CN113816877B - 一种新的甲萘威半抗原、完全抗原及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗原合成技术领域，公开了一种新的甲萘威半抗原、完全抗原及其制备与应用。该方法以4‑羟基‑2‑萘甲酸为原料，一步法得到4‑甲基氨基甲酰氧基‑萘酚‑2‑甲酸，将其作为半抗原与载体蛋白偶联获得完全抗原，本发明制备方法简单，半抗原直接在萘环上引入活性的羧基，完整的保留了甲萘威氨基甲酸酯的分子结构，具有较高的特异性和灵敏度。

Description

一种新的甲萘威半抗原、完全抗原及其制备与应用
技术领域
本发明涉及抗原合成技术领域，具体为一种新的甲萘威半抗原、完全抗原及其制备与应用。
背景技术
甲萘威是常用的氨基甲酸酯类农药，由于其对多种昆虫的高效性，是农业上应用最广泛的杀虫剂。然而，该农药残留在农产品或环境中可能会造成对人体产生持续的健康危害。为保障人体健康，监控农药暴露水平，建立一种简单、可靠、高灵敏度的检测方法用于检测甲萘威具有重要意义。
免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体结构、静电、氢键和范德华力等的综合作用，具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，因此具有灵敏度与常规的仪器分析一致、适合现场筛选、简单、快速、成本低、样品所需量少等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。世界粮农组织（FAO）已向许多国家推荐此项技术。美国化学学会（ACS）将免疫分析技术、色谱分析技术共同列为农药、兽药和渔药残留分析的主要技术。
公开号为CN101475637的发明专利公开了一种适用于同时分析甲萘威和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒的甲萘威和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原制备，它包括甲萘威人工半抗原和甲基对硫磷人工半抗原结构以及甲萘威和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原制备方法。该发明制备的甲萘威和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原可用于制备适用于同时分析甲萘威和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，对残留甲萘威和甲基对硫磷的最低检出浓度分别为11.0、15.0ng/ml，然而该试剂盒对于单独甲萘威残留的检测并不方便，易造成试剂盒未检测甲基对硫磷单检测甲萘威的浪费。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新的甲萘威半抗原、完全抗原及其制备与应用。
本发明的第一个目的是提供一种新的甲萘威半抗原。
本发明的第二个目的是提供所述甲萘威半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种新的甲萘威完全抗原。
本发明的第四个目的是提供所述甲萘威完全抗原的制备方法。
本发明的第五个目的是提供一种甲萘威抗体。
本发明的第六个目的是提供所述甲萘威半抗原、所述甲萘威完全抗原或所述甲萘威抗体在检测甲萘威的产品中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种包含所述甲萘威完全抗原或所述甲萘威抗体的酶联免疫检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种新的甲萘威半抗原，其结构式如式1所示：
Figure 952950DEST_PATH_IMAGE001
。
所述甲萘威半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S11. 将4-羟基-2-萘甲酸与溶剂混合，得到混合溶液；
S12. 在步骤S11得到的所述混合溶液中依次加入三乙胺、三甲基溴硅烷进行反应；
S13. 将步骤S12所得反应产物不经分离直接与异氰酸甲酯反应，再经水解、酸化得到4-甲基氨基甲酰氧基-萘酚-2-甲酸，即为甲萘威半抗原。
优选地，所述的4-羟基-2-萘甲酸、三甲基溴硅烷、异氰酸甲酯和三乙胺的投料摩尔比为1：1：1：2。
优选地，所述溶剂为四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、乙腈、乙酸乙酯中的一种或多种，优选为四氢呋喃。
本发明还提供一种新的甲萘威完全抗原，所述的甲萘威完全抗原为由所述甲萘威半抗原与载体蛋白偶联得到，其结构式如式2所示：
Figure 831913DEST_PATH_IMAGE002
，其中，
Figure 333039DEST_PATH_IMAGE003
为载体蛋白。
优选地，所述甲萘威半抗原与所述载体蛋白的质量比为1:1-1:20。
优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白（BSA）、卵血清蛋白（OVA）或钥孔血蓝蛋白（KLH）中的一种。
所述甲萘威完全抗原的制备方法为：
室温下，将甲萘威半抗原溶液与载体蛋白溶液进行反应、透析，即得所述的甲萘威完全抗原。
优选地，所述反应的反应时间为4-24h。
优选地，所述透析为4℃下用PBS缓冲溶液透析三天。
优选地，所述载体蛋白溶液为载体蛋白溶于碳酸盐缓冲溶液的溶液；所述碳酸盐缓冲溶液为0.1M，pH=9.6的碳酸盐缓冲溶液。
