JP2793587B2 - 免疫複合体レセプター - Google Patents

免疫複合体レセプター

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JP2793587B2 JP62256147A JP25614787A JP2793587B2 JP 2793587 B2 JP2793587 B2 JP 2793587B2 JP 62256147 A JP62256147 A JP 62256147A JP 25614787 A JP25614787 A JP 25614787A JP 2793587 B2 JP2793587 B2 JP 2793587B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 種々の試料中の微量の有機物質を測定する正確かつ高
感度な方法の必要性が存在し、しかも高まりつつある。
例えば、生理的液体中の薬物、天然生理活性化合物また
は栄養源、食物、水または他の液体中の微量の汚染物ま
たは毒性物質などを測定する方法や、化学工程中に導入
された微量の汚染物のモニタリングを行うための方法の
必要性が高まっている。 利用性の高まりつつある種々の方法の一つに、１分子
またはそれ以上の分子の特定の極性および空間的構成
（organizarion）を認識し、または該構成に結合するレ
セプターを用いる方法がある。多くの場合、レセプター
は抗体であり、この方法は免疫アッセイと称される。こ
のような方法においては、従来では、ラベルしたリガン
ドを使用し、そのレセプターへの結合によって結合ラベ
ルリガンドと非結合ラベルリガンドとを識別していた。
通例ヘテロジーニャスと称される方法は、結合ラベルリ
ガンドと非結合ラベルリガンドとを分離して行なわれ
る。通例ホモジーニャスと称される他の方法は、結合ラ
ベルリガンドが非結合リガンドとは異なるシグナルを発
生することによって行なわれる。 多価抗原の少なくとも２種の異なる結合部位を用いて
該抗原を検出する方法が知られている。２部位免疫アッ
セイ（two−site immunometric assey）がよく知られて
いる。このような方法は、液体試料中の決定基を複数個
有する抗原の存在の検出または濃度の測定に用いられ
る。このような方法は、１つの抗原決定基に対する固定
化抗体と、他の抗原決定基に対する抗体（得られる免疫
複合体を検出するために、間接または直接にラベルされ
ている。）との両方に抗原を反応させることによって行
う。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体とモノクローナル抗体との組み合わせ
を使用することも知られている。免疫アッセイに２種の
抗体を用いると、抗体と試料中のすべてのアナライトと
を確実に完全に結合させるために抗体を過剰に用いるの
で、アッセイの感度を高めることができる。２部位免疫
アッセイにおいても、モノクローナル抗体を使用する
と、陽性の結果をもたらすには同一分子上に２個のエピ
トープ部位が存在する必要があるので、アッセイの特異
性が高まる場合がある。 ２種の抗体を用いて行う前記のようなアッセイは、ア
ナライトが多価抗原である場合に有用であるが、２種の
抗体を用いることによるこのような利点は、薬物または
他の有機化合物のようなモノエピトープ抗原に対しては
もたらされていない。 （従来の技術） イムノアッセイの感度を高めるために２種の抗体を使
用することは、米国特許第4,281,061号に記載されてい
る。異なるクラスまたはサブクラスのモノクローナル抗
体を用いる２部位免疫アッセイおよび該アッセイ用試験
キットは、米国特許第4,474,892号に開示されている。
少なくとも２種の異なるモノクローナル抗体を用いて行
う多価抗原の検出および／または測定方法は、米国特許
第4,471,058号に記載されている。米国特許第4,486,530
号には、モノクローナル抗体を用いるイムノアッセイが
開示されている。モノクローナル抗体混合物およびイム
ノアッセイの感度を高めるためのその用途は、米国特許
第4,514,505号に記載されている。イムノアッセイにお
ける抗イディオタイプ抗体の使用は、米国特許第4,536,
479号に記載されている。米国特許第4,062,935号には、
RFと抗原−抗体複合体との結合によるイムノアッセイが
開示されている。免疫複合体を形成している抗原または
抗体の高感度イムノアッセイは、米国特許第4,459,359
号に開示されている。免疫複合体のアッセイは、米国特
許第4,141,965号に記載されている。米国特許第4,420,4
61号には、免疫複合体検出用凝集阻止試験キットが開示
されている。免疫応答の新規な成分である抗体は、ネマ
ジ−（Nemazee）ら、プラシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）、米国、79:3828−3832（1982年）に記載
されている。 ［発明の効果］ 本発明は、イムノアッセイを行うための組成物および
方法を提供する。本発明の一態様は、モノエピトープ抗
原と該抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該複
合体を形成していないモノエピトープ抗原または抗体に
対する結合親和性よりも実質的に大きい結合親和性を示
すモノクローナル抗体に関する。このモノクローナル抗
体は、前記抗原と（該抗原に対する）抗体とのアフィニ
ティーラベル化免疫複合体を調製し、宿主、好ましくは
動物、を該アフィニティーラベル化免疫複合体で免疫
し、そして、該宿主からモノクローナル抗体を取得する
ことを含む方法により調製される。通例、モノエピトー
プ抗原の分子量は約1500を越えない有機化合物である。
本発明の抗体は、イムノアッセイにおいて使用するラベ
ルと結合していてよい。 本発明の他の態様は、モノエピトープ抗原またはその
類縁体、該モノエピトープ抗原に結合する第１抗体、お
よび前記モノエピトープ抗原またはその類縁体と第１抗
体との免疫複合体に対して、該複合体を形成していない
モノエピトープ抗原または第１交代に対する結合親和性
よりも大きい結合親和性を示す第２抗体の免疫サンドウ
ィッチ複合体を含んで成る組成物に関する。 本発明の他の態様は、モノエピトープ抗原と第１抗体
との免疫複合体に結合する抗体を調製する方法に関す
る。この方法においては、相補的な抗原でアフィニティ
ーラベルした第１抗体で動物を免疫する。 本発明の他の態様は、試料中のモノエピトープ抗原を
測定する方法に関する。この方法は、モノエピトープ抗
原またはその類縁体、該抗原に結合する第１モノクロー
ナル抗体、および前記抗原と第１抗体との免疫複合体に
対して、該免疫複合体を形成していないモノエピトープ
抗原または抗体に対する結合親和性よりも大きい結合親
和性を示す第２抗体から成る免疫サンドウィッチ複合体
を形成することを含んで成る。この第２抗体は、該抗原
と（該抗原に対する）抗体とのアフィニティーラベル化
免疫複合体を調製市、宿主を該アフィニティーラベル化
免疫複合体で免疫し、そして該宿主から該第２抗体を取
得することを含む方法により調製される。次いで、該免
疫サンドウィッチ複合体を検出する。この複合体の量
が、試料中のモノエピトープ抗原の量に相関している。 本発明の他の態様は、試料中のモノエピトープ抗原を
測定するホモジーニャスアッセイ方法の改良に関する。
このようなホモジーニャスアッセイは、通例、（ａ）試
料、ラベルしたモノエピトープ抗原、および該抗原に結
合する第１抗体を水性媒体に入れ、（ｂ）第１抗体に結
合したラベルした抗原の量に対して試料が及ぼした影響
を測定することを含んで成る。本発明による改良は、モ
ノエピトープ抗原と第１抗体との免疫複合体に対して、
複合体を形成していない該抗原または第１抗原に対する
結合親和性よりも実質的に大きい結合親和性を示す第２
抗体を水性媒体に加えることを含んで成る。この第２抗
体は、該抗原と（該抗原に対する）抗体とのアフィニテ
ィーラベル化免疫複合体を調製市、宿主を該アフィニテ
ィーラベル化免疫複合体で免疫し、そして該宿主から該
第２抗体を取得することを含む方法により調製される。 本発明は、更に、試料中のアナライトのアッセイに使
用するキットに関する。このキットは、モノエピトープ
抗原と該抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該
免疫複合体を形成していない抗原または抗体に対する結
合親和性よりも実質的に大きい結合親和性を示す抗体、
およびアッセイ用試薬を包装中に含んで成る。 ［実施態様］ 本発明の抗体、方法、組成物およびキットにより、改
良されたイムノアッセイを行うことができる。本発明に
よると、モノエピトープ抗原に対して従来不可能であっ
たサンドウィッチ型アッセイを行うことができる。更
に、本発明により、ホモジーニャスアッセイの感度およ
び特異性を高めることができる。 本発明の特別な態様について記載に先だって、用語の
定義を行う。 アナライト：薬物、ホルモン、殺虫剤、環境汚染物、
毒素などである抗体に特異的に結合し得る抗原、通例モ
ノエピトープ抗原。モノエピトープ抗原および薬物アラ
ナイトの正確な性質並びにその例は、リットマン（Litm
an）らの米国特許第4,299,916号（特に第16〜23欄）、
米国特許第4,275,149号（特に第17および18欄）、およ
び米国特許第4,275,149号（第17および18欄）に記載さ
れている。 アナライトは、通例、分子量が約1500を越えず、好ま
