KR890002633B1 - B형간염 바이러스의 ad, ay형 표면 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

B형간염 바이러스의 ad, ay형 표면 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조방법

제1도는 조단백으로 부터 B형간염 바이러스의 표면 항원 정제 결과에 관한 것으로 B형 간염 바이러스 표면 항원의 겔크로마토그라피를 이용한 정제방법의 용리 형태를 나타내는 그래프이고,

제2도는 조단백으로부터 B형간염 바이러스의 표면 항원 정제 결과를 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel Electrophoresis)에 의해 순도를 확인한 것이다.

제3도는 모노클로날 항체의 정제 결과에 관한 것으로 이온 교환수지를 이용한 복수액 내의 항체 정제에 있어서의 용리 형태를 나타내는 그래프이고,

제4도는 모노클로날 항체의 정제 결과를 SDS-PAGE에 의해 순도를 확인한 것이다(F는 도시되지 않았음).

제5도는 옥터로니법에 의한 본 발명중의 한 모노클로날 항체의 서브타입 결정 및 타이터 조사의 결과를 나타내는 모식도로써 옥터로니법에 의한 침강선의 생성 상황을 나타내는 것이고,

제6도는 옥터로니법에 의한 본 발명중의 한 모노클로날 항체의 서브타입 결정 및 타이터 조사의 결과중 복수액을 연속 희석하였을때 ad, ay형 표면 항원과의 반응 정도를 나타내는 것으로 효소 면역 측정법(EIA)의 샌드위치법에 의해 실험을 하여 얻은 결과를 표시한 그래프이며,

제7도는 ad, ay형 표면 항원양의 변화에 따른 진단시약의 반응성에 대한 결과를 나타내는 것으로 모노클로날 항체를 조합하여 제조한 진단 시약을 이용, B형간염 바이러스의 표면 항원을 연속 희석하였을 때의 반응 결과를 표시한 그래프이다.

본 발명은 B형간염 바이러스의 ad, ay형 표면 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조방법과 이 항체를 이용한 간염 진단시약에 관한 것이다.

바이러스에 의한 B형간염은 우리나라 국민의 10%정도가 보유하고 있는 질병의 하나로 수혈을 통해서 또는 식기, 타액, 수건 등을 통해 수평, 수직으로 전염되며 그 증세는 경우에 따라 황달, 간경변, 간암으로 발전을 하기 때문에 국민 건강 증진을 위해 B형간염을 조기 발견하고 이에 대한 조속한 예방활동 및 치료가 불가피한 실정이다. 근래 B형간염 바이러스의 간염 여부를 정확하고 감도 높게 감지해 내는 진단시약의 개발에 관한 연구가 꾸준히 이루어져 면역 확산법에 의해 최초로 B형간염 바이러스의 표면 항원이 발견된 이래 C.E.P(Counter Electro Phoresis), C.F.(Complement Fixation), 역수동적 혈구 응집 반응법(RPHA), 방사성 면역 측정법(RIA) 및 효소 항체법(ELISA) 등의 방법들이 창안되었다.

이중에서 현재 간염 진단을 위해 주로 사용되는 방법으로는 역수동적 혈구 응집 반응법, 방사성 면역 측정법 및 효소 항체법들인데 이러한 방법의 문제점들을 열거하면 표 1의 기재와 같다.

[표 1]

현재까지 가장 감도가 높은 방법으로 방서성 면역 측정법을 사용하고 있으나, 효소 면역 측정법도 감도가 높아서 방사성 면역 측정법과 비슷한 수준으로 표면 항원을 감지할 수 있기 때문에 조작이 간편하고 환경 오염 등의 문제가 없는 효소 면역 측정법이 각광을 받고 있다. B형간염 바이러스에 대한 효소 면역 측정법 진단 시약으로는 보통 다클론성 항체를 이용하였거나, ad 또는 ay형 표면 항원에만 특성을 나타내는 것이 대부분이나, 모노클로날 항체를 이용하여 ad, ay형 표면 항원 모두에 같은 정도의 반응을 나타내는 진단 시약은 아직까지 보고된 바 없었다.

