CN105116152B - 一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法，属于免疫学和生物技术领域。本发明利用超滤和ELISA技术建立了检测人源性尿液Endocan蛋白的试剂盒，并首次证实在某些病理状态下人的尿液中存在Endocan。本发明提供的ELISA试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到人尿液Endocan蛋白含量，为基础实验和临床检验提供了一种新的手段和方法。

Description

一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

Endocan即内皮素，又称为内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell-specificmolecule 1，ESM-1)，是分子量为50KDa的可溶性蛋白多糖，由165个氨基酸的蛋白内核和连接在137位丝氨酸残基的硫酸软皮肤素链组成。在人类其基因定位于5号染色体长臂近端区域(5q11.2)，具有3个外显子和2个内含子。Endocan已证实在人血管内皮细胞、肝细胞、肾小管上皮等组织细胞中表达。其主要功能与血管新生、肿瘤细胞生长、炎症反应相关。近来研究发现经血管内皮生长因子A(VEGF-A)刺激，Endocan可以介导内皮细胞的迁移。体外细胞实验及小鼠体内实验均证实，Endocan过表达可以促进肿瘤细胞生长。干扰Endocan表达可以抑制癌细胞增殖(Overexpression of endothelial cell specific molecule-1(ESM-1)in gastric cancer)。研究还证实，Endocan可以与人白细胞CD11a/CD18整合素(淋巴细胞功能相关抗原-1，LFA-1)结合，抑制其与细胞粘附因子1(ICAM-1)结合。

已有研究证实Endocan参与了某些人体内常见恶性肿瘤的发生发展过程，并且血清中Endocan含量可作为某些肿瘤的诊断及预后标准物。与正常组织相比，Endocan在肺癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌、脑胶质瘤、膀胱癌等多种癌组织中明显高表达。已通过免疫组化证实，膀胱癌组织中Endocan表达量与膀胱癌恶性程度相关。与健康人群血清Endocan含量(26.82±10.80pg/ml)相比，肝细胞癌患者血清中Endocan含量(87.30±25.69pg/ml)明显升高，并且其含量与癌症分期密切相关。Endocan诊断肝细胞癌的特异性可达80.8％，敏感性可达83.8％。在早期大肠癌患者中，血清Endocan含量低的患者5年生存率为100％，而血清Endocan高的患者5年生存率为80％，有显著统计学差异。(ESM-1regulates cell growth and metastatic process through activation of NF-κB incolorectal cancer)。研究证实，晚期胃癌患者中血清Endocan含量明显高于早期胃癌(87.23±15.1vs.80.25±15.6pg/ml,P＝0.018)，且含量高者5年生产率明显降低(P<0.001)。(Overexpression of endothelial cell specific molecule-1(ESM-1)ingastric cancer)。在膀胱癌研究中，浸润性膀胱癌患者血浆Endocan含量明显(平均0.79ng/mL)明显高于健康对照人群(平均0.43ng/mL)。以0.43ng/mL作为截断值，血浆Endocan诊断浸润性膀胱癌敏感性为64％，特异性可达80％。

此外，Endocan还参与全身炎症反应，并可作为脓毒症的诊断和预后的标志物。研究报道脓毒症患者血清Endocan含量(2.71±4.88ng/mL)明显高于健康人群(0.77±0.44ng/mL)，且在脓毒症休克的患者中含量最高(6.11±12.99ng/m)。(Endocan,a newendothelial marker in human sepsis)。在导致多器官衰竭的严重脓毒症患者中，血清Endocan含量明显高于非多器官功能衰竭脓毒症患者(p<0.05)，其预测脓毒症转归效果好于降钙素原、器官序贯衰竭评分(SOFA)等传统指标。

上述研究表明Endocan在肿瘤和炎症中发挥了重要作用，其定量检测可用于相关疾病的诊断和预后判断。

以往对Endocan表达的定量研究主要是采集患者和对照人群的静脉血液，用ELISA检测血清中Endocan的含量。然而，静脉采血是一种有创性操作，会导致患者疼痛、晕针，甚至有感染及传播疾病的风险。患者依从性差。采集样品量少。不仅如此，静脉采血需要消毒器材、静脉针、肝素化或含EDTA试剂的专用采血管等设备，更需要受过培训的专业医护人员，成本高、用时长。而尿液，作为人体一种自然排出的体液，可以避免上述血液样品的缺点。具有患者无痛苦，无操作相关并发症，采集不需要专业医护人员，可采集量大，方便快捷等多种优势，是理想的人体样品来源。经查阅，目前对尿液中Endocan蛋白定量检测国内外尚属空白。

