JPS63112599A - 免疫複合体レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 種々の試料中の微量の有機物質を測定する正確かつ高感
度な方法の必要性が存在し、しかも高まりつつある。例
えば、生理的液体中の薬物、天２”（生理活性化合物ま
たは栄養源、食物、水よＬ’ｊま他の液体中の微量の汚
染物または毒性物質などを測定ずろ方法や、化学工程中
に導入された微量の汚染物のモニタリングを行うための
方法の必要性が高まっている。

利用性の高まりつつある種々の方、去の一つに、１分子
またはそれ以上の分子の特定の極性および空間的構成（
ｏｒｇａｎｉｚａｒｉｏｎ）を認識し、または該構成に
結合するレセプターを用いろ方法がある。多くの場合、
レセプターは抗体であり、この方法は免疫アッセイと称
される。このような方法においては、従来ては、ラベル
したリガンドを使用し、そのレセプターへの結合によっ
て結合ラベルリガンドと非結合ラベルリガンドとを識別
していた。

通例へテロジーニャスと称されろ方法は、結合ラベルリ
ガンドと非結合ラベルリガンドとを分離して行なわれる
。通例ホモジーニヤスと称される他の方法は、結合ラベ
ルリガンドが非結合リガンドとは異なるシグナルを発生
することによって行なわれる。

多価抗原の少なくとも２種の異なる結合部位を用いて該
抗原を検出する方法が知られている。２部位免疫アッセ
イ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ　　ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　
　ａｓｓｅｙ）がよく知られている。このような方法は
、液体試料中の決定基を複数個￥ｆする抗原のダ在の検
出または濃度の測定に用いられろ。このような方法は、
１つの抗原決定基に対する固定化抗体と、他の抗原決定
基に対する抗体（得られる免疫複合体を検出するために
、間接または直接にラベルされている。）との両方に抗
原を反応させろことによって行う。ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とモノ
クローナル抗体との組み合わせを使用することも知られ
ている。免疫アッセイに２種の抗体を用いると、抗体と
試料中のすへてのアナライトとを確実に完全に結合させ
るために抗体を過剰に用いるので、アッセイの感度を高
めることができる。２部位免疫アッセイにおいて乙、モ
ノクローナル抗体を使用すると、陽性の結果をらたらす
には同−分子上に２９Ｉのエピトープ部位か存在する必
要があるので、アッセイの特異性が高まる場合がある。

２種の抗体を用いて行う前記のようなアッセイは、アナ
ライトが多価抗原である場合にｑ用でδ５るが、２種の
抗体を用いろことによるこのような利点は、薬物または
他の有機化合物のようなモノエピトープ抗原に対しては
もたらされていない。

（従来の技術） イムノアッセイの感度を高めろために２種の抗体を使用
することは、米国特許第４，２８１．０６１号に記載さ
れている。異なるクラスまたはサブクラスのモノクロー
ナル抗体を用いろ２部位免疫アッセイおよび該アッセイ
用試験キットは、米国特許第・１，４７４，８９２号に
開示されている。少なくとも２種の皮なるモノクローナ
ル抗体を用いて行う多価抗原の検出および／または測定
方法は、米国特許第４，４７１，０５８号に記Ｉ！され
ている。

米国特許第４．．４８６，５３０号には、モノクローナ
ル抗体を用いるイムノアッセイが開示されている。モノ
クローナル抗体混合物およびイムノアッセイの感度を高
めるためのその用途は、米国特許第・＋、３１４．５０
５号に記載されている。イムノアッセイにおける抗イデ
イオタイプ抗体の使用は、米国特許第４．５３６，４７
９号に記載されている。

米国特許第４，０６２，９３５号には、ＲＦと抗原−抗
体複合体との結合によるイムノアッセイが開示されてい
る。免疫複合体を形成している抗原または抗体の高感度
イムノアッセイ１は、米国特許第４．４５９．３５９号
に開示されている。免疫；見合体のアッセイは、米国特
許第４．１４！、９６５号に記載されている。米国特許
第４０．１２０．ｌ＋　６１号には、免疫複合体検出用
凝集阻止試験キットが開示されている。免疫応答の新規
な成分である抗体は、ネマジー（Ｎｅｍａｚｅｅ）ら、
ブロノーデ、ｆングス・才ブ・ナノヨナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、米国、７９：３８２８−３８
３２（１９８２年）に記載されている。

［発明の要約コ 本発明は、イムノアッセイを行うための組成物および方
法を提供する。本発明の一態様は、モノエピトープ抗原
と該抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該複合
体を形成していないモノエピトープ抗原または抗体に対
する結合？−σｆ１］性よりも実質的に大きい結合親和
性を示す抗体に関するっ通例、モノエピトープ抗原の分
子量は約１５００を越えず、抗体はモノクローナル抗体
である。本発明の抗体は、イムノアッセイＺこおいて使
用するラベルと結合していてよい。

本発明の他の態様は、モノエピト−プ抗原またはその類
縁体、該モノエピトープ抗原に結合する第１抗体、およ
び前記モノエピトープ抗原またはその類縁体と第１抗体
との免疫複合体に対して、該複合体を形成していないモ
ノエピトープ抗原または第１抗体に対する結合親和性よ
りも大きい結合親和性を示す第２抗体の免疫サンドウィ
ッチ複合体を含んで成る組成物に関する。

本発明の他の態様は、モノエピトープ抗原と第１抗体と
の免疫複合体に結合する抗体を調製する方法に関する。

この方法においては、相補的な抗原でアフィニティーラ
ベルした第１抗体で動物を免疫する。

本発明の池の態様は、試料中のモノエピトープ抗原を測
定する方法に関する。この方法は、モノエピトープ抗原
またはその類縁体、該抗原に結合する第１モノクローナ
ル抗体、および前記抗原と第１抗体との免疫複合体に対
して、該免疫複合体を形成していないモノエピトープ抗
原または抗体に対する結合親和性よりも大きい結合親和
性を示す第２抗体から成る免疫サンドウィッチ複合体を
形成することを含んで成る。次いて、該免疫サンドウィ
ッチ複合体を検出する。この複合体の量が、試料中のモ
ノエピトープ抗原のｑに相関している。

本発明の他の態様は、試料中のモノエピトープ抗原を測
定するホモジーニャスアッセイ方法の改良に関する。こ
のようなポモジーニャスアッセイは、通例、（ａ）試料
、ラベルしたモノエピト−プ抗原、および該抗原に結合
する第１抗体を水性媒体に入れ、（ｂ）第１抗体に結合
したラベルした抗原の量に対して試料が及ぼした影響を
測定することを含んで成る。本発明による改良は、モノ
エピトープ抗原と第１抗体との免疫複合体に対して、複
合体を形成していない該抗原または第１抗体に対する結
合親和性よりも実質的に大きい結合親和性を示す第２抗
体を水性媒体に加えることを含んで成る。

本発明は、更に、試料中のアナライトのアッセイに使用
するキットに関する。このキットは、モノエピトープ抗
原と該抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該免
疫複合体を形成していない抗原または抗体に対する結合
親和性よりも実質的に大きい結合親和性を示す抗体、お
よびアッセイ用試薬を包装中に含んで成る。

［実施０様］ 本発明の抗体、方法、組成物およびキットにより、改良
されたイムノアッセイを行うことができる。本発明によ
ると、モノエピトープ抗原に対して従来不可能であった
ザンドウィッチ型アッセイを行うことができる。更に、
本発明により、ホモジーニャスアッセイの感度および特
異性を高めることができる。

本発明の特別な態様について記載に先だって、用語の定
義を行う。

アナライト　薬物、ホルモン、殺虫剤、環境汚染物、毒
素などである抗体に特異的に結合し得る抗原、通例モノ
エピトープ抗原。モノエピトープ抗原および薬物アナラ
イトの正確な性質並びにその例は、リットマン（Ｌ　ｉ
ｔｍａｎ）らの米国特許第１１．２９９，９１６号（特
に第１６〜２３欄）、米国特許第４．２７５，１４９号
（特に第１７およびＩ８欄）、および米国特許第４，２
７５，１４９号（第１７および１８１１１ｆｌ）ｉこＳ
己載されている、アナライトは、通例、分子量が約１５
００を越えず、好ましくは約１００〜１５００、より好
ましくは１２５〜１０００の化合物である。主なアナラ
イトの例には、薬物、代謝産物、殺虫剤、汚染物などが
ある。

そのような薬物には、アルカロイドが含まれる。

アルカロイドには、モルヒネアルカロイド（モルヒネ、
コディン、ヘロイン、デキストロメトルファンを含む）
、その誘導体および代謝産物；コカインアルカロイド（
コツＪイン、ペンゾイルエクゴニンを含む）、その誘導
体および代謝産物；麦角アルカロイド（リゼルグ酸のン
エヂルアミドを含む）；ステロイドアルカロイド１イミ
ナゾイルアルカロイド；キナプリンアルカロイド：イソ
キノリンアルカロイド；キノリンアルカロイド（キニー
ネおよびキニジンを含む）；ジテルペンアルカロイド、
その誘導体および代謝産物がある。

薬物の他の群はステロイドであり、エストロゲン、エス
トゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルステロイ
ド、胆汁酸、強心配糖体およびアグリコン（ノボキシン
およびジゴキシゲニン、サボニノおよびサボゲニンを含
む）、その誘導体および代謝産物を含む。ジエチルスチ
ルベストロールのようなステロイド様物質も含まれる。

薬物の他の群は５〜６貝環ラクタムであり、パルピッレ
ート（例えばフエノバルビタールおよびセコバルピクー
ル）、ジフェニルヒダントイン、ブリミドン、エトスク
シミドお工びその代謝産物を含む。

薬物の他の群は炭素原子２〜３個を有するアルキル基を
持つアミノアルキルベンゼンであり、アンフェタミン、
カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネ
フリン、ナルセイン、バノくベリンを含む）、およびそ
の代謝産物を含む。

