CN105675886A - 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105675886A
CN105675886A CN201610180011.1A CN201610180011A CN105675886A CN 105675886 A CN105675886 A CN 105675886A CN 201610180011 A CN201610180011 A CN 201610180011A CN 105675886 A CN105675886 A CN 105675886A
Authority
CN
China
Prior art keywords
foot
cell
antibody
mouth disease
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610180011.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王艳伟
但汉并
范俊青
贾慧琴
周云朵
韦奇勇
李盼盼
董晓辉
徐高原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Original Assignee
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd filed Critical WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority to CN201610180011.1A priority Critical patent/CN105675886A/zh
Publication of CN105675886A publication Critical patent/CN105675886A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明的目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒的优点在于使用了合成肽为包被抗原和辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，减少了非特异性反应，提高了检测的灵敏性和特异性。本发明的另一个目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，该方法敏感性强、特异性好与其荷兰Ceditest试剂盒的总符合率为91.06%，有着很好的应用前景。

Description

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，同时还涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性的传染病，感染后发病率100％。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物能准确反映一个地区的FMD感染状态，也是OIE判断一个国家或者地区有无FMD的依据。目前畜牧业生产中使用的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗，疫苗在制备过程中，病毒经过灭活，纯化和乳化等过程，非结构蛋白受到严重破坏，疫苗中几乎不存在非结构蛋白，因此，免疫动物体内无非结构蛋白抗体。感染口蹄疫野毒的动物，病毒经过生物合成和组装过程中产生非结构蛋白，因此野毒感染动物体内存在非结构蛋白抗体。所以，检测非结构蛋白抗体可以区分免疫动物和感染动物。经过各国学者多年的研究，已证明检测非结构蛋白3ABC是确定动物是否感染口蹄疫的最佳方法。
在口蹄疫抗体的诊断过程中，ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、快速且易于实现自动化操作等优点，检测抗体的ELISA方法一般分为间接ELISA和阻断ELISA或者竞争ELISA，间接ELISA方法容易出现非特异性反应，而阻断ELISA或者竞争ELISA采用了单克隆抗体和阻断技术，方法更为敏感和特异；本专利所采用的方法即为阻断ELISA方法，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒的优点在于使用了合成肽为包被抗原和辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，减少了非特异性反应，提高了检测的灵敏性和特异性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，该方法敏感性强、特异性好与其荷兰Ceditest试剂盒的总符合率为91.06％，有着很好的应用前景。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，包括酶标板、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗涤液。
所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进行偶联的多肽作为包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；
所述的样品稀释液：含0.5％(M/V)BSA的PBS缓冲溶液；
所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗体；
所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清；
所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清；
所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲溶液；
所述的显色液B为含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液；
所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液；
所述的洗涤液为含有0.05％(V/V)Tween-20的PBS缓冲液；
所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽序列与载体蛋白KLH进行偶联，偶联后的合成肽作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT培养基筛选，经过阻断ELISA筛选出来的阳性单克隆抗体，命名为杂交瘤细胞株4G6，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：C201639。
一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，其步骤是：
1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，37℃反应1h；
2)次日，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
3)加入100μL酶标抗体，37℃作用1h；
4)取出酶标板，甩掉孔中溶液，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
5)加入显色液A50μL、显色液B50μL，混匀后室温(20～25℃)避光显色10min，每孔加入终止液50μL，15min内用酶标仪测定每孔的OD630nm读值。
6)阻断率计算：阻断率(PI)＝1-S(样品OD630nm)/N(阴性对照OD630nm)；
7)试验成立条件：阴性对照OD630nm大于0.500，阳性对照的阻断率大于60％；
8)判定标准：猪、牛、羊血清阻断率大于等于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阳性，血清阻断率小于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阴性。
本发明的阻断ELISA方法与现有技术相比，具有如下显著优点：
一是采用间接法包被抗原，抗原为合成和偶联的多肽，抗原纯度高，特异性好，肽段一端偶联载体蛋白，使与抗体结合端暴露出来，更好的展示抗原结构，提高与目的抗体的结合率；二是利用单克隆抗体具有高均质性和高特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，使得该方法更加特异与敏感，而且可以同时检测猪、牛、羊等多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体；三是阳性对照采用合成的多肽免疫制备的兔多抗，以兔多抗作为阳性对照，免去了同时制备猪、牛、羊的抗血清，兔多抗做为阳性对照在间接ELISA中不能使用，因此，本专利的阻断ELISA方法具有优越性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：