尿液蛋白需由肾脏滤过膜透过或泌尿系统细胞裂解、分泌产生，往往浓度较低。尿液中Endocan蛋白因浓度较低，采用传统的用于血液的ELISA检测试剂盒无法实现定量检测。因此，建立尿液中Endocan蛋白检测试剂盒及检测方法可为其作为无创性诊断和预后标志物的研究奠定基础。

发明内容

发明人购买了市场上测血清Endocan蛋白ELISA检测试剂盒，用以检测人源性尿液Endocan蛋白，发现有以下问题：1.试剂盒适用范围不包括尿液，亦没有尿液样品的处理方法；2.按照现有试剂盒的样品处理方法检测不出人源性尿液Endocan蛋白的浓度；3.现有试剂盒在Endocan浓度在0.3-10ng/ml范围时最准确，人源性尿液Endocan蛋白多低于此浓度。

本发明的目的是提供一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法。本发明旨在为检测临床和实验室样品中人源性尿液Endocan蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。

本发明采用的技术方案如下：

本发明利用超滤和ELISA技术建立了检测人源性尿液Endocan蛋白的试剂盒，并首次证实在某些病理状态下人的尿液中存在Endocan。

本发明第一方面，提供了一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，主要包括：

内管量程为5ml的10KD截断值的超滤离心管。

捕获抗体，小鼠抗人源性Endocan抗体；

检测抗体，生物素标记的小鼠抗人源性Endocan的抗体；

标准蛋白，为重组人Endocan蛋白；

辣根过氧化物酶标记的链菌素；

所述的试剂盒，还包括有：

碳酸氢钠缓冲液、PBS缓冲液、96孔酶标板、显色液和终止液。

所述的试剂盒，96孔酶标板为市售的ELISA酶标板，较优地，可选用丹麦NUNC公司的Maxisorp系列ELISA酶标板(96孔，#44-2404)。

捕获抗体，小鼠抗人源性Endocan抗体，可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101

检测抗体，生物素标记的小鼠抗人Endocan抗体，可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101；

重组人Endocan标准蛋白可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101；

碳酸氢钠缓冲液为0.1M，pH＝9.6；

PBS缓冲液为含0.1％BSA，5mM EDTA，0.1％Tween20的1×PBS溶液；

显色液，四甲基联苯胺底物；

终止液，较优的为2mol/L的硫酸溶液。

本发明的第二方面，是提供人源性尿液Endocan蛋白的检测方法，其特征在于，先将采集的人尿液样品进行离心，再将上清液超滤浓缩10-20倍，然后用优化的ELISA技术检测人源性尿液Endocan蛋白。

该方法具体包括以下步骤：

室温下，用碳酸氢钠缓冲液稀释捕获抗体至2μg/mL，用每孔100μl该捕获抗体溶液包被96孔酶标板，4℃过夜孵育。

移除捕获抗体溶液，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍。移除PBS缓冲液，每孔再加入300μl PSA缓冲液后室温封闭1小时。封闭后，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍。

用PBS缓冲液制备10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,0.156ng/ml，0ng/ml等8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液

超纯水洗涤超滤离心管。5ml超纯水加入超滤离心管内管，4℃离心4000×g(水平离心机)或7500×g(固定角度离心机)，5分钟。弃去内管和外管超纯水。

采集人尿液样品后1小时内予以4℃离心1000×g，10分钟。将离心后上清1-5ml加入洗涤后的超滤离心管内管。4℃离心4000×g(水平离心机)或7500×g(固定角度离心机)，15分钟。记录内管剩余液体体积。计算超滤后原液浓缩倍数。

以100μl/孔的体积将上述处理过的人尿液样品及8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液加入上述处理过的酶标板各孔，室温孵育1小时。较优地，孵育时可轻度振荡。

移除各孔中的液体，每孔加入PBS缓冲液300μl，洗涤3次，甩干；加入将生物素标记的小鼠抗人Endocan的抗体0.2μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入HRP标记的链菌素，每孔100μl，室温避光孵育30分钟；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入底物四甲基联苯胺底物，每孔100μl，室温避光孵育10分钟；加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上测定450--630nm OD值。