しくは約100〜1500、より好ましくは125〜1000の化合物
である。主なアナライトの例には、薬物、代謝産物、殺
虫剤、汚染物などがある。 そのような薬物には、アルカロイドが含まれる。アル
カロイドには、モルヒネアルカロイド（モルヒネ、コデ
イン、ヘロイン、デキストロメトルファンを含む）、そ
の誘導体および代謝産物；コカインアルカロイド（コカ
イン、ベンゾイルエクゴニンを含む）、その誘導体およ
び代謝産物；麦角アルカロイド（リゼルグ酸のジエチル
アミドを含む）；ステロイドアルカロイド；イミナゾイ
ルアルカロイド；キナゾリンアルカロイド；イソキノリ
ンアルカロイド；キノリンアルカロイド（キニーネおよ
びキニジンを含む）；ジテルペンアルカロイド、その誘
導体および代謝産物がある。 薬物の他の群はステロイドであり、エストロゲン、エ
ストゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルステロ
イド、胆汁酸、強心配糖体およびアグリコン（ジゴキシ
ンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニンを
含む）、その誘導体および代謝産物を含む。ジエチルス
チルベストロールのようなステロイド様物質も含まれ
る。 薬物の他の群は５〜６員環ラクタムであり、バルビツ
レート（例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタ
ール）、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトス
クシミドおよびその代謝産物を含む。 薬物の他の群は炭素原子２〜３個を有するアルキル基
を持つアミノアルキルベンゼンであり、アンフェタミ
ン、カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エ
ピネフリン、ナルセイン、パパベリンを含む）、および
その代謝産物を含む。 薬物の他の群はベンゼン縮合複素環であり、オキサゼ
パム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミ
ン、その誘導体および代謝産物を含み、複素環としては
アゼピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンを含む。 薬物の他の群はプリンであり、テオフィリン、カフェ
イン、その誘導体および代謝産物を含む。 薬物の他の群はマリファナ誘導体であり、カンナビノ
ールおよびテトラヒドロカンナビノールを含む。 薬物の他の群は、ビタミンＡ、Ｂのようなビタミンで
あり、例えばビタミンB12、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉
酸、チアミンを含む。 薬物の他の群は、水酸化および不飽和の度合および位
置が様々であるプロスタグランジンを含む。 薬物の他の群は抗生物質であり、ペニシリン、クロロ
マイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、
テラマイシン、その誘導体および代謝産物を含む。 薬物の他の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであ
り、ATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジ
ンおよびシチジンであって、適当な糖置換基およびホス
フェート置換基を有するものを含む。 薬物の他の群は、メサドン、メプロバメート、セロト
ニン、メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカイ
ンアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バル
プロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、抗コリン剤
（例えばアトロピン）のような種々の薬物、その誘導体
および代謝産物を含む。 病態関連代謝産物は、スペルミン、ガラクトース、フ
ェニルピルビン酸およびポルフィリン（Ｉ）を含む。 薬物の他の群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ト
ブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシ
ドを含む。 殺虫剤には、ポリハルゲン化ビフェニル、リン酸エス
テル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハロゲン
化スルフェンアミド、その誘導体および代謝産物があ
る。 モノエピトープ抗原:1種の抗体のみに強力（Ｋ＞106M
-1）に結合し得るか、または強力に結合する多数の抗原
特異的抗体のうち１種に結合し得る抗原。後者の場合、
該抗原が抗体の１種に結合すると、実質的に他の抗体へ
の結合は弱められ、または阻害される。 抗原類縁体：非修飾モノエピトープ抗原と抗体を競合
し得る修飾モノエピトープ抗原。この修飾は、少なくと
も抗原が他の分子に結合する手段を提供する。抗原類縁
体は、結合によって水素がより多く置換されている点で
通例抗原とは異なり、通例ハブ（hub）またはラベルに
結合しているが、これは必要条件ではない。 抗体：他の分子の特定の空間性および極性構成に対し
て特異的に結合する（そのため相補的と定義される）イ
ムノグロブリン。抗体は、モノクローナルまたはポリク
ローナルであってよく、当業者既知の方法、例えば宿主
の免疫化および血清の収集（ポリクローナル）、または
連続ハイブリッドセルラインの調製および分泌タンパク
質の収集（モノクローナル）によって調製することがで
きる。抗体には、完全なイムノグロブリンまたはそのフ
ラグメントが含まれる。イムノグロブリンには、IgA、I
gD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgMなどのよ
うな種々のクラスおよびイソタイプのものが含まれる。
そのフラグメントには、Fab、Fv、Ｆ（ab′）２、Fab′
などが含まれる。 抗原に対する抗体：モノエピトープ抗原または抗原類
縁体に特異的な抗体。本明細書においては、第１抗体と
も称する。この抗体は、通例モノクローナルである。 免疫複合体に対する抗体：モノエピトープ抗原と該モ
ノエピトープ抗原に対する抗体との免疫複合体への結合
に対して、免疫複合体を形成していないモノエピトープ
抗原または該モノエピトープ抗原に対する抗体への結合
に対する単一部位親和性定数よりも、実質的に大きく、
少なくとも２倍、好ましくは少なくとも10倍大きい単一
部位親和性定数を有する抗体。本明細書においては、こ
の抗体を第２抗体とも称する。 好ましくは、第２抗体は、モノクローナル抗体であ
る。本発明において有用なモノクローナル抗体は、ミル
シュタイン（Milstein）およびコーラー（Kohler）によ
るネイチャー（Nature）256:495−497、1975年に記載の
方法によって得られる。この方法は詳細によく知られて
いるので、本明細書中には記載しない。しかし、基本的
には、宿主、通例マウスまたは他の適当な動物に免疫源
を注射して行う。次いでマウスを殺し、ひ臓から細胞を
採る。また、宿主は非感作ひ臓細胞であってもよく、こ
れをイン・ビトロで免疫源により感作する。得られた細
胞を、ミエローマ細胞と融合する。得られたハイブリッ
ド細胞（ハイブリドーマと称する）をイン・ビトロで培
養する。ハイブリドーマ群をスクリーニングし、それぞ
れ単一の抗体を分泌する個々のクローンを分離する。 本発明において個々のハイブリッドセルラインによっ
て製造した抗体をスクリーニングし、抗原とそれに対す
る抗体との免疫複合体に対する親和性が高く、免疫複合
体を形成していない抗原またはそれに対する抗体に対し
ては結合親和性の低い抗体を同定する。本発明において
は、使用する免疫源物質は、モノエピトープ抗原または
抗原類縁体とそれらに対する抗体との免疫複合体であ
る。このような免疫複合体は、抗原とそれに対する抗体
とが結合部位において結合したものである。免疫化の前
後において免疫複合体の解離を防止する手段を講じなけ
ればならない。免疫複合体を安定化する１方法において
は、「アフィニティー・ラベリング」、すなわち化学的
に活性化された抗原類縁体への抗体結合部位のコンジュ
ゲートを行う。抗原を化学的に活性化する基および方法
並びにアフィニティー・ラベリングにおけるそれらの使
用については、当業者によく知られている［例えば、ジ
ェイ・ピー・タイト（J.P.Tite）ら、イムノロジー（Im
munology）（1981年）42:355参照。］しかし、アフィニ
ティー・ラベルした物質を免疫源として使用すること
は、本発明以前には知られていない。この方法において
は、抗体結合部位の近くの基と反応する。抗原に結合し
た化学的活性基を用いることができる。通例、化学的活
性基は、結合部位への非共有結合が、実際の反応の前に
実質的に完全にはなり得ないほどタンパク質上の基と速
く反応してはならない。これは、適当な反応性の基を選
択することによって、または中性の結合条件下に反応性
の低い基を選択し、次いで条件を変えることによって
（例えばpHまたは温度を変えることによって）達成でき
る。活性化された酸は、活性エステル（NHS、ニトロフ
ェニル）、酸アジト、混合無水物、チオエステルなどを
含んで、特に有用である。これらの基は、主にアミンと