薬物の他の群はベンゼン縮合複素環であり、オキサゼパ
ム、クロルプロマジン、テグレトール、イミブラミン、
その誘導体および代謝産物を含み、複素環としてはアゼ
ピン、ジアゼピンおよびフェノデアジンを含む。

薬物の他の群はプリンであり、テオフィリン、カフェイ
ン、その誘導体および代謝産物を含む。

薬物の他の群はマリファナ誘導体であり、カンナビノー
ルおよびテトラヒドロカンナヒノールを含む。

薬物の他の群は、ビタミンＡＳＢのようなビタミンであ
り、例えばビタミンＢ１２、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＫＳ葉酸
、チアミンを含む。

薬物の他の群は、水酸化および不飽和の度合および位置
が様々であるプロスタグランジンを含む。

薬物の他の群は抗生物質であり、ベニソリン、クロロマ
イセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テ
ラマイシン、その誘導体および代謝産物を含む。

薬物の他の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであり
、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、
デミジンおよびシヂジンであって、適当な糖置換基およ
びホスフェート置換基を有するものを含む。

薬物の他の群は、メサトン、メブコバメート、セロトニ
ン、メペリジン、アミトリブチリン、ノルトリブヂリン
、リドカイン、ブロカインアミド、アセチルブロ力イン
アミド、プロプラノロール、クリセオフルビン、パルプ
ロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、抗コリン剤（
例えばアトロピン）のような種々の薬物、その誘導体お
よび代謝産物を含む。

病態関連代謝産物は、スペルミン、ガラクトース、フェ
ニルピルビン酸およびポルフィリン（Ｉ）を含む。

薬物の他の群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ｌ・
ブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシ
ドを含む。

殺虫剤には、ポリハルジン化ビフェニル、リン酸エステ
ル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハロゲン化
スルフェンアミド、その誘導体および代謝産物がある。

モノエビＩ・−プ抗原＝　１種の抗体のみに強力（Ｋ＞
１０８Ｍ−つに結合し得るか、または強力に結合する多
数の抗原特異的抗体のうちの１種に結合し得る抗原。後
者の場合、該抗原が抗体の１種に結合すると、実質的に
他の抗体への結合は弱められ、まｆこは阻害される。

抗原類縁体：　非修飾モノエピトープ抗原と抗体を競合
し得る修飾モノエピトープ抗原。この（ω飾は、少なく
とも抗原が他の分子に結合する手段を提供する。抗原類
縁体は、結合によって水素がより多く置換されている点
で通例抗原とは異なり、通例ハブ（ｈｕｂ）またはラベ
ルに結合しているが、これは必要条件ではない。

抗体：　他の分子の特定の空間性および極性構成に対し
て特異的に結合する（そのため＋ｆｌｈｔｉ的と定義さ
れる）イムノグロブリン。抗体は、モノクローナルまた
はポリクローナルであってよく、当業者既知の方法、例
えば宿主の免疫化および血；ｉ’／の収集（ポリクロー
ナル）、または連続的ハイブリッドセルラインの調製お
よび分泌タンパク質の収集（モノクローナル）によって
調製することができる。

抗体には、完全なイムノグロブリンまたはそのフラグメ
ントが含まれる。イムノグロブリンには、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇ
Ｇ３およびＴｇＭなどのような種々のクラスおよびイソ
タイプのものが含まれる。そのフラグメントには、Ｐａ
ｂ、　ＦｖＳＦ（ａｂ’）ｔ、Ｆ　ａｂ’などが含まれ
る。

抗原に対する抗体：　モノエピトープ抗原または抗原類
縁体に特異的な抗体。本明細書においては、第１抗体と
も称する。この抗体は、通例モノクローナルである。

免疫複合体に対する抗体：　モノエピトープ抗原と該モ
ノエピトープ抗原に対する抗体との免疫複合体への結合
に対して、免疫複合体を形成していないモノエピトープ
抗原または該モノエピトープ抗原に対する抗体への結合
に対する単一部位親和性定数よりも、実質的に大きく、
少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍大きい単
一部位親和性定数を有する抗体。本明細書においては、
この抗体を第２抗体とら称する。

好ましくは、第２抗体は、モノクローナル抗体である。

本発明において有用なモノクローナル抗体は、ミルシュ
タイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）およびコーラ−（Ｋｏｈｌ
ｅｒ）による不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２５６　＋４
９５−４９７．１９７５年に記載の方法によって得られ
る。この方法は詳細によく知られているので、本明細書
中には記載しない。しかし、基本的には、宿主、通例マ
ウスまたは他の適当な動物に免疫源を注射して行う。次
いでマウスを殺し、ひ臓から細胞を採る。また、宿主は
非感作ひ臓細胞であってもよく、これをイン・ビトロで
免疫源に上り感作する。得られた細胞を、ミエローマ細
胞と融合する。得られたハイブリッド細胞（ハイブリド
ーマと称する）をイン・ビトロで培養する。

ハイブリドーマ群をスクリーニングし、それぞれ単一の
抗体を分泌する個々のクローンを分離ずろ。

本発明において個々のハイブリッドセルラインによって
製造した抗体をスクリーニングし、抗原とそれに対する
抗体との免疫複合体に対する親和性が高く、免疫複合体
を形成していない抗原またはそれに対する抗体に対して
は結合親和性の低い抗体を同定する。本発明においては
、使用する免疫源物質は、モノエピトープ抗原または抗
原類縁対とそれに対する抗体との免疫複合体である。こ
のような免疫複合体は、抗原とそれに対する抗体とが結
合部位において結合したしのである。免疫化の前後にお
いて免疫複合体の分離を防止する手段を講じなければな
らない。免疫複合体を安定化する１方法においては、「
アフィニティー・ラベリング」、すなイっち化学的に活
性化された抗原類縁体への抗体結合部位のコンジュゲー
トを行う。

抗原を化学的に活性化する基および方法並びにアフィニ
ティー・ラベリングにおけるそれらの使用については、
当業者によく知られている［例えば、ジェイ・ビー・タ
イト（Ｊ、　Ｐ、　Ｔｉｔｅ）ら、イムノロノー（Ｉ　
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９８１年）４２：３５５参照
コ。しかし、アフィニティー・ラベルした物質を免疫源
として使用することは、本発明以前には知られていない
。この方法においては、抗体結合部位の近くの基と反応
する、抗原に結合した化学的活性基を用いることができ
る。通例、化学的活性基は、結合部位への非共有結合が
　実際の反応の前に実質的に完全にはなり得ないほどタ
ンパク買上の基と速く反応してはならない。これは、適
当な反応性の基を選択することによって、または中性の
結合条件下に反応性の低い基を選択し、次いで条件を変
えろことによって（例えばｐＨまたは温度を変えること
によって）達成できる。活性化された酸は、活性エステ
ル（Ｎ　ＩＩ　Ｓ、ニトロフェニル）、酸アジド、混合
無水物、ヂオエステルなどを含んで、特にｑ用である。

これらの基は、主にアミンと反応し、抗原に結合した鎖
に結合し得る。その長さは、結合部位に隣接するアミン
と反応するように選択する。他の基には、アンル化剤、
例えばハロアセタミド、マレイミド、アクリルアミド、
ハロケトン、ジアゾケトン、ノアゾエステル、トルレー
ト、トリフレートなどが含まれる。

他のアフィニティー・ラヘリング方法においては、光化
学活性化作用を用いろ。３００ｎｍを越える波長の光を
吸収する抗原の場合、免疫複合体に光を照射すると、抗
体への共有結合を直接に生成することができる。これが
不可能な場合？こは、光感受性基を抗原に導入する。ア
リールアジドおよびノアジケトンが頻繁に用いられろ。

ラベルした後、固相結合抗体を用いた免疫吸着によって
生成物を精製ずろことが望ましい。固相結合抗体を用い
た吸着によって、更に精製を行うことができる。

モノクローナル抗体の収率を高めるため、並びにそのモ
ノクローナル抗体を単離および精製中ろための従来の種
々の方法によって、他のタンパク質および汚染物からモ
ノクローナル抗体を分離する（例えば、キューラ−およ
びミルツユタイン、１ｉ７ｒ掲書参照）。

第２抗体の有用な結合フラグメント、例えばＦａｂ、　
Ｆ　ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）ｚ、Ｆ’ｖなども本発明の範
囲に含まれる。抗体フラグメントは、従来の方法によっ
て得られる。例えば、有用な結合フラグメントは、パパ
インまたはペブンンを用いて抗体をペプチダーゼ分解す
ることによって調製される。

第２抗体は、ネズミ、ヒトなどのポ乳動物、らしくは他
の生物、またはそれらの組み合わけに由来するものであ
り得る。本発明の範囲に含まれるら（７）ハ、ＥｇＧ、
ＩｇＭＳ　ＩｇＡ、ｒｇＥなどのようなりラスＣ）抗体
であり、そのイソタイプら含まれる。

免疫複合体：　抗原または抗原類総体とそれに対する抗
体との複合体であって、抗原または抗原類縁体への抗体
の結合親和性によって形成される複合体っ ラベル：　ラベルは、アナライトらしくは抗体または池
の分子にコンツユゲートしたいずれの分子であってもよ
い。本発明においては、ラベルは、シグナル発生手段を
含むシグナル発生系の構成員であり得る。ラベルは、同
位元素であって乙同位元素てなくてムよいが、同位元素
でない方が好ましい。例としては、ラベルは、触媒、例
えば酵素、補酵素、クロモーゲン、例えば蛍光剤（ｆ　
１ｕｏｒｅｓｃｅ「）または化学ルミネッセンス剤（ｃ
ｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、放射性物質、非磁性
または磁性の分散性粒子、固体支持体、リポソームなど
であってよいが、これらに限定されるものではない。

シグナル発生手段：　ラベルと什１互作用して検出可能
なシグナルを発生し得る手段。このようｔ、゛手段には
、例えば、電磁放射、熱、化学試薬などが含まれる。化
学試薬を用いる場合は、顕色溶液の一部として化学試薬
を含有させろことができろ。

