CN110836975B - 一种检测副溶血性弧菌td毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测副溶血性弧菌td毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用，所述的检测卡由按顺序依次固定的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫组成，其中胶体金垫内有胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；对上述检测核心进行冷裱塑封，并在加样处留出加样孔。通过本发明的实施，开发出低成本易制作的副溶血性弧菌TD毒素快速免疫检测卡的生产制备技术及其产品，推进本领域的技术进步。

Description

一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金检测卡及其制备方法和应用，本发明应用了抗体制备技术和胶体金检测方法。
背景技术
根据WHO估计，发达国家食源性疾病的漏报率在90%以上，而发展中国家则为95%以上。以此推论，我国目前掌握的食物中毒数据仅为我国实际发生的食源性疾病的“冰山一角”。 而如此高的漏报率，除管理上的问题外，致病微生物的检测和溯源手段的限制也是一个重要因素。当前细菌性食物中毒主要有感染型中毒和毒素型中毒两种。副溶血性弧菌TD毒素是一种近期较为常见的食源性致病原，在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物性食物中毒首位，可能是由于人们饮食中海产品的比重上升，而海产品中普遍携带副溶血性弧菌，更由于冷藏条件不完善，导致海产品中副溶血性弧菌增殖及产生毒素，误食后即导致呕吐腹泻等食物中毒症状。
目前我国食品安全研究队伍、设备和经费都十分缺乏，与国外相比，仍具有较大差距，主要表现在检测项目少、质量不稳定，不能满足食品检测工作的要求。严峻的现实向微生物检测提出了更高的要求―更准确、更快速地检出与监测病原菌。
传统上我国食源性疾病的病原检测、鉴定手段仍停留在传统的病原菌培养，此检验法的最大弱点是慢，难以适应诊断与治疗，主要包括两种方法：一是PCR分子鉴定技术检测病原菌，虽然灵敏度高、快速，可直接检测，但对实验室和试剂的要求比较高，否则结果十分不可靠；二是酶联免疫法（ELISA）检测虽是一项比较成熟的免疫分析技术，但该法操作比较繁琐，检测时间长，并需在实验室进行，不能满足现场快速检测的需求。因此，目前病原微生物检测方法的落后性在相当大的程度上限制了对引起食源性疾病的病原菌的溯源及鉴定能力。而当发生食物中毒事件时，由于中毒潜伏期短，来势急剧，短时间内可能有多数人发病，发病曲线呈突然上升的趋势，只有在最短时间内掌握食物中毒发生情况，确定中毒原因，才能控制食物中毒的蔓延和事态的扩大，保障人民身体健康。因此，开发应用于现场的快速、灵敏的食品安全检测技术平台是今后食品安全检测的趋势。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金检测卡及其制备方法和应用，采用单表位的副溶血性弧菌TD毒素抗原制备出针对单表位抗体，该抗体作为胶体金检测卡的胶体金垫的组分，具有良好的特异性和灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡，所述检测卡包括试纸条，所述试纸条包括背板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫在背板上按顺序依次固定，所述胶体金垫内含有胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测卡上设置有样本孔，所述样本孔位于样品垫正上方，所述试纸条上还设置有盖膜。
进一步的，所述检测线和质控线平行排列；所述胶体金垫中，胶体金的粒径为10nm；所述硝酸纤维素膜的孔径为6um；所述抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的用量为20ug，检测线包被单表位抗体的用量为25ug；所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫之间设有1-2mm的重叠区；所述样品垫、胶体金垫均为玻璃纤维，吸水垫为纤维素纤维；所述背板为PVC板；所述试纸条尺寸为60mm×3.7mm。
本发明还提供一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡制备方法，包括以下步骤：
副溶血性弧菌培养液裂解及除盐，得到副溶血性弧菌裂解液；
将制得的副溶血性弧菌裂解液，通过弱阴离子交换层析方法制得纯化后的副溶血性弧菌TD毒素抗原；
制备抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