一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，包括酶标板、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗涤液。
所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进行偶联的多肽作为包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；
所述的样品稀释液：含0.5％(M/V)BSA的PBS缓冲溶液；
所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗体；
所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清；
所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清；
所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲溶液；
所述的显色液B为含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液；
所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液；
所述的洗涤液为含有0.05％(V/V)Tween-20的PBS缓冲液；
一种多肽抗原的筛选和酶标板的制备，其步骤是：
1、有效肽段的选择和确定，
通过DNAStar、Genebank等分析软件对口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇(epitopes)，将不同序列对比，合成优化的肽段。分别将多肽与载体蛋白OVA偶联作为包被抗原，制备抗原酶标板；然后分别将多肽与载体蛋白KLH偶联作为免疫抗原，免疫6周龄BALB/c小鼠，三次免疫后采血测效价，使用间接ELISA检测不同多肽免疫后血清抗体的效价，本发明从以下肽段进行对比筛选：
1：GPYTGPLERQKPLKC
2：GPYAGPMERQKPLKC
3：GPYEGPVKKPVALKC
多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)与载体蛋白OVA偶联，制备抗原包被板，分别与多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应，结果如表1-1：
表1-1免疫后血清效价的测定
多肽序列2(GPYAGPMERQKPLKC)与载体蛋白OVA偶联，制备抗原包被板，分别与多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应，结果如表1-2：
表1-2免疫后血清效价的测定
多肽序列3(GPYEGPVKKPVALKC)与载体蛋白OVA偶联，制备抗原包被板，分别与多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应，结果如表1-3：
表1-3免疫后血清效价的测定
从表1-1，1-2，1-3看出，多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)与载体蛋白OVA偶联，制备的抗原包被板，与多肽序列1(GPYTGPLERQKPLKC)免疫后的血清反应效果最好，本发明选取GPYTGPLERQKPLKC作为抗原。
2、酶标板的制备：
将与载体蛋白OVA偶联的合成肽抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为100ng/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜，甩干；用200μL/孔含5mg/mLBSA的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液4℃封闭1h，甩干；置于干燥室干燥后，装入含有干燥剂的包装中密封保存。
实施例2：
一种抗口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体的制备方法，其步骤是：
1、饲养细胞的制备：
在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，75％(V/V)酒精消毒5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤(不可损伤腹膜)，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用10mL一次性注射器吸满含20％(V/V)胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，右手固定注射器不动，左手用镊子夹取酒精棉轻揉小鼠腹部，再用注射器抽出腹腔内的培养液，注入灭菌平皿中，加上述培养液调整细胞密度至106个/mL，用多道移液器分别接种至4块96孔细胞培养板，每孔100uL，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
2、制备免疫脾细胞：
取合适浓度的3B-KLH抗原与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，注射剂量为60～100μg。每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫。第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，加强免疫时不使用佐剂。
取经最后加强免疫的BALB/c鼠，眼球摘除放血，分离血清作阳性对照用。将小鼠按上法进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的平皿中清洗，剥离结缔组织。将脾脏移入另一盛有10mL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复三次。将脾细胞悬液转至10mL无菌离心管中，1000rpm离心10min，细胞沉淀用基础培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后备用。
3、制备骨髓瘤细胞：
在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，以保持HGPRT缺陷型。选择生长旺盛，形态良好的细胞作种子细胞用1640完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好处于对数生长期，形态良好的细胞(细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐，呈半致密分布)，1000rpm离心10min，弃去培养液，用基础培养液洗2次后将细胞重悬，记数后备用。
4、细胞融合：
先将免疫脾细胞1000r/min离心5min去掉上清，于37℃放置备用。将1×107个SP2/0与108个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，离心10min。倒空上清，用灭菌的滤纸吸干管壁，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG0.8mL(Sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌1min。然后慢慢加入37℃预温的基础液10mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL1640液，也需慢慢加入。800r/min离心5min，去上清于37℃放置5min。用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔细胞培养板中，约200μL/孔。一次融合可接种4块96孔板。于37℃5％CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察，有无污染，于第5天补加1滴培养基，第8天吸去100μL培养基换HT培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
5、阳性细胞的筛选和克隆：