反応し、抗原に結合した鎖に結合し得る。その長さは、
結合部位に隣接するアミンと反応するように選択する。
他の基には、アシル化剤、例えばハロアセタミド、マレ
イミド、アクリルアミド、ハロケトン、ジアゾケトン、
ジアゾエステル、トシレート、トリフレートなどが含ま
れる。 他のアフィニティー・ラベリング方法においては、光
化学活性化作用を用いる。300nmを越える波長の光を吸
収する抗原の場合、免疫複合体に光を照射すると、抗体
への共有結合を直接に生成することができる。これが不
可能な場合には、光感受性基を抗原に導入する。アリー
ルアジドおよびジアゾケトンが頻繁に用いられる。 ラベルした後、固相結合抗体を用いた免疫吸着によっ
て生成物を精製することが望ましい。固相結合抗原を用
いた吸着によって、更に精製を行うことができる。 モノクローナル抗体の収率を高めるため、並びにその
モノクローナル抗体を単離および精製するための従来の
種々の方法によって、他のタンパク質および汚染物から
モノクローナル抗体を分離する（例えば、キューラーお
よびミルシュタイン、前掲書参照）。 第２抗体の有用な結合フラグメント、例えばFab、Fa
b′、Ｆ（ab′）２、Fvなども本発明の範囲に含まれ
る。抗体フラグメントは、従来の方法によって得られ
る。例えば、有用な結合フラグメントは、パパインまた
はペプシンを用いて抗体をペプチダーゼ分解することに
よって調製される。 第２抗体は、ネズミ、ヒトなどのホ乳動物、もしくは
他の生物、またはそれらの組み合わせに由来するもので
あり得る。本発明の範囲に含まれるものは、IgG、IgM、
IgA、IgEなどのようなクラスの抗体であり、そのイソタ
イプも含まれる。 免疫複合体：抗原または抗原類縁体とそれに対する抗
体との複合体であって、抗原または抗原類縁体への抗体
の結合親和性によって形成される複合体。 ラベル：ラベルは、アナライトもしくは抗体または他
の分子にコンジュゲートしたいずれの分子であってもよ
い。本発明においては、ラベルは、シグナル発生手段を
含むシグナル発生系の構成員であり得る。ラベルは、同
位元素であっても同位元素でなくてもよいが、同位元素
でない方が好ましい。例としては、ラベルは、触媒、例
えば酵素、補酵素、クロモーゲン、例えば蛍光剤（fluo
rescer）または化学ルミネッセンス剤（chemiluminesce
r）、放射性物質、非磁性または磁性の分散性粒子、固
体支持体、リポソームなどであってよいが、これらに限
定されるものではない。 シグナル発生手段：ラベルと相互作用して検出可能な
シグナルを発生し得る手段。このような手段には、例え
ば、電磁放射、熱、化学試薬などが含まれる。化学試薬
を用いる場合は、顕色溶液の一部として化学試薬を含有
させることができる。化学試薬には、基質、補酵素、エ
ンハンサー、第２酵素、活性剤、補因子、阻害剤、スカ
ベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に必
要な特異的結合物質などが含まれる。補酵素、酵素生成
物と反応する物質、他の酵素および触媒などのような化
学試薬は、他の分子または支持体に結合していてよい。 シグナル発生系：シグナル発生系は、１つまたはそれ
以上の成分を有していてよく、少なくとも１成分はラベ
ルである。シグナル発生系は、ラベルと相互作用してシ
グナルを発生し得るシグナル発生手段を含み、測定可能
なシグナルの発生に必要なすべての試薬を包含する。 シグナル発生系は、外部的手段、通例電磁放射の測
定、好ましくは視覚的検査により検出できるシグナルを
発生させる。多くの場合、シグナル発生系は発色団性基
質および酵素を含み、発色団性基質は、紫外または可視
領域の光線、りん光または蛍光を吸収する色素に酵素的
に変換される。 シグナル発生系は、ラベルとして少なくとも１種の触
媒（通例少なくとも１種の酵素）および少なくとも１種
の基質を含んでいてよく、２種またはそれ以上の触媒お
よび複数の基質を含んでいてもよく、１種の酵素の基質
が他の酵素の生成物であるような酵素の組み合わせを含
んでいてもよい。シグナル発生系の操作により、結合お
よび非結合ラベルの量に相関して検出可能なシグナルを
発生する生成物が生成される。酵素を用いる場合は、多
くの場合加水分解または酸化還元反応を伴う。 酵素と非酵素的触媒とを組み合わせた２種の触媒を用
いてもよい。酵素は、非酵素的触媒で触媒される反応を
行い得る反応物質を生成し得るか、または非酵素的触媒
は、酵素の基質（補酵素を含む）を生成し得る。本発明
において使用し得る種々の非酵素的触媒は、米国特許第
4,160,645号に記載されている。 光を吸収する生成物（例えば色素）または照射によっ
て発光する生成物（例えば蛍光剤）の生成によってシグ
ナルを発生させる酵素または補酵素を使用する。また、
触媒反応によって直接の発光（例えば化学ルミネッセン
ス）を導くこともできる。このような生成物を生成する
多数の酵素および補酵素が、米国特許第4,275,149号の
第19〜23欄および米国特許第4,318,980号の第10〜14欄
に記載されている。 触媒の組み合わせが、米国特許第4,275,149号の第23
〜28欄に多数記載されており、それを本発明に使用し得
る。 ポリ（リガンド類縁体）：通例ハブ核に共有結合して
いる複数のリガンド類縁体。ハブ核は、通例高分子の多
官能性物質で、通例結合部位として複数の官能基、例え
ばヒドロキシ、アミノ、メルカプト、エチレン基などを
有する。ハブ核は、水溶性または不溶性、好ましくは水
溶性で、通例分子量が少なくとも約30,000であり、1000
万またはそれ以上であってもよい。ハブ核の例には、ポ
リサッカライド、ポリペプチド（タンパク質を含む）、
核酸、陰イオン交換樹脂などがある。水不溶性ハブ核に
は、ガラスまたはプラスチックなどの器壁、ガラスビー
ズ、付加および縮合重合体、セファデックス並びにアガ
ロースビーズなども含まれる。 支持体：極性または非極性の水不溶性材料。支持体
は、親水性であるか、または親水性となし得るものであ
ってよく、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナの
ような無機粉末；天然高分子材料、特にセルロース材料
およびセルロースから誘導される材料、例えば繊維含有
紙（濾紙、クロマトグラフ用紙など）；ニトロセルロー
ス、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）、ポリ
アクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリ
アクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレ
ート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポ
リ（ビニルブチレート）などのような合成または変性天
然ポリマーを含み、そのまま、またはガラス、セラミッ
クス、金属などのような他の材料と組み合わせて使用す
る。 補助物質：本発明のアッセイにおいて、種々の補助物
質をしばしば使用する。例えうば、緩衝剤並びにアッセ
イ系およびアッセイ成分用の安定剤が、アッセイ系中に
通例存在する。これらの添加剤に加えて、アルブミンの
ような追加のタンパク質、界面活性剤、特に非イオン性
界面活性剤、例えばポリアルキレングリコールのような
結合強化剤などが含まれていてもよい。 前記のように、本発明の一態様は、モノエピトープ抗
原と該抗原に対する抗体との免疫複合体に対して、該免
疫複合体を形成していないモノエピトープ抗原または該
抗原に対する抗体に対する結合親和性よりも実質的に大
きい結合親和性を示す抗体に関する。好ましくは、この
抗体はモノクローナル抗体である。 本発明のこのようなモノクローナル抗体の１種は、例
示すると新規抗体THC AIC 10−４であるが、これに限定
されるものではない。このモノクローナル抗体は、テト
ラヒドロカンナビノール（THC）とTHCに対するモノクロ
ーナル抗体との免疫複合体に対して、該免疫複合体を形
成していないTHCまたはTHCに対する抗体に対する結合親
和性よりも実質的に大きい結合親和性を示す。本発明の
モノクローナル抗体の、免疫複合体に対する結合親和性
は、THCまたは抗THC抗体に対する結合親和性よりも約５
倍大きい。本発明のモノクローナル抗体は、IgG1イソタ
イプのものである。抗体THC AIC 10−４は、ネズミのハ
イブリドーマによって製造する。 本発明の新規抗体により、特異性が高められる。この
抗体は、モノエピトープ抗原と該抗原に特異的な抗体と
の免疫複合体を認識する。この２種の抗体が独立して結
合するので、他の分子による妨害がより少ない。本発明
の抗体は、イムノアッセイにおいて特に有用性が見出さ
れているが、高特異性または高親和性の抗体を要する他
の用途、例えばアフィニティ精製にも使用し得、イン・
ビボにおいてモノエピトープ薬物による細胞介在性応答
を起こすための有用性が高い。 イムノアッセイにおいて、モノエピトープ抗原アナラ
イト、例えば薬物の測定に本発明を適用する。前記のよ
うに、本発明のアッセイ法を、ヘテロジーニャスおよび
ホモジーニャスアッセイのいずれにも適用する。ヘテロ
ジーニャスアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ［RI
A、ヤロウ（Yalow）およびバーソン（Berson）、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.
