KR19980027132A - 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체, 이 항체를 생성하는 하이브리도마, 이 항체를 함유하는 키트 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

1. 청구범위에 기재된 발명이 속한 기술분야

메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체, 이 항체를 생성하는 하이브리도마, 그 항체를 함유하는 키트, 그 항체, 하이브리도마 및 키트의 메탐페타민의 검출

2. 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제

본 발명은 메탐페타민에 대해 특이적인 하이브리도마 세포주, 이에 의해 생성된 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체를 사용하여 형성된 시약 키트, 직접 경쟁 ELISA 키트 및 1-단계 크로마토그래피 면역분석 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체 및 키트를 사용함으로써 메탐페타민을 검출하는 방법에 관한 것이다.

3. 발명의 해결 방법의 요지

메탐페타민에 대한 항체를 생성하는 B-림프구와 흑색종 세포주를 융합시켜 수득된 세포주로서 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마.

4. 발명의 중요한 용도

(+)-메탐페타민에 고도로 특이적이고 민감한 모노클로날 항체 및 그 시약

Description

메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체, 이 항체를 생성하는 하이브리도마, 이 항체를 함유하는 키트 및 그의 용도

본 발명은 메탐페타민(MA)에 특이적인 모노클로날 항체, 이 항체를 생성하는 하이브리도마, 이 항체를 함유하는 키트, 및 메탐페타민을 검출하는데 사용하기 위한 그 항체, 하이브리도마 또는 키트의 용도에 관한 것이다.

암페타민은 한 그룹의 합성 에페드린 유도체의 일반명칭이다. 이들 화합물은 도파민 및 에피네프린과 같은 신경전달물질과 구조적으로 유사성이 있기 때문에 중추 및 말초 교감 신경의 a 및 b 수용체를 자극할 수 있고 신경제 및 심장혈관제의 흥분을 유도할 수 있는 중추 신경 자극물질의 일원이다. 가장 흔한 것은 (+)- 및 (-)-암페타민, 및 (+)- 및 (-)-메탐페타민이다.

미국에서, (-)-메탐페타민(Vicks Inhaler)은 비출혈 및 비폐색을 치료하기 위한 흡입 치료제로서 사용되며 (J. Anal. Tox. 17:284, 1993) 기면 상태의 환자 및 운동항진증 어린이 환자의 치료에 응용되고 체중 감소용 약물로서 응용된다. 이 약물은 각성, 식용감퇴 및 다행증 유도와 같은 특정 효과를 지니고 있기 때문에 이의 남용은 심각한 문제를 야기한다. 이 약물의 장기 투여는 중독 및 약물 내성을 일으킬 수 있다. 장기간의 남용은 정서 및 사고에 영향을 줄 수 있다. 중증의 약물 중독은 암페타민 정신분열증을 유도할 수 있으며 난폭한 행동을 유발하고 사회안전에 위험요인이 된다.

보건부 및 사법부 조사국의 통계자료에 따르면 대만에서 발견 및 추적된 마취제의 양은 1990년 이래로 40 내지 50배로 증가하였다. 마취제의 급속한 유포 및 약물 남용자의 급속한 증가는 대만의 사회안전에 잠재적 문제가 된다. 또한, 대만의 약물 남용자가 투여하는 대다수의 마취제는 암페타민 계열의 메탐페타민(Clin. Med. J. (Taipeci) 48:305-9, 1991) 및 헤로인(Dulletin of Drug and Food No. 158, 20 Octrober 1993)이다.

정상 상태에서 43%의 메탐페타민이 투여후 24시간 내에 뇨를 통해 본래의 형태 그대로 배출될 것이다. 불과 4 내지 7%만이 암페타민의 형태로 배출되며 약 15%가 p-하이드록시메탐페타민 및 기타 다른 형태로 배출된다. 따라서, 뇨중에서 메탐페타민과 이의 대사물의 양을 검출하는 것은 메탐페타민이 투여되었는지를 알 수 있다. 약물 남용 문제의 측면에서 남용 약물을 위해 총체적인 검사를 실시할 필요가 있다.

약물 남용의 시험은 두 가지 주요 절차를 포함한다: 일차 스크리닝 및 이차 확인(Drug of Abuse Testing Market, Theta Corp. 1991). 일차 스크리닝의 경우 고도의 민감성, 이용 편리성 및 샘플의 대규모 처리와 같은 특성을 나타내는 도구가 사용된다. 양성 결과를 나타내는 샘플을 확인하는 경우 가스상 크로마토그래피/질량 스펙트럼분석(J. Anal. Tox. 16:109, 1992) 또는 가스상 크로마토그래피/퍼리어 전환 자외선-적외선 스펙트럼분석(J. Anal. Tox. 17:359, 1993)과 같이 고도로 특이성 및 정밀성을 갖는 스크리닝 방법이 사용된다. 현재 이용되고 있는 암페타민 남용의 스크리닝 검정법은 박층 크로마토그래피(TLC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 면역검정이 포함된다. 멀티클로날 및 모노클로날 항체를 사용하여 개발된 시약이 바람직하다. 이들은 고도의 특이성 및 민감성 때문에 간편한 이용, 신속한 반응 및 다량의 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 샘플의 후처리 불필요성과 같은 다른 장점을 지니고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 시약 키트는 전량 세트로서 수입되고 있으며 고가이다. 게다가 결과는 흔히 에페드린 및 페닐프로판올아민에 의해 영향을 받으며 이에 따라 가-양성 결과가 얻어진다(Bulletin of Drug and Food No. 158, October 1993). 비용을 줄이고 시약의 질을 개선하기 위하여 (+)-메탐페타민에 고도로 특이적이고 민감한 모노클로날 항체가 개발되었고 시험 시약이 선정되었다.