优选地，所述甲萘威半抗原溶液是采用如下方法一或方法二得到的：
方法一：将甲萘威半抗原溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）反应12-24h，即得所述的甲萘威半抗原溶液；
方法二：将甲萘威半抗原溶于DMF中，加入正丁胺和氯甲酸异丁酯反应0.5-2h，即得所述的甲萘威半抗原溶液。
更优选地，所述的甲萘威半抗原、DCC、NHS的摩尔比为1:1.0-2.0:1.0-2.0。
更优选地，所述的甲萘威半抗原、正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1：1.2:1.2。
本发明还提供一种甲萘威抗体，是由所述的甲萘威半抗原、所述的甲萘威完全抗原或所述制备方法制备得到的甲萘威完全抗原中的一种免疫动物得到。
优选地，所述甲萘威抗体为甲萘威多克隆抗体、甲萘威单克隆抗体或甲萘威基因工程抗体，更优选为甲萘威单克隆抗体。
所述甲萘威半抗原、所述甲萘威完全抗原或所述甲萘威抗体在检测甲萘威的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种包含所述甲萘威完全抗原或所述甲萘威抗体的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒含有所述甲萘威完全抗原或所述甲萘威抗体。
优选地，所述试剂盒包括：包被有甲萘威完全抗原的酶标板、酶标二抗、甲萘威标准品工作液、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液。
其中，所述的包被的甲萘威完全抗原为甲萘威半抗原与载体蛋白的偶联物。
所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）。
所述甲萘威标准品工作液为6瓶甲萘威标准品浓缩液溶液（浓缩液溶剂为甲醇），浓度分别为0 μg/L、100 μg/L、300 μg/L、900 μg/L、2700 μg/L和8100 μg/L。
所述底物显色液包括A液和B液，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。
所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，其中百分比为重量体积百分比。
所述复溶液为pH值为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
本发明中酶标板的制备过程优选为：用包被缓冲液（pH=9.6的碳酸盐缓冲液）将包被原稀释成2 μg/ ml，每孔加入100 μl，4℃避光孵育16 h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200 μl封闭液，37℃避光孵育2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明还提供所述试剂盒在检测甲萘威或其结构类似物中的应用。
具体地，所述应用是利用所述试剂盒检测甲萘威，包括如下步骤：
S21.加样：取出包被有甲萘威完全抗原的酶标板，往标准孔中加入不同浓度的甲萘威标准品溶液（所述甲萘威标准品溶液由甲萘威标准品工作液经稀释获得，具体为用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.2）以9:1稀释成甲萘威标准品溶液，稀释后浓度分别为0 μg/L、10 μg/L、30 μg/L、90 μg/L、270 μg/L和810 μg/L），样品孔中加入样本，然后每孔加入甲萘威抗体和酶标二抗，轻轻振荡混匀：
S22.温育：盖上盖板膜置25℃避光环境中反应45min；
S23.洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破）酶标板：
S24.显色：加入底物显色液A液，再加底物显色液B液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min：
S25.终止：每孔加入终止液，轻轻振荡混匀；
S26.读值：设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔的吸光度值。
本发明具有以下有益效果：
本发明以4-羟基-2-萘甲酸为原料，一步法得到4-甲基氨基甲酰氧基-萘酚-2-甲酸，将其作为半抗原与载体蛋白偶联获得完全抗原，本发明制备方法简单，半抗原直接在萘环上引入活性的羧基，完整的保留了甲萘威氨基甲酸酯的分子结构，具有较高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为甲萘威半抗原和甲萘威完全抗原的合成路线图。
具体实施方式
实施例1甲萘威半抗原合成
甲萘威半抗原合成路线如图1所示，其结构式如式1所示：
Figure 184320DEST_PATH_IMAGE004
。
具体制备如下：
称取0.5 g 4-羟基-2-萘甲酸溶于15 ml溶剂四氢呋喃中，加入690 μl三乙胺，搅拌10 min，滴入345 μl三甲基溴硅烷，继续搅拌30 min，然后滴入171 μl异氰酸甲酯，室温搅拌过夜。之后加入1.5 ml水淬灭反应，反应液浓缩，残余物25 ml水和1.5 ml 6M NaOH，加入25 ml甲基叔丁基醚萃取，水相用6M HCl酸化至pH=3~4，过滤，滤饼用10 ml水洗，真空干燥得固体的4-甲基氨基甲酰氧基-萘酚-2-甲酸（甲萘威半抗原），合成的甲萘威半抗原的纯度为99.9%。
实施例2甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为二氧六环，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.4%。