Clin.Invest.）（1960年）39、1157］、および酵素架橋
イムノアッセイ、例えば固相酵素免疫測定法（ELISA）
［エドワード・ティー・マギオ（Edward T.Maggio）、
「エンザイム・イムノアッセイ（Enzyme−Immunoasse
y）、CRCプレス社（CRS Press Incorporated）、1980
年］である。ホモジーニャスイムアッセイの例として
は、酵素多重イムノアッセイ法（enzyme multiplied im
munoassay technique）（米国特許第3,817,837号参
照）、免疫蛍光法（例えば米国特許第3,999,345号参
照）、酵素チャンネリング法（enzyme channeling tech
nique）（例えば米国特許第4,233,402号）および他の酵
素イムノアッセイ（マギオ、前掲書）が挙げられる。 アナライトのアッセイは、通例、最適のアッセイ感度
をもたらす中性pHの水性緩衝媒体中で行う。このアッセ
イは、アッセイ成分または生成物を分離せずに行っても
（ホモジーニャス）、分離して行っても（ヘテロジーニ
ャス）よい。 水性媒体は、水のみであっても、共溶媒０〜40容量％
を含有していてもよい。媒体のpHは、通例約４〜11、好
ましくは約５〜10、より好ましくは約6.5〜9.5である。
pHは、通例、結合成分の結合に最適なpHと、アッセイの
他の試薬（例えばシグナル発生系の成分）に対する最適
pHとを考慮して決定する。 所望のpHに調節し、測定の間にpHを維持するために、
種々の緩衝剤を使用し得る。緩衝剤の例には、ホウ酸、
リン酸、炭酸、トリス、バルビタール緩衝剤などがあ
る。本発明において用いる特定の緩衝剤に限定されるわ
けではないが、個々のアッセイに対して好ましい緩衝剤
がある。 アッセイを行う温度は通例中程度の温度であり、とり
わけ速度の測定の間は一定である。インキュベーション
温度は、通例約５〜45℃、好ましくは約15〜40℃であ
る。測定時の温度は、通例約10〜50℃、好ましくは約15
〜40℃である。 アッセイの対象であるアナライトの濃度は、通例約10
-4〜10-15M、とりわけ約10-6〜10-24Mの間で様々であ
る。アッセイが定性的、半定量的または定量的なものの
いずれであるかに応じて、検出法および対象となるアナ
ライトの濃度を考慮して、種々の試薬の濃度を決定す
る。 アッセイ媒体における種々の試薬の濃度は、通例アナ
ライトの濃度範囲に応じて決定するが、各試薬の最終濃
度は、通例経験的に決定して、アッセイ感度を最適化す
る。このようにして、対象となるアナライトの濃度の変
化が、検出可能なシグナルの相違として正確にあらわれ
る。 添加の順序は様々であるが、アッセイの性質に応じて
好ましい順序がある。最も簡単には、全材料を同時に加
えて、アッセイ媒体がシグナル発生系に及ぼした影響を
ホモジーニャスアッセイとして測定する。また、試薬を
連続的に加えてもよい。要すれば、各添加の後に、通例
約30秒間〜６時間、とりわけ約２分間〜１時間インキュ
ベーション工程を行ってもよい。 ホモジーニャスアッセイにおいて、全試薬を同時また
は連続的に加えた後、アッセイ媒体がシグナル発生系に
及ぼした影響を測定する。アッセイ媒体のシグナル発生
系に及ぼした影響は、試験試料中のモノエピトープアナ
ライトの量に相関している。本発明の新規抗体は、抗原
アナライトを含有する試料および該アナライトに対する
抗体を加えた後に加えることが好ましい。ホモジーニャ
スアッセイにおいて使用する本発明の抗体の量は、モノ
エピトープ抗原および抗原ラベルコンジュゲートの性質
によって決定する。このような試薬の量は、米国特許第
3,817,837号（とりわけ第４欄）において記載されてい
る。ホモジーニャスアッセイにおいて本発明の抗体を使
用することによって、モノエピトープ抗原とそれに対す
る抗体との有効な結合が向上して、アッセイの感度およ
び／または特異性が高まる。本発明の抗体は、モノエピ
トープ抗原アナライトと該アナライトに対する抗体との
免疫複合体に結合し、ホモジーニャスアッセイの間、こ
の免疫複合体の解離を減少させる。ホモジーニャスアッ
セイの例には、米国特許第3,817,837号に記載されてい
る酵素多重イムノアッセイ法がある。 本発明の特別な態様においては、サンドウィッチイム
ノアッセイによってモノエピトープ抗原を検出する。こ
の方法においては、モノエピトープ抗原またはその類縁
体、該抗原に結合する第１モノクローナル抗体、および
前記抗原とそれに対する抗体との免疫複合体に対して、
該免疫複合体を形成していない抗原またはそれに対する
抗体への結合親和性よりも実質的に大きい結合親和性を
示す第２モノクローナル抗体から成る免疫サンドウィッ
チ複合体を形成する。次いで、この免疫サンドウィッチ
複合体を検出し、試料中のモノエピトープ抗原アナライ
トの量を求める。免疫サンドウィッチ複合体は、複合体
中のラベルの存在によって検出する。第１抗体および第
２抗体の一方または両方がラベルまたはラベルと結合し
得る基（例えば抗体をビオチンに結合させ、ラベルにア
ビジン結合させる基）を有している。 本発明の新規抗体を用いて行うこの免疫サンドウィッ
チ複合体アッセイは、ヘテロジーニャスであっても、ホ
モジーニャスモードであってもよい。本発明のこの新規
方法においては、反応速度を高めるために、モノエピト
ープ抗原に対する抗体の一方または両方を過剰に使用し
得る。 多価抗原に対する免疫サンドウィッチ複合体アッセイ
はよく知られており、多くの場合、このようなアッセイ
のプロトルコを、本発明の新規抗体を用いて行うモノエ
ピトープ抗原のアッセイに利用し得る。このようなサン
ドウィッチ型アッセイは、例えば米国特許第4,486,530
号に開示されている。免疫サンドウィッチ複合体アッセ
イは、第２抗体を支持体に結合させて行うことができ
る。モノエピトープ抗原アナライトが試料中に存在すれ
ば、免疫サンドウィッチ複合体は支持体に結合する。ア
ナライトの存在が疑われる試料を第１抗体と組み合わ
せ、次いでこの組み合わせを第２抗体と組み合わせる。
試薬を同時に組み合わせてもよい。 本発明の新規抗体を用いる免疫サンドウィッチ複合体
アッセイ方法の他の例は、米国特許第4,366,241号に開
示されているヘテロジーニャスイムノアッセイにおける
濃縮域（concentrating zone）法を用いる方法である。
濃縮域法においては、結合対成分が結合するための小試
験域を有する装置を用いる。本発明においては、該試験
域中の結合成分は、本発明の新規モノクローナル抗体で
あり得る。試験域は、大きい液体吸収域から液体を取り
込み、液体を貯蔵し、液体の試験域への取り込み速度は
調節されている。モノエピトープ抗原アナライトの存在
が疑われる試料を、該抗原に対する抗体と共に水性媒体
に入れる。次いで水性媒体を試験域に接触させる。本発
明においては、モノエピトープ抗原に対する抗体に、シ
グナル発生系の一部としてラベルを結合させてよい。ま
た、モノエピトープ抗原に対する抗体を試験域に結合さ
せることもできる。試験域に、分析する試料を含有する
水性媒体および本発明の新規抗体を接触させる。アナラ
イトは試料中に存在すれば、本発明の新規抗体が試験域
に結合する。本発明の抗体は、シグナル発生系の一部と
してラベルを有している。 本発明を適用し得る他のイムノアッセイは、米国特許
第4,533,629号に記載されている。この方法は、同時較
正（simultaneous calibration）ヘテロジーニャスイム
ノアッセイによって行う。２表面を、通例並行に配置す
る。１表面は測定表面であり、もう一方の表面は較正表
面である。本発明を同時較正アッセイに付す場合、測定
表面はモノエピトープ抗原に対する抗体を含有し得る。
分析する試料を含有するアッセイ媒体を測定表面に接触
させる。次いで、測定表面を、ラベルに結合した本発明
の新規抗体を含有する水性媒体に接触させる。アナライ
トが試料中に存在すれば、本発明の新規抗体は測定表面
に結合し、ラベルは、シグナル発生系の他の成分と協力
してシグナルを発生する。また、本発明の新規抗体を測
定表面に結合させてもよい。試料およびモノエピトープ
抗原アナライトに対する抗体を含有する水性媒体を該表
面に接触させる。アナライトに対する抗体はラベルを含
有しており、測定表面上にシグナルが発生すれば、試料
中にアナライトが存在することがわかる。 本発明を適用し得るアッセイの他の例は、米国特許出
願第701,464号「濃縮免疫化学試験ストリップ」（欧州
特許出願第86300983.3号、特願昭61−030606号およびカ
ナダ国特許出願第501796号に対応）に記載されている。
この方法および装置により、アナライトの存在が疑われ
る試料中のアナライトの存在を測定する。この方法にお
いては、試料と特異的結合対の第１成分とを含有する試
験溶液を、毛管作用によって試験溶液を吸収し得る吸収
材料製の試験ストリップの端部と接触させる。特異的結
合対の第１成分は、アナライトと結合し得る。ストリッ
プは、特異的結合対の第２成分を含有しており、それに