따라서, 본 발명자들은 B형간염 바이러스 표면 항원의 주된 서브타입인 ad 및ay형에 모두 반응하여 결과를 나타내는 효소면역 측정법 간염 진단 시약의 개발을 위해 연구하던중, 이에 필요한 여러가지 모노클론 항체를 얻고 이들을 배합하여 사용하므로써 목적으로 하는 본 발명을 완성하였다.

즉, 일반적인 정제 방법을 통해 B형간염 바이러스 보균자의 혈청(ad형은 국내 보균자로 부터 얻었고, ay형은 뉴욕 혈액원 : New York Blood Center에서 구입)으로 부터 95%이상의 순도를 갖는 ad, ay형 B형간염 바이러스의 표면 항원을 얻은 다음, 이중의 일부는 전기 영동법에 의해 환원 상태에서 각 서브유니트별로 분리한뒤 각 서브 유니트별로 아크릴아미드 겔 띠를 절단하여 다운스 호모게나이져로 분쇄하고 분쇄물을 탄산나트륨염 완충액(pg 10.5, 0.1 M)에 넣어서 서브유니트 단백을 용출시키고 이것을 원심 분리하여 상등액을 취한뒤 생리 식염수에서 투석하여 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 제거 하였다. 이렇게 하여 얻어진 서브유니트들의 단백 함량을 측정하고 이들 표면 항원의 서브유니트들과 앞서 정제한 표면 항원(ad, ay형)들을 각각 프로인듀스 콤플리트 어쥬반트와 1 : 1로 혼합한 후 생후 4-10 주된 BALB/C쥐에 마리당 10-100㎍ 정도의 항원을 피하주사하고 30-90일 후에 10-100㎍ 정도의 항원을 복강에 각각 조합을 이루어 주사한 후 5일 후에 각 쥐들의 비장을꺼내어 DMEM 배지에서 주사기를 이용, 비장내의 B세포를 뽑아낸 후 원심분리하여 B세포를 얻은 후 적혈구 제거를 위해 ph 7.4, 0.85%의 염화 암모늄 용액으로 세척하였다.

이렇게하여 얻은 B세포와 배양중인 BALB/C 쥐의 골수종 세포로서 8-아자구아닌 내성이며 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제가 결핍된 NSO와 1 : 2내지 1 : 10의 비율로 혼합하여 주고

및 Milstein의 방법에 의해 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 1500을 융합제로 사용하여 세포 융합을 하였다. 여기에 10내지 15% 태아자우 혈청이 들어있는 DMEM 배지를 5내지 10분간 한방울씩 서서히 적가하여 세표 융합을 끝내고 150G내지 300G에서 5분간 원심분리하여 폴리에틸렌 글리콜을 제거한 후, 15%v/v 태아자우 혈청이 들어있는 DMEM 배지에 0.01M의 히포크산틴, 4×10^-5M의 아미노프테린, 1.6×10^-3M의 티미딘이 들어있는 용액을 1%가하여 제조한 HAT 배지를 NSO 세포가 10⁶-10⁷세포/ml 되도록 서서히 가하여 현탁액을 만든 후 쥐의 복강에 티오글리콜 배지(디프코)를 주사하여 5일 후에 얻어진 마크로파지가 구멍당 5000-15000세포 정도 들어있도록 하루전에 미리 만들어 놓은 96구멍의 평판에 세포 융합 현탁액 100μl씩을 넣는다. 1주일 후에 배지의 1/2을 HAT 배지로 치환하여 배양하고 14일째는 HT 배지로 치환하여 1주일 정도 배양한 후 DMEM 배지로 치환하여 배양하며 위의 배양중 콜로니가 형성되면 배양 상등액을 취하여 ad, ay형 표면 항원이 흡착된 EIA용 평판에서 항체 생산 여부를 확인하고 항체 생산 콜로니는 다시 한계희석법으로 서브 클로닝하여 세구멍당 1개의 세포가 들어가도록 희석된 구멍에서 콜로니가 형성되면 세포 배양 상동액을 EIA 법에 의해 항체 생산 여부를 확인하여 항체 생산 콜로니를 다시 서브클로닝 하였다.