化学試薬には、基質、ｈ１１酵素、エンハンザ−１第２
酵素、活性剤、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属
イオン、シグナル発生物質の結合に必要な特異的結合物
質などが含まれろ。補酵素、酵素生成物と反応する物質
、他の酵素および触媒などのような化学試薬は、他の分
子ま几は支持体に結合していてよい。

シグナル発生系：　シグナル発生系は、１つま１こはそ
れ以」二の成分を有していてよく、少なく２乙１成分は
ラベルである。シグナル発生系は、ラベルと相互作用し
てシグナルを発生し得るシグナル発生手段を含み、測定
可能なシグナルの発生に必要なすべての試薬を包含する
。

シグナル発生系は、外部的手段、通例電磁放射の測定、
好ましくは視覚的検査により検出できるシグナルを発生
さ仕る。多くの場合、ングナル発生、（は発色団性基質
および酵素を含み、発色団性基質は、紫外または可視領
域の光線、りん光または蛍光を吸収する色素に酵素的に
変換される。

ソゲナル発生系は、ラベルとして少なくとも１種の触媒
（通例少なくと乙１種の酵素）および少なくとも１種の
基質を含んでいてよく、２揮またはそれ以上の触媒およ
び複数の基質を含んでいてもよく、１種の酵素の基質が
他の酵素の生成物であるような酵素の組み合せを含んで
いてらよい。シグナル発生系の操作により、結合および
非結合ラベルの’ｈ１に相関して検出可能なシグナルを
発生する生成物が生成される。酵；・）甘を用いる場合
は、多く５）現金加水分解または酸化迩元反応を（１コ
う。

酵素と非酵素的触媒とを組み合わせた２種の触媒を用い
てもよい。酵素は、非酵（：的触媒で触媒されろ反応を
行い得る反応物質を生成し得るか、または非酵素的触媒
は、酵素の基質（補酵素を含む）を生成し得る。本発明
において使用し得る種々の非酵素的触媒は、米国特許第
４，１６０，６４５号に記）叔されている。

光を吸収する生成物（例えば色素）または照射によって
発光する生成物（例えば蛍光剤）の生成によってシグナ
ルを発生させる酵素またはｈｌｉ酵素を使用する。また
、触媒反応によって直接の発光（例えば化学ルミネッセ
ンス）を導くこともできる。このような生成物を生成す
る多数の酵素および補酵素か、米国特許第４．２７５，
１４９号の第１９〜２３欄および米国特許第４，３１８
，９８０号の第１０〜１４瀾に記載されている。

触媒の組み合わせが、米国特許第４，２７５．１４９号
の第２３〜２８側に多数記載されており、それを本発明
に使用し得る。

ポリ（リガンド類縁体）：　通例ハブ核に共有結合して
いる；夏散のリガント類縁体。ハブ核：ユ、通例高分子
の多官能性物質で、通例結合部位として複数の官能基、
例えばヒドロキノ、アミノ、メルカプト、エヂレン基な
どを宜する。ハブ核は、水溶性または不溶性、好ましく
は水溶性で、通例分子量が少なくとも約３０，０００で
あり、＋０００万またはそれ以上であってもよい。ハブ
核の例には、ポリサッカライド、ポリペプチド（タンパ
ク質を含む）、核酸、陰イオン交換樹脂などがある。水
不溶性ハブ核には、ガラスまたはプラスチックなどの器
壁、ガラスピーズ、付加および縮合重合体、セファデッ
クス並びにアカロースビーズなどら含まれる。

支持体−極性または非極性の水不溶性材料。

支持体は、親水性であるか、または親水性となし得るも
のであってよく、ンリカ、硫酸マグネシウムおよびアル
ミナのような無機粉末、天然高分子材料、特にセルロー
ス材料およびセルロースから誘導されろ材料、例えば繊
維含有紙（濾紙、クロマトグラフ用紙など）：ニトロセ
ルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）
、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース
、ポリアクリレ−！・、ポリエチレン、ポリプロピレン
、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタ
クリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロ
ン、ポリ（ビニルブヂレート）などのような合成ま八は
変性天然ポリマーを含み、そのまま、またはガラス、セ
ラミックス、金属などのような池の４４　Ｉｔと組み合
わせて使用する。

ｆ＋ｌｉ助物質二　本発明のアッセイにおいて、種々の
ｈｌｉ助物質をしばしば使用する。例えば、４７３．　
＋’Ｊ７剤並びにアッセイ系およびアンセイ成分用の安
定剤が、アッセイ系中に通例存在する。これらの添加剤
に加えて、アルブミンのような追加のタンパク質、界面
活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例えばポリアルキ
レングリクールのような結合強化剤などが含まれていて
らよい。

前記のように、本発明の一態様は、モノエピト−プ抗原
と、核抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該免
疫複合体を形成していないモノエピトープ抗原または該
抗原に対する抗体に対する結合親和性よりも実質的に大
きい結合親和性を示す抗体に関する。好ましくは、この
抗体はモノクローナル抗体である。

本発明のこのようなモノクローナル抗体の１種は、例示
すると新規抗体Ｔ　Ｉ（ＣＡ　Ｉ　ＣＩ　Ｏ−４てあろ
が、これに限定されろらのではない。このモノクローナ
ル抗体は、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とＴ
　ＨＣに対するモノクローナル抗体との免疫複合体に対
して、該免疫腹合体を形成していないＴ　ＨＣまｆこは
Ｔ　Ｉ（Ｃに対する抗体に対する結合親和性上り６実質
的に大きい結合親和性を示す。本発明のモノクローナル
抗体の、免疫複合体に対する結合親和性は、Ｔ　Ｉ−Ｉ
　Ｃまたは抗’ｒ　ｌ−ＩＣ抗体に対する結合親和性よ
り６約５倍大きい。

本発明のモノクローナル￥）”０体は、１ｇＣｌインク
イブの乙のである。抗体Ｔｌ−ＩＣＡ　Ｉ　ＣＩ　０−
１１は、ネズミのハイブリドーマによって製逍する。

本発明の新規抗体により、特異（１：が高められろ。

この抗体は、モノエピトープ抗原と該抗原に特異的な抗
体との免疫複合体を認識する。この２種の抗体が独立し
て結合するので、他の分子による妨害がより少ない。本
発明の抗体は、イムノアッセイにおいて特に有用性が見
出されているが、高特異性または高親和性の抗体を要す
る他の用途、例えばアフィニティ精復にも使用しくＶ、
イン・ビボにおいてモノエピトープ薬物による細胞介在
性応答を起こすための有用性が高い。

イムノアッセイにおいて、モノエピトープ抗原アナライ
ト、例えば薬物の測定に本発明を適用する。前記のよう
に、本発明のアッセイ法を、ヘテロノ一二ヤスおよびポ
モジーニャスアッセイのいずれにも適用する。ヘテロン
ーニャスアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ［ｆｌ
ｌＡ、ヤロウ（Ｙａｌｏｖ）およびバーソン（Ｂ　ｅｒ
ｓｏｎ）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステ
ィゲーンヨン（ＪＣｌｉｎ、　　Ｔ　ｎｖｅｓｔ、　）
（１９６０年）３９１１１５７］、および酵素架橋イム
ノアッセイ、例えば（２ｉ］ｌ１ｇ醇素免疫測２法（Ｅ
ＬＩＳＡ）［ニドワード・ティー・マギオ（Ｅｄｗａｒ
ｄ　　Ｔ、　Ｍａｇｇｉｏ）、「エンザイム・イムノア
ッセイ（Ｅ　ｎｚｙｍｅ　−ｒ　ｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ
）Ｊ、ＣＲＣブレス社（ＣＲＳ　　Ｐ　ｒｅｓｓ　　ｒ
　ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、■９８０年コである。ポ
モジーニャスイムノアッセイの例としては、酵素多重イ
ムノアッセイ法（Ｃｎｚｙｍｅ　　ｍｕＨｉｐｌｉｅｄ
　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）
（米国特許第３．８１７．８３７号参照）、免疫蛍光法
（例えば米国特許第３，９９３，３４５号参照）、酵素
チャンネリング法（ｅｎｚｙｍｅ　　ｃｈａｎｎｅｌｉ
ｎｇ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｃＸ例えば米国特許′５５４
，２３３．４０２号）および他の酵素イムノアッセイ（
マギオ、市掲書）が挙げられる。

アナライトのアッセイは、通例、最適のアッセイ感度を
もたらす中性Ｉ１．　Ｉ−１の水性緩衝媒体中で行う。

このアッセイは、アッセイ成分または生成物を分離せず
に行っても（ポモジーニャス）、ＩＩして行っても（ヘ
テロジ一二ヤス）よい。

水性媒体は、水のみであってら、共溶媒０〜４０容量％
を含有していてもよい。媒体のｐＨは、通例約、１〜Ｉ
ｆ好ましくは約５〜１０、より好ましくは約６．５〜９
．５である。ｐｔｒは、通例、結合成分の結合に最適な
ｐＨと、アッセイの他の試薬（例えばシグナル発生系の
成分）に対する最適ｐＨとを考誓して決定する。

所望のｐＨに調節し、測定の間にｐ）−１を推持するた
めに、種々の緩衝剤を使用し得ろ。緩衝剤の例には、ホ
ウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルピタール緩衝剤など
がある。本発明において用いる特定の緩衝剤に限定され
るわけではないが、個々のアッセイに対して好ましい緩
衝剤かある。

アッセイを行う温度は通例中程度の温度であり、とりイ
つけ速度の測定の間は一定である。インキュベーション
温度は、通例約５〜４５°Ｃ１好ましく（ま約１５〜１
１０°Ｃである。測定時の温度は、通例約１０〜５０°
Ｃ１好ましくは約１５〜４０℃であるう アッセイの対象であるアナライトの濃度は、通例的１０
−４〜Ｉ　０−１５Ｍ、とりわけ約１０−〇〜ＩＯ−”
Ｎ１の間で様々である。ア・・ノセイが定性的、半定量
的または定ｎ的なもののいずれであるかに応して、検出
法および対象となるアナライトの濃度を考慮して、種々
の試薬の濃度を決定する。