制备胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
组装检测卡。
进一步的，所述副溶血性弧菌TD毒素抗原根据序列wtnrnvkrkpykdvygqsvfttsgtkwl合成的小肽制备而成。
进一步的，TD毒素抗原的单表位抗体的制备方法包括：采用肌肉注射型非乳化水溶性佐剂与合成制备所得TD抗原小肽等体积混合均匀，对家兔免疫接种，取全血，血凝后取血清，进一步采用亲和层析柱进行亲和纯化。
进一步的，组装检测卡的步骤包括：将硝酸纤维素膜贴到背板上，在硝酸纤维素膜膜上用划膜仪以包被羊抗兔二抗和抗副溶血性弧菌TD毒素单表位抗体分别作为C线和T线，胶体金垫上喷涂稀释好的金标抗体，干燥后贴在背板上，然后依次贴上样品垫和吸水纸，使用切条机将组装好的试纸条切条，进一步采用压塑工艺制成产品。
进一步的，胶体金标记抗体制备方法包括：
透析掉多余的盐离子；加入碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，将抗体溶液逐滴地加入到胶体金溶液中，混匀后静置；加入BSA溶液和PEG20000溶液，以封闭金颗粒的表面的残留表位使颗粒聚集，继续静置；离心后取上清液，移入新的离心管中，除去标记过程中未连接的金粒子；将吸取的上清液离心，弃去上清，除去未标记成功的抗体及胶体金粒子，得到胶体金标记抗体。
进一步的，胶体金标记抗体的质量鉴定方法包括：将羊抗兔二抗用PB稀释100倍后以0.6 μl/条在NC膜上点样，包被完全后，再将稀释过的金标抗体溶液滴在二抗位置上，直接与二抗反应作用，观察结果。
进一步的，所述BSA溶液和PEG20000溶液的浓度均为20%。
本发明还提供前述的检测卡在副溶血性弧菌TD毒素检测中的应用。
本发明还提供前述的制备方法在副溶血性弧菌TD毒素检测中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
免疫胶体金层析技术是一种快速、灵敏的食品安全检测方法。其是根据免疫反应原理、利用大孔径微孔滤膜为载体、以胶体金作为固相标记物，来定性、半定量或定量检测样本中待测物质的一种胶体金快速免疫分析技术。其原理是：样品中如果含有抗原，其首先在加样垫下与胶体金颗粒标记的抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在检测板的硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一单表位抗体。当样品处理液层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的红线。无此红线则表示样品中无抗原存在，方便快捷。
通过本发明的实施，开发出一种塑封型副溶血性弧菌TD毒素快速免疫检测卡的生产制备技术，推进本领域的技术进步。通过本发明产品的推广，提升了人民群众对食源性病原在日常生活中存留分布的认识，为预防群体性食源性公共卫生事件的发生，促进公共卫生事业的稳定发展提供便捷的监测手段。本发明实施后将提供一个新产品系列，预计扩大销售额300万元以上。
附图说明
图1为检测卡试纸条示意图；
图2为检测卡检测结果示意图；
图3为试制的塑封检测卡；采用多联试纸条塑封，撕开后可开始检测。
图4为副溶血性弧菌TD毒素的强识别抗原表位（aa 63-78）；
实施方式
为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
实施例
一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡，所述检测卡包括试纸条，所述试纸条包括背板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫在背板上按顺序依次固定，所述胶体金垫内含有胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线。所述检测卡上设置有样本孔，所述样本孔位于样品垫正上方，通过撕开盖膜露出加样。所述试纸条上还设置有盖膜，所述盖膜通过冷裱塑封，检测后直接观察。
所述检测线和质控线平行排列；
所述胶体金垫中，胶体金的粒径为10nm 。
所述硝酸纤维素膜的孔径为6um。
所述抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的用量为20ug，检测线包被单表位抗体的用量为25ug；
所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫之间设有1-2mm的重叠区。
所述样品垫、胶体金垫均为玻璃纤维，吸水垫为纤维素纤维。
所述背板为PVC板；
所述试纸条尺寸为60mm×3.7mm。
所述样本孔为矩形孔，且样本孔横截面面积从上到下呈线性依次递减。