실시 결과 서브타입 ad형에만 반응하는 클론들과 ay형에만 반응하는 클론들 및 ad, ay에 공통적으로 반응하는 콜론들을 각각 얻었다. 이것들을 점차로 단면적이 넓은 용기로 옮겨가며 순화시키고 대량으로 배양하여 동결보관하는 한편, 8일과 1일전에 프리스탄(2,6,10,14 테트라메틸 펀타데칸) 0.2-0.5ml씩을 복강에 주사한 BALB/C 쥐에 마리당 10⁶-10⁸세포를 복강에 주사한 후, 1-3주에 걸쳐 복수액을 얻는다. 이 복수액을 적당한 배수로 희석하여 이온 교환 수지에 흡착시킨 후 염화나트룸의 농도가 0.04-0.5M에 되도록 농도 구배를 중 유출시키고 각 분획을 SDS-PAGE 방법으로 순도 실험을 하고 EIA 빙법으로 B형간염 표면 항원에 대한 항체임을 확인하였다. 이 항체가 B형간염 표면 항원에 대한 반응성이 있을 재확인하기 위하여 임뮤노블러팅 방법을 이용, 양성반응을 보이는 항체만을 따로 선발하였으며 그 중에서도 가장 특이성있게 B형간염 바이러스 표면 항원을 전기 영동법으로 환원 상태에서 전개할때 분자량 24,000과 27,000의 주서브유니트와 프리에스(pre-s)가 상술한 두 서브유니트에 접합하여 만들어지는 분자량 33,000과 36,000, 41,000과 44,000의 서브유니트 밴드를 얻는다. 이들 밴드를 니트로 셀룰로오즈 페이퍼에 옮긴 후, 선발된 항체로 반응시키고 여기에 쥐를 면역 글로블린 중 IgG와 IgM에 대한 염소의 항혈청 면역체에 과산화 효소가 붙어있는 시약을 반응시킨 다음, 세척한뒤 침전 시약으로써 4-클로로나프톨을 넣어 주면 선발항체가 반응된 부위에 검은색의 밴드가 형성되는데 이것으로 부터 표면 항원의 서브유니트중 분자량 33,000과 36,000의 서브유니트에 반응하는 항체와 분자량 41,000과 44,000의 서브유니트에 반응하는 항체 및 분자량 24,000, 27,000, 33,000, 36,000 41,000 44,000 모두에 반응하는 항체를 각각 분류할 수 있었다. 이에따라 이들 각 항체를 이용하여 B형간염바이러스의 DNA 복제, 단백질 합성에 관한 연구를 할 수 있을 뿐만 아니라, 현재까지 알려진 표면 항원을 이용한 백신 제조에 있어서 면역가를 높이는데 중요한 역할을 하는 pre-s부위에 대한 연구도 가능하게 되었다.

상술한 바로 얻어진 항체들을 진단 시약용으로 사용하기 위해 그 선별을 목적으로 각 항체들의 정확한 단백질 함량을 측정하고 각각의 타이터를 측정하여 그중에서 우수한 몇몇의 항체를 선발하여 글루탈 알데히드로 플라스틱에 붙이고, 한편으로는 기존 제품의 항체가 흡작된 구슬을 이용, 정제된 항체에 비오틴을 붙인 다음 아비딘(또는 스트렙토 아비딘)과 호스래디쉬(양고추 냉이) 과산화 효소의 접합체를 이용한 항체효소 접합체를 가지고 1차 또는 2차 항체로서의 적합성 여부를 실험하였다. 이렇게하여 얻어진 본 발명의 모노클로날 항체들은 신규의 물질로 이 항체들을 적절히 조합시켜 ad, ay에 모두 반응하는 역수동 적혈구 응집 반응법, 방사성 면역 측정법, 효소면역 측정법 등의 방법으로 진단 시약을 제조할 수 있다.

