CN1763217A - 一种单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

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本发明涉及一种用单克隆抗体的制备方法，以及这种单克隆抗体的应用。本发明所述的单克隆抗体是指金黄色葡萄球菌外壳蛋白SPA的单克隆抗体。其制备方法为用杀菌后的金黄色葡萄球菌免疫Balb/C小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金黄色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体。本发明的单克隆抗体的应用是用这种单克隆抗体制备ELISA试剂盒，或者用其制备胶体金检测试剂盒。

Description

一种单克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用单克隆抗体的制备方法，以及这种单克隆抗体的应用。
背景技术
对于金黄色葡萄球菌外壳蛋白SPA的单克隆抗体的制备，至今鲜有披露。另外，由于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)广泛分布于自然界和食品原料中，污染食品的机会很多，污染的食品又多为肉制品及乳制品。因此对其进行检测是非常必要的，特别是对原料乳中金黄色葡萄球菌的检测对于乳品行业将是今后的一个主要内容。但对原料乳中金黄色葡萄球菌的检测，至今尚没有一种快速简便的方法。
我国目前对金黄色葡萄球菌采用的检测方法是以国家标准GB.4789-10-84及检验检疫系统行业标准SN.0172-92作为依据，主要步骤包括：增菌培养(18-24h)，接种Baird-Parker(B-P)平板和血平板(18-24h)，再挑取可疑菌落做血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验。该试验需要新鲜兔血，整个检测过程需2-3天，获得最终结果需5天左右，费时费力，不适宜现场使用，更不适合原料乳检测。
发明内容
本发明提供一种采用单克隆抗体的制备方法，同时提供这种单克隆抗体的应用方式。
本发明所述的单克隆抗体是指金黄色葡萄球菌外壳蛋白SPA的单克隆抗体。其制备方法为用杀菌后的金黄色葡萄球菌免疫Balb/C小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金黄色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体的应用是用这种单克隆抗体制备ELISA试剂盒，或者用其制备胶体金检测试剂盒。
本发明提供的单克隆抗体对金黄色葡萄球菌有特别异性高，灵敏度强的特点，可以用于特定领域内对金黄色葡萄球菌进行检测，特别是用本发明的单克隆抗体制备ELISA试剂盒或胶体金检测试剂盒可以对原料乳中的金黄色葡萄球菌进行快速检测，同时具有检测快速，特异性高，操作简便，无需特殊设备，便于在基层推广应用的优点。
附图说明
附图为胶体金免疫层析测试条特异性检测结果图
具体实施方式
以下给出本发明的制备方法及相关的测试结果。
将金黄色葡萄球菌标准产毒菌株接种于厚氏斜面培养基，培养16-18h后，以无菌生理盐水冲下，加0.8％甲醛，37℃1h杀菌，再用无菌生理盐水4000rpm×40min离心洗涤3次，比浊计数后作为免疫源。
采用8-12周龄雌性Balb/c纯系小鼠，全菌体悬液直接腹腔注射，第一针免疫剂量为2×106cfu/ml，以后逐次倍增，每针次间隔时间为一周，共免疫5针，最后一针皮下两点注射。末次免疫后一周，经小鼠眼内眦取血，以玻片凝集法检测血清抗体效价，选择凝集效价在1：160以上者，尾静脉免疫2×108cfu/ml，2天后用于融合。
融合前两周，取出冻存于液氮中的Sp2/0细胞复苏，长成单层后传代培养。培养液为含15％小牛血清的RPMI1640培养液，培养条件为：细胞培养箱内8％二氧化碳，37℃。然后1000rpm离心5min，再用RPMI1640培养液洗涤2次，悬浮于RPMI1640培养液，计数备用。在实际的制备过程中可根据需要融合的细胞量决定，一般一只脾脏需106Sp2/0细胞。
将8-12周龄，雌性健康Balb/c小鼠拉脱颈椎处死，75％酒精浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔外表皮后，再换剪刀和镊子剪开腹膜，用毛细滴管吸取RPMI1640培养液注入腹腔，反复吹打涮取腹腔渗出细胞，悬浮于RPMI1640培养液后，0.1ml/孔滴于待融合细胞板孔中备用。
将免疫后用于融合的小鼠拉脱颈椎处死，75％酒精浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔外表皮后，再换剪刀和镊子剪开腹膜，取出脾脏，剥去周围结缔组织。置于灭菌200目铜网上，剪碎后不断研磨并加RPMI1640培养液轻轻冲洗，得到脾细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清。沉淀细胞用RPMI1640培养液洗一次，悬浮于RPMI1640培养液，计数备用。一般要求计数应大等于或大于107。
