CN115184616A - 前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于良性前列腺增生诊断试剂盒领域,具体公开了前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用;所述前列腺小体外泄蛋白抗原为经过多次离心和分离纯化后从良性前列腺增生患者尿中获得,并以此为基础进一步得到对应的前列腺小体外泄蛋白抗体,以上述抗原和抗体本发明构建了用于诊断良性前列腺增生的酶联免疫吸附的试剂盒,以有效用于检测和诊断良性前列腺增生;相比现有技术,检测是非侵入性的,易于操作,简便,并且具有高灵敏度和特异性,而且早期良性前列腺增生的诊治将会进一步加强对慢性前列腺炎的防治,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于良性前列腺增生诊断试剂盒领域,具体公开了前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用。
背景技术
良性前列腺增生是男性中老年最常见的疾病,其病理学特点为前列腺上皮与基质细胞的过度增生,前列腺体积增大,当引起临床症状时则称为临床良性前列腺增生。据一组国外尸解资料报告男性40岁以上80.1%,80岁以上90.5%有组织学良性增生。临床良性前列腺增生的发病率,国内有报告60-69岁及70-79岁的男性中有中到重度症状者分别达到60%及69%。良性前列腺增生的临床特点主要包括:1前列腺体积增大;2以下尿路症状(LUTS)为主的临床症状;3膀胱出口梗阻。此外,还可继发血尿、泌尿系统感染、膀胱结石以及上尿路积水和肾功能损害等严重合并症。对良性前列腺增生患者的恰当处置对维护中老年的健康及提高生活质量具有重要意义。
良性前列腺增生与前列腺炎具有明显区别,前列腺炎是前列腺的感染性疾病,好发于中青年。前列腺炎的症状表现为恶寒、发热、乏力,在盆腔部位具有压迫、疼痛等症状,久坐的时间长了或排便时情况会加重,且向腰部、下腹、背部及大腿等扩散,疼痛加剧而不能排便;排尿时有烧灼感、尿急、尿频,可伴有排尿终末血尿或尿道脓性分泌物;大便时尿道口可流出白色分泌物等。
目前良性前列腺增生的诊断主要有直肠指检(DRE),但是直肠指检具有侵入性,并且需要专业医师进行,DRE可以了解前列腺的大小、形态、质地、有无结节及压痛、中央沟是否变浅或消失以及肛门括约肌张力情况。但是直肠指诊对前列腺体积的判断不够精确,目前经腹超声或经直肠超声检查可以更精确描述前列腺的形态和体积,但是上述检测需要专业医师,或者专业的仪器,无法普遍展开,限制了良性前列腺增生的检测,目前的尿常规只可以确定下尿路症状患者是否有血尿、蛋白尿、脓尿及尿糖等,并未发现良性前列腺增生的特异性标志物,因此也无法使用尿常规检测,因此目前急需一种便捷的非侵入性检测方法来检测良性前列腺增生。
发明内容
为了解决上述问题,本发明公开了前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用。
本发明的技术方案如下:
前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述前列腺小体外泄蛋白抗原由以下方法制备:
取良性前列腺增生患者随机尿,加入PBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,在0-4℃环境下200-600g离心5-15分钟,去沉淀,取上清液继续在0-4℃环境下8000-12000g离心10-30分钟,去沉淀,取上清液继续于0-4℃环境下80000-120000g离心60-120分钟,倒去上清液,取沉淀加入1-5mL TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,混匀,继续0-4℃环境下80000-120000g离心60-120分钟,倒去上清液,取沉淀溶于1-5mL的包含0.5%NP-40,80mM NaCl,0.2%Deoxycholate,50mM Tris,pH 8.0和蛋白酶抑制剂的溶剂中;在0-4℃环境下80000-120000g离心20-30分钟;取上清液,上样凝胶柱过柱,280纳米读数,取在40kDa区域峰值蛋白,-80℃冷冻保存。
所述抗体为针对上述前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆抗体。
优选的,所述前列腺小体外泄蛋白抗原由以下方法制备:
取500mL良性前列腺增生患者随机尿,加入等量pH=7.3的PBS缓冲液和蛋白酶抑制剂。在4℃环境下400g离心10分钟,去沉淀。取上清液继续在4℃环境下10000g离心20分钟,去沉淀。取上清液继续于4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀加入2.5mL pH7.8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,混匀。继续4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀溶于2.5mL的包含0.5%NP-40(质量分数),80mM NaCl,0.2%Deoxycholate(质量分数),50mM Tris,pH 8.0和蛋白酶抑制剂的溶剂中;在4℃环境下100000g离心20至30分钟;取上清液,上样TSKgel G3000PW,280纳米读数,取在40kDa区域峰值蛋白,-80℃冷冻保存。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述抗体为鼠抗人单克隆抗体。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述抗体的制备包括以下步骤:
S1杂交瘤细胞的制备