アッセイ媒体における種々の試薬の濃度は、通例アナラ
イトの濃度範囲に応じて決定するが、各試薬の最終濃度
は、通例経験的に決定して、アッセイ感度を最適化する
。このようにして、対象となるアナライトの濃度の変化
が、検出可能なシグナルの相違として正確にあられれる
。

添加の順序は様々であるが、アッセイの性質に応じて好
ましい順序かある。最も簡単には、全［オ料を同時に加
えて、アッセイ媒体がノブナル発生系に及ぼした影響を
ポモノーニャスアー・セイとして測定する。また、試薬
を連続的に加えてもよい。

要すれば、各添加の後に、通例約３０秒間〜６時間、と
りわけ約２分間〜１時間のインキュベーション工程を行
ってもよい。

ポモジーニャスアッセイにおいて、全試薬を同時または
連続的に加えた後、アッセイ媒体がシグナル発生系に及
ぼした（、シ響を測定する。アッセイ媒体のシグナル発
生系に及ぼした影゛イは、試験試料中のモノエピト−プ
アナライトの！コ１に（１１関している。本発明の新規
抗体は、抗原アナライトを含有する試ｔ１および該アナ
ライトに対する抗体を加えた後に加えることか好ましい
。ホモジーニャスアソセイにおいて使用する本発明の抗
体の槍は、モノエピトープ抗原および抗原ラベルコンジ
ュゲートの性質によって決定する。このような試薬の量
は、米国特許第３，８１７，８３７号（とりわけ第、１
欄）において記載されている。ホモジーニャスアッセイ
において本発明の抗体を使用することによって、モノエ
ピトープ抗原とそれに対する抗体との有効な結合が向上
して、アッセイの感度および／または特異性が高まる。

本発明の抗体は、モノエピトープ抗原アナライトと該ア
ナライトに対する抗体との免疫複合体に結合し、ホモジ
ーニャスアノセイの間、この免疫複合体の解離を減少さ
せる。ホモシーニャスアソセイの例には、米国特許第３
．８１７，８３７号に記載されている酵素多重イム７ノ
アソセイ法がめる。

本発明の特別な態様においては、サンドウィッチイムノ
アゾセイによってモノエピトープ抗原を検出する。この
方法においては、モノエピトープ抗原またはその類縁体
、該抗原に結合する第１モノクローナル抗体、および前
記抗原とそれに対する抗体との免疫複合体に対して、該
免疫複合体を形成（７ていない抗原まｆこはそれに対す
る抗体への結合親和性よりも実質的に大きい結合親和性
を示す第２モノクローナル抗体かみ成る免疫サンドウィ
ッチ曳合体を形成する。次いで、この免疫サンドウィッ
チ曳合体を検出し、試料中のモノエピ）・−ブ抗原アナ
ライトの量を求める。免疫サンドウィッチ曳合体は、複
合体中のラベルの存在によって検出する。第１抗体およ
び第２抗体の一方まｆこは両方がラベルまたはラベルと
結合し得る基（例えば抗体をビオチンに結合させ、ラベ
ルにアヒンン結合させる基）を有している。

本発明の新規抗体を用いて行うこの免疫サンドウィッチ
複合体アッセイは、ヘテロノ一二ヤスであっても、ホモ
ジーニャスモードであってもよい。

本発明のこの新規方法においては、反応速度を高めるた
めに、モノエピトープ抗原に対する抗体の一方または両
方を過↑りに使用し得る。

多価抗原に対する免疫サンドウィッチ複合体アッセイは
よく知られており、多くの場合、このようなアユ・セイ
のプロトコルを、本発明の新規抗体を用いて行うモノエ
ピトープ抗原のアッセイに利用［２得る。このようなサ
ンドウィッチ型アッセイは、例えば米国特許第。ｉ、４
８６．５３０号に開示されている。免疫ザントウィッチ
曳合体アッセイは、第２抗体を支持（トに結合さ什て行
うことができる。

モノエピトープ抗原アナライトが試料中にｆ７在すれば
、免疫サンドウィッチ曳合体）ま支持体に結合する。ア
ナライトの存在が疑われる試料を第１抗体と徂み合わ仕
、次いてこの組み合わせを第２抗体と組み合わける。試
薬を同時に組み合わせて乙よい。

本発明の新規抗体を用いる免疫ザンドウイヅチ複合体ア
ッセイ方法の池の例は、米国特許第４゜３６６．２’Ｌ
１号に開示されているヘテロンーニャスイムノアンセイ
にお：するＬａ縮域（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ　ｉｎｇｚ
ｏｎｅ）法を用いろ７ｊ法である。濃縮域法においては
、結合対成分が結合するための小試験域を有する装置を
用いる。本発明においては、該試験域中の結合成分は、
本発明の新規モノクローナル抗体であり得る。試験域は
、大きい液体吸収域から液体を取り込み、液体を貯蔵し
、液体の試象域への取り込み速度は調節されている。モ
ノエピト−プ抗原アナライトの存在が疑われる試料を、
該抗原に対する抗体と共に水性媒体に入れる。次いで水
性媒体を試験域に接触させる。本発明においては、モノ
エピトープ抗原に対する抗体に、シグナル発生系の一部
としてラベルを結合さＵ゛てよい。

また、モノエピトープ抗原に対する抗体を試験域に結合
させることもできる。試験域に、分１：〒する試料を含
有する水性媒体および本発明の新規抗体を接触させる。

アナライトか試料中に存在すれば、本発明の新規抗体が
試験域に結合する。本発明の抗体は、シグナル発生系の
一部としてラベルを有している。

本発明を適用し得ろ池のイムノアッセイは、米国特許第
４．５３３，６２９号に足代ｃ−札でいろ。

この方法は、同時較正（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　　
ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）ヘテロジ一二ャスイムノアッ
セイによって行う。２表面を、通例並行に配置する。１
表面は測定表面であり、もう一方の表面は較正表面であ
る。

本発明を同時較正アッセイに付す場合、測定表面はモノ
エピトープ抗原に対する抗体を含有し得る。

分析する試料を含有するアッセイ媒体を測定表面に接触
さ且る。次いで、測定表面を、ラベルに結合した本発明
の新規抗体を含有する水性媒体に接触させろ。アナライ
トが試料中に存在すれば、本発明の新規抗体は測定表面
に結合し、ラベルは、シグナル発生系の他の成分と協力
してシグナルを発生ずる。また、本発明の新規抗体を測
定表面に結合させて乙よい。試料およびモノエピトープ
抗原アナライトに対する抗体を含有する水性媒体を該表
面に接触さ仕る。アナライトに対する抗体はラベルを含
有しており、ｉ＋＋定表面上にシグナルか発生すれば、
試料中にアナライトが存在することがわかる。

本発明を適用し得るアッセイの他の例は、米国特許出願
第’７０１，４６４号ロ濃縮免疫化学試験ストリップ」
（欧州特許出願第ｇ　ｅ　３０　Ｇ　９８３．３号、特
願昭６１−０３０６０６号およびカナダ国特許出願第５
０１７９６号に対応）に記載されている。この方法およ
び装置により、アナライトのび在が疑われる試料中のア
ナライトの存在を測定する。この方法においては、試料
と特異的結合対の第１成分とを含（ｆする試験溶液を、
毛管作用によって試験溶液を吸収し得る吸収材料製の試
験ストリップの端部と接触さＵ゛る。特異的結合対の第
１成分は、アナライトと結合し得る。ストリップは、特
異的結合対の第２成分を含有しており、それにより、ス
トリップの端部から離れた小部位に特異的結合対第１成
分を濃縮し、非拡散結合さける。検出可能なシグナルは
、試験溶液中のアナライトの存在に相関して発生する。

この方法および装置に本発明を適用する場合、小部位は
、本発明の新規モノクローナル抗体を含有し得る。モノ
エピト−プ抗原アナライトの存在が疑われる試料とアナ
ライトに対する抗体とを水性媒体内に組み合わせる。こ
の媒体を、ストリップの端部と接触させ、毛管作用によ
ってストリップに浸透させる。

アナライトが試料中に存在すれば、アナライトとそれに
対する抗原との免疫複合体が生成する。次いて、この免
疫複合体を小部位で捕獲する。ノブナル発生系の成分を
用いて、免疫；夏合体の捕獲の結寒としてこの部位でソ
ゲナルを発生させる。−方、アナライトが試料中に存在
しなげれば、試七トおよびアナライトに対する抗体を含
有する水性媒体をストリップの端部と接触さけ、毛管作
用によって小部位に浸透させても、免疫ｉ夏合体は形成
・捕獲されない。従って、こめ部（ｌγでシグナルは発
生せず、そｔＬにより試料中にアナライトが存在しない
ことがわかる。

本発明の他の態様は、モノエピトープ抗原、該抗原に対
する第１抗体、および１νｊ記抗原と面記第１抗体との
免疫複合体に対して１．伎免疫複合体を形成していない
抗原または第１抗体に対する結合１４和性よりも実質的
に大きい拮合親、Ｆ＋、ｉ性を示す第２抗体から成る免
疫−１ｊ゛ン）パウイゾチ度合体を含んで成る組成物に
関する。

本発明の用途を広げるために、該方法およびア・ンセイ
を実質的に最適化するような割合の試薬を、同じ、また
は異なる容器中に組み合わせて包装し得る。このキット
は、１試薬として、モノエピトープ抗原と該抗原に対す
る抗体との免疫複合体に対して、免疫複合体を形成して
いない抗原または抗体に対する結合親和性よりも実質的
に大きい結合親和性を示す抗体を含んで成る。このキッ
トは、シグナル発生系の成分、他の抗体などのような、
アニ・セイを行うための他の試薬を別に包装した乙のを
更に含有する。