用8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液的OD值和Endocan浓度拟合出标准曲线和回归方程，将所测人尿液样品的原始OD值减去浓度为0ng/ml的标准品所对应的OD值，将差值代入方程，得到Endocan浓度。

所述的超滤离心管，包括外管及内管，所述外管具有向外扩张呈喇叭状的外管开口；

所述内管具有向外扩张呈喇叭状的内管开口；

所述内管侧壁上设有与内管容量对应的刻度值，每个刻度值对应设有刻度线，相邻刻度线之间形成的内管容量为1ml。超滤离心管管口处向外扩张呈喇叭状的开口设计增加了管口的口径，便于对液体样品取样、收集。以往的超滤离心管内管的容量标注刻度值过小，无法了解超滤前超滤离心管内液体样品的真实体积，只能通过超滤离心管内管得到超滤后根据液体样品获得的悬浮的微小颗粒(如细胞、生物大分子的沉淀等)的体积，而本结构提升了超滤离心管内管标注的刻度尺寸的最大体积量，可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积。

所述的内管上的刻度线为1000μl、2000μl、3000μl及4000μl。以往的内管容量为4ml的超滤离心管其内管刻度只标有50μl、100μl、250μl、500μl这四条刻度线，无法了解超滤前超滤离心管内液体样品的真实体积，而本结构中超滤离心管内管的容量略大于4000μl，且将该内管所标注的最大容量提升至4000μl，可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积。

优选地，所述的内管上的刻度线还包括50μl、100μl、250μl、500μl。

优选地，所述的内管的容量为5ml，该内管上的刻度线还包括5000μl。

优选地，所述的内管的容量为15ml，该内管上的刻度线为1ml-15ml。内管容量为15ml的超滤离心管其内管刻度只标至4ml，无法了解超滤前超滤离心管内液体样品的真实体积，而本结构将超滤离心管内管所标注的最大容量提升至15ml，可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积。

优选地，所述的内管开口的内壁对侧设有凹槽；

所述超滤离心管还包括漏斗，该漏斗外侧壁的对侧伸出卡接头，所述卡接头与凹槽进行卡接，漏斗的底部伸入所述超滤离心管的内管开口。将漏斗与超滤离心管配合使用，便于液体样品更顺利地进入内管中。当要进行取样操作时，将漏斗放置在超滤离心管上方，把漏斗的卡接头卡接在超滤离心管内管的凹槽内，使漏斗牢固固定在超滤离心管上，便可进行取样操作。

优选地，所述的超滤离心管还包括管盖，所述管盖的内壁为向内收缩结构，盖管内壁与超滤离心管的管口外壁形状相匹配。

优选地，所述刻度线对应的刻度值还包括5000μl。

优选地，所述外管的长度为8-10cm，外管开口的外径为1.5-2cm，外管开口的长度为0.8-1.5cm。

本发明的有益效果：

1)准确：目前市场上无商业化的人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，经文献检索没有定量检测人源性尿液Endocan蛋白含量的方法，因此对于人的尿液Endocan蛋白无法精确定量。此ELISA试剂盒可准确检测人源性尿液Endocan蛋白的含量，结果由酶标仪定量分析，排除了免疫组化、免疫荧光、Western blot等半定量方法的主观性。

2)灵敏度高：用该方法可以检测到的pg级每毫升的Endocan蛋白，敏感性明显高于普通的western blot和免疫组化等半定量方法。

3)简单方便：本方法中所用试剂和实验耗材均为市售商业化产品，容易获得；检测中仅需离心机、移液器和酶标仪，普通的实验室均可开展此项检测。

本发明提供的ELISA试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到人尿液Endocan蛋白含量，为基础实验和临床检验提供了一种新的手段和方法。

本发明的试剂盒可用于自身免疫性疾病、各种炎症、肿瘤等病人的尿液样品中Endocan蛋白的定量检测。

本发明检测时不需要复杂仪器，易于在科研院校和医疗机构中推广应用，可大规模检测临床标本，快速获得人尿液Endocan蛋白相关的海量数据和信息，为Endocan相关的基础和临床医学研究推波助澜，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