본 발명의 목적은 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체를 함유한 메탐페타민의 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 메탐페타민 과용을 검출하는데 사용하기 위한 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체, 이를 생성하는 하이브리도마 및 키트의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적, 장점 및 특징은 이하에서 더욱 자세히 설명될 것이다.

도 1은 메탐페타민의 직접 경쟁 ELISA의 표준 억제 프로필을 나타낸 도면,

도 2는 다양한 농도의 메탐페타민을 검출하기 위해 메탐페타민의 1-단계 크로마그래피 침지 스틱 테스트에 의해 얻은 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 메탐페타민에 대해 특이적인 하이브리도마 세포주, 이에 의해 생성된 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체를 사용하여 형성한 시약 키트, 직접 경쟁 ELISA 키트 및 1-단계 크로마토그래피 면역분석 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체 및 키트를 사용함으로써 메탐페타민을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 B 세포 융합 방법에 의해 메탐페타민에 대해 특이적인 B 세포 하이브리도마를 생성하는 통상의 기법을 사용한다. 상기 방법은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 통상의 세포-융합 시약에 의해 메탐페타민에 대한 항체를 생성하는 B-림프구를 사용하여 마우스 골수종 세포를 융합시키는 단계를 포함한다. HAT 선별법에 의해서 목적하는 하이브리도마를 선별한다. 간접적인 효소-결합 면역수착 분석(ELISA) 및 경쟁 ELISA를 사용하여 상기 하이브리도마의 배지내에 함유된 항체의 특이성을 분석함으로써, 메탐페타민에 대해 특이적인 모노클로날 하이브리도마 세포주를 선별한다. 그 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강내로 주입하여 복수증을 유발시킨다. 단백질 정제 기법을 사용하여 복수증으로부터 항체를 회수한다. 이어서 모노클로날 항체를 사용함으로써 직접 경쟁 ELISA 키트 및 1-단계 크로마토그래피 침지 스틱을 형성하여 뇨중의 메탐페타민을 검출한다.

면역분석의 특이성 및 감도는 항체의 특성에 좌우된다. 면역원의 설계 및 제법은 특히 메탐페타민과 같은 1,000 돌턴 이하의 분자량을 가진 약물에 대한 항체의 경우에, 특이적인 항체를 수득할 수 있는지의 여부에 관하여 대단히 중요한 요건이 된다. 메탐페타민은 그 분자량이 낮음에 기인하여 반-면역원성 면역원으로 분류된다. 즉, 이 약물은 단독으로 존재할 경우에는 면역 반응을 발새하도록 시스템을 촉진하지 않는다. 통상적으로, 소분자 반-면역원에 대하여 면역 반응을 발생하기 위해서는, 그 소분자 면역원을 면역원성 대분자 캐리어 단백질에 결합시키는 경우가 많다. 따라서, 반-면역원에 대한 면역성은 캐리어의 면역원성의 도움을 받아 유발되는 것이다. 그러므로, 소분자 반-면역원과 캐리어로 된 복합체의 설계, 결합 및 제법은 모두 항체의 질과 특이성에 특정의 영향을 미친다.

미국 특허 제 5,026,827 호는 N-(4-아미노부틸) 암페타민과 단백질의 복합체를 사용하여 메탐페타민을 결합시킬 수 있는 항체를 생성한다. 미국 특허 제 5,135,863 호는 알콕시티올릴알킬아미도암페타민/메탐페타민을 사용하여 항체 및 효소 복합체를 생성하므로써, 암페타민 및 메탐페타민의 존재를 검출한다. 구로이와 등은 p-아미노메탐페타민-BSA 및 o-아미노메탐페타민-BSA를 면역원으로 사용하여 메탐페타민에 대한 모노클로날 항체를 생성한다(Forensic Science International 44:245-255, 1990; J. of Immunoassay 12(2): 277~292, 1991). 사용된 메탐페타민 유도체들간의 차이로 인하여, 결과적으로 생성되는 항체의 특이성이 달라진다.