［実施例］ 以下の実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。

実施例の記載の１ｒｊに、用語を以下のように定義する
・ ＰＢＳ：　０．ＯＩＭｓａｌＬＰｃ１４、０１５ＭＮａ
ＣＣ，０，０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３ ＮＧ　イムノグロブリンＧ ｒｇＡ：　イムノグロブリンＡ ＩｇＭ：　イムノグロブリンＭ ＥＩＡ・酵素イムノアッセイ Ｍ　Ａ　ｂ・モアツクローナル抗体 Ａｂｔ：モノクローナル抗体ＴＨＣＡＩＣＩＯＩｇＧ、
：　　ＩｇＧのＩｇＧ＋イソタイプＡｂｌ：モノクロー
ナル抗体’ｒｌ−（Ｃ２−５７ＨＲＰ　：西洋ワサビペ
ルオキシダーゼＴ　Ｉ−Ｉ　Ｃ：テトラヒドロカンナビ
ノールＡＢＴＳ：　　２．２°−アンノビス（３−エチ
ルベンズチアゾリンスルポン酸）、商標 ＯＤ＝吸光度 Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　：ダルヘツコ改良イーグル培地ＥＣＤ
Ｉ：　　Ｉ−エチル−３−（３−ツメチルアミノプロピ
ル）カルボッイミド・塩 酸塩　　　。

Ａｇ８．６５３＋　ＡＴＣＣの非分泌ミニａ　−７セル
ライン Ｓ−ＤＭＥＭ：浦足しｆこＤ　Ｍ　Ｅ　ＭＥＮＤＬＯ：
　ｒロウ・イン・エンドドキンンズ（Ｌｏｗ　　ｉｎ　
　ｃｎｄｏｔＯＸｉｒ＋ｓ）ｊ、ウソ血清の商標名 Ｎ　ＣＴ　Ｃ：ギブコ（Ｇ　１ｂｃｏ）製特定細胞培地
Ｔ（ＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキノエチルピペラジン−
Ｎｏ−２−エタンスルホン 酸 ＣＦＡ：完全フロイントアジニバン！・ＩＦＡ・不完全
フロインドアジュバントＭｅＯＨ：メタノール ＥＬＯＡｃ：酢酸エチル ＨＯＡｃ（ＡｃＯＨ）・酢酸 ｔｉｃ：薄膜クロマトグラフィー Ａ　ｒ　Ｃ：本発明の抗−免疫複合体 亙■泗± １！−ツルー△”ＴＨ（、−９−カルボン酸、β−アラ
ニルＥＩ　−”ＣＥＣＡ）の合成＋１−ツルー△’−Ｔ
ＨＣ−９−カルボン酸［リザーチ・トライアングル・イ
ンスティテユート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｔ　ｒｉａｎ
ｇｌｃ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）コ４２ｍｇ（０，１
２２ｍｍｏの、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１５゜＝
ｉ　ｍｇ（０、Ｉ　３４　ｍｍｏｊ）およびＮ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド２７．６ｍｇ（０，１
３４ｍｍｏのを、無水テ）・ラヒドロフラン３−７ｃと
合わ仕、室温で１６時間撹拌した。反応をＨｃ分升によ
ってモニターシ１コ［アナルテク（ａｎａｌｔｅｃｈ）
シリカゲルＧＦ、０．５１９、ｂＭｃＯｔｌ　　ＣＨ２
Ｃ（！２．５％Ｉ−１２５０４中の０．５％硫酸第２セ
リウムにより視覚化、加熱、［〜０．６　ｒ２゜ 前記の活性化したエステル溶液を、β−アラニン３２．
８ｍｇ（０，３６８ｍｍｏｄ）およびβ−アラニン［１
−”ＣＥＯ，１６ｍｇ（０，００１７ｍｍｏ＆）を含有
する５％Ｎａ１−ＩＣ０３３ｍｆｆの撹拌した溶液（比
活性６５　、４　ｍＧ　／　ｍｍｏＲ）に満願しｌコ。

１６時間撹拌後、溶液をａ＋−＋ｃａでｐｔｒ３〜４に
酸性化し、窒素気流下に有機溶媒を除去した。溶液を５
！＆の酢酸エチルで２回抽出し、Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、
］−２０Ｘ２０ｃｍｌＯＯＯμアナルテク・シリカゲル
ＧＦプレート、０．５：９．５：０．０５Ｍ＋！０１（
Ｅｔａ、ＡＣ−Ａ　ＣＯｌ−１で濃縮および精製した。

適当なバンドを単離し、抽出し、濃ワ１１シ、減圧下に
乾燥して、比活性０　、２８７　ｍｃ　ｉ／ｉｍｏ（２
の生成物２２ｍｇを得た。

実施例２ １］−ツルー△”−ＴＩｒＣ−９−カルボン酸、β−ア
ラニル［＋　−１４Ｇ］−β−アラニル（ＩＴ）の合成 １１−ツルー△’−ＴｔｌＣ−９−カルボン酸、β−ア
ラニル［＋　−Ｉ４Ｃ］４７＋ｎｇ（０，１１３ｍｍｏ
（２）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１３．４ｍｇ（
０，１１３ｍｍｏｆりお上びＮ、Ｎ’−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド２３．３ｍｇ（０，１１３ｍｍｏのを
、無水テトラヒドロフラン１０ｚＱと合わせ、室温で１
６時間撹拌した。この溶液を、５％Ｎａ１−Ｔ　ＣＯ＊
　Ｉ　Ｏ＋１ｇ中のβ−アラニン１５．ｌｏｇ（０，１
６９ｍｍｏのの激しく撹拌した溶液に加えた。室温で１
５時間撹拌後、実施例１と同様に生成物を単剤ｔして、
３５ｍｇの生成物を得た；シ１０分析アナルテク・シリ
カゲルＧＦ、０．５１９、５：０．０５ＭｃＯＩｆ−Ｅ
ＩＯＡｃＩｔ　ＯＡ　ｃ、　Ｉ−ｔ　ｆ〜０　、３７、
比活性０．２−１８ｍＣｉ／　ｍｍｏ（！。

製 リザーヂ・トライアングル・インステイテユート製△’
　Ｔ　ＨＣの１１−カルボキシメチルオキシム誘導体を
既知の方法でキーポール・リンベット・ヘモシアニン（
ＫＬＨ）にコンジュゲートし、これによってεニー孕的
な方法でマウスを免疫した。融合の９６時間前に、静脈
内に生理食塩液中のブースター注射を行った。

Ａ、ハイブリッド化 ひｌｌａを血清非含有ＲＰ　Ｍ　Ｉて穏やかに潅流ずろ
ことによって、ひ細胞を調製した。他の組織（よ、Ｒｊ
ｌ織ポモジナイザーで破壊した。ホモジネートを滅菌ナ
イテックス（Ｎ　１ｔａｘンモノフイラメントスクリー
ン［ドプラー、エルンストおよびＩ・ラバー（Ｔｏｂｌ
ｅｒ、　　Ｅｒｎ５ｔ　　ａｎｄ　　Ｔｒａｂｅｒ）；
＃ｌＩＤ−３−８５］に通ずことによって、単一細胞懸
澗液を得た。

ひ細胞およびＡｇ８．６５３細胞を２回洗い、訳１の比
で混合しノこ。クリニカル・イムノロジー・アンド・イ
ムノパソロジ＝（ＣＩｉｎ、　　Ｉ　ｍ１ｕｎｏｌ　　
Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　）２３１７２〜１７８（
１９８２年）に記載の方法に従って、細胞をポリエチレ
ングリコール［ｒ’ＥＧ−１４５０、ベテスダ・リザー
チーラブス（１３ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｃｓｅａｒｃｈ
　　Ｌ　ａｂｓ）］で融合した。

Ｂ９組織培養 すべてのハイブリドーマおよび非分泌ミエローマセルラ
インＡｇ８．６５３を、ｌ　５　Ｌ？ｇウシ胎児血清（
Ｆｅ２）、１０％ＮＣＴＣ−Ｉ　Ｑ９、Ｏ，ｒｉＳｍＭ
ピルベート、１．０ｍＭオキザロ酢酸、ｌ０７１ｇ／ｌ
牛インシュリン、２．ＯｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび５
０ｇｇ／ｐＯ，ゲンタマイシンを含〈丁「るＳ−Ｄ　Ｍ
　Ｅ　！ｖｌ中で対数増殖期に保持しＬｏＣ，クローニ
ング 非免疫腹腔マクロファージの存６：下にハイブリドーマ
をクローニングした。１匹のマウスからの腹腔洗浄液を
Ｓ−〇’：ｖＩＥＭ　Ｉ　５０ｙ、Ｑ中に分散５仕た。

９６ウエルプレートからのハイブリドーマ、細胞を媒地
５ｍ１．の中に入れた。ついで、これを、９６ウエルプ
レートの第１列の８つのウェルに１００　ＩｔＱずつ入
れた。次いて、これらの細胞を全プレートを（苗断じて
連続希釈した。

Ｄ、Ｔｌ−ＩＣ陽性ＭＡｂのスクリーニングコスタ−（
Ｃｏｓｔａｒ）Ｅ　Ｉ　Ａミクロプレートに、４℃で一
晩、ＰＢＳ（ｐＩ−１７，２）中の５μρ／ｒＩＱの濃
度のウザギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ↓Ｉ　ｇＭ　（１−
Ｉ　＋Ｉ、）［ザイムド・ラプス（Ｚｙｍｅｄ　　Ｌａ
ｂｓ）］を各ウつルに１０７１ｇずつ入れた。プレート
を、２００μＱ／３ａのａ度の非免疫ヒツジ血清ガンマ
グロブリンフラクション２００μＱてブロックした。ハ
イブリドーマ上澄を各ウェルに加え、９０分間インキュ
ベートした。プレートを洗浄後、△’−Ｔ　Ｉ−Ｉ　Ｃ
−Ｔ（Ｉ’（Ｐコンジュゲートを各ウェルに加え、４５
分間インキュベートした。プレートを洗い、ＡＢＴＳ基
質で発色させ、自動プレートリーダーで４１５ｎｍでｉ
（ｌ＋＋定した。最乙ＯＤの高いウェルは、コンジュゲ
ート工程において△’ＴＨＣを２０ｇｇ／７ＩＱ含’（
了するレプリカプレート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ　　ｐｌ
ａｔｅ）ＥＬＩＳ、〜における顕色のロス乙最大てあっ
ｆこ。この方法によって製造し、選択した多数のモノク
ローンから、ハイブリドーマＴ　ＨＣ２−５７を選択し
た。

