CN107894510A - 定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents

定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法 Download PDF

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刘卫晓
李亮
金芜军
宛煜嵩
黄卫红
苗朝华
高进
董美
王迪
胡晓颖
安娜
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Abstract

本发明公开了定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，从而具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

Description

定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒 及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在营养生长期分泌具有高抗虫活性的可溶蛋白(Vegetative InsecticidalProteins,Vip proteins)。在接种15个小时至产孢期，菌液上清均可检测到Vip3蛋白的表达。抗虫蛋白Vip3对鳞翅类(Lepidoptera)昆虫有广泛毒性，当昆虫取食Vip3蛋白后，该蛋白经中肠蛋白酶活化，活化的蛋白穿透围食膜，与中肠细胞的上皮细胞顶膜特异蛋白结合并形成肠穿孔，从而破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，最终导致死亡。因此Vip3基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最具有潜力和应用前景的抗虫基因。其中Vip3Aa基因已成功的被用于转基因棉花和玉米。
但是在转基因作物的飞速发展在带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题，越来越多的国家要求对转基因产品进行检测以实行标识制度。
目前在检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒方面，美国envirologix只有定性检测试剂盒，国内外尚未有定量检测试剂盒的报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。
为实现上述目的，本发明提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白 Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。
其中，样品处理液的配方为：
生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的Vip3Aa20 1F9-1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；
标准品：2ng的His-Vip3Aa20重组蛋白(冻干粉)，所述His-Vip3Aa20 重组蛋白是通过将Vip3Aa20编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与 pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-vip3Aa20转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Vip3Aa20表达菌株复苏培养，用IPTG 于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到；
辣根过氧化物酶标记的亲和素：1:40辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)标记的亲和素(avidin)母溶液(金开瑞公司)，工作液以1:100 倍稀释；
生物素标记的抗体稀释液/辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方：
浓缩洗涤液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；
底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；
终止液：1M H2SO4。
所述试剂盒的特性：
1)灵敏度为：10.242pg/mL
2)精密度：批内差CV％<8％，批间差CV％<10％
3)特异性：本试剂盒特异性检测vip3A，且与其他相关蛋白无交叉反应。
上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述的捕获抗体由保藏号为 CGMCCNo.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7分泌得到的，
上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，捕获抗体检测范围： 0.03125ng/mL-2ng/mL。
上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述检测抗体由保藏号为 CGMCCNo.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5分泌得到。
所述的杂交瘤细胞株2G3-1D7和1F9-1F5是用原核表达的重组蛋白 Vip3Aa20免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。
本发明还提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)将上述样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟；
2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干后加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，混匀在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度OD值；
3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。
上述检测方法在另一种实施方式中，生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体液用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。
浓缩洗涤液：洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶；洗液工作液：将浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取 240mL去离子水，倒入浓烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。
上述检测方法在另一种实施方式中，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。
上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本80-120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5-2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2-4次，每次浸泡 1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液 80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液 80-100μL，37℃避光显色15-30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。
上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL。
上述检测方法在另一种实施方式中，所述检测方法为ELISA双抗体夹心方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明试剂盒是一种基于ELISA双抗体夹心方法的检测试剂盒，成本低，主要试剂均以工作液形式提供，操作简便，能同时快速检测大批样品；具有高灵敏度、高特异性的特点；也是目前国内乃至国际首个能定量特异检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20 的试剂盒。
保藏信息
本发明提供的杂交瘤细胞株1F9-1F5(即保藏证明上所体现的：生物材料 (株)：PA1-1611048/1F9-1F5，分类命名：“Vip3单克隆抗体杂交瘤细胞株”) 已于2017年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.14725；
杂交瘤细胞株2G3-1D7(即保藏证明上所体现的：生物材料(株)： PA1-1611048/2G3-1D7，分类命名：“Vip3单抗杂交瘤细胞株”)，已于2017 年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.14733。
附图说明
图1是根据本发明的酶联免疫检测方法标准曲线建立。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1本申请的酶联免疫试剂盒定量检测转基因玉米中抗虫蛋白 Vip3Aa20
标准品从10ng稀释成系列浓度标准品，按照本申请所述的检测方法在每孔中加入标准品进行温育，然后弃去液体，加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值做标准曲线，详见附图1，标准曲线的R2>0.99，线性检测范围31.25pg/mL-1ng/mL，推出样品浓度计算公式：x＝(y-0.0013)/0.002。
取转基因玉米MIR162种子标准品(AOCS 1208-A,USA)100mg，经液氮研磨，与样本提取液充分混均，冰上静止30min后取上清，800和1600倍稀释后，按照本专利所述的检测方法在每孔中加入标准品进行温育，然后弃去液体，加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5 分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值，计算出转基因玉米MIR162种子标准品中，Vip3Aa20的含量x＝12.90±0.35μg/g。
操作要点
1、为保证检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。
2、如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，最后计算时再乘以相应的稀释倍数。
3、加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。一次加样时间最好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。
5、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
(1)手工洗板方法：吸去(不可触及孔壁和孔底)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液按200μL/孔注入孔内，浸泡2分钟。根据操作步骤中所述，重复此过程数次。
(2)自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
6、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔10分钟)。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
7、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；
其中，样品处理液的配方为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA20uL，50％甘油 2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；
生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Vip3Aa20 1F9-1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；
标准品为2ng的His-Vip3Aa20重组蛋白；
辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；
生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN3 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；
浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；
底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；
终止液为1M H2SO4。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCC No.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7分泌得到的。
3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，捕获抗体的检测范围0.03125ng/mL-2ng/mL。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由保藏号为CGMCC No.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5分泌得到。
5.一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟；
2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干后加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，混匀在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度OD值；
3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体液用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本80-120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5-2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2-4次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液80-100μL，37℃避光显色15-30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为ELISA双抗体夹心方法。
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