在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入96孔细胞培养板上的细胞上清，于37℃温育1h，洗涤3次，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值。同时设无集落生长孔作为阴性对照。选取生长旺盛的阳性孔进行克隆。
6、阻断单抗的筛选鉴定：
在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入稀释好的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阴、阳性血清，37℃温育1h，洗涤3次后加入初步筛选阳性孔细胞的上清，37℃温育1h，洗涤3次后加入稀释好的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值，当加入阳性血清孔OD值低于加入阴性血清孔OD值的一半左右时，此单抗即具有阻断效果的单抗，对此单抗进行连续三次克隆，得到100％表达口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阳性杂交瘤细胞株，该细胞分类命名：杂交瘤细胞株4G6，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：C201639。
7、单克隆抗体生产：
用常规培养液培养上述鉴定阳性杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用小鼠体内诱生法。通过将上述得到的产生抗口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的杂交瘤细胞注入经不完全弗式佐剂处理的雌性小鼠(6～8周龄)腹腔内，10天后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗口蹄疫非结构蛋白3ABC的单克隆抗体。
8、单克隆抗体的纯化：
抗体的纯化采用辛酸－硫酸铵法，具体如下：向一份预处理过的腹水中加入两份0.06mol/L(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的盐酸调pH值至4.7。室温(20～25℃)搅拌下在30min内逐渐滴加入辛酸(每毫升稀释前的腹水加33μL)，4℃静置2h，12000rpm离心30min，弃沉淀。上清经滤纸过滤后调pH至7.4。在4℃冰浴下缓慢加入pH为7.4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45％，搅拌30min，静置2～4h或4℃过夜。4℃下12000r/min离心20min弃去上清。沉淀用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)重悬，用pH为8.0的10mmol/LTris-Hcl透析过夜。收集抗体后用分光光度计检测其浓度。
9、单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于lmL双蒸水中，加500μL新配制的0.06mol/L的NaIO4，4℃放置30min，勿超过此时间，此时溶液呈草绿色，加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)室温(20～25℃)避光反应30min。再加入5mg/mL的纯化抗体1mL，在0.05MpH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜。吸出后加5mg/mL新配的NaBH40.2mL4℃放置2h，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min，7000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水重悬，再在0.15MpH7.4的PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗体进行工作浓度标定，然后分装(每个批次的酶标抗体都要进行工作浓度标定)。
实施例3：试剂盒组成
试剂盒含96孔ELISA检测板2块，酶标抗口蹄疫非结构蛋白3ABC单克隆抗体1瓶(20mL/瓶)，阴、阳性对照各1管(1.5mL/管)，样品稀释液1瓶(50mL/瓶)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，显色液A、显色液B、终止液各1瓶(10mL/瓶)，附说明书1份。
20倍浓缩洗涤液：160g氯化钠、10mLTween-20溶于1000mL蒸馏水中。
封闭液：含5mg/mLBSA的磷酸盐缓冲液。
样品稀释液：含0.5％(M/V)BSA的PBS缓冲溶液。
阳性对照、阴性对照的制备：将筛选获得的标准阳性血清按1000U/mL加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的标准阴性血清按1000U/mL加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阴性对照。
实施例4：
一种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的检测方法，其步骤是：
1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，37℃反应1h；
2)次日，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
3)加入100μL酶标抗体，37℃作用1h；
4)取出酶标板，甩掉孔中溶液，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
5)加入显色液A50μL、显色液B50μL，混匀后室温(20～25℃)避光显色10min，每孔加入终止液50μL，15min内用酶标仪测定每孔的OD630nm读值。
6)阻断率计算：阻断率(PI)＝1-S(样品OD630nm)/N(阴性对照OD630nm)；
7)试验成立条件：阴性对照OD630nm大于0.500，阳性对照的阻断率大于60％；
8)判定标准：猪、牛、羊血清阻断率大于等于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阳性，血清阻断率小于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阴性。
1、特异性试验
用口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA试剂盒检测猪口蹄疫野毒感染血清及猪伪狂犬病、猪瘟、猪圆环和猪繁殖与呼吸综合征标准阳性血清和阴性、阳性对照血清，除口蹄疫野毒感染血清盒阳性对照的PI值显著大于0.4外，其余血清PI值均小于0.4，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。
表2特异性血清的检测
2、敏感性的检测
用自制试剂盒和进口Ceditest试剂盒同时检测不同稀释倍数的感染猪伪狂犬病毒的血清，从表3中可以看出9号血清稀释32倍时，两种方法检测抗体均为阳性，54号和55号血清稀释64倍时,两种方法检测抗体均为阳性，说明自制的试剂盒和进口Ceditest试剂盒敏感性相当。
表3不同稀释倍数的感染血清检测结果
注：Ceditest试剂盒判定标准:PI大于0.5判为阳性，PI小于0.5判为阴性。
自制试剂盒判定标准为:PI大于0.4判为阳性，PI小于0.4判为阴性。
3、符合率比较
用自制试剂盒和进口Ceditest试剂盒同时检测临床猪牛羊血清，检测羊血清310份，两种试剂盒的符合率为90％；检测牛血清184份，两种试剂盒的符合率为91.3％；检测猪血清110份，两种试剂盒的符合率为93.64％；检测临床猪牛羊血清共604份，两种试剂盒的总符合率为91.06％。结果见表4-1，4-2，4-3，4-4。
表4-1口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒与Ceditest公司口蹄疫3ABC抗体检测试剂盒符合率比较
表4-2口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒与Ceditest公司口蹄疫3ABC抗体检测试剂盒符合率比较
表4-3口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒与Ceditest公司口蹄疫3ABC抗体检测试剂盒符合率比较
表4-4口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒与Ceditest公司口蹄疫3ABC抗体检测试剂盒符合率比较

Claims (4)

1.一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，包括酶标板、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗涤液；其特征在于：