역수동 적혈구 응집 반응법에서는 본 발명의 항체를 표유류나 조류의 적혈구에 감작시키거나 폴리스티렌 미립자, 폴리에스테르 미립자 등에 결합시켜 사용할 수 있고 효소 면역 측정법에서는 본 발명 항체의 한가지를 폴리스티렌구에 글루탈 알데히드 등을 이용 부착시키고, 또 다른 항체는 글루코스옥시다제, 과산화 효소, 알카린 포스파타제, β-갈락토시다제 등을 아비딘(또는 스트렙토 아비딘)-비오틴 결합을 이용, 효소 표지된 항체를 만들거나 항체-효소 접합체를 글루탈 알데히드를 이용 직접 만들 수도 있다. 전술한 방법에 의해 만들어진 본 발명의 진단 시약은 B형간염(ad형 또는 ay형)의 진단을 위해 사용될 때 정성적일 뿐만 아니라 정량적인 분석을 할 수있다.

본 발명은 모노 클로날 항체를 이용한 B형 간염 바이러스의 ad, ay형 표면 항원을 무두 감지해 낼 수 있는 간염 진단 시약을 개발해 낼 수 있을 뿐 아니라, 본 발명의 모노클로날 항체를 이용한 친화성 크로마토 그라피법으로 ad, ay형 표면 항원의 정제에 이용하거나, B형간염 바이러스의 학술적 연구에도 이용할 수 있다.

본 발명에 의한 간염 진단 시약은 본 발명의 단일 클론 항체들 중 몇가지를 선발하여 조합하였기 때문에 ad, ay형 표면 항원을 거의 동일한 수준으로 감지해 낼 수 있으며, 종래의다클론성 항체를 이용한 진단 시약보다 제조가 간단하고 계속적으로 동질의 항체를 이용하여 진단 시약을 제조할 수 있다.

본 발명의 항체 면역 측정법에 의한 진단 시약은 감도면에서 방사성 면역 측정법과 거의 비슷한 수준이며 방사성 동위 원소를 사용하지 않아도 되기때문에 환경 오염 문제나 방사능을 측정하는 특수 시설이 필요치 않다. 항체 면역 측정법에 의한 진단 시약이 개발됨에 따라 종래 수입에만 의존해 오던 방사성 면역 측정법에 의한 진단 시약을 대치할 수 있으며 경계적이기 때문에 진단 시약의 비용이 저렴해 질 수 있다.

다음의 실시예 에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

조단백으로부터 B형간염 바이러스의 표면 항원의 정제

시료 : 일반적인 방법에 의해 얻어진 조단백 B형간염 바이러스의 표면 항원

방법 : 브롬화칼륨을 인산염 완충액으로 용해하여 밀도 1.0-1.35까지를 단계별 만들고 원심 분리튜브에 단계 농도 구배가 형성되도록 각 밀도의 브롬화칼륨 용액을 담고 맨 윗층에 조단백 B형간염 바이러스 표면 항원을 얹은 다음, 2800rpm에서 20시간 초원심분리하여 부상밀도 1.15-1.25부근의 표면 항원 밴드를 얻었다.

이 밴드 부분을 투석막에 넣고 인산염 완충액에서 3-4시간 간격으로 완충액을 교환하면서 24시간 동안 투석한 후 세파크릴 S-300(파마시아)이 충진되어 있는 컬럼에 초원심 분리한 결과 얻어진 항원 조단백을 넣고 0.4ml/분의 유속으로 용리시키면서 한분획당 2ml 씩을 받아 이물 단백질과 항원을 분리 정제 하였다.

이렇게 용리된 분획에서 소량씩을 취하여 SDS-PAGE법에 따라 3% 스택킹 겔(Stacking gel)을 시료가 통과하는 동안에는 5mA를, 12% 분획 겔(Separating gel)을 통과하는 동안에는 20mA를 걸어 주면서 10시간후에 전원으 공급을 중단하고 겔을 메탄올 50%, 초산10%, 코마시블루 R0.01%가 들어 있는 염색 용액에 넣어 1-2시간 동안 단백질을 염색하고 메탄올 5%, 초산10%의 탈색 용액에서 용액을 갈아 주며 4-5시간동안 탈색시켜 염색된 단백질 밴드를 얻었다. 이렇게 하여 순수 항원 분획을 확인하고 이들을 함께 모은 결과를 제1도와 제2도에 나타 내었다.