Ｅ　、　Ｔ　ＨＣ２−５７抗体の精製 バイオラド・パルティン（１３ｉｏｎａｄ　　＋３ｕｌ
ｌｅｔｉ＊）１１７２による、バイオラドのアフィーゲ
ル・プロティンへンステム（Ａｆ’ｒｉ−Ｇｅｌ　　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　　、へｓｙｓｔｅｍ）（Ｍ　Ａ　Ｐ　Ｓ
　、商標）を用いてモノクローナル抗体Ｔ　ＨＣ２−５
７を精製した。

実施例４ 中空ファイバー培養材料／方法によろｉ’　ＨＣ２−５
７の増殖 ＴｌＯ２−５７を、以下の成分を含有するＳ−Ｄ　Ｍ　
Ｅ　Ｍ中で増殖させた・ １）ＤＭＥＭ（ギブコ・ラプス１１３０−２１００．１
ＯＬパツケージ） ２）１５％Ｅ　Ｎ　Ｄ　Ｌ　Ｏ４−胎児血ｉｔ？　（＋
＜　ｃバイオロジックス（ＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）；
：３０００）３）Ｉ　Ｏ％ＮＣＴＣＩ　Ｏ９（またはＮ
ＣＴＣ１３５）（ギブコ＃４４０−１１０） ４）４ｍＭＬ−グルタミン（シグマ、（Ｓ　ｉｇｍａ）
Ｇ　−５）０．０５ｍｇ／、究σゲンタマインン（ギブ
コ＃６６　）　Ｉ　ｍＭピルビン酸ナトリウム（ギブコ
＃３２７　）　ｌ　ｍＭオキザコ酢酸（シグマＣｌ−４
１２６）８）０．０１　ｍｇ（２５Ｌ　Ｌ、ｉ／ｍｇ）
／ａ（！牛インシュリン（シグマｌ−５５００） ９）１１．７６５ｍｇ／ｙ＆ＨＥＰＥｓｍｉＪＦ液（シ
グマｒ−Ｉ−３３７５） 対数期の細胞［約５ＸＩＯ’生存細飽／ｆｆｃの密度（
トリパン・ブルー・エクスクル−ジョン・ヘマトシトメ
トリー（Ｔ　ｒｙｐａｎ　　Ｂ　ｌｕｅ　　ｅｘｃｌｕ
ｓｉｏｎ　　ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により測定
］を採り、ヴイタファイバー（Ｖ　ｉ　ｔａｒ　１ｂｅ
ｒ）　Ｈ中空ファイバー増殖カートリッジ［アミコン（
７〜ｍ１ｃｏｎ）］に入れ１こ。

中空ファイバーカートリッジは、木質的にアミコンによ
り提案された方法で用いた： 磁気撹拌されたｌａの培養容器に、シリコーンチューブ
で、培地を＋００７ｆ２／分て中空ファイバー腔（表面
積１０００ｃｍ２）に再循環する変速ぜん動ポンプを連
結した。

スーパー（Ｓ　ｕｐｅｒ）　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　２５　ｖ
ｌＱにＬ％Ｇさせた細胞１０８個をエクストラキャピラ
リー増殖容器に入れた。次いて、中空ファイバーカート
リッジおよび培地溜（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を３７℃の
従来のインキク、ベーターに入れた。

毎週３回、培地の１つを置換し、上澄（高ａ度の抗体を
含有する）を採った。上澄の抗体生成を、アガロース電
気泳動によってモニターシ、次いて凍結（−２０℃）貯
蔵した。

実施例５ Δｂ、　−ＨＩ’Ｉ　Ｐコンジュゲーンヨンｏ　ＲＰ　
（西洋ワザビベルオキシグーゼ、シグマ・グレードｉＶ
）２５ｍｇを、Ｏ、Ｉ　Ｍ　　リン酸ナトリウム（ｐＨ
６、８）　０　、５　ｙｔ２中で、１．２５％グルタル
アルデヒドと共に室温で一晩インキュベートシＩこ。

これを、Ｇ−２５カラムを用い、最初の２．０７ρを溶
出して、ハンクス生理食塩液中で平衡にした。

まｆこ、プロティンＡ精製Ａｂ、（’Ｉ”ＨＣ２−５７
）　１０ｍｇを、Ｇ−２５カラムを用い、ハンクス生理
食塩液中で平衡にした。

翌日、Ａｂｌ液２．０ｍｇおよびグルタルアルデヒド時
間保った。次いて、コンジュゲート混合物に０２Ｍグリ
シン０　、　２　、ｘ１２を加え、室．：（て２時間イ
ンキクベートして残りのグルタルアルデヒドを反しムさ
せ、それによって更に架橋が起こるのをブロックした。

ブロック反応の完了後、コンノコゲートをＰＩＪｓｌ衝
液の対して一晩透析し、２ＸＩ８０ｃｍバイオゲル（１
３　ｉｏ　−　６６１）Ａ　Ｉ　、　５　ｍゲル濾過カ
ラムを用いて非結合Ｈ　ｉＩ　Ｐを分離して精製した。

溶出された最初の主なピークをプールし、Ａｂ＋−トＩ
ＲＰコンジ，ゲート貯蔵溶液として使用した。

実施例６ １１−ツルー△’ーＴＩＩＣー９ーカルホン酸、ビスβ
−アラニル（、　Ｉｌ　４　Ｃ　ｌβ−−アラニル（１
１）によるＡｂｌｌｇＧのアフィニティラへリング実施
例２において．、！７Ｊ　’Ｆ＋した化合物（０　、　
５　ｍｍＨｇの減圧下に、１００℃においてｒ’２ｏ５
で８時間予め乾燥した乙の）３．０ｍｇ（０．０　０　
６　２ｍｍｏｊ）、Ｎ−ヒト′：１キシスクンンイミド
Ｉ　、Ｏｍｇ（０．０　０　８７　ｍｍｏ＆）、Ｎ　、
　Ｎ　’ージシクロへキシルカルボッイミド！　、５ｍ
ｇ（０．０　０　７　３ｍｍｏのおよび無水テトラヒド
ロフラン１１を合わせ、室！，＋１にで１６時間撹拌し
た。メルク（：ｖｌｅｒｃｋ）Ｒ　Ｐ−２ノリカケルプ
レート、２：８ＦＣｔＯＡｃ−ヘキサンを用いたｔｉｃ
分析により、Ｎ　Ｉ（　Ｓエステル形成が完全であるこ
とがわかった。

前記溶液１　５　０μＣ（０．４　５ｍｇＸ　〜９．２
Ｘ　Ｉ　Ｏ−　４ｍ　ｍ　ｏ　１２）を、５〜ＩＱ℃の
リン酸緩衝液（ｐＨ　８　、　５　）およびツメデルホ
ルムアミド（０．５ｚρ）中の、（１゛＋ＩＣ２−５７
）１ｇＧ４．９．６ｍｇ（３．１ｘｌ　Ｏ−’ｍｍ。

Ｑ）の撹拌した溶液３．０ａｆ２に満願した。溶液を１
１℃で１６時間撹拌し、次いて、ＰＢＳＣＩＯｍＭＮａ
２１１ＰＯ＋−Ｎａｌｌ＝ＰＯａ、１　５　４　ｍ〜ｒ
　ＮａＣＣ、ｐ！−１７．４）中でｌ〔川音容量のＭ−
セファデソＣ゛スＧ−５０カラムを用いたゲル濾過に付
した。

ゲル濾過およびアフィニティゲルによって精製した後、
”ＣラベルされたＴ　ＨＣと（ＴＨＣ２−５７）ｒｇＧ
＋との比を測定した。

シンチレーンヨン液１０ｚ（で希釈したタンパク質溶液
１．ＯＯμＣ中のｃｐｍを、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）ＬＳ２８００でブＪウン卜することｊこよって　１
４Ｃ−Ｔ　ＨＣ濃度を測定した。

２１３０ｎｆＴＩにおける吸光係数〜１，４ｘｌＯＪｇ
Ｇまたはローリ−法を用いて、タンパク質濃度を測定し
ｆこ。

ラベルしたＩｇＧ、を、セファロース４Ｂ−ＩｇＧ１（
２−５７Ｘｌ　６時間）およびＡ　Ｉ（−セファロース
４Ｂ−ＴＨＣ（１５分間）アフィニティーゲルそれぞれ
Ｉ　、　５　、ｗＱづつに付した。

ゲ　　）Ｉし　　　　　　　　ｆＩ′ｃ−ｒｒ−ｒｃコ
／　Ｉ　ｇＧ　＋Ｅｍ−セファデックスＧ　−５０３、
１ セフアロース４Ｂ　　ＩｇＧ、　　　　　２．４セフア
ロース４ＢＴＨＣ２゜３ セフアロース４８　　ＩｇＧ、　　　　　２．１」１記
試料を、０６ＰＤＩ（−ＴｆＩＣコンジュゲートの観察
によって、共有結合修飾モノクローナル抗体（ＴＩ（Ｃ
２−５７）ＩｇＧ、の結合部位非利用性（ｎｏｎａｖａ
ｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を測定する方法に付した。０６　
Ｐ　Ｄ　ＩＩ−Ｔ　Ｉ−Ｔ　Ｃコンジュゲートは、非修
飾（ＴＨＣ−２−５７）ＩｇＧ、と組み合わ＋ｉ−ろと
、電気泳動ゲル上に明らかな免疫複合体バンドを形成す
る。このバンドは、０６　Ｐ　Ｄ　Ｉ（−’ｌ”　Ｉ　
Ｃと（ＴＨＣ２５７）［ｇＧ＋のバンドのほぼ中点に見
られる。前記ラベルした（ＴＨＣ２５７）ｒｇｃ；＋−
Ｉ４Ｃ−ＴＨＣは、Ｇ　６　Ｐ　Ｄ　Ｉ（−Ｔ　ＨＣか
過剰であれば免疫複合体を形成しなかった。従って、結
合部位は、放射性ラベルされたＴ　ＩＴ　Ｃ誘導体の共
有結合に占められていると考えられる。