所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进行偶联的多肽作为包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；
所述的样品稀释液：含0.5％M/VBSA的PBS缓冲溶液；
所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗体；
所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清；
所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清；
所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲溶液；
所述的显色液B为含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液；
所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液；
所述的洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的PBS缓冲液。
2.权利要求1所述的一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于：所述的单克隆抗体细胞株命名为杂交瘤细胞株4G6，CCTCCNO：C201639。
3.权利要求1或2所述的一种抗口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体的制备方法，其步骤是：
A、饲养细胞的制备：
在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，75％V/V酒精消毒5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤，用10mL一次性注射器吸满含20％V/V胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，再用注射器抽出腹腔内的培养液，注入灭菌平皿中，加上述培养液调整细胞密度至106个/mL，用多道移液器分别接种至4块96孔细胞培养板，每孔100uL，置37℃，5％CO2培养箱中培养；
B、制备免疫脾细胞：
取浓度的3B-KLH抗原与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，注射剂量为60～100微克，每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫，第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，将脾脏移入另一盛有10mL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，将脾细胞悬液转至10mL无菌离心管中，1000rpm离心10min，细胞沉淀用基础培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后备用；
C、制备骨髓瘤细胞：
在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，用1640完全培养基进行扩大培养，1000rpm离心10min，弃去培养液，用基础培养液洗2次后将细胞重悬，记数后备用；
D、细胞融合：
先将免疫脾细胞1000r/min离心5min去掉上清，于37℃放置备用，将1×107个SP2/0与108个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，离心10min，倒空上清，用灭菌的滤纸吸干管壁，将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，在1min内滴入预温至37℃的50％PEG0.8mL，边加边用吸管尖搅拌，然后加入37℃预温的基础液10mL，第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，并不断地搅拌，最后加入30mL1640液，800r/min离心5min，去上清于37℃放置5min，用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，一次融合接种4块96孔板，于37℃5％CO2培养箱中培养，进行抗体检测；
E、阳性细胞的筛选和克隆：
在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入96孔细胞培养板上的细胞上清，于37℃温育1h，洗涤3次，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值；
F、阻断单抗的筛选鉴定：
在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阴、阳性血清，37℃温育1h，洗涤3次后加入初步筛选阳性孔细胞的上清，37℃温育1h，洗涤3次后加入稀释好的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值，选取具有阻断效果的单抗。
4.权利要求1所述的一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，其步骤是：
1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，37℃反应1h；
2)次日，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
3)加入100μL酶标抗体，37℃作用1h；
4)取出酶标板，甩掉孔中溶液，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；
5)加入显色液A50μL、显色液B50μL，混匀后室温避光显色10min，每孔加入终止液50μL，15min内用酶标仪测定每孔的OD630nm读值；
6)阻断率计算：阻断率＝1-S/N；
7)试验成立条件：阴性对照OD630nm大于0.500，阳性对照的阻断率大于60％；8)判定标准：猪、牛、羊血清阻断率大于等于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阳性，血清阻断率小于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阴性。
CN201610180011.1A 2016-03-25 2016-03-25 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法 Pending CN105675886A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610180011.1A CN105675886A (zh) 2016-03-25 2016-03-25 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610180011.1A CN105675886A (zh) 2016-03-25 2016-03-25 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105675886A true CN105675886A (zh) 2016-06-15

Family

ID=56225384

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610180011.1A Pending CN105675886A (zh) 2016-03-25 2016-03-25 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105675886A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106501512A (zh) * 2016-11-22 2017-03-15 盐城拜明生物技术有限公司 一种口蹄疫抗体检测试剂盒、检测方法及其应用
CN106520702A (zh) * 2016-10-20 2017-03-22 扬州大学 一种杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用
