1为C1-4烷基,未经取代或经卤素取代;C1-4烷氧基;-OCH2Ph;或-OC(C1-4烷基)3;
R2为=O,=S或-H;
R3及R4各自为-H,C1-4烷基或二(C1-4烷基);
R5及R6各自为-H,或R5及R6一起表-(CH2)4-。
12、根据权利要求11所述的方法,其中甲基苯丙胺衍生物是甲基苯丙胺-对-丁酸。
13、根据权利要求10所述的方法,其中载体蛋白质是白蛋白、球蛋白、血蓝质、铁蛋白质。
14、根据权利要求9所述的方法,其中骨髓瘤细胞为鼠源骨髓瘤细胞FO细胞株,B细胞是得自以甲基苯丙胺-对-丁酸-牛血清白蛋白免疫的鼠。
15、根据权利要求9所述的方法,其中使用聚乙二醇进行细胞融合。
16、一种试剂盒,其包括根据权利要求8的单克隆抗体。
17、根据权利要求16所述的试剂盒,其为直接竞争型ELISA试剂盒。
18、根据权利要求17所述的试剂盒,其包括(1)固相支持物,(2)根据权利要求8所述的单克隆抗体,(3)甲基苯丙胺标准品,(4)甲基苯丙胺-讯号复合物,及(5)呈色物质。
19、根据权利要求18所述的试剂盒,其中固相支持物为微滴盘、微球体或纸。
20、根据权利要求18所述的试剂盒,其中讯号选自萤光物、冷光标记物、放射性元素及酵素。
21、根据权利要求20所述的试剂盒,其中酵素选自过氧化氢酶、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶。
22、根据权利要求16所述的试剂盒,其为层析式免疫检验片。
23、根据权利要求22所述的试剂盒,其包括(1)样品接触区,(2)根据权利要求8的单克隆抗体-指示剂区,(3)反应测试区,及(4)液体回收区。
24、根据权利要求22所述的试剂盒,其中该检验片由可提供毛细胞现象并吸附液体的材质的多孔性载体物质所构成。
25、根据权利要求24所述的试剂盒,其中该检验片选自滤纸、硝化纤维膜、耐龙膜、玻璃纤维膜。
26、根据权利要求23所述的试剂盒,其中该指示剂选自有颜色乳胶颗粒,如聚苯乙烯、聚乙烯甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸及聚丙烯醛的聚合物;金属胶质溶液,如金属质溶液;非金属胶溶液,如硅胶溶液,及染料胶质溶液。
27、根据权利要求23所述的试剂盒,其中反应测试区含有甲基苯丙胺-载体抗原结合物。
28、根据权利要求27所述的试剂盒,其中载体抗原为白蛋白、球蛋白、血蓝质、铁蛋白质。
29、一种侦测尿液中甲基苯丙胺的方法,该方法是利用根据权利要求8的单克隆抗体或根据权利要求16-28中任一项的试剂盒检测尿液。
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