本发明的超滤离心管的喇叭状开口设计便于尿液样品等液体样品取样、收集到超滤离心管中，超滤离心管的内管标注刻度尺寸可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积，便于计算超滤后原液体样品的浓缩倍数。

附图说明

图1人源性尿液Endocan蛋白ELISA检测法标准曲线

图2为本发明超滤离心管结构示意图；

图3为本发明超滤离心管中漏斗部分的结构示意图；

图4为本发明超滤离心管又一结构示意图。

其中：

1-外管 11-外管开口 2-内管

21-内管开口 22-凹槽 3-漏斗

31-卡接头 4-管盖

具体实施方式

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

实施例1

人源性尿液Endocan蛋白的检测方法，该方法具体包括以下步骤：

室温下，用碳酸氢钠缓冲液稀释捕获抗体至2μg/mL，用每孔100μl该捕获抗体溶液包被96孔酶标板，4℃过夜孵育。

移除捕获抗体溶液，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍。移除PBS缓冲液，每孔再加入300μl PSA缓冲液后室温封闭1小时。封闭后，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍。

用PBS缓冲液制备10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,0.156ng/ml等7个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液

超纯水洗涤超滤离心管。5ml超纯水加入超滤离心管内管，4℃离心4000×g(水平离心机)或7500×g(固定角度离心机)，5分钟。弃去内管和外管超纯水。

采集人尿液样品后1小时内予以4℃离心1000×g，10分钟。将离心后上清1-5ml加入洗涤后的超滤离心管内管。4℃离心4000×g(水平离心机)或7500×g(固定角度离心机)，15分钟。记录内管剩余液体体积。计算超滤后原液浓缩倍数。

以100μl/孔的体积将上述处理过的人尿液样品或8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液加入上述处理过的酶标板，室温孵育1小时。较优地，孵育时可轻度振荡。

移除各孔中的液体，每孔加入PBS缓冲液300μl，洗涤3次，甩干；加入将生物素标记的小鼠抗人Endocan的抗体0.2μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入HRP标记的链菌素，每孔100μl，室温避光孵育30分钟；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入底物四甲基联苯胺底物，每孔100μl，室温避光孵育10分钟；加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上测定450--630nm OD值。

用8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液的OD值(见表1)和Endocan浓度拟合出标准曲线和回归方程，将所测人尿液样品的原始OD值减去浓度为0ng/ml的标准品所对应的OD值，将差值代入方程，得到Endocan浓度。将测得的Endocan浓度除以浓缩倍数即可得到原尿液中Endocan的浓度。

以下表1中的标准品指冻干的人源性重组Endocan蛋白标准品，于室温解冻后，用PBS稀释成浓度为10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,0.156ng/ml，0ng/ml等8个梯度浓度标准品溶液。可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101。

表1不同浓度Endocan蛋白标准品ELISA检测法结果

样品编号	OD值	Endocan浓度(ng/ml)
			标准品1	2.549	10
标准品2	2.407	5
			标准品3	1.910	2.5
标准品4	1.112	1.25
			标准品5	0.549	0.625
标准品6	0.204	0.312
			标准品7	0.122	0.156
标准品8	0.023	0

得到Logistic曲线方程:

y＝(2.57292+0.00181)/[(1+(x/2.19809)^-2.29173)]^0.55508-0.00181

r²＝0.99978

人源性尿液Endocan蛋白ELISA检测法标准曲线见图1.

表2膀胱癌患者尿液Endocan蛋白ELISA检测法结果

患者编号	OD值差值	Endocan浓度(ng/ml)
			1	2.112	3.187
2	2.387	5.112
			3	0.405	0.524
4	0.598	0.723
			5	1.689	2.081
6	0.574	0.698
			7	2.449	6.199
8	2.370	4.898
			9	0.071	0.133
10	0.098	0.171
			11	0.063	0.122
12	2.544	11.973
			13	0.046	0.096
14	0.026	0.063
			15	0.037	0.081