1)选8只8-12周龄Balb/C小鼠进行肌肉内免疫,初次免疫用50μg/mL上述制备的前列腺小体蛋白抗原加弗氏完全佐剂。两周后,用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原加弗氏不完全佐剂强化免疫2次,每次间隔2周。最后一次用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原肌肉注射强化免疫(不含佐剂),3天后尾部采血,ELISA检测血清抗体效价;
2)杂交瘤细胞融合筛选:融合前4天将阳性小鼠强化免疫,小鼠脾细胞与骨髓
瘤细胞SP2/0比例为10:1,PEG(分子量1500)融合,选择培养基为含HAT的RPMI640培养基。10天后,ELISA筛选杂交瘤细胞上清,用有限稀释法对抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克隆,经过4次筛选最终确定若干株细胞为阳性细胞;
3)间接ELISA法用2μg/mL的抗原50u1/孔包被96孔板,1小时,用洗液洗涤3次,加100μL/孔封闭液在37℃封闭2h,洗涤3次,拍干;加入待测样品(血清),第一孔1:1000稀释,往下1:2的梯度倍比稀释,37℃孵育30min,洗板4次,拍干。取HRP标记的羊抗鼠IgG按照1:3000倍稀释,100μL/孔加入反应孔,37℃孵育30min,洗涤4次,拍干。最后加入TMB 100μL/孔,显色15-30min。然后加入终止液(2M H2SO4)50μL/孔。以450/630nm双波长测定各孔OD值,并用阳性对照孔OD值(1:600),作为判断阳性或者确定效价的临界点。结果为血清效价为1:100000的阳性小鼠,可以用于细胞融合。
S2单克隆抗体的生产及纯化
1)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备:采用动物体内生产单抗的方法。每只Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5m1,7天后,每只小鼠腹腔注射1×106个上述杂交瘤细胞,7天后观察小鼠腹水生产情况,如腹部明显膨大,即可抽取腹水。腹水采集后13000rpm离心1Omin除去油脂和沉淀,收集上清液,即为腹水单克隆抗体。采用硫酸按沉淀和透析法,纯化腹水单克隆抗体;
2)采用Sigma分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,上述单克隆抗体的重链为IgGl,轻链为Kappa型。采用间接ELISA测定纯化的腹水单克隆抗体,2μg/mL的抗原100μL/孔包被96孔板做ELISA,结果显示纯化后效价为l:120000。采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体,显示单克隆抗体的重链约为46KD,轻链约为25KD。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、胶体金免疫层析试剂盒、乳胶免疫层析试剂盒、荧光免疫层析法试剂盒或化学发光免疫法试剂盒。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述试剂盒为ELISA试剂盒,包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆检测抗体、酶标抗体、清洗液,显色剂A,显色剂B、终止液。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述试剂盒还包含标准品和阴性对照,所述标准品为前列腺小体外泄蛋白抗原。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG,清洗液为含0.05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA,TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
进一步的,上述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,包括以下步骤:
1)在96孔酶标板中,将待测尿液标本以100μL/孔加入各反应孔,37℃恒温箱孵育1小时,洗板,加1%BSA封闭,100μL/孔,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板;加入前列腺小体外泄蛋白单克隆抗体,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板后,再加入HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃恒温箱孵育20分钟,洗板后进行避光TMB显色,显色后加入终止液,终止反应,用酶标仪测定各反应孔在双波450/630nm处的OD值;自配清洗液,显色剂,终止液:清洗液为含0.05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA,TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
2)根据各健康患者和患病患者样本测试的OD值,进行ROC曲线分析灵敏度、特异性、总符合率。
进一步的,一种良性前列腺增生诊断试剂盒,包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆抗体、酶标抗体、清洗液,显色剂A,显色剂B、终止液、前列腺小体外泄蛋白抗原标准品和阴性对照;所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG,清洗液为含0.05%吐温-20的PBS溶液(质量分数);显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA,TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