제1도는 단백질의 분리 형태를 나타내는 것이며,

제2도는 분리 형태의 각 분획에 들어있는 단백질의 종류를 나타내는 것으로 도면중 ①-⑥으로 표시된 숫자는SDS-PAGE를 위해 시료를 채취한 분획을 나타낸다.

제2도에서 분획 ④까지에는 이물 단백질이 거이 포함되어 있지 않기 때문에 처음부터 분획 ④까지의 분획들을 모아 표면 항원으로 이용하였다.

A의 분자량은 92,000, B는 67,000, C는 45,000, D는 32,000, E는 21,000, F는 14,000이며 분획 ①-④에는 분자량 66,000 정도의 이물 단백이 미량 들어 있고 그외 나머지 밴드 들에는 표면 항원이 환원 조건에서 여러개의 서브유니트로 분리되어 나타난다. 각 서브유니트의 분자량은 24,000, 27,000, 33,000, 36,000, 41,000 등이다.

[실시예 2]

모노믈로날 항체의 정제

시료 : 하이브리도마를 쥐의 복강에 주사하여 얻은 클론의 복수액

방법 : 복수액을 300g에서 15분간 원심분리하여 상등 혈장을 얻고, 이것을 직경 0.45㎛ 여막의 여과장치를 통해 여과하여 불순물이 없는 복수액 혈장을 만들었다.

이 혈장을 ph 7.9, 0.02M 트리스 완충 용액으로 희석하고 G-25(파마시아)로 충진된 컬럼에 통과시킨다.

이것을 이온교환수지(세파로스 CL6B-DEAE)에 흡악시키고 동일한 트리스 완충용액으로 세척한 후, 소금의 농도 구배가 0.04M-0.5M이 되도록 하면서 용리 시켰다. 용리된 단백질의 농도를 자외선으로 계속 추적하면서 10분에 3-5ml 씩의 분획을 받아냈다. 이렇게하여 얻은 분획을 효소 면역 측정법에 의해 항체임을 확인하고 SDS-PAGE방법으로 순도를 확인하여 항체 분획들을 모으고 그 결과를 제3도와 제4도에 나타 내었다.

제3도는 복수 혈장의 용리 형태이며 제4도는 SDS-PAGE에 의한 순도 획인 결과이다.

①-⑥의 숫자는 확인을 위해 시료를 채취한 분획의 임의 숫자이며 A의 분자량은 92,000, B는 67,000, C는 45,000, D는 32,000, E는 21,000, F는 14,000이다.

①-④에 분자량 55,000-56,000 부근의 밴드와 분자량 25,000-27,000 부근의 밴드는 항체가 환원 조건에서 큰사슬과 작은 사슬의 서브 유니트로 분리되어 나타난 것이다.

실험결과 ①-④의 분획들을 모았으며 이때의 순도는 95%이상 이었다.

[실시예 3]

실시예1에서 어어진 B형간염 바이러스 표면 항원(ad 및 ay형)이 1mg/ml 들어 있는 시료 0.5ml를 0.5M트리스 완충액 ph6.8, 에 SDS 10% 글리세롤 10%, 2-머캅토 에탄올 10%, 브로모페놀 블루 0.1%가 들어있는 용액 0.5ml와 혼합하여 100℃에서 2-5분간 끓여준 뒤 스텍킹 겔 윗 부분을 모두 제거하여 1개의 슬롯(Slot)으로 만들고, 여기에 1ml의 시료를 해밀톤 주사기를 이용하여 주입하고 실시예1에서와 같이 암페어와 시간을 맞춘 다음 10시간 후에 겔을 제거하여 메탄올 5%, 초산10%의 용액에 담가주고 겔의 양쪽 끝부분을 절단하여 염색 용액에서 2시간 염색한 뒤 탈색 용액으로 4-5시간 동안 탈색시키고 염색되지 않는 겔의 각 서브유니트에 해당하는 부분을 절단하여 각각을 50ml 켑튜브에 담고 생리 식염수로 1-2회 세척한 다음, 다운스호모게나이저에 넣어 고형물이 거의 없어질 때 까지 분쇄하였다. 이 분쇄물을 1ml의 탄산나트륨 완충액(ph 10.5, 0.5M)에 현탁시켜서 단백질을 용출시켰다. 상동액을 원심분리병에 옮겨서 1000G에서 30분간 원심분리후 상등액을 투석막에 넣고 생리 식염수에서 12시간 투석하여 SDS를 제거하였다. 이것을 로우지법으로 단백정량을 한 결과, 서브유니트에 따라 10-100㎍/ml의 단백질이 용출되었다.