OD值差值＝人尿液样品的原始OD值—浓度为0ng/ml的标准品所对应的OD值。

样品来源于长海医院泌尿外科临床诊断为膀胱癌的患者尿液。收集患者晨起后第一次排尿尿液，1小时内送至实验室按上述流程处理。

实施例2条件的优化

1.超滤浓缩步骤的优化

将同一患者的同次尿液4℃离心1000×g，10分钟后，分别用上述的超滤离心管对上清液采用超滤离心0分钟(方案1)、超滤离心10分钟(方案2)、超滤离心15分钟(方案3)，其余步骤按照实施例1，对多个患者的尿液Endocan进行检测。根据获得的OD值差值，计算相应的浓度。发现超滤离心15分钟，可保证最多的样品浓度在0.3-10ng/ml，即试剂盒最准确的检测范围。并且15分钟是市售超滤管推荐的离心时间，故超滤浓缩的最佳时间为15分钟。

如编号6的膀胱癌患者尿液：

方案1得到的OD值差值为0.074，计算得到的相应的浓度为0.138ng/ml；

方案2得到的OD值差值为0.574，计算得到的相应的浓度为0.698ng/ml。

编号17的膀胱癌患者尿液

方案1得到的OD值差值为0.000，不能计算相应的浓度；

方案3得到的OD值差值为0.020，计算得到的相应的浓度为0.065ng/ml。

编号18的膀胱癌患者尿液

方案1得到的OD值差值为0.080，计算得到的相应的浓度为0.198ng/ml；

方案3得到的OD值差值为1.568，计算得到的相应的浓度为2.077ng/ml。

2.孵育前PBS缓冲液体积的优化

将同一患者的同次尿液4℃离心1000×g，10分钟，超滤离心15分钟，分别加入PBS缓冲液0ml(方案4)，体积比1:1(PBS缓冲液体积：尿液样品体积)加入PBS缓冲液(方案5)，1:4加入PBS缓冲液(方案6)，其余步骤按照实施例1，对多个患者的尿液Endocan进行检测。根据获得的OD值差值，计算相应的浓度。发现不加入PBS缓冲液，可保证最多的样品浓度在0.3-10ng/ml，即试剂盒最准确的检测范围。故较优地，孵育前不加入PBS缓冲液。

如编号19的膀胱癌患者尿液

方案4得到的OD值差值为0.029，计算得到的相应的浓度为0.071ng/ml；

方案5得到的OD值差值为0.000，不能计算得到的相应的浓度。

编号20的的膀胱癌患者尿液

方案4得到的OD差值值为0.003，计算得到的相应的浓度为0.016ng/ml；

方案6得到的OD值差值为-0.002，不能计算得到的相应的浓度。

实施例3

如图2-4所示的一种超滤离心管，包括外管1及内管2，所述外管1具有向外扩张呈喇叭状的外管开口11；

所述内管2具有向外扩张呈喇叭状的内管开口21；

所述内管2侧壁上对应设有刻度值，每个刻度值对应设有刻度线，所述内管2侧壁上设有与内管2容量对应的刻度值，每个刻度值对应设有刻度线，相邻刻度线之间形成的内管2容量为1ml。超滤离心管管口处向外扩张呈喇叭状的开口设计增加了管口的口径，便于对液体样品取样、收集。以往的超滤离心管内管的容量标注刻度值过小，无法了解超滤前超滤离心管内液体样品的真实体积，只能通过超滤离心管内管得到超滤后根据液体样品获得的悬浮的微小颗粒(如细胞、生物大分子的沉淀等)的体积，而本结构提升了超滤离心管内管标注的刻度尺寸的最大体积量，可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积。

所述的内管2上的刻度线为1000μl、2000μl、3000μl及4000μl。以往的内管容量为4ml的超滤离心管其内管刻度只标有50μl、100μl、250μl、500μl这四条刻度线，无法了解超滤前超滤离心管内液体样品的真实体积，而本结构中超滤离心管内管的容量略大于4000μl，且将该内管所标注的最大容量提升至4000μl，可以有效了解超滤前超滤离心管内原始液体样品的真实体积。

所述的内管上的刻度线还包括50μl、100μl、250μl、500μl。

所述外管1的长度为8cm，外管开口11的外径为2cm，外管开口11的长度为1cm。

所述的内管开口21的内壁对侧设有凹槽22；

所述超滤离心管还包括漏斗3，该漏斗3外侧壁的对侧伸出卡接头31，所述卡接头31与凹槽22进行卡接，漏斗3的底部伸入所述超滤离心管的内管开口21。将漏斗与超滤离心管配合使用，便于液体样品更顺利地进入内管中。当要进行取样操作时，将漏斗放置在超滤离心管上方，把漏斗的卡接头卡接在超滤离心管内管的凹槽内，使漏斗牢固固定在超滤离心管上，便可进行取样操作。