将脾细胞与Sp2/0细胞以5/1的细胞数量比例混合，按常规方法融合。采用含50％(体积比)的聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬浮于含有HAT的选择性培养液中，使用的培养液量为8块板需80毫升左右培养液。将其滴加到已加有饲养细胞的96孔培养板中，0.1ml/孔。培养板置8％CO2、37℃培养箱内培养，第4天换HAT培养液一次，第7天视克隆生长情况换HAT或HT培养液。
细胞培养板孔内细胞克隆生长至1/4视野以上时开始检测，先以玻片凝集法筛选，筛选出的阳性细胞孔再以间接ELISA法检测。以超声破碎的标准产毒菌株26071包被酶标板，包被浓度4×106cfu/ml；包被液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为检测抗体。筛选出的阳性细胞用细胞记数板记数后按每孔一个细胞的浓度滴入到加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，培养液为HAT培养液。克隆化的细胞生长至1/4视野时，检测单细胞集落孔，挑选生长迅速，培养上清液抗体检测呈强阳性的细胞进行第2、3次克隆化。当所有单细胞集落的培养孔抗体检测阳性，且反应程度基本一致时停止克隆。挑选形态良好，抗体活性较高的细胞克隆进行扩大培养。至此，得到本发明的抗体。
在实际的生产中可将生长旺盛，形态良好的细胞收集起来，用1000rpm离心沉淀，用冻存液(90％RPMI1640+10％小牛血清)悬浮，调整浓度为3-5×106/ml，分装安瓶，用火焰封口，-20℃放置3-4小时后，移入液氮罐冻存，待用。
本发明的单克隆抗体的检测结果如下：
单抗腹水制备  选用20g以上F1代小鼠，用1：6弗氏不完全佐剂腹腔致敏。1-2周后，小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射量为2-5×106个/只，10-14天左右腹水诱生后，采集腹水，4℃离心，9000rpm，30min。取上清加入等量甘油，混匀放置-20℃冰箱备用。
单抗的特异性检测  用0.15Mol/L氯化钠溶液将各株单抗腹水稀释200倍后用玻片凝集试验分别检测与沙门氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌、乙型溶血性链球菌的反应性，鼠抗金黄色葡萄球菌阳性血清和正常鼠血清分别作为阳、阴性对照，以确定各株单抗的特异性。
与SPA(金黄色葡萄球菌表面蛋白A)的反应性  用SPA 5ug/ml包被酶标板，IgG类McAbs腹水用含0.05％吐温20的0.01Mol/L磷酸缓冲盐水200倍稀释后，以间接ELISA法检测各株IgG McAbs与SPA的反应性。6G5单抗反应结果呈阳性视为抗SPA单抗；IgM类McAbs的腹水20倍稀释后以琼脂双扩散法测定与SPA的反应性。铺1％浓度琼脂板，打梅花孔，中心孔加入用0.15Mol/L氯化钠溶液稀释的浓度为1mg/ml的SPA，周围孔加入用0.15Mol/L氯化钠溶液20倍稀释的腹水，置37℃湿盒24-48小时，观察沉淀线。9E10单抗出现沉淀线视为抗SPA单抗。
单克隆抗体纯化  将待纯化的腹水加入等量生理盐水稀释，再加入饱和硫酸铵使成50％饱和度，4℃离心，9000rpm，30min。收集沉淀并以适量蒸馏水溶解后用0.02M pH7.0的磷酸缓冲液透析，4℃离心，9000rpm，30min；取上清上Sepharose-DEAE柱进行层析纯化。先用0.02M pH7.0PB缓冲液洗脱杂蛋白后更换0.2M NaCl-PB缓冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱峰即为纯化的IgG。一部分加等体积甘油，-20℃保存；余量直接置于-20℃下保存。
单克隆抗体活性检测  用超声破碎的标准产毒金黄色葡萄球菌包被市售ELISA反应板，包被浓度4×106cfu/ml，包被液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，每孔100ul，4℃包被过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为检测抗体。加入四氨基联苯胺底物(TMB底物)显色后测OD450值。按蛋白含量计算，纯化单抗活性不得低于10ug/ml。
辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体  采用改良过碘酸钠法。重悬5mgHRP于1.2ml三蒸水中，加入0.1M高碘酸钠(溶于10mMpH7.0PB)0.3ml，室温避光氧化25min；加入0.16M乙二醇(0.1ml/mlHRP)终止反应；对pH4.4醋酸钠缓冲液透析过夜，期间更换透析液几次；加入欲标记抗体(6G5和5D1单抗)5mg，再用pH9.5碳酸盐缓冲液透析，在避光条件下搅拌4h；加入新鲜配制的4mg/ml的NaBH4100ul，置4℃2h终止反应。标记后的酶标抗体用50％饱和度硫酸铵沉淀，4℃离心，7000rpm，30min。加等体积甘油，-20℃保存。