实施例3甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为二氯甲烷，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.6%。
实施例4甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为氯仿，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.5%。
实施例5甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为DMF，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.7%。
实施例6甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为DMSO，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.8%。
实施例7甲萘威半抗原合成
与实施例1的区别在于，所用溶剂为体积比为1:1的乙腈和乙酸乙酯，其余设置与实施例1相同。合成的甲萘威半抗原的纯度为99.3%。
实施例8甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
甲萘威完全抗原合成路线如图1所示，其结构式如式2所示：
Figure 4378DEST_PATH_IMAGE005
，其中，
Figure 980424DEST_PATH_IMAGE006
为载体蛋白。
具体制备如下：
称取实施例1得到的甲萘威半抗原10 mg溶于200μlDMF中，加入22 mg DCC，12 mgNHS，室温搅拌过夜得活性酯溶液，也就是甲萘威半抗原溶液，其中室温搅拌过夜的时间为12-24h。称取50 mg BSA溶于4 ml碳酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液离心，取上清滴入BSA溶液中，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:5，室温过夜，室温过夜时间为4-24h，得到甲萘威BSA完全抗原溶液。将甲萘威BSA完全抗原溶液在4℃下用PBS缓冲溶液透析三天，完成后取出透析液，冻干得甲萘威BSA完全抗原，-40℃保存。
实施例9甲萘威完全抗原（甲萘威OVA完全抗原）合成
与实施例8的区别在于，将具体制备中的BSA溶液替换为OVA溶液，即可得到甲萘威OVA完全抗原。
实施例10甲萘威完全抗原（甲萘威KLH完全抗原）合成
与实施例8的区别在于，将具体制备中的BSA溶液替换为KLH溶液，即可得到甲萘威KLH完全抗原。
实施例11甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例8的区别在于，称取100 mg BSA溶于8 ml碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:10，其余设置与实施例8相同。
实施例12甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例8的区别在于，称取20 mg BSA溶于2 ml碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:2，其余设置与实施例8相同。
实施例13甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
甲萘威完全抗原合成路线如图1所示，其结构式如式2所示：
Figure 819329DEST_PATH_IMAGE005
，其中，
Figure 853013DEST_PATH_IMAGE006
为载体蛋白。
具体制备如下：
称取10 mg实施例1得到的甲萘威半抗原溶于250 μl DMF中，冰浴冷却，然后加入9.7 μl正丁胺，再加入5.3μl氯甲酸异丁酯，继续冰浴反应0.5h得甲萘威半抗原溶液。称取50 mg BSA溶于4 ml碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，缓慢滴入甲萘威半抗原溶液，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:5，室温避光反应4h，得到甲萘威BSA完全抗原溶液。甲萘威BSA完全抗原溶液4℃下用PBS缓冲溶液透析三天，得甲萘威BSA完全抗原，-40℃保存。
实施例14甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，冰浴反应的时间为1 h，室温避光反应的时间为4h，其余设置与实施例13相同。
实施例15甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，冰浴反应的时间为1 h，室温避光反应的时间为16 h，其余设置与实施例13相同。
实施例16甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，冰浴反应的时间为2 h，室温避光反应的时间为24 h，其余设置与实施例13相同。
实施例17甲萘威完全抗原（甲萘威OVA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，将具体制备中的BSA溶液替换为OVA溶液，即可得到甲萘威OVA完全抗原。
