CN1570637A - 沙门氏菌快速检测装置 - Google Patents
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Abstract
沙门氏菌快速检测装置，包括载有生物制剂的载体，其特征在于载体上所含生物制剂的成分为特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体，由此形成能够快速检测沙门氏菌的检测装置。本发明的特点是：制成快速检测沙门氏菌的检测装置，大大缩断了检测时间，经过增菌培养后，其检测过程只需10分钟左右，操作程序简单，使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测食物、饲料中沙门氏菌的装置，特别是沙门氏菌快速检测装置。
背景技术
沙门氏菌是食物中毒及动物饲料中最常见的致病微生物，感染该致病微生物的动物的肉、血、内脏、蛋以及制成品中可含有大量的沙门氏菌。目前对于沙门氏菌的检测主要是在实验室中进行，即通过前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生物化学筛选和血清学鉴定等步骤最终得到检测结果。其整个过程需要5-7天，耗时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于对食物和动物饲料中的沙门氏菌进行快速检测的沙门氏菌快速检测装置。
本发明的目的是这样实现的：沙门氏菌快速检测装置包括载有生物制剂的载体，其特征在于载体上所含生物制剂的成分为特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体，由此形成能够快速检测沙门氏菌的检测装置。特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体的使用浓度为1∶50-1∶300u。载体上至少应载有20微升的特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。
上述生物制剂可以通过下述方法获得：
生物制剂的制备：包括沙门氏菌H抗原的单克隆抗体、(多抗)及兔抗鼠血清(多抗)的制备，以及单抗和多抗的提纯(提取免疫球蛋白IgG)和胶体金制备及标记。
1.沙门氏菌H抗原的提取及纯化：将沙门氏菌菌株接种至营养琼脂平板上培养16-22小时，再进行扩大培养收获细菌。将细菌与生理盐水混合后用1M盐酸调pH至2.0，搅拌一定时间(20-40分钟)后离心，弃沉淀。取上清再次离心，而后将上清液用氢氧化钠调至pH为7.0-7.5，加饱和硫酸铵过夜。再次离心，弃上清液，收集沉淀物。将沉淀物溶于蒸馏水后透析，冻干包存。
2.抗沙门氏菌H抗原单克隆抗体细胞株及单克隆抗体是这样建立和制备的：
(1)分泌抗沙门氏菌H抗原单克隆抗体细胞株的建立；A、动物免疫：取沙门氏菌H抗原，用生理盐水稀释，在与等量的完全福氏佐剂混合，经腹腔免疫Balb/C小鼠，2周后再用同量沙门氏菌H抗原与等量的完全福氏佐剂混合，加强免疫，2周后再加强免疫一次，第二次加强免疫后2周左右即可考虑做细胞融合，融合前3天，直接用沙门氏菌H抗原脾内追加免疫一次；B、细胞融合：细胞融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，培养至对数增长期，融合前一天取饲养细胞铺96孔细胞培养板中培养，第15天取上清杂交瘤；C、阳性抗沙门氏菌H抗原单克隆抗体的筛选：包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将沙门氏菌H抗原稀释至1-10μg/ml，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃过夜，然后弃去孔内的液体用生理盐水一吐温洗涤缓冲液3次，拍干，加样：将有克隆生长的培养上清按顺序加入，100μL/孔37℃温育1小时，洗涤3次，甩干，加二抗：用吐温洗涤液稀释辣根酶标羊抗鼠，100μL/孔，置37℃温育10-30分钟，终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL，结果判断阴性对照孔无色，阳性对照孔明确显色，测定OD值，以空白对照调零，OD值大于或等于阴性对照2.1倍即为阳性，对其中阳性的上清再作游离沙门氏菌的试验，筛选出特异阳性细胞，及时扩大、冻存、转种并进行有限稀释法纯化，即可获得抗沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(2)接种杂交瘤细胞：在接种杂瘤细胞前1周，先给Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡；将抗沙门氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞数调至1×106-2×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。
(3)采集腹水：接种杂交瘤细胞后第10天，用注射器抽取腹水，300g离心15分钟，收集上清，即得抗沙门氏菌单克隆抗体。