所述胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体针对的副溶血性弧菌TD毒素的一个识别性强的特定抗原表位（序列：WTNRNVKRKPYKDV
YGQSVFTTSGTKWL），其为特征性的Emini表位。
本发明还提供一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金检测卡的制备方法，包括如下步骤：
1）副溶血性弧菌培养液裂解及除盐，得到副溶血性弧菌裂解液；
2）将步骤1）制得的副溶血性弧菌裂解液，通过弱阴离子交换层析方法制得纯化后的副溶血性弧菌TD毒素抗原；
3）抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的制备；
4）胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的制备；
5）检测卡的组装。直接冷裱塑封成型，非常方便制作。
实施例
一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金检测卡的制备方法，包括如下步骤：
1）副溶血性弧菌培养液裂解及除盐，得到副溶血性弧菌裂解液；
2）将步骤1）制得的副溶血性弧菌裂解液，通过弱阴离子交换层析方法制得纯化后的副溶血性弧菌TD毒素抗原；
3）抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的制备；
4）胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的制备；
5）检测卡的组装。直接冷裱塑封成型，非常方便制作。
实施例
一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金检测卡的制备方法，包括如下步骤：
1）副溶血性弧菌TD毒素单表位抗原合成
根据设计的单表位序列：WTNRNVKRKPYKDVYGQSVFTTSGTKWL合成小肽。
2） TD毒素的单表位抗体制备及纯化
采用肌肉注射型非乳化水溶性佐剂与合成制备所得TD抗原小肽等体积混合均匀，对家兔免疫接种，只需9天和7天的两次免疫期，即可获得较高抗体效价。取全血后，血凝后取血清，进一步采用亲和层析柱进行亲和纯化。
通过上述整套工艺，纯化后的抗体纯度超过97％，且具有稳定效价（1：50000以上）。周期短，产量高。
3）胶体金标记抗体制备
（1）蛋白处理：胶体金标记蛋白前需要彻底去除多余的盐，将抗体置于透析袋中，用PB缓冲液在4℃条件下透析过夜，将多余的盐离子透析掉。从透析袋中取出抗体，4℃下以10000 r/min速度离心5 min，除去多余的抗体聚合物，取上清液和胶体金连接进行标记。
（2）加入适量的碳酸钾溶液调节胶体金溶液至最适pH值，将抗体溶液逐滴地加入到胶体金溶液中，快速混匀，将混合后的溶液置于4℃条件下静置１小时
（3）加入浓度为20%的BSA溶液和20%的PEG20000溶液，以封闭金颗粒的表面的残留表位使颗粒聚集，继续静置30 min；
（4）在4℃条件下，以2000 r/min速度离心15 min，吸取1 ml上清液，移入新的离心管中，除去标记过程中未连接的金粒子；
（5）将吸取的上清液在4℃下以10000 r/min速度离心30 min，弃去上清，除去未标记成功的抗体及胶体金粒子；
（6）制备好的金标抗体使用时，用金标工作液重悬到一定的浓度，4℃条件下保存备用。
（7）胶体金标记抗体的质量鉴定：将羊抗兔二抗用PB稀释100倍后以0.6 μl/条在NC膜上点样，包被完全后，再将稀释过的金标抗体溶液滴在二抗位置上，直接与二抗反应作用，观察结果。
4）组装检测卡
根据优化的检测参数，按比例混合胶体金标记抗体，保证各标记抗体的终浓度为最优检测浓度。胶体金免疫层析试纸条由硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水纸、背板四部分组成。将硝酸纤维素膜贴到PVC背板上，在NC膜上用划膜仪以1 μl/cm包被羊抗兔二抗和抗副溶血性弧菌TD毒素单表位抗体分别作为C线和T线，金标垫采用SB08玻璃纤维素膜喷涂稀释好的金标抗体，干燥后贴在PVC背板上，然后依次贴上样品垫(SB06玻璃纤维素膜)和吸水纸，使用切条机将组装好的试纸条切成60mm×3.7mm的成条，进一步采用压塑工艺制成产品，低温干燥保存。
实施例
采用上述方法，试制了一批产品并进行了样品测试，如图3所示。
从水产品市场上搜集了冷冻海鱼、冰鲜海鱼、活淡水鱼、死淡水鱼各10个样本。分别取1克鱼肉，加2ml去离子水研磨，沉淀5分钟后吸取上清液，加5滴到4ml去离子水中作为待检液。吸取待检液滴加4滴到检测卡样品垫处，反应5分钟左右观测结果。结果测得冷冻海鱼、冰鲜海鱼、活淡水鱼、死淡水鱼的阳性数（率）分别为1（10%）、2（20%）、0（0%）、0（0%），与国标方法检测结果符合率均为100%。
