CN105158486B - 用于检测人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫试剂盒。其由以下成分组成：(1)包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板；(2)人氧化低密度脂蛋白系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液。

Description

用于检测人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种用于用于检测人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫试剂盒。
背景技术
动脉粥样硬化 (atherosclerosis AS) 是指有动脉壁增厚、变硬及弹性降低, 并以动脉内膜形成粥样斑块为特征的病变。目前对于其发病原因尚未完全确定, 可能与年龄、性别、血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病、肥胖、感染等因素有关。高胆固醇浓度, 尤其是低密度脂蛋白 (LDL) 是AS的一个主要的危险因子。近年来研究发现, 低密度脂蛋白经氧化修饰后其致AS作用大为加强。目前认为氧化低密度脂蛋白 (Oxidized low density lipoprotein, ox-LDL) 主要从内皮细胞损伤、促进泡沫细胞形成、促进血管平滑肌细胞的增殖、引起血小板粘附与聚集等方面参与动脉粥样硬化的形成。1-LDL的氧化修饰LDL的核心组分是甘油三酯和胆固醇脂, 表面组分是载脂蛋白、游离胆固醇和磷脂。LDL含有丰富的多不饱和脂肪酸, 在吸烟、药物、高血压、糖尿病等因素诱发下产生大量氧自由基, 很容易被氧化修饰成氧化低密度脂蛋白 ( ox-LDL)。冠心病，冠状动脉粥样硬化性心脏病，其诊断主要根据为病人的典型病史、临床症状，并结合仪器和生化检查进行。目前常用的检查手段有常规心电图、心电图负荷试验、超声心动图、螺旋CT和超高速CT、冠状动脉超声显像、血管内超声、核素心肌显像和选择性冠状动脉造影，以及实验室检查包括心肌酶学检查、肌钙蛋白、C反应蛋白、血脂和脂蛋白检查等。以上检查手段中，大多数是以检测心肌缺血或者心肌梗死后的心电信号变化(各种心电图)和心室壁运动形态变化(超声心动图，心脏放射性核素检查，螺旋CT和超高速CT，磁共振成像)为基础进行冠心病的诊断，若冠状动脉狭窄程度尚未引致心肌缺血，以上检测手段往往不能有助于诊断冠心病。
研究表明，氧化低密度脂蛋白Ox-LDL与冠心病的发生发展有关，通常认为可以通过检测待检样本血清中氧化低密度脂蛋白Ox-LDL的含量，来评估患冠心病的风险。现有技术中，已经公开了一些相关的检测方法，如: 专利申请号:03109935.1，发明名称:用抗磷酸胆碱抗体对氧化低密度脂蛋白的定量测定及其在诊断动脉粥样硬化中的应用。该发明公开的定量检测方法包括下列步骤: (a) 将抗磷酸胆碱的抗体与含有Ox-LDL的样品接触；(b)使所述抗体与Ox-LDL结合；(c)测定所述抗体与Ox-LDL的结合量；(d)依据以磷酸胆碱为标准品测得的标准曲线，定量Ox-LDL含量。因抗原抗体反应很复杂，与很多因素有关，虽然磷酸胆碱的抗原决定族与低密度脂蛋白经氧化修饰后表面呈现的抗原决定族相同，但是抗磷酸胆碱抗体与氧化低密度脂蛋白的抗原抗体反应的特异性程度难以预测，用抗磷酸胆碱抗体检测氧化低密度脂蛋白的准确度不够高，难以应用于临床检测。
专利CN201210160797公开了一种人氧化低密度脂蛋白的ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有较好的灵敏度和准确性，但实际应用中该试剂盒稳定性不佳，并且单克隆抗体产量较低，影响其大规模应用。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1) 包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板； (2) 人氧化低密度脂蛋白系列标准品；(3) 酶标记抗体溶液；(4) 稀释液；(5) 洗涤液；(6) 底物液；(7) 显色液；(8) 终止液。
所述人氧化低密度脂蛋白系列标准品的人氧化低密度脂蛋白含量为：0、1、2、4、8和16U/L的15mmol/L PBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和5g蔗糖。
所述酶标记抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的抗apoB 抗体（羊抗人载脂蛋白B 抗体）和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。
所述稀释液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
所述洗涤液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
所述显色液为四甲基联苯胺（TMB）的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
所述终止液为3mol/L硫酸。
本发明的第二方面是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
(1) 抗人氧化低密度脂蛋白抗体的制备：将表达抗OxLDL 单克隆抗体的杂交瘤细胞（保藏号为CCTCC NO：C200304）体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97%DMEM/F12:RPMI1640=1:1；3%FBS ；滚速0.5rpm ；每隔96 个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次。并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF（白细胞抑制因子），2IU/10ml HCG, 2IU/10ml 牛胰岛素。培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；
(2) 包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板的制备：
a、抗体稀释:用pH为8.0的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗人氧化低密度脂蛋白单克隆抗体稀释到2.5〜20μg/ml，得包被液；
b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗人氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；
C、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含1%酪蛋白和1%蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300 μl/孔，室温，1小时；
d、真空干燥，密封，即得包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板。
(3) 酶标记抗体溶液制备：
a, 将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；
b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；
c, 加入含5mg抗apoB抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；
d，吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4,4℃下放置2小时；
e，滴加等体积饱和 (MM)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；
f，上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；
g, 吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；
h，将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
(4) 人氧化低密度脂蛋白标准品的制备：
a, LDL的制备: 按一次性密度梯度离心法分离人血浆脂蛋白，收集密度为1.03至l.05g/ml的LDL组分，
b，Ox-LDL的制备:体外无细胞金属Cu2+离子氧化法制备OxLDL，然后按照相应浓度用水将Ox-LDL稀释，并且在每升标准品溶液中添加1g/L酪蛋白和5g/L蔗糖。
(5)稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液，按照本领域常规的溶液配制方法制备。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例 1
(1) 抗人氧化低密度脂蛋白抗体的制备：将表达抗OxLDL 单克隆抗体的杂交瘤细胞（保藏号为CCTCC NO：C200304）体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97%DMEM/F12:RPMI1640=1:1；3%FBS ；滚速0.5rpm ；每隔96 个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次。并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF（白细胞抑制因子），2IU/10ml HCG, 2IU/10ml 牛胰岛素。培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；