单抗-酶结合物活性测定  以直接ELISA法检测。即以超声破碎的金黄色葡萄球菌标准产毒菌株26071包被酶标反应板(包被浓度2×106cfu/ml)，封闭后加入系列稀释的单抗-酶标物，每孔100ul，37℃反应60min后加入TMB底物显色液，反应10-15min后用2M H2SO4终止反应，测OD450值。
包被抗体与酶标抗体的配伍试验  分别比较不同包被浓度、不同包被抗体和不同工作浓度酶标记抗体配伍时检测金黄色葡萄球菌菌株的灵敏度。试验证明用9E10、7D9和10B7三株抗体等量混合包被(包被液为0.02M pH7.0PB，每孔100ul，4℃过夜)，标记辣根过氧化物酶的6G5和5D1单抗联合使用作为检测抗体时，检测11株金黄色葡萄球菌的灵敏度最高，达到5×105-1.5×107。
按配伍试验的包被体系制备酶标抗体包被反应板。即取9E10、7D9和10B7三株纯化抗体稀释至10ug/ml，等量混合后每孔加100ul，包被液为0.02M PH7.0PB，4℃过夜；洗涤液(0.01M，pH7.2的磷酸缓冲盐水，含0.05％吐温20)洗涤3遍后，加入含有20％小牛血清的洗涤液置37℃封闭2h。倾去酶标反应板内液体，真空干燥包装后2-8℃保存。
在本发明的实际操作中，抗体包被板是用三株抗金黄色葡萄菌的单克隆抗体包被，酶标抗体是辣根过氧化物酶标记的另两株抗金黄色葡萄菌的单克隆抗体，这样可以提高检测灵敏度和扩大检测菌株的覆盖面。
本发明的试剂盒对数种常见菌的特异性检测结果见下表
                              表1.双抗体夹心法ELISA的特异性检测结果
  菌株种类(1×108cfu/ml)   菌株数   光密度值均值   待检菌光密度值/阴性对照光密度值   结果
  NSSalmonellaE.coliShigellaS.HemolyticusS.aureus 6591411   0.2620.284(0.263-0.332)0.301(0.168-0.393)0.293(0.146-0.296)0.2752.047 1.141.441.051.027.93   -----+
本试验表明，采用本发明检测沙门氏菌(Salmonella)6株、大肠埃希氏菌(E.coli)59株、志贺氏菌(Shigella)14株、溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus)1株，所有检测P/N值在1.02-1.44之间，阳性对照金黄色葡萄菌P/N值7.93；以P/N≥2.1为cutoff值判断，所有被检菌株在浓度为108时均呈阴性反应。表明本试验方法的特异性较好。
本发明的试剂使用如下：
将包被好的酶标板每孔加入待检样品100ul，孵育40min；用洗液洗涤后加入酶标记抗体，37℃孵育40min；洗液洗涤三遍后加入底物TMB，37℃显色15min，用2M H2SO4终止反应，测定OD450判定结果。P/N(待检样品与阴性对照之比)≥2.1判为阳性，P/N＜2.1判为阴性。阳性对照为1×108cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌标准产毒菌株26071，阴性对照为生理盐水。检测结果如下表。
                     表2.双抗体夹心法ELISA的灵敏度检测结果(OD450)
 样品编号   浓度(×106cfu/ml)   灵敏度(cfu/ml)P/N≥2.1
  500   250   125   62.5   31.2   15.6   7.8   3.9   1.95   0.975   0.486   N
 26071260722607326074260751#2#3#4#7#10#   2.2091.3592.2620.8452.2370.9270.5591.4640.6600.8250.535   2.2070.9192.3560.6432.3150.6320.4220.7980.5290.5390.479   2.2160.5142.3890.3181.6870.6270.3330.6370.3300.3260.299   2.3040.3492.3990.1711.0850.3250.2330.4320.2690.2430.282   2.1100.2872.2780.1900.6280.2300.1980.3710.2340.2600.258   1.5820.1701.7470.1610.3520.1890.1680.2700.2080.1990.201   1.0220.0611.1610.0720.2270.1630.0720.1970.0790.0740.073   0.5110.0690.7660.0850.1670.0720.0820.1680.0680.0710.054   0.3820.0720.4240.0280.1510.0660.0790.0830.0820.0780.062   0.2080.080.2570.0260.0690.0590.0690.0740.0950.0790.071   0.2010.0550.1630.0570.0680.0670.0920.0890.0520.0810.070   0.0860.0800.0820.0640.0720.0800.0830.0820.0690.0770.071   4.86×1051.56×1074.86×1051.56×1073.90×1057.80×1061.56×1073.90×1061.56×1071.56×1071.56×107