副溶血性弧菌TD毒素单表位抗体相比传统单抗在特异性方面相似，其优势有制备时间短、细菌突变体包容性好、成本低等，是对难检靶标很好的补充。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡，所述检测卡包括试纸条，其特征在于，所述试纸条包括背板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫在背板上按顺序依次固定，所述胶体金垫内含有胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测卡上设置有样本孔，所述样本孔位于样品垫正上方，所述试纸条上还设置有盖膜；检测线和质控线分别包被抗副溶血性弧菌TD毒素另一单表位抗体和羊抗兔二抗；抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体的用量为20ug，检测线包被的另一单表位抗体的用量为25ug；
副溶血性弧菌培养液裂解及除盐，得到副溶血性弧菌裂解液；
将制得的副溶血性弧菌裂解液，通过弱阴离子交换层析方法制得纯化后的副溶血性弧菌TD毒素抗原；
制备抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
制备胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
组装检测卡；
所述副溶血性弧菌TD毒素抗原根据序列wtnrnvkrkpykdvygqsvfttsgtkwl合成的小肽制备而成。
2.根据权利要求1所述的检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡，其特征在于，所述检测线和质控线平行排列；所述胶体金垫中，胶体金的粒径为10nm；所述硝酸纤维素膜的孔径为6um；所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫之间设有1-2mm的重叠区；所述样品垫、胶体金垫均为玻璃纤维，吸水垫为纤维素纤维；所述背板为PVC板；所述试纸条尺寸为60mm×3.7mm；所述样本孔为矩形孔，且样本孔横截面面积从上到下呈线性依次递减。
3.一种检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
副溶血性弧菌培养液裂解及除盐，得到副溶血性弧菌裂解液；
将制得的副溶血性弧菌裂解液，通过弱阴离子交换层析方法制得纯化后的副溶血性弧菌TD毒素抗原；
制备抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
制备胶体金标记抗副溶血性弧菌TD毒素抗原的单表位抗体；
组装检测卡；
所述副溶血性弧菌TD毒素抗原根据序列wtnrnvkrkpykdvygqsvfttsgtkwl合成的小肽制备而成；
TD毒素抗原的单表位抗体的制备方法包括：采用肌肉注射型非乳化水溶性佐剂与合成制备所得TD抗原小肽等体积混合均匀，对家兔免疫接种，取全血，血凝后取血清，进一步采用亲和层析柱进行亲和纯化；
胶体金标记抗体制备方法包括：
透析掉多余的盐离子；加入碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，将抗体溶液逐滴地加入到胶体金溶液中，混匀后静置；加入BSA溶液和PEG20000溶液，以封闭金颗粒的表面的残留表位使颗粒聚集，继续静置；离心后取上清液，移入新的离心管中，除去标记过程中未连接的金粒子；将吸取的上清液离心，弃去上清，除去未标记成功的抗体及胶体金粒子，得到胶体金标记抗体。
4.根据权利要求3所述的检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡制备方法，其特征在于，组装检测卡的步骤包括：将硝酸纤维素膜贴到背板上，在硝酸纤维素膜膜上用划膜仪以包被羊抗兔二抗和抗副溶血性弧菌TD毒素单表位抗体分别作为C线和T线，胶体金垫上喷涂稀释好的金标抗体，干燥后贴在背板上，然后依次贴上样品垫和吸水纸，使用切条机将组装好的试纸条切条，进一步采用压塑工艺制成产品。
5. 根据权利要求3所述的检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡制备方法，其特征在于，胶体金标记抗体的质量鉴定方法包括：将羊抗兔二抗用PB稀释100倍后以0.6 μl/条在NC膜上点样，包被完全后，再将稀释过的金标抗体溶液滴在二抗位置上，直接与二抗反应作用，观察结果。
6.根据权利要求3所述的检测副溶血性弧菌TD毒素的胶体金塑封检测卡制备方法，其特征在于，所述BSA溶液和PEG20000溶液的浓度均为20%。
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