본 발명은 메탐페타민 유도체와 캐리어의 복합체를 면역원으로서 사용하여 메탐페타민에 대한 모노클로날 항체를 생성한다. 메탐페타민 유도체는 하기 [화학식 1]로 통상 표시된다:

[화학식1]

상기 식에서, n은 1, 2, 3 또는 4 이고; R¹은 할로겐으로 치환되거나 비치환된 C_1-4알킬; C_1-4알콕시; -OCH₂Ph; 또는 -OC(C_1-4알킬)₃이고; R²는 =O, =S 또는 -H 이고; R³및 R⁴는 각각 -H, C_1-4알킬, 또는 디(C_1-4알킬)이며, R⁵및 R⁶는 각각 -H 이거나, 또는 R⁵와 R⁶가 함께 -(CH₂)₄- 를 나타낸다.

예를 들면, R¹은 -CF₃, -CCl₃, -CH₃, -OCH₃, -OC₂H₅, -OCH₂Ph, 또는 -OC(CH₃)₃이고; R³및 R⁴는 -H, -CH₃또는 -(CH₃)₂이다. 본 발명에 사용될 수 있는 캐리어 단백질은 예컨대 헴알부민, 글로불린, 헤마토시아닌, 페리틴 등이다.

본 발명이 한 양태에서는, N-트리플루오르-메탐페타민-p-부탄산-N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 소 혈청 알부민을 면역원으로서 사용하며, 수득한 항체의 특성은 후술하는 실시예에 상세히 기술된 바와 같다. 수득한 항체로부터 유도된 ELISA 시약 키트는 시판되는 Microzyme^TM(미국, Immunotech Corp.)에 비해서 GC/MS와 고도한 상관관계를 갖는데, 이는 본 발명의 항체가 종래 기술의 항체와 비교하여 메탐페타민에 대해서 실질적으로 개선된 항체임을 시작한다.

직접 경쟁 면역분석은 모노클로날 항체를 고체상 지지체의 표면상에서 메탐페타민에 대한여 부동화시킴으로써 수행된다. 이러한 분석법에 있어서, 테스트하고자 하는 다양한 농도의 메탐페타민 또는 샘플을 신호체(예: 효소, 형광체, 방사성동위원소)와 결합된 메탐페타민 복합체와 반응시킨다. 메탐페타민 및 메탐페타민-신호제 복합체는 제한된 항-메탐페타민 항체에 대하여 서로 경쟁할 것이다. 그러므로, 기지의 농도의 메탐페타민 표준물질로부터 얻은 신호 강도에 의해 밝혀진 메탐페타민 억제의 표준 프로필을 사용하여 뇨 샘플중의 메탐페타민의 존재 및 그 농도를 측정할 수 있다.

본 발명의 직접 경쟁 ELISA 키트는 (1) 고체상 지지체, (2) 메탐페타민에 대한 모노클로날 항체, (3) 메탐페타민 표준물질, (4) 메탐페타민-신호제 복합체, 및 (5) 착색 물질을 포함한다. 고체상 지지체는 미소역가 평판, 비이드 및 종이일 수 있다. 고체상 지지체는 단백질 부동화에 적합한 물질, 예를 들면 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 니트로셀룰로오스, 나일론 등으로 제조되는 것이 바람직하다. 신호체는, 예를 들면 란탄족 형광체와 같은 형광체; 생물학적 형광체 및 화학적 형광체와 같은 형광체; 방사성동위원소; 및 카탈라아제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제와 같은 효소일 수 있다. 분석 방법 및 반응 조건은 통상의 기법을 따른다(Antibody: A Laboratory Manual, Harlow 및 Dayid Lane 편집, 1988).

한 단계 크로마토그래피 면역분석은 크로마토그래피 기법과 함께 항원과 항체간의 특이적인 결합을 사용하므로써 개발된 간단하고 신속하며 시각적으로 해독가능한 면역분석법이다. 이 면역분석법은 특별한 기술적 경험이 없는 개인이라도 누구나 실시할 수 있다.

본 발명의 한 단계 크로마토그래피 침지 스틱은 (1) 샘플-접촉 영역, (2) 항-암페타민-표시제 영역, (3) 반응-테스트 영역, 및 (4) 액체-회수 영역을 포함한다. 본 발명의 침지 스틱은 모세관 현상을 제공할 수 있고 액체를 흡수할 수 있는 다공성 캐리어 물질, 예컨대 여과지, 니트로셀룰로오스 막, 유리 선유 막 등으로 제조될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 표시제는, 예를 들면 착색된 라텍스 입자, 예컨대 폴리스티렌, 폴리비닐 틀루엔, 플라스티렌-아크릴산 및 폴리아크롤레인의 중합체; 금속 콜로이드질 졸, 예컨대 금 졸; 비-금속성 졸, 예컨대 콜로이드질 실리카 입자 및 염료 졸이다. 이러한 물질들은 모두 시판제품으로서 입수할 수 있다.