[실시예 4]

실험예1과 실험예3에서와 같이 전기영동을 끝낸후, 겔을 제거하여 25mM 트리스, 0.192mM 글리신, 10%메탄올이 들어 있는 완충 용액에 30분간 담가 두었다가 니트로 셀룰로오즈 페이퍼에 겔을 붙이고 여과지를 위 용액에 적셔서 니트로 셀룰로오즈 페이퍼와 겔 양면에 붙이고 또 다시 양면에 스폰지를 댄 후 다공성 플라스틱판을 양면에 대어 압착시키고 이것을 위의 용액에 담가서 니트로 셀룰로오즈 페이퍼 쪽에 양극(＋)을, 반대편에 음극(－)을 걸어주고 100V에서 1-2시간 동안 단백질을 니트로 셀룰로오즈 페이퍼에 옮겨 붙인다. 니트로 셀룰로오즈 페이퍼를 조심스럽게 겔에서 떼어내어 위 용액에 30분 정도 담가둔 후 3% 우혈청 알부민이 들어 있는 트리스식염 완충액에서 1시간 동안 블로킹하고 블로킹이 끝난 후 3% 우혈청 알부민이 들어 있는 트리스 식염 완충액에 선발된 모노클로날 항체를 적당량 가하여 4℃에서 일야 반응시킨다. 반응 후 트리스식염 완충액으로 4-5회 세척하고 다시 한번 블로킹을 1시간 한 후 쥐의 면역 글로블린 IgG와 IgM에 대한 염소의 항혈청 면역체에 과산화 효소가 결합된 접합체(타고사 제품)를 적당량 가하여 4℃에서 10시간 정도 반응시키고 트리스 식염 완충액으로 5-6회 세척한 뒤 4-클로로 나프톨 3mg이 1ml 메탄올에 용해된 스톡 용액을 만든 뒤 19.2ml 트리스 식염 완충액에 0.8ml의 3% 과산화수소, 4ml의 4-클로로나프톨 스톡 용액을 넣고 혼합한 후 앞서 반응과 세척이 완료된 니트로 셀룰로오즈 페이퍼를 용액에 담가 반응시킨다. 냉암소에서 5-10분 가량 반응시키면 검은색은 밴드가 니트로 셀룰로오즈 페이퍼에 나타나게 되는데 밴드가 나타나면 니트로 셀룰로오즈 페이퍼를 여과지 사이에 끼워 말리고 건암소에서 보관한다.

[실험예 1]

옥터로니법에 의한 본 발명중의 한 모노클로날 항체의 서브 타입 결정 및 타이터 조사

시료 : 세포 융합 기술과 서브 클로닝의 방법이 따라 선발된 ad, ay형 표면 항원에 모두 반응하는 모노클로날 항체(임의로 DY 10이라함). 쥐의 IgG, IgG_2a, IgG_2b, IgG_3,IgA 그리고 IgM에 대한 염소의 항 혈청

방법 : 1) 아가로스(시그마)를 인산 완웅 용액에 1%(w/v)가 되도록 용해하고 두께 2.0mm의 한천 겔 평판을 만들어 각시료에 대하여 옥터로니법에 따라 실험하였다.