所述的超滤离心管还包括管盖4，所述管盖4的内壁为向内收缩结构，盖管4内壁与外管开口11外壁形状相匹配。

内管2套入外管1后，将漏斗3置入内管2的管口内。漏斗3的上端开口接通被检者尿道外口直接收集尿液，或将其他容器中的液体倒入漏斗3内，去除漏斗3，盖上管盖4。根据内管2上的刻度线得出内管2中收集液体的体积，旋紧管盖4，置入离心机即可。超滤离心管的喇叭口结构伸出在离心机外，即该超滤离心管可采用现有的离心机进行离心操作。

Claims (5)

1.一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，包括：

内管量程为5ml的10KD截断值的超滤离心管；

捕获抗体，其为小鼠抗人源性Endocan抗体；

检测抗体，其为生物素标记的小鼠抗人源性Endocan的抗体；

标准蛋白，其为重组人Endocan蛋白；

辣根过氧化物酶标记的链菌素；

所述的超滤离心管，包括外管(1)及内管(2)，所述外管(1)具有向外扩张呈喇叭状的外管开口(11)；

所述内管(2)具有向外扩张呈喇叭状的内管开口(21)；

所述内管(2)侧壁上设有与内管(2)容量对应的刻度值，每个刻度值对应设有刻度线，相邻刻度线之间形成的内管(2)容量为1ml。

2.根据权利要求1所述的一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括有碳酸氢钠缓冲液、PBS缓冲液、96孔酶标板、显色液和终止液。

3.根据权利要求2所述的一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：

碳酸氢钠缓冲液的浓度为0.1M，pH＝9.6；

PBS缓冲液为含0.1％BSA，5mM EDTA，0.1％Tween20的1×PBS溶液；

显色液，为四甲基联苯胺底物；

终止液，为2mol/L的硫酸溶液。

4.一种非诊断目的的人源性尿液Endocan蛋白的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1至3任一项所述的检测试剂盒，先将采集的人尿液样品进行离心，再将上清液超滤浓缩10-20倍，然后用ELISA技术检测人源性尿液Endocan蛋白。

5.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的人源性尿液Endocan蛋白的检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

室温下，用碳酸氢钠缓冲液稀释捕获抗体至2μg/mL，用每孔100μl该捕获抗体溶液包被96孔酶标板，4℃过夜孵育；

移除捕获抗体溶液，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍；移除PBS缓冲液，室温封闭1小时；封闭后，酶标板每孔加入300μl PBS缓冲液，洗涤3遍；

用PBS缓冲液制备10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,0.156ng/ml,0ng/ml 8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液；

超纯水洗涤超滤离心管：5ml超纯水加入超滤离心管内管，4℃离心，水平离心机4000×g,或固定角度离心机7500×g，5分钟；弃去内管和外管超纯水；

采集人尿液样品后1小时内予以4℃离心1000×g，10分钟；将离心后上清1-5ml加入洗涤后的超滤离心管内管；4℃离心，水平离心机4000×g或固定角度离心机7500×g，15分钟；记录内管剩余液体体积，计算超滤后原液浓缩倍数；

以100μl/孔的体积将上述处理过的人尿液样品及8个梯度浓度的重组人Endocan标准品溶液加入上述处理过的酶标板各孔，室温孵育1小时；

移除各孔中的液体，每孔加入PBS缓冲液300μl，洗涤3次，甩干；加入0.2μg/ml的生物素标记的小鼠抗人源性Endocan的抗体，每孔100μl，室温孵育1小时；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入HRP标记的链菌素，每孔100μl，室温避光孵育30分钟；移除各孔中的液体，加入PBS缓冲液，每孔300μl，洗涤3次，甩干；加入底物四甲基联苯胺底物，每孔100μl，室温避光孵育10分钟；加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上测定450--630nm OD值；

用重组人Endocan标准品溶液的OD值和Endocan浓度拟合出标准曲线和回归方程，将所测人尿液样品的原始OD值减去浓度为0ng/ml的标准品所对应的OD值，将差值代入方程，得到Endocan浓度。