샘플-접촉 영역은 침지 스틱의 한쪽 단부에 위치하여 테스트하고자 하는 샘플과 접촉한다. 샘플-접촉 영역에 의해 흡수된 샘플은 모세관 현상에 의해 다른 한쪽 단부를 향해 이동함으로써 침지 스틱 전체를 습윤시킨다. 표시제 영역은 샘플-접촉 영역에 인접하여 위치하며, 매우 안정하고 특별한 장치를 사용하지 않고도 시각적으로 해독할 수 있는 표시제와 메탐페타민에 대한 모노클로날 항체의 건조된 복합체를 수집한다. 테스트 영역은 표시제 영역 바로 위에 위치한다. 이 영역상에서 착색 시약, 예를 들면 메탐페타민-캐리어 항원 복합체는 부동화되고, 이는 항-메탐페타민-표시제 복합체와 반응할 수 있으며, 시각적으로 해독가능한 신호 변화를 나타낼 수 있다. 캐리어 항원의 예로는 헴알부민, 글로불린, 헤마토시아닌, 페리틴 등을 들 수 있다.

테스트를 함에 있어서는, 침지 스틱의 샘플-접촉 단부를 기지의 농도의 메탐페타민 표준물질 및 테스트하고자 하는 샘플과 접촉시킨다. 뇨 샘플은 모세관 현상에 의해서 다른 한쪽 단부를 향해 침지 스틱을 습윤시켜서 항체-표시제 복합체를 용해시킨다. 메탐페타민이 뇨 샘플중에 함유된 경우, 메탐페타민은 테스트 영역상에서 제한된 항-메탐페타민-표시제 복합체에 대하여 메탐페타민-캐리어 항원과 경쟁할 것이다. 그러므로, 보다 높은 함량의 메탐페타민이 샘플내에 존재할수록 테스트 영역에서 양성 신호는 더욱 약하게 나타난다. 테스트 영역에서 반응의 존재 및 강도를 사용하여 뇨 샘플중의 메탐페타민의 존재 및 그 함량을 측정할 수 있다.

본 발명의 목적, 방법, 특징 및 기술 내용을 더욱 상세히 설명하기 위해서, 이하에 구체적인 실시예를 도면과 함께 게재하였다. 그러나, 후술하는 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 이하에서는 다음과 같은 약어를 사용하였다.

HAT : 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘

Tg : 소의 티로글로불린

FCS : 소 태아 혈청

DMSO : 디메틸 설폭사이드

PBS : 인산염 완충 염수

TMB : 테트라메틸 벤지딘

BSA : 소 혈청 알부민

실시예 1 : 하이브리도마 2602-16.2의 제조

(+)-메탐페타민-p-부탄산-소 혈청 알부민의 제조

N-트리플루오로-메탐페타민-p-부탄산-N-히드록시숙신이미드 에스테르 14mg을 DMSO 2.8ml에 용해시켰다. 얼음조에서, 수득한 용액 2.55ml를 BSA(100mg/0.05M 탄산 나트륨 용액) 20ml에 첨가하고, 교반하여 하룻밤 반응시켰다. 반응 생성물을 0.1M 탄산 나트륨(pH 11), 및 pH 7.4 의 PBS 완충액에 대하여 투석하고, 동결건조하여 보관하였다.

MA/BSA 몰비율이 2.6인 (+)-메탐페타민-p-부탄산-소 혈청 알부민 복합체(MA-BSA) 및 프로인트 보조액으로 된 1:1 에멀션을 MALB/C 마우스에게 피하 주입하였다. 4 차례의 연속적인 처치시에는 매주 1회 마우스에게 125㎍ 의 BSA(마우스 한마리당)를 주입하였으며, 이어서 5회의 처치시에는 4주마다 보충적으로 주사하였다(40㎍/마우스). 1차 면역시에는 완전 프로인트 보조액을 사용하였고, 이어 매회의 면역에 있어서는 불완전 프로인트 보조액을 사용하였다. 세포를 융합하기 3일 전에 마우스에게 다시 추개 용량(보조액 없음)을 정맥내 주사하였다. 3일 경과후에 폴리에틸렌 글리콜-400(PEG 400)을 사용하여 비장 세포를 마우스 골수종 세포, FO 세포주(ATCC CRL 1646)과 1:3 비율로 융합시켰다. 이어서 세포를 RPMI 배지(HAT, 20% FCS)에 현탁시키고, 1×10⁵FO 세포의 농도까지 희석시켰다. 세포 현탁액을 96-웰 배양 평판내로 주입하였다(0.2ml/웰). 10일 경과후에, 세포 배양액의 상청액을 MA/Tg 몰 비율 5.8 인 (+)-MA-소 티로글로불린복합체(MA-Tg)를 제공하는 ELISA 평판으로 테스트하였다. (+)-메탐페타민(MA)에 대해 특이적인 하이브리도마를 선별하고, 추가로 한계 희석법에 의해 클로닝하였다. 모노클로날 하이브리도마 1602-16.2 를 그 절차에 따라 선별하였다. 상기 하이브리도마로부터 분비된 모노클로날 항체는 카파 경쇄 및 6.7-7.0 의 등전점을 가진 IgG2a 유전인자형인 것으로 밝혀졌다. 이 하이브리도마를 액상 질소중에 -70℃ 하에 보관하고(예를 들면 10% DMSO 및 90% FCS로 이루어진 배지중에 보관), 표준 포유류 세포 배양 기법(예를 들면 200mM의 글루타민 및 50mM의 2-메르캅토에탄올로 보충된 10% FCS를 사용한 RPMI 1640)을 사용하여 배양하였다. 하이브리도마는 중화민국, 대만, 친추 소재의 식품 산업 연구소(FIRDI)에 1994년 7년 13일자로 수탁 번호 960003 으로서 기탁되었다.