より、ストリップの端部から離れた小部位に特異的結合
対第１成分を濃縮し、非拡散結合させる。検出可能なシ
グナルは、試験溶液中のアナライトの存在に相関して発
生する。この方法および装置に本発明を適用する場合、
小部位は、本発明の新規モノクローナル抗体を含有し得
る。モノエピトープ抗原アナライトの存在が疑われる試
料とアナライトに対する抗体とを水性媒体内に組み合わ
せる。この媒体を、ストリップの端部と接触させ、毛管
作用によってストリップに浸透させる。アナライトが試
料中に存在すれば、アナライトとそれに対する抗原との
免疫複合体が生成する。次いで、この免疫複合体を小部
位で捕獲する。シグナル発生系の成分を用いて、免疫複
合体の捕獲の結果としてこの部位でシグナルを発生させ
る。一方、アナライトが試料中に存在しなければ、試料
およびアナライトに対する抗体を含有する水性媒体をス
トリップの端部と接触させ、毛管作用によって小部位に
浸透させても、免疫複合体は形成・捕獲されない。従っ
て、この部位でシグナルは発生せず、それにより試料中
にアナライトが存在しないことがわかる。 本発明の他の態様は、モノエピトープ抗原、該抗原に
対する第１抗体、および前記抗原と前記第１抗体との免
疫複合体に対して、該免疫複合体を形成していない抗原
または第１抗体に対する結合親和性よりも実質的に大き
い結合親和性を示す第２抗体から成る免疫サンドウィッ
チ複合体を含んで成る組成物に関する。 本発明の用途を広げるために、該方法およびアッセイ
を実質的に最適化するような割合の試薬を、同じ、また
は異なる容器中に組み合わせて包装し得る。このキット
は、１試薬として、モノエピトープ抗原と該抗原に対す
る抗体との免疫複合体に対して、免疫複合体を形成して
いない抗原または抗体に対する結合親和性よりも実質的
に大きい結合親和性を示す抗体を含んで成る。このキッ
トは、シグナル発生系の成分、他の抗体などのような、
アッセイを行うための他の試薬を別に包装したものを更
に含有する。 ［実施例］ 以下の実施例によって、本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例の記載の前に、用語を以下のように定義する： PBS:0.01M NaH2PO4、015M NaCl、0.02％NaN3 IgG:イムノグロブリンＧ IgA:イムノグロブリンＡ IgM:イムノグロブリンＭ EIA:酵素イムノアッセイ MAb:モノクローナル抗体 Ab2:モノクローナル抗体THC AIC 10−４ IgG1:IgGのIgG1イソタイプ Ab1:モノクローナル抗体THC 2−57 HRP:西洋ワサビペルオキシダーゼ THC:テトラヒドロカンナビノール ABTS:2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリ
ンスルホン酸）、商標 OD:吸光度 DMEM:ダルベッコ改良イーグル培地 ECDI:1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド・塩酸塩 Ag8.653:ATCCの非分泌ミエローマセルライン Ｓ−DMEM:補足したDMEM ENDLO:「ロウ・イン・エドドキシンズ（Low in endot
oxins）」、ウシ血清の商標名 NCTC:ギブコ（Gibco）製特定細胞培地 HEPES:N−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸 CFA:完全フロイントアジュバント IFA:不完全フロイントアジュバント MeOH:メタノール EtOAc:酢酸エチル HOAc（AcOH）：酢酸 tlc:薄膜クロマトグラフィー AIC:本発明の抗−免疫複合体 実施例１ 11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸、β−アラニル
［１−14C］（Ｉ）の合成 11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸［リサーチ・
トライアングル・インスティテュート（Research Trian
gle Institute）］42mg（0.122mmol）、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド15.4mg（0.134mmol）およびN,N′−ジシ
クロヘキシルカルボジイミド27.6mg（0.134mmol）を、
無水テトラヒドロフラン3mlと合わせ、室温で16時間撹
拌した。反応をtlc分析によってモニターした［アナル
テク（analtech）シリカゲルGF、0.5:9.5MeOH−CH2C
l2、５％H2SO4中の0.5％硫酸第２セリウムにより視覚
化、加熱、Rf〜0.67］。 前記の活性化したエステル溶液を、β−アラニン32.8
mg（0.368mmol）およびβ−アラニン［１−14C］0.16mg
（0.0017mmol）を含有する５％NaHCO33mlの撹拌した溶
液（比活性65.4mG/mmol）に滴加した。16時間撹拌後、
溶液を濃HClでpH3〜４に酸性化し、窒素気流下に有機溶
媒を除去した。溶液を5mlの酢酸エチルで２回抽出し、M
gSO4で乾燥し、１−20×20cm1000μアナルテク・シリカ
ゲルGFプレート、0.5:9.5:0.05MeOH−EtOAc−AcOHで濃
縮および精製した。適当なバンドを単離し、抽出し、濃
縮し、減圧下に乾燥して、比活性0.287mCi/mmolの生成
物22mgを得た。 実施例２ 11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸、β−アラニル
［１−14C］−β−アラニル（II）の合成 11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸、β−アラニ
ル［１−14C］47mg（0.113mmol）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド13.4mg（0.13mmol）およびN,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド23.3mg（0.113mmol）を、無水
テトラヒドロフラン10mlと合わせ、室温で16時間撹拌し
た。この溶液を、５％NaHCO310mg中のβ−アラニン15.1
ng（0.169mmol）の激しく撹拌した溶液に加えた。室温
で15時間撹拌後、実施例１と同様に生成物を単離して、
35mgの生成物を得た;tlc分析アナルテク・シリカゲルG
F、0.5:9.5:0.05MeOH−EtOAc−HOAc、Rf〜0.37、比活性
0.248mCi/mmol。 実施例３ モノクローナル抗体THC2−57（Ab1）の調製 リサーチ・トライアングル・インスティテュート製△
9THCの11−カルボキシメチルオキシム誘導体を既知の方
法でキーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）に
コンジュゲートし、これによって標準的な方法でマウス
を免疫した。融合の96時間前に、静脈内に生理食塩液中
のブースター注射を行った。 A.ハイブリッド化 ひ臓を血清非含有RPMIで穏やかに潅流することによっ
て、ひ細胞を調製した。他の組織は、組織ホモジナイザ
ーで破壊した。ホモジネートを滅菌ナイテックス（Nite
x）モノフィラメントスクリーン［トブラー、エルンス
トおよびトラバー（Tobler,Ernst and Traber）＃HD−
３−85］に通すことによって、単一細胞懸濁液を得た。
ひ細胞およびAg8.653細胞を２回洗い、2:1の比で混合し
た。クリニカル・イムノロジー・アンド・イムノパソロ
ジー（Clin.Immunol Immunopathol.）23172〜178（1982
年）に記載の方法に従って、細胞をポリエチレングリコ
ール［PEG−1450、ベテスダ・リサーチ・ラブス（Bethe
sda Research Labs）］で融合した。 B.組織培養 すべてのハイブリドーマおよび非分泌ミエローマセル
ラインAg8.653を、15％ウシ胎児血清（FCS）、10％NCTC
−109、0.45mMピルベート、10mMオキザロ酢酸、10μg/m
l牛インシュリン、2.0mM L−グルタミンおよび50μg/ml
ゲンタマイシンを含有するＳ−DMEM中で対数増殖期に保
持した。 C.クローニング 非免疫腹腔マクロファージの存在下にハイブリドーマ
をクローニングした。１匹のマウスからの腹腔洗浄液を
Ｓ−DMEM150ml中に分散させた。96ウェルプレートから
のハイブリドーマ細胞を媒地5mlの中に入れた。つい
で、これを、96ウェルプレートの第１列の８つのウェル
に100μずつ入れた。次いで、これらの細胞を全プレ
ートを横断して連続希釈した。 D.THCの陽性MAbのスクリーニング コスター（Costar）EIAミクロプレートに、４℃で一
晩、PBS（pH7.2）中の５μ/mlの濃度のウサギ抗マウ