表2样品中26071至26075为标准金黄色葡萄球菌菌株，而1至10号样品为从原乳中分离的金黄色葡萄球菌菌株。由试验可见，本发明的试剂盒对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度高，特异性好，能直接检测样品中的金黄色葡萄球菌。
胶体金免疫层析法的建立
1、金标抗体浓度的确定
结果显示，在检测阳性样品和阴性样品时，当金标6B10抗体浓度小于A280为6.0时，对照带和显色带显色颜色浅，显色时间长，灵敏度不高，检测阳性样品的低限大于104；当探针浓度大于A280为6.0时，灵敏度得到提高，检测阳性样品的低限在104以下，但硝酸纤维素膜的背景加深。只有当金标6B10抗体浓度在A280为6.0时，灵敏度低限在104左右，背景颜色恰好，显色时间与8.0、10.0的时间基本一致。因此，在层析膜的制备过程中，确定金标6B10抗体的浓度为A280为6.0。
2、捕获带抗体浓度的确定
结果显示，当对照带羊抗鼠IgG浓度和络合板金标6B10抗体浓度固定，检测阳性样品时，加于硝酸纤维素膜捕获带抗体5D1+6B10的浓度小于2.0mg/ml时，检测线显色较淡，显色时间长；当浓度为2.0mg/ml时，检测线显色呈粉色，显色时间较短；当浓度大于2.0mg/ml时，检测线显色与2.0mg/ml时无异。因此，在层析膜的制备过程中，确定捕获带抗体5D1+6B10的浓度为2.0mg/ml。
3、羊抗鼠IgG对照带浓度的确定
结果显示，检测阳性样品时，羊抗鼠IgG对照带浓度为0.2mg/ml时，对照带显色仍很清晰，因此，在层析膜的制备过程中，确定捕获带抗体的浓度为0.2mg/ml。
4、胶体金免疫层析测试条的特异性检测结果
结果见附图。用制备的金标试纸条检测沙门氏菌6株、大肠杆菌59株、志贺氏菌14株、溶血性链球菌1株，结果均呈阴性。说明制备的胶体金免疫层析测试条特异性较好。
5、胶体金免疫层析测试条的灵敏度检测定结果
见表3，对S.aureus标准菌株的检测灵敏度为8.5×104-1.25×106；对6株地方分离菌株的检测灵敏度在7.5×104-1.50×106之间。
            表5.胶体金免疫层析测试条的灵敏度检测结果
          Table 5.The sensitivity determination of GICA
  S.aureus   Concentration(×108cfu/ml) Diluted by   Sensitivity(cfu/ml)
×10-3 ×10-4 ×10-5 ×10-6
  26071260722607326074260751#2#3#4#7#10#   11512575851007515801257260 +++++++++++   ++++++-++++   +--+++-+---   -----------   1.15×1061.25×1067.5×1058.5×1041.0×1057.5×1041.50×1068.0×1041.25×1067.2×1056.0×105
6、胶体金免疫层析测试条对50份原料乳样品的检测结果
除5份样品在检测线处出现淡红色条带外，其余各份株待测样品均呈现阴性结果。对照金黄色葡萄球菌选择性培养基上的菌落生长结果，呈现阴性检测结果的原料乳样品菌含量低于1000个/毫升，出现弱阳性反应的原料乳样品菌含量在几千个/毫升。进一步分离培养后挑取形态各异的菌落涂片镜检，分别为革兰氏染色阴性杆菌和球菌，推测系非特异性反应。试验结论：应用本发明的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析测试条可用于原料乳现场检测金黄色葡萄球菌，其灵敏度可达1×105cfu/ml，特异性高于90％。
以上结果表明，本发明的单克隆抗体对金黄色葡萄球菌具有特异性。另外在以上的内容中也给出以本发明的抗体制备ELISA检测盒及胶体金检测盒的原则方法。

Claims (3)

1、一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于用杀菌后的金黄色葡萄球菌免疫Balb/C小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金黄色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需产物。
2、根据权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征是用这种单克隆抗体制备ELISA试剂盒。
3、根据权利要求1所述的单克隆抗体的应用，其特征是用这种单克隆抗体制备胶体金检测试剂盒。
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