本发明具有如下有益效果:本发明提供了一种前列腺小体外泄蛋白抗原及与其特异对应的抗体,并可进一步得到基于前列腺小体外泄蛋白定量的间接酶联免疫吸附的试剂盒,以有效用于检测和诊断良性前列腺增生。本申请从良性前列腺增生患者尿液中分离的前列腺小体为抗原,进行筛选,获得特异的抗体,是为抗前列腺小体外泄蛋白的鼠抗人抗体,用于进一步研究其针对良性前列腺增生检测的灵敏度和特异性。
目前诊断良性前列腺增生所用方法,对病人有很大侵犯性和不适,而本发明基于特殊的前列腺小体外泄蛋白抗原提供的检测方法简便可靠,灵敏度达到94%,特异性可达到96%,总符合率高达94.67%,是一种可用于良性前列腺增生诊断的一种新颖的非侵入性的,无痛分子检验手段。
附图说明
图1.本发明实施例4中的ROC曲线,其中对角线由绑定值生成。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
前列腺小体外泄蛋白抗原制备
取500mL良性前列腺增生患者随机尿,加入等量pH=7.3的PBS缓冲液和蛋白酶抑制剂。在4℃环境下400g离心10分钟,去沉淀。取上清液继续在4℃环境下10000g离心20分钟,去沉淀。取上清液继续于4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀加入2.5mL pH7.8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,混匀。继续4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀溶于2.5mL的包含0.5%NP-40(质量分数),80mM NaCl,0.2%Deoxycholate(质量分数),50mM Tris,pH 8.0和蛋白酶抑制剂的溶剂中;在4℃环境下100000g离心20至30分钟;取上清液,上样TSKgel G3000PW,280纳米读数,取在40kDa区域峰值蛋白,-80℃冷冻保存,即得。
实施例2
前列腺小体外泄蛋白抗体制备
1杂交瘤细胞的制备
(1)选8只8-12周龄Balb/C小鼠进行肌肉内免疫,初次免疫用50μg/mL上述实施例1制备的前列腺小体蛋白抗原加弗氏完全佐剂。两周后,用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原加弗氏不完全佐剂强化免疫2次,每次间隔2周。最后一次用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原肌肉注射强化免疫(不含佐剂),3天后尾部采血,ELISA检测血清抗体效价。
(2)杂交瘤细胞融合筛选:融合前4天将阳性小鼠强化免疫,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0比例为10:1,PEG(分子量1500)融合,选择培养基为含HAT的RPMI640培养基。10天后,ELISA筛选杂交瘤细胞上清,用有限稀释法对抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克隆,经过4次筛选最终确定若干株细胞为阳性细胞。
(3)间接ELISA法用2μg/mL的抗原50u1/孔包被96孔板,1小时,用洗液洗涤3次,加100μL/孔封闭液在37℃封闭2h,洗涤3次,拍干。加入待测样品(血清),第一孔1:1000稀释,往下1:2的梯度倍比稀释,37℃孵育30min,洗板4次,拍干。取HRP标记的羊抗鼠IgG按照1:3000倍稀释,100μL/孔加入反应孔,37℃孵育30min,洗涤4次,拍干。最后加入TMB 100μL/孔,显色15-30min。然后加入终止液(2M H2SO4)50μL/孔。以450/630nm双波长测定各孔OD值,并用阳性对照孔OD值(1:600),作为判断阳性或者确定效价的临界点。结果为血清效价为1:100000的阳性小鼠,可以用于细胞融合。
2.单克隆抗体的生产及纯化
(1)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备:采用动物体内生产单抗的方法。每只Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5m1,7天后,每只小鼠腹腔注射1×106个上述杂交瘤细胞,7天后观察小鼠腹水生产情况,如腹部明显膨大,即可抽取腹水。腹水采集后13000rpm离心1Omin除去油脂和沉淀,收集上清液,即为腹水单克隆抗体。采用硫酸按沉淀和透析法,纯化腹水单克隆抗体。
(2)采用Sigma分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,上述单克隆抗体的重链为IgGl,轻链为Kappa型。采用间接ELISA测定纯化的腹水单克隆抗体,2μg/mL的抗原100μL/孔包被96孔板做ELISA,结果显示纯化后效价为l:120000。采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体,显示单克隆抗体的重链约为46KD,轻链约为25KD。紫外分光法测定单克隆抗体在280nm和260nm处的吸光度值,结果为蛋白质含量为15mg/mL,为前列腺小体外泄蛋白单克隆抗体。
实施例3
构建酶联免疫法(ELISA)测前列腺小体外泄蛋白以诊断良性前列腺增生的检测试剂盒:
在96孔酶标板中,将待测尿液标本以100μL/孔加入各反应孔,37℃恒温箱孵育1小时,洗板,加1%BSA封闭,100μL/孔,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板,加入上述体前列腺小体外泄蛋白单克隆抗体,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板后,再加入HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃恒温箱孵育20分钟,洗板后进行避光TMB显色,显色后加入终止液,终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450/630nm处的OD值。
自配清洗液,显色剂A和B,终止液:清洗液为含0.05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA,TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
实施例4
对实施例3构建的试剂盒进行测试。
样本:选取100例健康成年男性尿液;选择200例BPH(良性前列腺增生)患者(依据《良性前列腺增生(BPH)诊疗指南》,选取50岁以上具有明显下尿路症状的中年男性,排除具有细菌性前列腺炎病史,结合如下诊断:病史及I-PSS、QOL评分;体格检查(直肠指诊);尿常规;血清PSA;超声检查(包括残余尿量测定);尿流率,临床确诊为良性前列腺增生患者,采集其中段尿。)尿样,共计300例样本,以上述实施例3制备的试剂盒进行测试,将测试OD值依据样本分组情况,进行ROC曲线分析,曲线见附图1,临床评价如下表1所示:
表1患者和正常人群中前列腺小体蛋白水平(OD值)
分组 | 病例数 | 平均数 | 标准偏差 | 中位数 |
BPH患者 | 200 | 1.113 | 0.468 | 1.136 |
健康人 | 100 | 0.301 | 0.129 | 0.036 |
。
从附图1的ROC曲线分析可知,选择以OD值0.459为临界值,即大于0.459为阳性,小于0.459为阴性,则临床诊断结果和试剂盒测试结果比对如下表2所示:
表2:临床诊断结果和试剂盒测试结果比对
临床结果阳性 | 临床结果阴性 | 合计 | |
试剂盒阳性 | 188(a) | 4(b) | 192 |
试剂盒阴性 | 12(c) | 96(d) | 108 |
总数 | 200 | 100 | 300 |
。
根据表2的数据,灵敏度和特异性评价如下:
灵敏度:a/(a+c)×100%=188/200×100%=94%
特异度:d/(b+d)×100%=96/100×100%=96%
总符合率:(a+d)/(a+b+c+d)=(188+96)/300×100%=94.67%;
因此,上述方法学以OD为测试结果进行临床意义评估,配合上述制备纯化的前列腺小体外泄蛋白抗原作为同步测试定标曲线,可准确评估患者样本中前列腺小体外泄蛋白的含量水平。
以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体在制备良性前列腺增生诊断试剂盒中的应用,其特征在于,
所述前列腺小体外泄蛋白抗原由以下方法制备:
取良性前列腺增生患者随机尿,加入PBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,在0-4℃环境下200-600g离心5-15分钟,去沉淀,取上清液继续在0-4℃环境下8000-12000g离心10-30分钟,去沉淀,取上清液继续于0-4℃环境下80000-120000g离心60-120分钟,倒去上清液,取沉淀加入1-5mL TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,混匀,继续0-4℃环境下80000-120000g离心60-120分钟,倒去上清液,取沉淀溶于1-5mL 的包含质量分数0.5%的NP-40、80mM NaCl、质量分数0.2%的 Deoxycholate、50 mM Tris pH 8.0和蛋白酶抑制剂的溶剂中;在0-4℃环境下80000-120000g离心20-30分钟;取上清液,上样凝胶柱过柱, 280纳米读数,取在40kDa区域峰值蛋白,-80℃冷冻保存;
所述抗体为针对上述前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的的应用,其特征在于,
所述前列腺小体外泄蛋白抗原由以下方法制备:
取500mL良性前列腺增生患者随机尿,加入等量pH=7.3的PBS缓冲液和蛋白酶抑制剂;在4℃环境下400g离心10分钟,去沉淀;取上清液继续在4℃环境下10000g离心20分钟,去沉淀;取上清液继续于4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀加入2.5mLpH7.8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂,混匀;继续4℃环境下100000g离心60至120分钟,倒去上清液,取沉淀溶于2.5mL 的包含质量分数0.5%的NP-40、80mM NaCl、 质量分数0.2%的Deoxycholate、 50 mM Tris pH 8.0和蛋白酶抑制剂的溶剂中;在4℃环境下100000g离心20至30分钟;取上清液,上样TSKgel G3000PW, 280纳米读数,取在40kDa区域峰值蛋白,-80℃冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的的应用,其特征在于,所述抗体为鼠抗人单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的的应用,其特征在于,所述抗体的制备包括以下步骤:
S1杂交瘤细胞的制备