2) DY10 복수액을 염소 혈청이 3%, 소혈청 1%가 들어 있느 인산 완충 용액으로 1 : 4로 연속 희석하여 ad, ay영 표면 항원이 각각 흡착된 효소 면역 측정법 평판에 500μl 씩 가하고 실온에서 3시간 반응시킨 후 증류수로 5-10회 세척한 뒤 여기에서 1 : 1000으로 희석된 과산화 효소가 표시된 쥐의 IgG와 IgM에 대한 염소의 항혈청(TAGO)을 50μl 씩 넣고 2시간 반응 시켰다. 다시 증루수로 5-10회 세척하고 0-페닐린디아민이 0.5M 구연산 소다 완충액에 20mgml 들어있고 과산화 수소가 0.1% 들어 있는 기질을 100μl 씩 넣고 실온에서 30분간 발색 반응을 시킨 후 2N 황산 75μl로 반응을 정지시키고 마이크로 웰플래이트리더로 파장 492nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 제5도와 제6도에 나타 내었다.

제5도는 옥터로니법에 의해 나타난 DY10의 결과이며 제6도는 모노클로날 항체 DY10과 표면 항원과의 반응 결과를 나타낸 것이다.

도면에서 알 수 있듯이 모노클로날 항체는 옥터로니 실험에서 오직 한개의 침강선을 나타내었으며 연속 희석에 의해 ad 형 표면 항원에 반응하는 정도가 ay형 표면 항원에 반응하는정도에 비해 다소 높았다. 연속 희석이 계속됨에 따라 492nm에서의 흡광도치가 더이상 하락하지 않고 일정하게 되는데 흡광도치가 일정해지기 시작하는 점 까지를 DY10의 타이터로 잡았다. DY10의 서브타입은 IgG_2b이었으며 타이터는 6.0×10⁶이었다.

위와같은 방법으로 본 발명 항체들의 서브타입과 타이터 그리고 ad형, ay형 표면 항원에 대한 특이도를 측정하여 표 2에 기재하였다.

[표 2]

대표적인 항체들의 서브타입 및 특이도(타이터)

[실험예 2]

ad, ay형 표면 항원양의 변화에 따른 진단 시약의 반응성

시료 : a) 본 발명의 효소 면녁 측정버버용 진단시약

b) ad, ay형 표면 항원

방법 : ad, ay형 표면 항원을 각각 1% 소 혈청 알부민, 3% 염소 혈청이 들어 있는 인산 완충액에 적당히 희석 하였다. 희석 항원 200μl와 본 발명 진단시약의 효소 표지된 항체를 200μl 가한 후 혼합하여 실온에서 3시간 반응시킨 다음, 증류수로 잘 세척하고 다시 본 발명의 진단시약 지질 용액 300μl 씩을 넣어주어 30분동안 반응시키고 2N 황산 300μl를 가하여 반응을 정지시켰다.

반응이 완료된 용액을 200㎕씩 효소 면역 측정법 평판으로 옮겨서 파장 492nm에서 흡광도를 읽고 결과를 제7도에 나타내었다.

ad, ay형 표면 황원에서 거의 같은 수준으로 반응을 나타내었으며 ad형에서 반응을 일으키는 정도가 ay형에서 반응을 일으키는 정도보다 10%가량 높았다. 반응 최소 항원량은 0.8mg/ml 정도 되었으며 이것은 방사성 면역 측정법과 유사한 수준이었다.

Claims (2)

1. B형간염 바이러스의 표면 항원(ad및 ay형)중 프리에스 (pre-s) 부위에 대한 모노클로날 항체의 제조에 있어서, 전기 영동법에 의해 얻어진 프리에스 밴드를 겔로부터 용출시키고 용출된 프리에스 단백질을 쥐에 감작시킨 다을, 공지의 방법으로 하미브리도마를 생산하고 이들중 프리에스 부위에 특이한 반응을 나타내는 클론을 공지의 임뮤노블러팅 기술, 효소 면역 측정법(EIA)을 이용하여 프리에스 부위에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, B형간염 바이러스 표면 항원으로 쥐를 감작시킬 때 정제된 ad, ay형 표면 항원의 조합을 ad로 1차 감작시키고 ay로 2차 감작시키거나, ay로 1차 감작시키고 ad로 2차 감작시키거나, ad로 1차.2차 감착시키거나 ay로 1차.2차 감착시켜서 서브타입 ad, ay 또는 ad 및 ay 공통에 대해 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 취득함을 특징으로 하는 모노클로날 항체의 제조방법.

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