실시예 2 : 메탐페타민 남용 검측용 직접 경쟁 ELISA법

항체 결합 평판의 제작

모노클로날 항체 2602-16.2를 2.5㎍/ml가 되도록 탄산염 완충 식염수(pH=9.6)로 희석시켰다. 희석물 200μl를 96-웰 폴리스티렌 평판의 각 웰의 표면상에 흡착시키고 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 이 평판을 0.05% 트윈 20-PBS로 4회 세정하고, 그 다음 두드려 건조시켰다. 각 웰에 0.1% 탈지분유-PBS를 250μl씩 첨가하여 37℃에서 30분동안 차단시키고, 0.05% 트윈-PBS로 3회 세정한 다음 이후에 사용하기 위하여 두드려 건조시켜 두었다.

메탐페타민-카탈라제 복합체의 제조

카탈라제(5mg/ml)를 50mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)중의 10mM과 요오드산 나트륨으로 실온에서 30분동안 산화시킨 다음 50mM 아세트산 나트륨 용액에 대해 투석하여 과요오드산 나트륨을 제거하였다. N-트리플루오로-메탐페타민-p-부탄산-디아민 15μl를 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 반응시키고, 그 반응물의 pH를 0.5M 탄산나트륨 용액(pH 11.6)으로 9.5로 조정하였다. 20mM 붕수소화나트륨을 첨가하여 4℃에서 하룻밤동안 환원시켰다. 그 반응물을 0.1M 탄산나트륨(pH=11)에 대하여 2시간동안 투석하였다. 그 다음 완충액을 0.1M 아세트산 나트륨(pH 8.0)으로 치환하였다. 일정량으로 분할시켜 사용할 때까지 -70℃에서 저장한다.

시험할 때에는, 음성의 뇨 샘플로 제조한 (+)-메탐페타민 표준물(0, 50, 100, 200, 300, 500, 750 및 1000 ng/ml) 각각과 표 2 및 3에 제시한 약물(각각의 농도에 대해서는 표 2 및 3을 참조하라)을 50μl 씩 항체 2602-16.2를 나타내는 웰에 첨가했다. 그 다음 메탐페타민-카탈라제 복합체(4,200X 희석물) 150μl를 첨가하고, 혼합한 다음 실온에서 10분동안 항온처리했다. 그 반응 용액을 제거한 뒤, 웰을 0.05% 트윈 20-PBS로 충전시키고, 그 후 세정액을 제거했다. 세정을 5회 반복한 뒤, 카탈라제 수용체 TMB 100μl를 첨가한 다음, 실온에서 10분동안 항온처리하고, 그 반응물을 급냉시키기 위해 2N HCL 50μl를 첨가했다. 이 샘플의 OD_450/650값을 측정했다.

표 1은 (+)-메탐페타민 표준물의 광학 흡광도 값, 및 6회 반복시험의 변동계수(cv) 및 억제율(%)을 나타낸다. 각각의 표준농도로부터 수득되는 cv는 모두 10% 이하였다. 억제율은 제공된 물질에 대한 항체의 상대적인 민감도를 나타낸 것이다. 억제율은 (1-OD_시험치OD_OMA)로 계산하고, 이때 OD_OMA는 MA를 함유하지 않는 음성 대조군 샘플의 OD 값이고, OD_시험치는 여러 농도의 MA 또는 기타 다른 비-MA 약제(표 2 및 표 3 참조)를 함유하는 샘플의 OD값이다. 도 1은 본 발명의 직접 경쟁 ELISA 법을 사용하여 수득한 (+)-MA의 표준 억제 프로파일을 나타낸 것이다(=0.993). 음성 대조군의 변동계수의 10% 표준편차의 2배값이 20% 이상인 수치가 상당한 차이를 의미한다면, 본 발명의 MA 직접 경쟁 ELISA 키트의 민감도는 50ng/ml 이하이다.

표 2에 기술한 비-(+)-메탐페타민 약물 모두를 100㎍/ml 농도로 시험했을 때 20% 이상의 억제율은 산출하지 않았다. 표 3에 기술한 약물을 여러 농도로 첨가했을 때, 측정된 농도를 사용하여 계산한 교차반응성의 백분율(%)로부터, (+)-메탐페타민 외에 모노클로날 항체 2602-16.2도 또한 메탐페타민 대사물인 p-히드록시메탐페타민 및 오해를 유발할 수 있는 암페타민 유사체인 3,4-메틸렌디옥소-메탐페타민도 검출함을 알게 되었다.(J. Anal. Tox. 14:146-150, 1990). (+)-슈도에페드린은 평균 36%의 교차반응성을 산출하였다. 디펜히드라민, 페넬진 및 라니티딘에 대한 교차 반응성 백분율은 모두 1% 이하였다.