スIgG＋IgA＋IgM（Ｈ＋Ｌ）［ザイムド・ラブス（Zymed
Labs）］を各ウェルに10μｇずつ入れた。プレート
を、200μ/mlの濃度の非免疫ヒツジ血清ガンマグロブ
リンフラクション200μでブロックした。ハイブリド
ーマ上澄を各ウェルに加え、90分間インキュベートし
た。プレートを洗浄後、△９−THC−HRPコンジュゲート
を各ウェルに加え、45分間インキュベートした。プレー
トを洗い、ABTS基質で発色させ、自動プレートリーダー
で415nmで測定した。最もODの高いウェルは、コンジュ
ゲート工程において△9THCを20μg/ml含有するレプリカ
プレート（replicate plate）ELISAにおける顕色のロス
も最大であった。この方法によって製造し、選択した多
数のモノクローンから、ハイブリドーマTHC2−57を選択
した。 E.THC2−57抗体の精製 バイオラド・バルティン（BioRad Bulletin）1172に
よる、バイオラドのアフィ−ゲル・プロテインＡシステ
ム（Affi−Gel Protein Asystem（MAPS、商標）を用い
てモノクローナル抗体THC2−57を精製した。 実施例４ 中空ファイバー培養材料／方法によるTHC2−57の増殖 THC 2−57を、以下の成分を含有するＳ−DMEM中で増
殖させた： １）DMEM（ギブコ・ラブス＃430−2100;10Lパッケー
ジ） ２）15％ENDLO牛胎児血清（KCバイオロジックス（KC B
iologics）＃3000） ３）10％NCTC109（またはNCTC135）（ギブコ＃440−11
0） ４）4mM L−グルタミン（シグマ（Sigma）Ｇ−5763） ５）0.05mg/mlゲンタマイシン（ギブコ＃600−5750） ６）1mMピルビン酸ナトリウム（ギブコ＃320−1360） ７）1mMオキザロ酢酸（シグマ０−4126） ８）0.01mg（25IU/mg）/ml牛インシュリン（シグマＩ−
5500） ９）4.765mg/mlHEPES緩衝液（シグマＨ−3375） 対数期の細胞［約５×106生成細胞/mlの密度（トリパ
ン・ブルー・エクスクルージョン・ヘマトシトメトリー
（Trypan Blue exclusion hemocytometry）により測
定］を採り、ヴィタファイバー（Vitafiber）II中空フ
ァイバー増殖カートリッジ［アミコン（Amicon）］に入
れた。 中空ファイバーカートリッジは、本質的にアミコンに
より提案された方法で用いた： 磁気撹拌された１の培養容器に、シリコーンチュー
ブで、培地を100ml/分で中空ファイバー腔（表面積1000
cm2）に再循環する変速ぜん動ポンプを連結した。 スーパー（Super）DMEM25mlに懸濁させた細胞108個を
エクストラキャピラリー増殖容器に入れた。次いで、中
空ファイバーカートリッジおよび培地溜（reservoir）
を37℃の従来のインキュベーターに入れた。 毎週３回、培地の１つを置換し、上澄（高濃度の抗体
を含有する）を採った。上澄の抗体生成を、アガロース
電気泳動によってモニターし、次いで凍結（−20℃）貯
蔵した。 実施例５ Ab1−HRPコンジュゲーション HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ、シグマ・グレー
ドIV）25mgを、0.1Mリン酸ナトリウム（pH6.8）0.5ml中
で、1.25％グルタルアルデヒドと共に室温で一晩インキ
ュベートした。これを、Ｇ−25カラムを用い、最初の2.
0mlを溶出して、ハンクス生理食塩液中で平衡にした。
また、プロテインＡ精製Ab1（THC2−57）10mgを、Ｇ−2
5カラムを用い、ハンクス生理食塩液中で平衡にした。 翌日、Ab1液2.0mlおよびグルタルアルデヒド活性化HR
P液2.0mlを混合し、４℃に24時間保った。次いで、コン
ジュゲート混合物に0.2Mグリシン0.2mlを加え、室温で
２時間インキュベートして残りのグルタルアルデヒドを
反応させ、それによって更に架橋が起こるのをブロック
した。 ブロック反応の完了後、コンジュゲートをPBS緩衝液
の対して一晩透析し、２×180cmバイオゲル（Bio−Ge
l）A1.5mゲル濾過カラムを用いて非結合HRPを分離して
精製した。溶出された最初の主なピークをプールし、Ab
1−HRPコンジュゲート貯蔵溶液として使用した。 実施例６ 11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸、ビスβ−アラ
ニム［１−14C］β−アラニル（II）によるAb1IgGのア
フィニティラベリング 実施例２において調製した化合物（0.5mmHgの減圧下
に、100℃においてP2O5で８時間予め乾燥したもの）3.0
mg（0.0062mmol）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド1.0m
g（0.0087mmol）、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド1.5mg（0.0073mmol）および無水テトラヒドロフラ
ン1mlを合わせ、室温で16時間撹拌した。メルク（Merc
k）RP−２シリカゲルプレート、2:8EtOAc−ヘキサンを
用いたtlc分析により、NHSエステル形成が完全であるこ
とがわかった。 前記溶液150μ（0.45mg）（〜9.2×10-4mmol）を、
５〜10℃のリン酸緩衝液（pH8.5）およびジメチルホル
ムアミド（0.5ml）中の、（THC2−57）IgG49.6mg（3.1
×104mmol）の撹拌した溶液3.0mlに滴加した。溶液を４
℃で16時間撹拌し、次いで、PBS（10mM Na2HPO4−NaH2P
O4、154mM NaCl、pH7.4）中）で10倍容量のＭ−セファ
デックスＧ−50カラムを用いたゲル濾過に付した。 ゲル濾過およびアフィニティゲルによって精製した
後、14CラベルされたTHCと（THC 2−57）IgG1との比を
測定した。 シンチレーション液10mlで希釈したタンパク質溶液10
0μ中のcpmを、ベックマン（Beckman）LS2800でカウ
ントすることによって14C−THC濃度を測定した。 280nmにおける吸光係数〜1.4×105IgGまたはローリー
法を用いて、タンパク質濃度を測定した。 ラベルしたIgG1を、セファロース4B−IgG1（２−57）
（16時間）およびAH−セファロース4B−THC（15分間）
アフィニティーゲルそれぞれ1.5mlづつに付した。 ゲ ル ［14C−THC］/IgG1］ ｍ−セファデックスＧ−50 3.1 セファロース4B IgG1 2.4 セファロース4B THC 2.3 セファロース4B IgG1 2.1 上記試料を、G6PDH−THCコンジュゲートの観察によっ
て、共有結合修飾モノクローナル抗体（THC2−57）IgG1
の結合部位非利用性（nonavailability）を測定する方
法に付した。G6PDH−THCコンジュゲートは、非修飾（TH
C−２−57）IgG1と組み合わせると、電気泳動ゲル上に
明らかな免疫複合体バンドを形成する。このバンドは、
G6PDH−THCと（THC−２−57）IgG1のバンドのほぼ中点
に見られる。前記ラベルした（THC−２−57）IgG1−14C
−THCは、G6PDH−THCが過剰であれば免疫複合体を形成
しなかった。従って、結合部位は、放射性ラベルされた
THC誘導体の共有結合に占められていると考えられる。 実施例７ アフィニティーラベルされた（THC2−57）IgG1−THCコ
ンジュゲートの精製に用いるアフィニティーゲルの調製 1.（THC−２−57）IgG1を結合した、臭化シアン−活性
化セファロース4Bの調製 CNBr活性化セファロース4B1gを洗い、メディウムフリ
ット・ディスクファネル中、1mM HClで15分間膨潤さ
せ、次いで1mM HCl200mlで洗った。IgG1（THC2−57）
（10mM PO4、145mM NaCl、0.05％NaN3、pH4）15mlをメ
ンブランチューブに入れ、0.5M NaClを含有する0.2M Na
HCO3−Na2CO3のカップリング・バッファー（pH8.5）３
×250mlに対して４時間ずつ透析した。膨潤および洗浄
したCNBr活性化セファロース4B1g〜3.5mlをカップリン
グ・バッファーで洗浄した。プラスチック血清容器中
で、CNBrセファロース4BおよびIgG115mlを、カップリン
グ・バッファー20mlと合わせ、室温で２時間混合し、次
いで残った活性化基を一晩でブロックした。ゲルをＭ−
焼結フィルター漏斗に洗い込み、酢酸緩衝液（0.1M、pH
4）とカップリング・バッファー（0.2M,pH8.5）とで交
互に洗った。ゲルを10mM PO4、145mM NaCl0.05％NaN
3（PH7.4）中に４℃で貯蔵した（〜7.5mg IgG1/mlゲ
ル）。 2.AH−セファロース4Bに結合した11−ノル−Δ８−THC
−９−カルボン酸の調製 AH−セファロース4B（NH2基10μmol/ml）2gをＭフリ