实施例18甲萘威完全抗原（甲萘威KLH完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，将具体制备中的BSA溶液替换为KLH溶液，即可得到甲萘威KLH完全抗原。
实施例19甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，称取100 mg BSA溶于8 ml碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:10，其余设置与实施例13相同。
实施例20甲萘威完全抗原（甲萘威BSA完全抗原）合成
与实施例13的区别在于，称取20 mg BSA溶于2 ml碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，甲萘威半抗原与载体蛋白的质量比为1:2，其余设置与实施例13相同。
试验例
（a）甲萘威单克隆抗体制备
动物免疫：将采用实施例8、11、12、13制备方法得到的免疫原分别注入到Balb/c（8周）小鼠体内，免疫剂量为120 μg/只，使其产生抗血清。
细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌甲萘威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的生产与纯化：采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后采集腹水。用proteinG纯化柱进行腹水纯化，-20℃保存。
（b）酶标二抗的制备
以山羊作为免疫动物，以甲萘威单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到甲萘威抗抗体。将甲萘威抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联得到酶标二抗。
（c）酶标板的制备
用包被缓冲液（pH=9.6的碳酸盐缓冲液）将采用实施例8-20制备方法得到的包被原稀释成2 μg/ ml，每孔加入100 μl，4℃避光孵育16 h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200 μl封闭液，37℃避光孵育2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
（d）检测甲萘威的酶联免疫检测试剂盒的组建
组建检测甲萘威的酶联免疫检测试剂盒，使其包含下述组分：
（1）包被有甲萘威完全抗原的酶标板；
（2）甲萘威标准品工作液溶液6瓶（浓缩液溶剂甲醇），浓度分别为0 μg/L、100 μg/L、300 μg/L、900 μg/L、2700 μg/L和8100 μg/L，使用时用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.2）以9:1稀释成甲萘威标准品溶液，稀释后浓度分别为0 μg/L、10 μg/L、30 μg/L、90 μg/L、270 μg/L和810 μg/L；
（3）用辣根过氧化物酶标记的甲萘威抗抗体；
（4）底物显色液包括A液和B液，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
（5）终止液为2 mol/L硫酸；
（6）洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，其中百分比为重量体积百分比；
（7）复溶液为pH值为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
（e）甲萘威酶联免疫检测试剂盒的检测
（1）用试剂盒检测
加标准溶液或样本50μl到对应的微孔中，再加入甲萘威抗体50μl/孔，最后加入酶标二抗50μl/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干酶标板（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破）。加入底物显色液A液50μl/孔，再加底物显色液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀。设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔吸光度值。
（2）检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准品（0标准）的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以甲萘威标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲萘威的实际浓度。
（3）精密度检测
从实施例8制备的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含50μg/L甲萘威）的吸光光度值，计算变异系数，变异系数的计算方法：变异系数（CV）＝（各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值）×100％。实验重复三次结果，结果如下表1所示：
表1实施例8制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数：
Figure 922600DEST_PATH_IMAGE007