(2) 包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板的制备：
a、抗体稀释:用pH为8.0的50mM的Tris-HCl缓冲溶液将抗人氧化低密度脂蛋白单克隆抗体稀释到2.5〜20μg/ml，得包被液；
b、包被:取微孔板，用洗涤液洗涤3次，加入上述含抗人氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的包被液，每孔100μL/孔，4℃孵育12小时；
C、封闭:倾去包被液，置于吸水纸上轻拍几次，去除残液，加入含1%酪蛋白和1%蔗糖的浓度为50mmol/L的Tris-HCl封闭液，其pH为8.0，300μl/孔，室温，1小时；
d、真空干燥，密封，即得包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板。
(3) 酶标记抗体溶液制备：
a, 将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml,混匀于4℃放置30分钟；
b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；
c, 加入含5mg抗apoB抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；
d，吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4,4℃下放置2小时；
e，滴加等体积饱和 (MM)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；
f，上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；
g, 吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；
h，将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。
(4) 人氧化低密度脂蛋白标准品的制备：
a, LDL的制备: 按一次性密度梯度离心法分离人血浆脂蛋白，收集密度为1.03至l.05g/ml的LDL组分，
b，Ox-LDL的制备:体外无细胞金属Cu2+离子氧化法制备OxLDL，然后按照相应浓度用15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液将Ox-LDL稀释，并且在每升标准品溶液中添加1g/L酪蛋白和5g/L蔗糖。
(5)稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液，按照本领域常规的溶液配制方法制备。
所述人氧化低密度脂蛋白系列标准品的人氧化低密度脂蛋白含量为：0、1、2、4、8和16U/L的15mmol/L PBS缓冲液，并且每升标准品中含有1g酪蛋白和5g蔗糖。
所述酶标记抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的抗apoB 抗体（羊抗人载脂蛋白B 抗体）和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5。
所述稀释液为15mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
所述洗涤液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
所述底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
所述显色液为四甲基联苯胺（TMB）的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
所述终止液为3mol/L硫酸。
实施例 2 试剂盒灵敏度测定
分别配制Ox-LDL标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1U/L，0.5 U/L，1 U/L， 5 U/L，10 U/L，20 U/L，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，并且同时使用对比例试剂盒进行同样检测，对比例为专利CN201210160797实施例1制备的ELISA试剂盒，具体检测方法如下：
a) 抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入50μl 标准品标准品溶液和稀释液， 37℃水浴保温50分钟。清洗缓冲液洗板操作5次。
b) 将HRP标记的抗apoB抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温50分钟。重复洗板操作5次。
c) 显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温20分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
d) 比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
e) 制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；
计算Ox-LDL标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的Ox-LDL标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
结果表明本发明实施例1制备的试剂盒其灵敏度可以达到0.1 U/L，而对比例的灵敏度为0.5 U/L。并且根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y=0.237x-0.0032；R2=0.99。
实施例 3
按照专利CN201210160797实施例1的方法制备抗人氧化低密度脂蛋白抗体，采用HPLC方法测定纯化前上清液中的抗体含量，同时对本发明实施例1进行同样的测定，结果表明：本发明实施例1收获的上清液中抗体含量为9.7mg/L，而专利CN201210160797实施例1的上清液中抗体含量为3.8mg/L。
实施例 4 试剂盒稳定性考察
将实施例1制备的试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对数据进行回归分析，计算R2值。
本实施例中对比例设定如下：
对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的抗apoB抗体溶液中不添加PEG200。
对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的抗apoB抗体溶液中PEG200替换为胎牛血清（FBS），浓度同PEG200。
对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含20g/L的BSA和50g/L的蔗糖。
对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含0.5g/L的酪蛋白和2g/L的蔗糖。
对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含3g/L的酪蛋白和10g/L的蔗糖。
具体结果如下：
另外，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。
实施例 5
应用本发明实施例1制备的酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测精密度：随机抽取50盒不同批次试剂盒，用同一份动脉粥样硬化患者血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于2％。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (3)

1.一种人氧化低密度脂蛋白的酶联免疫检测试剂盒，其由以下成分组成：(1) 包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗体的酶标板； (2) 人氧化低密度脂蛋白系列标准品；(3) 酶标记抗体溶液；(4) 稀释液；(5) 洗涤液；(6) 底物液；(7) 显色液；(8) 终止液；
所述人氧化低密度脂蛋白系列标准品的人氧化低密度脂蛋白含量为：0、1、2、4、8和16U/L的15mmol/L PBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和5g蔗糖；
所述酶标记抗体溶液为含0.5mg/L的HRP标记的抗羊抗人载脂蛋白B 抗体和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为8.5；
所述稀释液为15mmol/L pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤液为15mmol/L pH7.4的PBS配制的0.05％吐温20溶液。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为pH7.4的磷酸-柠檬酸缓冲液配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；所述终止液为3mol/L硫酸。
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