ット・ディスクファネル中で膨潤させ、0.5M NaCl400ml
で洗浄した。11−ノル−△８−THC−９−カルボン酸55m
g（160μmol）をH2O:ジオキサン1:1（pH4.5）10mlに溶
解した。リガンド溶液10mlをゲル8mlに加え、液体：ゲ
ル比2:1とした。次いで、ECDI 1.5gを加え、室温で16時
間混合した。ゲルを、1:1H2O−ジオキサン、1:1 0.2M N
aHCO3−ジオキサンおよび次いで1:1酢酸緩衝液（0.1M、
pH4）−ジオキサン各50％４×50mlで洗った。次いで、
ゲルを蒸留水で洗い、10mM PO4、145mM NaCl、0.05％Na
N3（pH7.4）中に４℃で貯蔵した。 実施例８ Ab2の調製 キューラーおよびミルシュタイン（前掲書）の標準的
な方法を用いた。ミエローマ細胞（P3−NS1/1）を、免
疫Balb/cマウスのひ臓細胞と融合した。用いた免疫源
は、プロテインＡ精製THC2−57抗体（Ab1）を中空ファ
イバー培養して、ビスβ−アラニン架橋剤（実施例１〜
６参照）を介して△8THCに結合したものであった。雌Ba
lb/cマウスを、10日間毎に250μg/ブースト（１×CFA、
２×IFA）を３回腹腔内投与することにより免疫した。
４箇月後、マウスを、融合の前３日間毎日１回づつ免疫
源200μg/ブーストを３回IP投与することによって過免
疫した。 細胞融合は、標準的なハイブリドーマ方法に従って、
ポリエチレングリコール処理によって行った。最終的
に、ELISAプレート上でTHCによる発色が良好で、THCの
無いレプリカプレート（replication plate）上では発
色が良好でない１ウェル（2G3）を選択した（実施例９
参照）。このウェルからのセルラインをTHC AIC10−４
と命名し、更に分析するために96ウェル組織培養プレー
トでクローニングした。 THA AIC10−４の最初のクローニングプレートのELISA
の結果は、クローン特異性再生性免疫複合体活性（a cl
onally specificreproducible immune complex activit
y）を示していた。細胞を第１列目のウェルに入れ、次
いで連続的に下方に向かって希釈した。培養液上澄の前
記AIC活性をアッセイした。結果は、バックグラウンド
（非増殖ウェルに対して0.15）に対して補正した。細胞
増殖しているウェルのTHC存在下の平均吸収は、0.95で
あり、THC不存在下には0.25であった。 免疫複合体ELISAプロトコルにおいて、THC2−57に対
して生じたTHC AIC 10−４の上清、イディオタイプ特異
性抗血清およびパラトープ特異性抗血清（後二者は希釈
した腹水試料である）を過剰のTHCと混合し、次いで混
合物をプレート上で連続的に希釈することにより、力価
測定した。この実験の結果を第１〜３図に示す。 第１図のAIC抗体の力価測定は、THC薬物の存在下に
は、Ab2濃度に応じて、全体に高い値を示している。２
種の対照抗体は、典型的な抗イディオタイプMAb（第２
図−抗原のAb1に対する影響なし）およびパラトープ特
異性MAb（第３図−Ab1の抗原部位への結合に対する薬物
との競合）の応答を示している。 同様に、THC AIC10−４の上澄を、抗体およびコンジ
ュゲート濃度を一定にして、免疫複合体ELISAに付す
と、AIC応答がTHC依存性であることがわかった。この実
験の結果（第４図）によると、THC AIC10−４のTHC2−5
7−HRPコンジュゲートへの結合は、△9THC濃度にのみ依
存していることがわかる。 AIC系による特異性を証明するために、△8THCのカル
ボキシレートメタボライト（△9THCC−COOH）を用いて
第４図の実験を繰り返した。第１抗体はTHC−COOHに結
合するが、AIC抗体は複合体を認識しない。従って、△9
THC:THC2−57−HRP複合体が強い応答を示すような条件
下においても、ELISAプレート上で、AIC抗体による△9T
HC−COOH:THC2−57−HRPコンジュゲート複合体への結合
は検出されない。この例により、AIC系は、モノエピト
ープ抗原に対する高い特異性を提供し、関連した化学構
造の分子またはメタボライトによる妨害を防ぐ能力を有
することがわかる（第５図参照）。 この実験は、２種のモノクローナル抗体および抗免疫
複合体を用いて行う、小さい抗原、とりわけハプテンに
対するイムノアッセイの原理を示している。 他の実験は、THC−西洋ワサビペルオキシダーゼをプ
レートコートとして用いたELISAによって示されたよう
に、THC AIC10−４は、THCまたはTHCの通常のタンパク
質コンジュゲートを認識せず、またはそれらに結合しな
いことを示している。モノクローナル抗体THC AIC 10−
４は、抗原△9THCに結合したモノクローナル抗体THC2−
57に対して大きい結合特異性を示す。THC2−57とTHCと
の複合体に対するTHC AIC10−４のこのような大きい特
異性を、抗免疫複合体活性と称する。 実施例９ 免疫複合体ELISA アフィニティ精製したウサギ抗マウスIgG、IgA、IgM
抗血清［ザイムド・カト（Zymed cat.）＃61−6400 1mg
/ml）の1:400希釈物を96ウェルのコスターEIAプレート
に各ウェルの50μｇずつ入れ、次いでプレートを高湿度
のインキュベーター内で37℃でインキュベートした。 使用前に、プレートをELISA洗浄緩衝液（0.01M NaH2P
O4、0.15M NACl、0.0290NaN3、0.05％トウィーン、pH7.
2）で３向洗った、試料（Ab2）を各ウェルに50μずつ
を加え、前記と同様にインキュベートした。次いで、プ
ロッカーIgG1（これは、不適切なIgG1分泌ハイブリドー
マセルラインからの腹水の50％飽和（NH4）2SO4の沈澱
の1:100希釈物である。）を各ウェルに50μずつ加
え、室温で15分間インキュベートした。この不適切なIg
G1はプレートコートが、Ab1−HRPコンジュゲートのIgG1
部分に結合して偽の正のシグナルが発生しないように、
非結合ウサギ抗IgG1プレートコート部位をすべて飽和さ
せるために必要であった。 次いで、プレートを洗わずに、最適化したAb1−HRPコ
ンジュゲートを各ウェルに50μずつ加えた。（Ab1はT
HCに特異的なネズミモノクローナル抗体である。）レプ
リカプレート１セットに、Ab1−HRPコンジュゲートとエ
タノール中の貯蔵THC1.0mg/mlの1:2000希釈物とを入れ
た。プレートを室温で15分間インキュベートした。 最後にプレートをELISA洗浄緩衝液で５回洗い、基質
（0.1Mシトレート、pH4.2、ABTS1.0mg/ml、30％H2O2の
1:1000希釈液）を各プレートの各ウェルに100μずつ
加えた。充分に発色したら、414nmでの吸光度を測定し
た。 ハイブリッドセルラインTHC2−57およびTHC AIC10−
４をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）に1986年９月25日に寄託し、それぞれHB9214お
よびHB9213の寄託番号を受けた。 本発明を例および実施例によって説明したが、本発明
の範囲内において変化および改良をなし得ることは明ら
かである。
【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例８および９において、本発明のモノク
ローナル抗体を用いて行ったTHC ELISAの結果を示すグ
ラフである。 ●＝THC存在、○＝THC不存在 第２図は、実施例８および９において、抗イディオタイ
プモノクローナル抗体を用いて行ったTHC ELISAの結果
を示すグラフである。これは、単に比較のためのもので
あって、本発明の一部ではない。 ●＝THC存在、○＝THC不存在 第３図は、実施例８および９において、パラトープ特異
性モノクローナル抗体を用いて行ったTHC ELISAの結果
を示すグラフである。これは、単に比較のためのもので
あって、本発明の一部ではない。 ●＝THC存在、○＝THC不存在 第４図は、実施例８および９において、抗体およびコン
ジュゲートの濃度を一定にして、本発明のモノクローナ
ル抗体を用いて行ったELISAの結果を示すグラフであ
る。 ●＝THC存在、○＝THC不存在 第５図は、実施例８および９において、THCのカルボキ
シレートメタボライトを用いて行ったAIC系試験の結果
を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーセル・アール・ピリオ アメリカ合衆国カリフォルニア 95123、 サン・ホセ、コハセット・ウェイ 5766 番 (72)発明者 トーマス・ディー・ケンプ アメリカ合衆国カリフォルニア 94087、 サニーベイル、ヨークタウン・ドライブ 1093番 (56)参考文献 特開 昭61−71361（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501657（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/08 C07K 16/42 G01N 33/577 G01N 33/564 Ｍｅｄｌｉｎｅ