과요오드산 나트륨은 히드로아민 약물(예, 에페드린 및 슈도에페드린)을 단편으로 파괴시킬 수 있다(J. Anal. Tox. 17:125-126, 1993). 따라서, 본 발명에서는 과요오드산 나트륨(125mM)을 96-웰 평판상에 흡착시킨 뒤 건조시켜, (+)-슈도에페드린을 함유하여 가양성 반응을 유도할 수도 있는 뇨 샘플을 전처리하는데 사용하였다. 표 4는 여러 농도의 (+)-슈도에페드린 또는 (+)-메탐페타민을 함유하는 뇨 샘플을 실온에서 10분동안 항온처리하므로써 수득되는 결과를 나타낸 것이다. 이러한 처리는 (+)-슈도에페드린의 방해를 효과적으로 감소시킬 수 있었고, 따라서, 교차반응성을 평균 36%에서 5%로 감소시켰다. 또한, 이러한 처리는 (+)-메탐페타민의 억제 프로파일에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

본 발명의 직접 경쟁 ELISA 키트를 사용하여 213개의 샘플을 시험했다. 샘플중에서, 80개의 기체상 크로마토그래피/질량 분석계로 분석시 양성으로 입증되었고, 3개의 음성으로, 130개는 보통의 뇨인 것으로 입증되었다. ELISA로부터 ≥300ng/ml의 값은 양성의 표시로서 사용하였고, 본 발명의 시약으로, 그리고 기체상 크로마토그래피/질량 분석계로 수득한 결과는 매우 일치하였고, 민감도 및 특이성도 높았다. 이러한 결과는 표 5에 나타내었다.

본 발명의 개선점을 입증하기 위해, 시판용 Microzyme^TM메탐페타민/암페타민 ELISA 키트(Immunotech Corp, 미국)를 비교용으로서 사용했다. 106개의 샘플을 시험했다. 이 샘플들중에서, 52개는 기체상 크로마토그래피/질량분석계에서 양성으로 나타났고, 3개는 음성으로, 51개는 보통 뇨인 것으로 나타났다. ≥300ng/ml의 값은 시약의 프로토콜에 따라 양성의 표시로서 사용하였고, 상기 시판용 ELISA 시약으로 수득한 결과 및 기체상 크로마토그래피/질량분석계로 수득한 결과는 표 6에 예시하였다. 이로부터 본 발명의 모노클로날 항체로부터 유래된 효소-결합된 분석시약이 매우 개선된 일치성, 카파 및 특이성을 갖고 있다는 것이 명백해졌다.

[표1]

(+)-메탐페타민 표준물의 흡광도값, 6회 반복시험의 변이계수 및 억제율

[표2]

억제율이 20% 이하인 약물(100mg/ml)

[표3]

교차반응성 비-(+)-메탐페타민 약물

[표4]

(+)-메탐페타민 및 (+)-슈도에페드린에 미치는 나트륨의 영향

[표5]

(+)-메탐페타민 직접경쟁 ELISA 및 가스상 크로마토그래피/질량스펙트럼분석에 의해 측정된 샘플의 비교결과

* ELISA(+) : 300 ng/ml(+)-메탐페타민.

GC/MS(+) : 50 ng/ml 메탐페타민 및 암페타민.

** ELISA를 이용한 3회 실험에서 (+)-메탐페타민의 평균농도는 277 ng/ml이다.

*** 4개의 샘플중 하나의 GC/MS의 결과 음성으로 판명된다.

카파 : 변화-교정된 비례승인(Practical Statistics for Medical Research, Douglas G.Altman Chapman Hall, 1991, p.403)

민감성(양성으로서의 정확한 측정률)

특이성(음성으로서의 정확한 측정률)

[표6]

시판되고 있는 마이크로자임 ELISA 및 가스상 크로마토그래피/질량스펙트럼분석에 의해 측정된 샘플의 비교결과

* ELISA(+) : 300 ng/ml(+)-메탐페타민.

GC/MS(+) : 50 ng/ml 메탐페타민 및 암페타민.

** 6개 샘플중 3개는 GC/MS의 결과 음성으로 판명된다.

실시예 3 : 메탐페타민 남용을 검출하기 위한 일단계 크로마토그래피 면역분석법

항-메탐페타민(2602-16.2)-청색 라텍스 복합체의 제작

1.5ml 미량원심분리기 튜브중에 균일하게 혼합된 청색 라텍스(카르복실-개질된 폴리스티렌, 10% 고형물, 0.284μM, 미국, Seradyn) 200μl, 붕산염 완충식염수(50mM, pH=8.5) 650μl, 1mg의 항체 2602-16.2 및 총부피를 1ml로 만들기 위한 물을 첨가하여 잘 혼합했다. 이 미량원심분리기 튜브를 회전 진탕기중에 배치하여 실온에서 18시간동안 배양하고, 12,000×g 에서 15분동안 4℃ 하에 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 펠릿을 50mM 붕산염 완충식염수(pH=8.5) 1ml 중에 재현탁시키고, 다시 12,000×g에서 15분동안 원심분리시킨 뒤, 상청액을 제거하였다. 세정을 3회 반복하고 항체-라텍스 펠릿을 10% BSA-붕산염 완충식염수(50mM, pH=8.5) 1ml중에 재현탁시켰다. 미량원심분리기 튜브를 회전 진탕기상에 배치하여 실온에서 2시간동안 항온배양하고 1,200×g에서 15분동안 원심분리했다. 항체-라텍스 펠릿을 15% 트레할로스 및 0.01% NaN₃를 함유하는 붕산염 완충 식염수(50mM, pH=8.5) 1ml 중에 재현탁시켜 4℃에 저장했다.