3.抗沙门氏菌H抗原多克隆抗体是这样制备的：将6个月左右，体重2.5Kg的健康家兔，每足注射0.1-1ml牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化的抗原，两周后加强免疫，用同剂量牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化进行第二、三、四次加强免疫，每次加强免疫后的第5天耳静脉取血，用琼脂双扩散法检测免疫应答效果，当滴度达到1∶64以上时，颈动脉放血，离心，收集血清。
4.免疫亲和纯化多克隆抗体和单克隆抗体，及交叉纯化多克隆抗体是这样进行的：
(1)沙门氏菌H抗原单克隆抗体和多克隆抗体的预处理：将1-10ml血清或腹水用磷酸缓冲液稀释1倍，经0.22μm微孔膜过滤，4℃、10000g离心；(2)辛酸-硫酸铵法纯化：向1-10ml毫升预处理的抗血清或腹水中加入2-10ml 0.06M PH4.0乙酸缓冲液，调PH至4.8，于搅拌下30分钟内缓慢加入辛酸33-300μL，4℃静置2小时，15000g、4℃离心30分钟，弃沉淀，上清加入1/10体积的0.1M PH7.4磷酸缓冲液，调PH至7.4，30分钟内加入饱和硫酸铵，使成45％饱和度，静置1小时，4℃下10000g离心30分钟，沉淀溶于1/2量PH7.4磷酸盐缓冲液中，对上述缓冲液透析，4℃下10000g离心30分钟，-20℃保存
5.胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单克隆抗体及多克隆抗体用复合物是这样制备的：取0.01％四氯金酸水溶液200ml，加热至沸腾，加入8ml 1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸5分钟，出现橙红色胶体金颗粒直径由电镜测定为200nm。取50ml胶体金一份，用0.1mol/L碳酸钾调PH至8.0。搅拌下将胶体金溶液分别与免疫亲和纯化的抗沙门氏菌H抗原单克隆抗体或多克隆抗体混合，再加入聚乙二醇20000水溶液，使最终浓度为0.05％；将粗制品6000g离心45分钟，离心后，沉淀物生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存；
6.将按上述方法制备的胶体金标记的以1∶5混合的多克隆抗体及单克隆抗体分别喷撒在厚度1mm的三张玻璃纤维纸上，冻干密封保存。
本发明的特点是：制成快速检测沙门氏菌的检测装置，大大缩短了检测时间，经过增菌培养后，其检测过程只需10分钟左右，操作程序简单，使用方便。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
具体实施方式
实施例1 如图1所示，本发明的检测装置是由外部的盒体1和位于盒体内的载体2构成，盒体上设有待测样品注入口3和查看结果的视窗4以及检测线区、质控线区的标注符号T、C，载体的支持部分为硝酸纤维膜。载体分为三个区域，两端分别为样品区和吸水区，中部为实验反应区(含检测线T区和质控线C区)。实验反应区有三个带有生物制剂标记的条带，三个条带上含有特异性的抗沙门氏菌IgG，胶体金标记的抗沙门氏菌H抗原单抗IgG，胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。上述四种生物制剂的使用量为70μl，浓度均为1∶70u。吸水材料覆盖在胶体金标记的抗沙门氏菌H抗原的单抗IgG上面。在各条带的标记完成后，用1％小牛血清白蛋白封闭硝酸纤维膜，然后将载体放入盒内，最后用铝箔袋干燥封装。
实施例2 四种生物制剂的使用量为100μl，浓度均为1∶200u。其它内容均与实施例1的相同。
实施例3 四种生物制剂的使用量为55μl，浓度均为1∶55u。其它内容均与实施例1的相同。
实施例4 四种生物制剂的使用量为80μl，浓度均为1∶100u。其它内容均与实施例1的相同。
使用本检测装置时，首先采用培养液将已经受损或完整的沙门氏菌修复、存活及恢复繁殖。经过培养液的处理，可促使沙门氏菌选择性的富集生长到本检测装置可检测的水平。检测时，取120ul富集培养液加到检测装置盒体上的圆形注入孔中，样品通过毛细管作用沿载体移动，如果样品中存在抗原则会结合到金标记抗体上形成抗原抗体复合物，并于检测线T区呈现一条紫红色带线，为阳性结果，余下的样品继续迁移到载体末端最终沉淀于废液池中。如样品中无待测抗原，则在检测线T区无任何色条出现，即为阴性结果。两种情况下，质控线C区皆出现紫红色带线，表示检测有效。如C区无带线，无论T区有无紫红色带线，都表示检测无效。
Claims (3)
1、沙门氏菌快速检测装置，包括载有生物制剂的载体，其特征在于载体上所含生物制剂的成分为特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体，由此形成能够快速检测沙门氏菌的检测装置。
2、根据权利要求1所述的沙门氏菌快速检测装置，其特征在于特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体的使用浓度为1∶50----1∶300u。
3、根据权利要求1所述的沙门氏菌快速检测装置，其特征在于载体上至少应载有20微升的特异性的抗沙门氏菌IgG、胶体金标记抗沙门氏菌H抗原单抗IgG、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。
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