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免疫
    複合体に対して、該複合体を形成していない該抗原また
    は（該抗原に対する）該抗体に対する結合親和性よりも
    実質的に大きい結合親和性を示すモノクローナル抗体で
    あって、該モノクローナル抗体が、該抗原と（該抗原に
    対する）該抗体とのアフィニティーラベル化免疫複合体
    を調製し、宿主を該アフィニティーラベル化免疫複合体
    で免疫し、そして該宿主から該モノクローナル抗体を取
    得することを含む方法によって調製されるものである、
    抗体。 ２．宿主が動物である、特許請求の範囲第１項記載の抗
    体。 ３．AIC 10−４である、特許請求の範囲第１項記載の抗
    体。 ４．抗原が、分子量が1500未満の有機化合物である、特
    許請求の範囲第１項記載の抗体。 ５．該有機化合物が薬物である、特許請求の範囲第４項
    記載の抗体。 ６．該薬物がテトラヒドロカンナビノールである、特許
    請求の範囲第５項記載の抗体。 ７．抗体が酵素、蛍光剤、化学ルミネッセンス剤、補酵
    素、分散性固体粒子、リポソーム、放射性同位元素、磁
    気粒子および固体支持体から成る群から選択されるラベ
    ルに結合している、特許請求の範囲第１項記載の抗体。 ８．モノエピトープ抗原またはその類縁体、該抗原に結
    合する第１抗体、および前記抗原またはその類縁体と第
    １抗体との免疫複合体に対して、該複合体を形成してい
    ない抗原もしくはその類縁体または第１抗体に対する結
    合親和性よりも大きい結合親和性を示す第２モノクロー
    ナル抗体の免疫サンドウィッチ複合体を含んで成る組成
    物であって、該第２モノクローナル抗体が、該抗原と
    （該抗原に対する）該抗体とのアフィニティーラベル化
    免疫複合体を調製し、宿主を該アフィニティーラベル化
    免疫複合体で免疫し、そして該宿主から該モノクローナ
    ル抗体を取得することを含む方法により調製されるもの
    である、組成物。 ９．該宿主が動物である、特許請求の範囲第８項記載の
    組成物。 １０．第１抗体がモノクローナル抗体である、特許請求
    の範囲第８項記載の組成物。 １１．第２モノクローナル抗体がAIC 10−４である、特
    許請求の範囲第８項記載の組成物。 １２．抗原が、分子量が1500未満の有機化合物である、
    特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １３．該有機化合物が薬物である、特許請求の範囲第12
    項記載の組成物。 １４．該薬物がテトラヒドロカンナビノールである、特
    許請求の範囲第13項記載の組成物。 １５．分子量が1500未満のモノエピトープ抗原を含む疑
    いのある試料中の該抗原を測定する方法であって、 前記抗原またはその類縁体、該抗原に結合する第１モノ
    クローナル抗体、および前記抗原と（該抗原に対する）
    該抗体との免疫複合体に対して、該複合体を形成してい
    ない該ハプテンまたは該抗体に対する結合親和性よりも
    実質的に大きい結合親和性を示す第２モノクローナル抗
    体を含んで成る免疫サンドウィッチ複合体を形成させ、
    但し、該第２モノクローナル抗体が、該抗原と（該抗原
    に対する）該抗体とのアフィニティーラベル化免疫複合
    体を調製し、宿主を該アフィニティーラベル化免疫複合
    体で免疫し、そして該宿主から該モノクローナル抗体を
    取得することを含む方法により調製されるものである、
    そして 該免疫サンドウィッチ複合体を検出する、 ことを含んで成り、免疫サンドウィッチ複合体量が、試
    料中の抗原量を示すものである方法。 １６．該宿主が動物である、特許請求の範囲第15項記載
    の方法。 １７．前記抗体の少なくとも一つが、酵素、蛍光剤、化
    学ルミネッセンス剤、補酵素、分散性固体粒子、リポソ
    ーム、放射性同位元素、磁気粒子および固体支持体から
    成る群から選択されたラベルによってラベルされたもの
    である、特許請求の範囲第15項記載の方法。 １８．第２モノクローナル抗体がAIC 10−４である特許
    請求の範囲第15項記載の方法。 １９．抗原が、薬物である、特許請求の範囲第15項記載
    の方法。 ２０．該薬物がテトラヒドロカンナビノールである、特
    許請求の範囲第19項記載の方法。 ２１．モノエピトープ抗原を含む疑いのある試料中にお
    ける該抗原を測定するホモジーニャスアッセイ方法であ
    って、（ａ）該試料、ラベルした抗原、および該抗原に
    結合する第１抗体を水性媒体中で混合し、（ｂ）該ラベ
    ルした抗原に結合する第１抗体の量に対して該試料が及
    ぼした影響を、該試料中のモノエピトープ抗原量との相
    関として測定する ことを含んで成り、 前記抗原と第１抗体との免疫複合体に対して、該複合体
    を形成していない抗原または第１抗体に対する結合親和
    性よりも実質的に大きい結合親和性を示す第２抗体を前
    記水性媒体に加えること、但し、該第２抗体は該抗原と
    （該抗原に対する）該抗体とのアフィニティーラベル化
    免疫複合体を調製し、宿主を該アフィニティーラベル化
    免疫複合体で免疫し、そして該宿主から該モノクローナ
    ル抗体を取得することを含む方法により調製されるもの
    である、を特徴とする方法。 ２２．該宿主が動物である、特許請求の範囲第21項記載
    の方法。 ２３．該ラベルが、蛍光剤、化学ルミネッセンス剤、補
    酵素、分散性固体粒子、放射性同位元素、リポソーム、
    磁気粒子および固体支持体から成る群から選択したもの
    である、特許請求の範囲第21項記載の方法。 ２４．抗体がモノクローナル抗体である、特許請求の範
    囲第21項記載の方法。 ２５．第２モノクローナル抗体がAIC 10−４である、特
    許請求の範囲第21項記載の方法。 ２６．抗原が、分子量が1500未満の有機化合物である、
    特許請求の範囲第21項記載の方法。 ２７．該有機化合物が薬物である、特許請求の範囲第26
    項記載の方法。 ２８．該薬物がテトラヒドロカンナビノールである、特
    許請求の範囲第27項記載の方法。 ２９．モノエピトープ抗原を含む疑いのある試料中にお
    ける該抗原のアッセイに使用するキットであって、 モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免疫複合
    体に対して、該免疫複合体を形成していない該抗原また
    は（該抗原に対する）該抗体に対する結合親和性よりも
    実質的に大きい結合親和性を示す抗体、およびアッセイ
    用各試薬を、包装した組み合わせとして含んで成り、該
    抗体は該抗原と（該抗原に対する）該抗体とのアフィニ
    ティーラベル化免疫複合体を調製し、宿主を該アフィニ
    ティーラベル化免疫複合体で免疫し、そして該宿主から
    該モノクローナル抗体を取得することを含む方法により
    調製されるものである、キット。 ３０．該宿主が動物である、特許請求の範囲第29項記載
    のキット。 ３１．抗体がモノクローナル抗体である、特許請求の範
    囲第29項記載のキット。 ３２．該モノクローナル抗体がAIC 10−４である、特許
    請求の範囲第31項記載のキット。 ３３．抗原が、分子量が1500未満の有機化合物である、
    特許請求の範囲第29項記載のキット。 ３４．該有機化合物が薬物である、特許請求の範囲第33
    項記載のキット。 ３５．該薬物がテトラヒドロカンナビノールである、特
    許請求の範囲第34項記載のキット。 ３６．モノエピトープ抗原と該抗原に対する抗体との免
    疫複合体に対して、該免疫複合体を形成していない抗原
    または抗体に対する結合親和性よりも実質的に大きい結
    合親和性を示す抗体を調製する方法であって、 抗原と該抗原に対する抗体とのアフィニティーラベル化
    免疫複合体を調製し、 該アフィニティーラベル化免疫複合体で、宿主を免疫す
    る ことを含んで成る方法。 ３７．該宿主が動物である、特許請求の範囲第36項記載
    の方法。
JP62256147A 1986-10-09 1987-10-08 免疫複合体レセプター Expired - Fee Related JP2793587B2 (ja)

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