한 단계 크로마토그래피 침지 막대의 제조

0.5cm×2.0cm의 20개 침지 막대와 동일하게, 소공 크기가 5mm인 니트로셀룰로스 막(Schleider Schnell)을 10cm×2.0cm의 스트라이프로 절단하였다. 약 1.5mm의 라인을 형성하기 위하여, 폭이 넓은 면(2.0cm)의 상부로부터 약 0.6cm(대조 면적) 및 1.2cm(시험 면적)에서 마우스 IgG에 대한 래빗 항체(1mg/ml) 및 메탐페타민-p-부탄산-소의 티로글로불린 복합체를 각각 분무총(2kg/㎠ 압력)으로 스트라이프위에 분무한 뒤, 30분동안 실온에서 공기 건조시켰다. 이 스트라이프를 차단용 완충액(0.24% 카세인, 0.01% 트리톤 X-100, 3% 트레할로스-PBS(20mM)) 중에 놓고, 실온에서 30분동안 차단반응시켰다. 이 스트라이프를 완충액으로부터 꺼내어, 20℃ 및 30% 습도의 항온처리기중에서 30분동안 건조시켰다.

한면이 아교처리된 플라스틱 이면 판을 10cm×7cm 로 절단했다. 상기와 같이 제조된 니트로셀룰로스 막을 폭이 넓은 면(7cm)의 상부로부터 3~5cm의 면적에 부착시키고, 10cm×3cm의 여지(와트만)를 상부에서부터 3cm까지의 면적에 부착시켰다. 그 다음 10cm×2cm의 유리섬유막을 하부의 샘플-접촉부위에 부착시켰다. 총부피가 80μl인 항-암페타민-청색 라텍스 복합체를 니트로셀룰로스 막의 하부로부터 1.5cm 떨어진 부위의 유리섬유막위에 분무하였다. 스트라이프를 20℃ 및 30% 습도의 항온처리기중에서 하룻밤동안 건조시킨 다음, 0.5cm×7cm의 침지 막대로 절단시켰다.

시험을 위해, 샘플-접촉 부위의 하부를 1000, 500, 300, 100ng/ml의 (+)-메탐페타민을 각각 함유하는 뇨 샘플 약 200ml 중에 침지시키고, 메탐페타민을 함유하지 않는 뇨 샘플은 대조용으로서 사용하였다. 5 내지 10분 후, 청색 시그널이 대조부위와 시험부위에서 관찰되면, 반응은 음성으로서 간주하여, 그 샘플이 표적인 메탐페타민을 함유하지 않음을 나타낸다. 청색 시그널이 대조부위에서만 나타나고 시험부위는 청색 시그널을 나타내지 않거나 매우 약한 청색 시그널을 나타내면, 반응은 양성으로서 그 샘플이 표적인 메탐페타민을 함유함을 나타내는 것이다. 시험결과는 도 2에 예시하였고, 이 또한 침지 막대의 민감도가 300ng/ml임을 나타내고 있다. 또한, 샘플-접촉 부위에 있는 유리 섬유막상에 과요오드산 나트륨을 흡착시키면 (+)-슈도에페드린의 교차반응성이 효과적으로 감소하였다.

본 발명을 많이 변형하고 수정할 수 있고, 그 구체예들을 실시예를 통해 상세히 기술하여 예시하였다. 그러나, 이러한 실시예들이 본 발명을 그 특정 구체예들에만 제한하고자 제공된 것이 아님은 당연한 것이다. 본 발명은 첨부되는 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위 및 취지를 벗어남이 없이 다양한 변형체 및 유사체를 포함하고 있다.

암페타민 계열의 메탐페타민을 용이하게 검출함으로써 약물중독의 증가를 방지할 수 있다.