実施例７ アフィニティーラヘルされた（ＴＨＣ２−５７）ｔｇｃ
ｌ　　Ｔｌ（Ｃコンジュゲートの精製に用いるアフィニ
ティーゲルの調製 １、（ＴＩ−ＩＣ−２−５７０ｇＧ、を結合した、臭化
シアン−活性化セファロース４Ｂの調製ＣＮ　Ｂ　ｒ活
性化セファロース４ＢＩｇを洗い、メディウムフリット
・ディスクノアネル中、ＩｍＭＩ（ＣＲで１５分間膨潤
させ、次いて１ｍＭＨＣ（２２００ｍ４で洗った。Ｉｇ
Ｇ、（ＴＨＣ２−５７）（ｌ　ＯｍＭ　Ｐ○ａ、Ｉ　４
５ｍＭ　ＮａＣ（！、０．０５％ＮａＮａ、ｐＨ１１）
　Ｉ　５ｚｉ７をメンプランデユープに入れ、０゜５　
ｉＶＩ　Ｎ　ａ　Ｃρを含有する０、２Ｍ　ＮａＨｃ（
１＋−Ｎａ２ＣＯ３のカブプリング・バッファ　（ｐＨ
８，５）３Ｘ　２　Ｄ　Ｏ’ＩＱに対して７１時間ずつ
透析した。膨潤および洗浄したＣ　Ｎ　１３ｒ活性化セ
フアロ一ス４Ｂ１ｇ〜３５ηρをカシプリング・バッフ
ァーで洗浄した。プラスチック血清容器中で、ＣＮ　Ｂ
　ｒセファロース１１．　ＢおよびｒｇＧ、１５ｍ１７
を、カップリング・バッファー２０１と合わせ、室温で
２時間混合し、次いで残っ、を活性化基を一晩でブロッ
クした。

ゲルをＭ−焼結フィルター漏斗に洗い込み、酢酸緩衝液
（０，目（１、ｐＬ（４）とカップリング・バッファー
（０、２Ｍ、ｐｒ−ｒ　８　、５ンとで交互ニ洗ッｔ：
。ケルヲ１０ｍＭＰＯ，，１４５ｍ〜Ｉｉ’ＪａＣＣ１
０，０５％ＮａＮ　３（ｐＩ（７、４）中に・１℃で貯
蔵した（〜７，５Ｂｒ　ｇ　ｃ　ｒ　／　ｚｌゲル）。

２、ＡＨ−セファロース４Ｂに結合しｌこ１ｍ−ツルー
△’−ＴＨＣ−９−カルボン酸の調製Ａ　Ｉ−（−セフ
ァロース４　Ｂ　（Ｎ　Ｉ−１２Ｆ＆　ｌ　Ｏμｍｏｂ
／　ｖｔｉり２ｇをＭフリット・ディスクノアネル中で
膨潤させ、０．５Ｍ　ＮａＣ（２４００ｍＱで洗浄した
。１１−ツルー△’−ＴＨＣ−９−カルボン酸５５ｍｇ
（１６０７１ｍａｉｌ）を１−１，０：ジオキサンＩ：
Ｉ（ｐＨ４，５）１０酎に溶解した。リガンド溶液１０
；ｒ（！をゲル８ｍ（ｌに加え、液体ニゲル比２：Ｉと
した。次いで、ＥＣＤ　Ｉ　　１．５ｇを加え、室温で
１６時間混合した。

ゲルを、１：１１（２０−’、）オキサン、ｌ：ｌＯ，
２〜ｆ　Ｎ　ａ　ＨＣ０３Ｎ　ａ　２　ＣＯ３−ジオキ
サンおよび次いで１：１酢酸緩衝液（０、１Ｍ、　ｐＨ
１１）−ジオキサン各５０％４Ｘ５０ｍ（で洗った。次
いで、ゲルを蒸留水で洗い、ｌｏｍＭＰＯ，、Ｉ　４５
ｍｆｖｌ　ＮａＣ１２，０，０５％Ｎ　ａＮ　３（ｐ）
（７、４）中に・ピＣで貯蔵した。

実施例８ Ａ　ｂ　２の調製 キユーラ−およびミルシュタイン（前掲書）の標♀的な
方法を用いた。ミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ　ｌ／ｌ）
を、免疫Ｂａ１ｂ／ｃマウスのひ臓細胞と融合した。用
いた免疫源は、プロティンＡ精製ＴＨＣ２−５７抗体（
Ａ　ｂ＋）を中空ファイバー培養して、ビスβ−アラニ
ン架橋剤（実施例１〜６参照）を介して△”ＴＨＣに結
合したものであった。雌［３ａｌｂ／　（！７ウスを、
１０日間毎に２５０μｇ／ブースト（Ｉ　ＸＣＦＡ、２
Ｘ　Ｉ　ＰＡ）を３回腹腔内投与することにより免疫し
た。４箇月後、マウスを、融合の前３日間毎日１回づつ
免疫源２００μｇ／ブーストを３回ＩＰ投与することに
よって過免疫した。

細胞融合は、標阜的なハイブリドーマ方法に従って、ポ
リエチレングリコール処理によって行っ几。

最終的に、ＥＬＩＳＡプレート上でＴ　ＨＣによる発色
が良好で、Ｔ　Ｉ（Ｃの無いレプリカプレート（ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ　　ｐｌａｔｅ）上では発色が良好で
ないｌウェル（２Ｇ３）を選択した（実施例９参照）。

このウェルからのセルラインをＴｌ−ＩＣＡ　Ｉ　Ｃｌ
　Ｏ−４と命名し、更に分析するために９６ウ工ル組繊
培養プレートでクローニングした。

ＴＨＣＡｌＣｌ０−４の最初のクローニングプレートの
ＥＬｒＳＡの結果は、クローン特異性再生性免疫複合体
活性（ａ　　ｃｌｏｎａｌｌｙ　　５ｐｅｃｉｆｉｃｒ
ｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　　ｉｍｍｕｎｅ　　ｃｏｍｐ
ｌｅｘ　　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示していた。細胞を第
１列目のウェルに入れ、次いて連続的に下方に向かって
希釈した。培養液上澄のｎｆｊ記ＡＩＣ活性をアッセイ
した。結果は、バックグラウンド（非増殖ウェルに対し
て０．１５）に対して補正した。細胞増殖しているウェ
ルのＴＨＣ存在下の平均吸収は、０．９５であり、Ｔ　
ＨＣ不存在下には０．２５であった。

免疫複合体ＥＬ　Ｉ　ＳＡプロトコルにおいて、ＴＩ（
Ｃ２−５７に対して生じたＴＩ（ＣＡ　ｒ　ＣＩ　０−
４の上清、イディオタイプ特異性抗血清およびバラトー
プ特異性抗血清（後二者は希釈した腹水試料である）を
過剰のＴ　ＨＣと混合し、次いで混合物をプレート上で
連続的に希釈することにより、力価測定した。この実験
の結果を第１〜３図に示第１図のＡ■Ｃ抗体の力価測定
は、Ｔ　ＨＣ’Ｊ物の存在下には、Ａｂ２ａ度に応じて
、全体に高い値を示している。２種の対照抗体は、典型
的な抗イデイオタイプＭＡｂ（第２図−抗原のＡｂ＋に
対する影響なし）およびパラトープ特異性ＭＡｂ（第３
図−Ａｂ、の抗原部位への結合に対する薬物との競合）
の応答を示している。

同様に、ＴｌＩＣＡ　Ｉ　ＣＩ　Ｏ−１’）上澄を、抗
体およびコンジュゲート３度を一定にして、免疫複合体
ＥＬ　Ｔ　ＳＡに付すと、ＡＩＣ応答がＴ　Ｉ−Ｉ　Ｃ
依ａ性であることがわかっ１こ。この実験の結果（第４
図）によると、ＴＨＣＡ　Ｉ　Ｃ１０−４のＴ　Ｉ−Ｉ
　Ｃ２−５７−ＨＲＰコンジュゲートへの結合は、△’
　Ｔ　ＨＣ濃度にのみ依存していることがわかる。

ＡｒＣ系による特異性を証明するために、△９Ｔ　ｔｌ
　Ｃのカルボキシレートメタボライト（△”Ｔｌ４Ｃ−
ＣＯＯＨ）を用いて下４図の実験を繰り返した。第１抗
体はＴ　ＨＣ−ＣＯＯＨに結合するが、Ａ　Ｉ　Ｃ抗体
は複合体を認識しない。従って、△９ＴＩＩＣ：ＴＨＣ
２−５７−ＨＲＰ複合体が強い応答を示すような条件下
においてら、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート上で、ＡＩＣ抗体
による△’Ｔ、Ｉ　Ｃ−Ｃ００Ｈ：ＴｌＩＣ２−５７−
Ｉ（ＲＰコンジュゲート複合体への結合は検出されない
。この例により、Ａｒｃ系は、モノエピトープ抗原に対
する高い特異性を提供し、関連した化学構造の分子また
はメタポライドによる妨害を防ぐ能力を有することがわ
かる（第５図参照）。

この実験は、２種のモノクローナル抗体および抗免疫複
合体を用いて行う、小さい抗原、とりわけハプテンに対
するイムノアッセイの原理を示している。

他の実験は、Ｔ　Ｉ（Ｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ
をプレートコートとして用いたＥＬＩＳＡにヨッテ示さ
れたように、ＴＩ−（ＣＡｒｃ　　Ｉ　Ｏ−４は、Ｔ　
ＨＣまたはＴ　ＨＣの通常のタンパク質コンジュゲート
を認識せず、またはそれらに結合しないことを示してい
る。モノクローナル抗体Ｔ　Ｉ−Ｉ　Ｃ〕＼ＩＣｌｏ−
４は、抗原△ＤＴ　ｔ（Ｃに結合しｆこモノクローナル
抗体ＴＨＣ２−５７に対して大きい結合特異性を示す。