由表1可以看出，实施例8制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒测定标准溶液（含50μg/L甲萘威）的变异系数为在5.9%-7.9%之间，实施例11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒测定标准溶液（含50μg/L甲萘威）的变异系数与实施例8的变异系数相近，均符合国家对于试剂盒精密度的标准。
（4）特异性检测
分别配置α-萘酚、克百威、灭多威不同浓度标准曲线0μg/L、10μg/L、30μg/L、90μg/L、270μg/L和810μg/L，使用上述甲萘威酶联免疫检测试剂盒检测，通过吸光光度值得出α-萘酚、克百威、灭多威的IC50值，然后计算交叉反应率，计算公式如下：
Figure 534411DEST_PATH_IMAGE008
结果如下表2所示，与其他药物的交叉反应率越小说明甲萘威酶联免疫检测试剂盒对甲萘威的检测特异性越好。
表2 α-萘酚、克百威、灭多威的交叉反应率
Figure 675542DEST_PATH_IMAGE009
由表2可以看出，实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒测得α-萘酚，克百威，灭多威交叉反应率结果均小于1%，该结果说明实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒中的甲萘威抗原特异性好，不易出现假阳性、错检等现象，可以应用于实际样品中甲萘威残留的筛查检测。
（5）灵敏度检测
对实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒进行最低检出限检测，结果如下表3所示：
表3实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒的最低检出限检测结果
Figure 907940DEST_PATH_IMAGE010
由表3可以看出，实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒的最低检出限较低，均低于公开号为CN101475637的发明专利公开的甲萘威和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒对残留甲萘威的最低检出浓度（11.0 ng/ml），说明实施例8、11、12、13制备的甲萘威酶联免疫检测试剂盒与甲萘威和甲基对硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒（公开号为CN101475637）相比，灵敏度较高。
综上所述，本发明以4-羟基-2-萘甲酸为原料，一步法得到4-甲基氨基甲酰氧基-萘酚-2-甲酸，将其作为半抗原与载体蛋白偶联获得完全抗原，本发明制备方法简单，半抗原直接在萘环上引入活性的羧基，完整的保留了甲萘威氨基甲酸酯的分子结构，具有较高的特异性和灵敏度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种新的甲萘威半抗原，其特征在于，其结构式如式1所示：
Figure 81886DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种如权利要求1所述的甲萘威半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11. 将4-羟基-2-萘甲酸与溶剂混合，得到混合溶液；
S12. 在步骤S11得到的所述混合溶液中依次加入三乙胺、三甲基溴硅烷进行反应；
S13. 将步骤S12所得反应产物不经分离直接与异氰酸甲酯反应，再经水解、酸化得到4-甲基氨基甲酰氧基-萘酚-2-甲酸，即为甲萘威半抗原。
3.根据权利要求2所述的甲萘威半抗原的制备方法，其特征在于，所述的4-羟基-2-萘甲酸、三甲基溴硅烷、异氰酸甲酯和三乙胺的投料摩尔比为1：1：1：2。
4.一种新的甲萘威完全抗原，其特征在于，所述的甲萘威完全抗原为由权利要求1所述的甲萘威半抗原与载体蛋白偶联得到，其结构式如式2所示：
Figure 64885DEST_PATH_IMAGE002
，其中，
Figure 896313DEST_PATH_IMAGE003
为载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵血清蛋白或钥孔血蓝蛋白中的一种。
5.一种如权利要求4所述的甲萘威完全抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：
室温下，将甲萘威半抗原溶液与载体蛋白溶液进行反应、透析，即得所述的甲萘威完全抗原。
6.根据权利要求5所述的甲萘威完全抗原的制备方法，其特征在于，所述甲萘威半抗原与所述载体蛋白的质量比为1:1-1:20；所述反应的反应时间为4-24h。
7.根据权利要求6所述的甲萘威完全抗原的制备方法，其特征在于，所述的甲萘威半抗原溶液是采用如下方法一或方法二得到的：
方法一：将甲萘威半抗原溶于DMF中，加入DCC和NHS反应12-24h，即得所述的甲萘威半抗原溶液；
方法二：将甲萘威半抗原溶于DMF中，加入正丁胺和氯甲酸异丁酯反应0.5-2h，即得所述的甲萘威半抗原溶液。
8.一种用于检测甲萘威的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求4所述的甲萘威完全抗原、权利要求5或权利要求6或权利要求7所述制备方法制备得到的甲萘威完全抗原中的一种。
9.一种如权利要求4所述的甲萘威完全抗原在检测甲萘威的产品中的应用。
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