Claims (29)

1. 메탐페타민에 대한 항체를 생성하는 B-림프구와 흑색종 세포주를 융합시켜 수득된 세포주로서 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마.
2. 제 1 항에 있어서, B-림프구가 메탐페타민 유도체 및 캐리어 단백질의 복합체에 의해 면역화된 동물로부터 유도되는 하이브리도마.
3. 제 2 항에 있어서, 메탐페타민 유도체가 하기 일반식으로 나타나는 하이브리도마:

   상기 식에서,

   n은 1, 2, 3 또는 4 이고;

   R¹은 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C_1-4알킬; C_1-4알콕시; -OCH₂Ph; 또는 OC(C_1-4알킬)₃이며;

   R²는 =O, =S 또는 -H 이고;

   R³및 R⁴는 독립적으로 -H, C_1-4알킬 또는 디(C_1-4알킬)이며;

   R⁵및 R⁶은 독립적으로 -H 이거나 함께 -(CH)- 이다.
4. 제 3 항에 있어서, 메탐페타민 유도체가 메탐페타민-p-부탄산인 하이브리도마.
5. 제 2 항에 있어서, 캐리어 단백질이 알부민, 글로불린, 헤마토시아닌 또는 페리틴인 하이브리도마.
6. 제 1 항에 있어서, 흑색종 세포주가 마우스 흑색종 세포 FO 세포주이고 B-림프구가 메탐페타민-p-부탄산-소 혈청 알부민 복합체에 의해 면역화된 마우스로부터 유도되는 하이브리도마.
7. 제 2 항에 있어서, 마우스 B-림프구 하이브리도마 2602-16.2인 하이브리도마.
8. 제 1 항의 하이브리도마에 의해 생성되는 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 항체.
9. 메탐페타민에 대한 항체를 생성하는 B-림프구와 흑색종 세포주를 융합시키고 메탐페타민에 특이적인 모노클로날 하이브리도마 세포주를 선별하여 제 1 항의 하이브리도마를 제조하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, B-림프구가 메탐페타민 유도체 및 캐리어 단백질의 복합체에 의해 동물로부터 유도되는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 메탐페타민 유도체가 하기 일반식으로 나타나는 방법:

    상기 식에서,

    n은 1, 2, 3 또는 4 이고;

    R¹은 비치환되거나 할로겐으로 치환된 C_1-4알킬; C_1-4알콕시; -OCH₂Ph; 또는 OC(C_1-4알킬)₃이며;

    R²는 =O, =S 또는 -H 이고;

    R³및 R⁴는 독립적으로 -H, C_1-4알킬 또는 디(C_1-4알킬)이며;

    R⁵및 R⁶은 독립적으로 -H 이거나 함께 -(CH)- 이다.
12. 제 11 항에 있어서, 메탐페타민 유도체가 메탐페타민-p-부탄산인 방법.
13. 제 10 항에 있어서, 캐리어 단백질이 알부민, 글로불린, 헤마토시아닌 또는 페리틴인 방법.
14. 제 9 항에 있어서, 흑색종 세포주가 마우스 흑색종 세포 FO 세포주이고 B-림프구가 메탐페타민-p-부탄산-소 혈청 알부민 복합체에 의해 면역화된 마우스로부터 유도되는 방법.
15. 제 9 항에 있어서, 세포 융합이 폴리에틸렌 글리콜에 의해 수행되는 방법.
16. 제 8 항의 항체를 함유하는 키트.
17. 제 16 항에 있어서, 직접 경쟁적 ELISA 키트인 키트.
18. 제 17 항에 있어서, (1) 고체상 지지체, (2) 제 8 항의 모노클로날 항체, (3) 메탐페타민 표준물, (4) 메탐페타민-시그날 복합체, 및 (5) 착색물질을 함유하는 키트.
19. 제 18 항에 있어서, 고체상이 미세역가 평판, 비드 또는 페이퍼인 키트.
20. 제 18 항에 있어서, 시그날이 형광물질, 방광물질, 방사성동위원소 및 효소로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키트.
21. 제 20 항에 있어서, 효소가 카탈라제, 알카리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키트.
22. 제 16 항에 있어서, 원 스텝 크로마토그래피 침지 스틱인 키트.
23. 제 22 항에 있어서, (1) 샘플-접촉 영역, (2) 제 8 항의 모노클로날 항체-지시제의 영역, (3) 반응-시험 영역, 및 (4) 액체-회수 영역을 포함하는 키트.
24. 제 22 항에 있어서, 침지 스틱이 모세관성을 제공하고 액체를 흡수할 수 있는 재질의 다공성 캐리어 물질로 만들어진 키트.
25. 제 24 항에 있어서, 침지 스틱이 필터, 니트로셀룰로즈 막, 나일론 막 및 유리 섬유 막으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키트.
26. 제 23 항에 있어서, 지시제가 폴리스티렌, 폴리비닐톨루엔, 폴리스티렌-아크릴산 및 폴리아크롤레인과 같은 착색된 라텍스 입자; 금 졸과 같은 금속성 교질성졸; 및 교질성 실리카 입자 및 염료 졸과 같은 비-금속성 졸로 이루어진 그룹중에서 선택되는 키트.
27. 제 23 항에 있어서, 반응-시험 영역이 메탐페타민-캐리어 항원 복합체를 함유하는 키트.
28. 제 27 항에 있어서, 캐리어 항원이 알부민, 글로불린, 헤마토시아닌 또는 페리틴키트.
29. 뇨 샘플을 제 8 항의 모노클로날 항체 또는 제 16 항 내지 28 항중 어느 한 항의 키트로 시험하여 뇨 샘플중의 메탐페타민을 검출하는 방법.