ＴＨＣ２−５７とＴＨＣとの複合体に対するＴｌ−ＩＣ
ＡＩＣ１０−４のこのような大きい特異性を、抗免疫複
合体活性と称する。

実施例９ 免疫複合体ＥＬ　Ｉ　ＳＡ アフィニティ精製したウサギ抗マウスｒｇＧ。

ＩｇＡ、ＩｇＭ抗血清［ザイムド・カド（Ｚ　ｙｍｅｄ
　　ｃａｔ、　）＃６１−６４００　　！ｍｇ／ｍｃ）
の１：４００希釈物を９６ウエルのコスタ−Ｅ　Ｉ　Ａ
プレートに各ウェルの５０μｇずつ入れ、次いてプレー
トを高湿度のインキュベーク−内で３７℃でインキ、ベ
ートした。

使用前に、プレートをＥＬＩＳ、Ａ洗浄緩衝液（０、０
１Ｍ　ＮａＨｔＰ　Ｏ，、Ｏ，ｌ５ＭＮａＣｌ２．０．
０２９０　Ｎ　ａＮ　３．０．０５％トウィーン、ｐｔ
−ｒ７．２）で３回洗った。試料（Ａｂｚ）を各ウェル
に５０μρ５　ずっを加え、前記と同様にインキュベー
トした。

次いで、ブロヅカーＩｇＧ＋（これは、不適切なｒｇＧ
１分泌ハイブリドーマセルラインからの腹水の５０％飽
和（Ｎ　Ｌｒ　、）！　Ｓ　Ｏ，沈１（７）ｌ：１００
希択物である。）を各ウェルに５０μσずつ加え、室温
で１５分間インキュベートした。この不適切な１ｇＧ１
はプレートコートが、Ａｂ、−ＨＲＰコンジュゲートの
Ｉ　ｇ　Ｇ　＋部分に結合して偽の正のシグナルが発生
しないように、非結合ウサギ抗ＩｇＧ＋プレートコート
部位をすべて飽和させるために必要であった。

次いで、プレートを洗わずに、最適化したＡ　ｂ　＋−
Ｉ−Ｉ　ＲＰコンジュゲートを各ウェルに５０μσずつ
加えた。（Ａ　ｂ、はＴ　Ｉ−ｒ　Ｃに特異的なネズミ
モノクローナル抗体である。）レプリカプレート１セツ
トに、Ａｂｌ−ＨＲＰコンジュゲートとエタノール中の
貯蔵ＴＨＣＩ　、Ｏｍｇ／ｉｆ２のＩ：２０００希釈物
とを入れた。プレートを室温で１５分間インキュベート
した。

最後に、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で５回洗い、
基質（０，１Ｍシトレート、ＰＨ４，２、ＡＢＴＳ　ｌ
ｏｍｇ／７１Ｑ、　　３０％Ｈ２０ｔの１：１０００希
釈液）を各プレートの各ウェルに１００μρずつ加えた
。充分に発色したら、４１４ｎｍでの吸光度を測定した
。

ハイブリッドセルラインＴＨＣ２−５７およびＴＨＣＡ
ＩＣＩＯ−４をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）にｌ９８６年９月２５日に寄託し
、それぞれＨ）’３９２１４およびＩ−１［３９２１３
の寄託番号を受けた。

本発明を例および実施例によって説明したが、本発明の
範囲内において変化および改良をなし得ることは明らか
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例８および９において、本発明のモノク
ローナル抗体を用いて行ったＴＨＣＥＬＩＳＡの結果を
示すグラフである。 ・＝　Ｔ　ＨＣ存在、○＝　Ｔ　ｌ（Ｃ不存在第２図は
、実施例８および９において、抗イデイオタイプモノク
ローナル抗体を用いて行ったＴ　Ｉ（ＣＥＬＩＳＡの結
果を示すグラフである。これは、単に比較のためのらの
であって、本発明の一部ではない。 ・−Ｔ　Ｌ（Ｃ存在、○＝　Ｔ　Ｉ４　Ｃ不存在第３図
は、実施例Ｓおよび９において、パラトープ特異性モノ
クローナル抗体を用いて行ったＴＨＣＥＬＩＳＡの結果
を示すグラフである。これは、単に比較のためのもので
あって、本発明の一部ではない。 ・＝　Ｔ　ＨＣ存在、○＝　Ｔ　ＨＣ不存在第・１図は
、実施例８および９において、抗体およびコンジュゲー
トの濃度を一定にして、本発明のモノクローナル抗体を
用いて行ったＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果を示すグラフである
。 Φ＝　Ｔ　ＨＣ存在、○＝　Ｔ　ＩＩ　Ｃ不存在第５図
は、実施例８および９において、ＴＩ（Ｃのカルボキシ
レートメタボライトを用いて行ったＡＴＣ系試験の結果
を示すグラフである。 特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーボレイデット 代理　人　弁理士　青　山　葆　はか１名＋　　　　２
　　３　　　４　　５　　　６　　７　　５１　　９　
　１０　　１＋　　　１２ウエノｂ１馨弓 ＋　　　　２　　　３　　　４　　５　　　６　　７　
　８　　９　　１０　　　ＩＩ　　　１２ウエル＋４易 第３ス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免疫
   複合体に対して、該複合体を形成していない該抗原また
   は（該抗原に対する）該抗体に対する結合親和性よりも
   実質的に大きい結合親和性を示すモノクローナル抗体。 ２、ＡＩＣ１０−４である特許請求の範囲第１項記載の
   抗体。 ３、抗原が、分子量が１５００未満の有機化合物、好ま
   しくは薬物、より好ましくはテトラヒドロカンナビノー
   ルである特許請求の範囲第１項記載の抗体。 ４、ラベルに結合しており、好ましくはラベルが酵素、
   蛍光剤、化学ルミネッセンス剤、補酵素、分散性固体粒
   子、リポソーム、放射性同位元素、磁気粒子および固体
   支持体から成る群から選択される特許請求の範囲第１項
   記載の抗体。 ５、モノエピトープ抗原またはその類縁体、該抗原に結
   合する第１抗体、および前記抗原またはその類縁体と第
   １抗体との免疫複合体に対して、該複合体を形成してい
   ない抗原もしくはその類縁体または第１抗体に対する結
   合親和性よりも大きい結合親和性を示す第２モノクロー
   ナル抗体の免疫サンドウィッチ複合体を含んで成る組成
   物。 ６、第１抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範
   囲第５項記載の組成物。 ７、第２モノクローナル抗体がＡＩＣ１０−４である特
   許請求の範囲第５項記載の組成物。 ８、抗原が、分子量が１５００未満の有機化合物、好ま
   しくは薬物、最も好ましくはテトラヒドロカンナビノー
   ルである特許請求の範囲第５項記載の組成物。 ９、分子量が１５００未満のモノエピトープ抗原を含む
   疑いのある試料における該抗原を測定する方法であって
   、 前記抗原またはその類縁体、該抗原に結合する第１モノ
   クローナル抗体、および前記抗原と第１抗体との免疫複
   合体に対して、該複合体を形成していないハプテンまた
   は抗体に対する結合親和性よりも実質的に大きい結合親
   和性を示す第２モノクローナル抗体を含んで成る免疫サ
   ンドウィッチ複合体を形成し、 該免疫サンドウィッチ複合体を検出する ことを含んで成り、免疫サンドウィッチ複合体量が、試
   料中の抗原量を示すものである方法。 １０、前記抗体の少なくとも一方を、酵素、蛍光剤、化
   学ルミネッセンス剤、補酵素、分散性固体粒子、リポソ
   ーム、放射性同位元素、磁気粒子および固体支持体から
   成る群から選択されたラベルによってラベルする特許請
   求の範囲第９項記載の方法。 １１、第２モノクローナル抗体がＡＩＣ１０−４である
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、抗原が、薬物、最も好ましくはテトラヒドロカン
   ナビノールである第９項記載の方法。 １３、モノエピトープ抗原を含む疑いのある試料中にお
   ける該抗原を測定するホモジーニャスアッセイ方法であ
   って、（ａ）試料、ラベルした抗原、および該抗原に結
   合する第１抗体を水性媒体中で混合し、（ｂ）ラベルし
   た抗原に結合する第１抗体の量に対して試料が及ぼした
   影響を、試料中のモノエピトープ抗原量との相関として
   測定することを含んで成り、 前記抗原と第１抗体との免疫複合体に対して、該複合体
   を形成していない抗原または第１抗体に対する結合親和
   性よりも実質的に大きい結合親和性を示す第２抗体を前
   記水性媒体に加えることを特徴とする方法。 １４、ラベルが、蛍光剤、化学ルミネッセンス剤、補酵
   素、分散性固体粒子、放射性同位元素、リポソーム、磁
   気粒子および固体支持体から成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   第１３項記載の方法。 １６、第２モノクローナル抗体がＡＩＣ１０−４である
   特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、抗原が、分子量が１５００未満の有機化合物、好
   ましくは薬物、最も好ましくはテトラヒドロカンナビノ
   ールである特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １８、モノエピトープ抗原を含む疑いのある試料中にお
   ける該抗原のアッセイに使用するキットであって、 モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免疫複合
   体に対して、該免疫複合体を形成していない抗原または
   抗体に対する結合親和性よりも実質的に大きい結合親和
   性を示す抗体、およびアッセイ用試薬を包装した組み合
   わせとして含んで成るキット。 １９、抗体がモノクローナル抗体、好ましくはＡＩＣ１
   ０−４である特許請求の範囲第１８項記載のキット。 ２０、抗原が、分子量が１５００未満の有機化合物、好
   ましくは薬物、最も好ましくはテトラヒドロカンナビノ
   ールである特許請求の範囲第１９項記載のキット。 ２１、モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免
   疫複合体に対して、該免疫複合体を形成していない抗原
   または抗体に対する結合親和性よりも実質的に大きい結
   合親和性を示す抗体を調製する方法であって、 抗原と該抗原に対する抗体とのアフィニティーラベル免
   疫複合体を調製し、 該アフィニティーラベル免疫複合体で、宿主、好ましく
   は動物を免疫する ことを含んで成る方法。