CN107991481A (zh) * 2016-10-27 2018-05-04 武汉科前生物股份有限公司 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN108872575A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种塞尼卡谷病毒非结构蛋白3abc抗体elisa检测试剂盒
CN109799345A (zh) * 2018-12-07 2019-05-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于病毒样颗粒的c型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒
CN112285347A (zh) * 2020-09-30 2021-01-29 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102662062A (zh) * 2012-04-17 2012-09-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102662062A (zh) * 2012-04-17 2012-09-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.K. OEM ET AL: "Development of an epitope-blocking-enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between animals infected with and vaccinated against foot-and-mouth disease virus", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
K. J. SORENSEN ET AL: "Differentiation of foot-and-mouth disease virus infected animals from vaccinated animals using a", 《ARCH VIROL》 *
杨继飞等: "以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测 ELISA 试剂盒", 《中国农业科学》 *
蔡利军: "口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC单克隆抗体的制备及初步应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520702A (zh) * 2016-10-20 2017-03-22 扬州大学 一种杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用
CN106520702B (zh) * 2016-10-20 2019-05-07 扬州大学 一种杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用
CN107991481A (zh) * 2016-10-27 2018-05-04 武汉科前生物股份有限公司 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN106501512A (zh) * 2016-11-22 2017-03-15 盐城拜明生物技术有限公司 一种口蹄疫抗体检测试剂盒、检测方法及其应用
CN108872575A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种塞尼卡谷病毒非结构蛋白3abc抗体elisa检测试剂盒
CN109799345A (zh) * 2018-12-07 2019-05-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于病毒样颗粒的c型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒
CN109799345B (zh) * 2018-12-07 2021-08-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于病毒样颗粒的c型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒
CN112285347A (zh) * 2020-09-30 2021-01-29 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒
CN112285347B (zh) * 2020-09-30 2023-12-22 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105675886A (zh) 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法
CN102967710B (zh) 小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法
CN101833005B (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa试剂盒
CN101831407B (zh) 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体
Andrew et al. Antigen specificity of the ovine cytotoxic T lymphocyte response to bluetongue virus
CN102353783A (zh) 一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断elisa检测方法
CN107541500A (zh) 一种a型口蹄疫病毒单克隆抗体及应用
CN111849922B (zh) 一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用
CN107459574A (zh) 一种PRV gB单克隆抗体及其应用
CN104480072A (zh) 一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN106366188A (zh) 抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
CN104807992A (zh) 一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法
CN102747044B (zh) 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
CN1650013B (zh) 抗汉坦病毒属病毒感染的dna疫苗
CN104120109A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒gB抗体检测阻断ELISA试剂盒及用途
CN100376671C (zh) 抗乙型肝炎病毒表面抗原的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体
CN101671655B (zh) 一种艾滋病毒p24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用
CN106442998A (zh) 一种基于型特异性单抗的a型口蹄疫病毒抗体固相竞争elisa试剂盒
CN101322844A (zh) 无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法
CN113355291B (zh) 抗丝状支原体丝状亚种p0071蛋白的单克隆抗体及其应用
CN104965083A (zh) 一种检测h3n2亚型犬流感病毒的试剂盒
CN103728457A (zh) 一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒制备方法及其应用
CN110452884B (zh) 抗BCoV-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体和应用
CN106483291A (zh) 一种基于型特异性单抗的Asia1型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA试剂盒
CN111686246B (zh) 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160615