1)选8只8-12周龄Balb/C小鼠进行肌肉内免疫,初次免疫用50μg/mL上述制备的前列腺小体蛋白抗原加弗氏完全佐剂;两周后,用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原加弗氏不完全佐剂强化免疫2次,每次间隔2周;最后一次用25μg/mL前列腺小体蛋白抗原肌肉注射强化免疫,不含佐剂;3天后尾部采血,ELISA检测血清抗体效价;
2)杂交瘤细胞融合筛选:融合前4天将阳性小鼠强化免疫,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0比例为10:1, 分子量1500PEG融合,选择培养基为含HAT的RPMI640培养基;10天后,ELISA筛选杂交瘤细胞上清,用有限稀释法对抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克隆,经过4次筛选最终确定若干株细胞为阳性细胞;
3)间接ELISA法用2μg/mL的抗原50μ1/孔包被96孔板,1小时,用洗液洗涤3次,加100μL/孔封闭液在37℃封闭2h,洗涤3次,拍干;加入待测样品血清,第一孔1:1000稀释,往下1:2的梯度倍比稀释,37℃孵育30min,洗板4次,拍干;取HRP标记的羊抗鼠IgG按照1:3000倍稀释,100μL/孔加入反应孔,37℃孵育30min,洗涤4次,拍干;最后加入TMB 100μL/孔,显色15-30min;然后加入终止液2M H2SO4 50μL/孔;以450/630nm双波长测定各孔OD值,并用阳性对照孔OD值1: 600,作为判断阳性或者确定效价的临界点;结果为血清效价为1:100000的阳性小鼠,可以用于细胞融合;
S2单克隆抗体的生产及纯化
1)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备:采用动物体内生产单抗的方法;每只Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5m1, 7天后,每只小鼠腹腔注射1 ×106个上述杂交瘤细胞,7天后观察小鼠腹水生产情况,如腹部明显膨大,即可抽取腹水;腹水采集后13000rpm离心1Omin除去油脂和沉淀,收集上清液,即为腹水单克隆抗体;采用硫酸铵沉淀和透析法,纯化腹水单克隆抗体;
2)采用Sigma分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,上述单克隆抗体的重链为IgGl,轻链为Kappa型;采用间接ELISA测定纯化的腹水单克隆抗体,2μg/mL的抗原100μL/孔包被96孔板做ELISA,结果显示纯化后效价为l:120000;采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体,显示单克隆抗体的重链为46KD,轻链为25KD。
5.根据权利要求1所述的的应用,其特征在于,所述试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、胶体金免疫层析试剂盒、乳胶免疫层析试剂盒、荧光免疫层析法试剂盒或化学发光免疫法试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂盒为ELISA试剂盒,包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆检测抗体、酶标抗体、清洗液,显色剂A,显色剂B、终止液。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含标准品和阴性对照,所述标准品为前列腺小体外泄蛋白抗原。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG,清洗液为含质量分数0. 05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA, TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:
1)在96孔酶标板中,将待测尿液标本以100μL/孔加入各反应孔,37℃恒温箱孵育1小时,洗板,加1%BSA封闭,100μL/孔,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板;加入前列腺小体外泄蛋白单克隆抗体,37℃恒温箱孵育40分钟,洗板后,再加入HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃恒温箱孵育20分钟,洗板后进行避光TMB显色,显色后加入终止液,终止反应,用酶标仪测定各反应孔在双波450/630nm处的OD值;
自配清洗液,显色剂,终止液:清洗液为含质量分数0. 05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA, TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4;
2)根据各健康患者和患病患者样本测试的OD值,进行ROC曲线分析灵敏度、特异性、总符合率。
10.一种良性前列腺增生诊断试剂盒,其特征在于,包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆抗体、酶标抗体、清洗液,显色剂A,显色剂B、终止液、前列腺小体外泄蛋白抗原标准品和阴性对照;所述酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG,清洗液为含质量分数0. 05%吐温-20的PBS溶液;显色剂A含柠檬酸,乙酸钠,过氧化脲;显色剂B含柠檬酸,EDTA, TMB盐酸盐,硫代硫酸钠溶液;终止液为2M H2SO4。
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