WO1993017042A1 - Moyens pour le controle de produits renfermant des proteines laitieres - Google Patents

Moyens pour le controle de produits renfermant des proteines laitieres Download PDF

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WO1993017042A1
WO1993017042A1 PCT/FR1993/000200 FR9300200W WO9317042A1 WO 1993017042 A1 WO1993017042 A1 WO 1993017042A1 FR 9300200 W FR9300200 W FR 9300200W WO 9317042 A1 WO9317042 A1 WO 9317042A1
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antibodies
milk
bovine
peptide
fragment
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PCT/FR1993/000200
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Marie-Paule Roland
Lotfi Bitri
Jacques Lafont
Pierre BESANÇON
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Universite Montpellier Ii - Sciences Et Techniques Du Languedoc
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the invention relates to means for the control of products containing milk proteins.
  • milk proteins is meant, in the description and the claims, both milk proteins, as milk protein fractions or milk protein derivatives, whatever their nature and origin; or the derived peptides. These are natural proteins, or proteins obtained by synthesis, or alternatively recombinant proteins as prepared according to the techniques of genetic engineering.
  • the invention relates, in particular, to the detection of adulterations or mixtures of dairy products originating from a given animal species with milk or milk components of other species.
  • dairy products from separation technologies may be authorized.
  • These additives until now exclusively obtained from cow's milk, are purified proteins: caseinates, whey proteins. Their use therefore constitutes another possible type of adulteration.
  • thermocoagulable serum proteins which are no longer detected if the starting milk has undergone heat treatment.
  • bovine species The choice of markers characteristic of a species to be looked for, in this case the bovine species, is the main problem to be solved given the short phylogenetic distance between the three polygastric species considered (bovine, ovine, caprine).
  • the invention therefore aims to provide peptides having immunogenic properties, capable of leading to immunsera and antibodies usable as markers of milk proteins of a given species.
  • the invention further aims to provide an immunological method for qualitative detection and quantitative evaluation of adulterations or interspecific mixtures in products containing dairy proteins, this method making it possible to solve the problems posed hitherto, in particular those resulting from proteolysis and heat treatments, while maintaining the sensitivity thresholds and the speed of implementation.
  • the peptides according to the invention are characterized in that they are capable of forming polyclonal antibodies capable of specifically recognizing, by giving rise to a reaction of the antigen-antibody type, a milk protein of a given species which can be present in a mixture containing dairy proteins of different species.
  • the expression “specifically” means that the antibodies form a complex with the milk protein in question, using the ELISA method described in the examples. In addition, they do not significantly cross-react with peptide sequences from dairy proteins from other species.
  • the amino acid sequence of the peptides is formed by a fragment of the milk protein recognized by polyclonal antibodies.
  • This fragment corresponds more specifically to a region of the primary sequence of the milk protein of a given species where the number of different amino acids is large compared to the corresponding region in the primary sequences of this same protein in other species. . It is in particular a fragment of approximately 5 to 20 amino acids.
  • preferred peptides of the invention consist of fragments of such proteins.
  • These peptides advantageously correspond to a fragment of bovine casein kappa or of caseinomacropeptide or of bovine casein ⁇ si. As a variant, these are fragments of ⁇ casein.
  • the invention also relates to the above peptides in which one or more amino acids of their sequences are different, substituted, or deleted, with respect to the corresponding fragment of the milk protein, provided that these alterations do not affect recognition specific with antibodies as defined above.
  • the peptides of the invention are easily obtained according to conventional techniques of solid phase peptide synthesis such as those described by Hanin V. Thesis University ofvier II, 1990.
  • the peptide chain is constructed on a support, in particular a resin of the type acrylic resins.
  • the presence of amide bonds in the composition of these polyacrylic resins makes them relatively close to a protein structure.
  • We can then make the resin play the role of the carrier protein by directly using the resin-peptide complex as an immunogen, knowing that the peptides alone are too short to elicit an appreciable immune response.
  • This methodology has the advantage of leading to a more homogeneous configuration of the peptide-resin complex compared to that of a peptide-carrier protein complex.
  • the invention also relates, as new products, to the immune sera containing antibodies capable of specifically recognizing a milk protein of a given species in a mixture containing it and the antibodies per se.
  • polyclonal immunosera and antibodies are advantageously as obtained, in a conventional manner, by immunization of animals with a peptide as defined above.
  • a peptide-support complex in particular peptide-resin is administered to the animal, intradermally, in an amount of approximately 0.3 to 1 mg of peptide, in emulsion in an adjuvant capable of stimulating the maximum immune response, such as Freund's complete or incomplete adjuvant.
  • an adjuvant capable of stimulating the maximum immune response, such as Freund's complete or incomplete adjuvant.
  • the injection is repeated several times, at time intervals, generally from 15 days to 1 month.
  • the peptide used as an immunogenic agent advantageously corresponds to a peptide fragment selected from the milk protein with which an immunological recognition is sought.
  • the immune sera are obtained from blood samples taken from the immunized animals, after elimination of the red cells by coagulation and centrifugation. They are stored under the usual conditions, for example in frozen or lyophilized form.
  • the estimation of the level of specific antibodies, present in the total sera collected throughout the immunization program, is carried out for example by means of an immunometric technique called "by antibody capture", using the resin-peptide complex as antigen.
  • the appearance of antibodies is relatively rapid from the first injection and their production increases during the immunization program until reaching a maximum beyond which it decreases. He has. It has therefore been possible to verify that the rabbit, for example, produces antibodies from a synthetic peptide sequence whose size is less than or equal to fifteen amino acid residues.
  • the immune sera and antibodies of the invention are further characterized in that they give rise to a reaction of the antigen-antibody type both with a peptide as defined above, and with the mother protein containing the same sequence, but which has a more complex structure with folds in the space of the polypeptide chain, which can make the epitopes concerned inaccessible for antibodies.
  • the anti-peptide antibodies and antibodies of the invention compared with the total caseins as well as with the various individual caseins constituting bovine (respectively ⁇ and kappa caseins) recognize their epitopes in each case.
  • the invention relates in particular to anti-bis casein anti- ⁇ si antibodies and antibodies and bovine anti-casein-macropeptide antibodies and antibodies.
  • Polyclonal antibodies are recovered from the sera according to conventional techniques. They can be purified for example by affinity chromatography.
  • Monoclonal antibodies as obtained by operating according to the technique of Kohler and Milstein in Nature, vol 256, p. 495., 1975, are also part of the invention.
  • the immunological studies carried out with the immune sera and antibodies of the invention demonstrate their monospecificity vis-à-vis a dairy protein of a given species. They also show, as illustrated in the examples, that their immunoreactivity is not affected by heat treatment or partial hydrolysis of the antigens.
  • the invention therefore also relates to the application of these immune sera and antibodies as bioreagents for the in vitro detection of a given milk protein in a product to be checked.
  • the antibodies are free. Alternatively, they are fixed on an immunologically inert support.
  • the method of controlling the presence of proteins of dairy in a product is characterized by - contacting the test material with a preparation of antisera or antibodies as defined above, immobilized on a solid carrier, suitable conditions for the production of a complex of antigen-antibody type with milk protein, followed by
  • a second antibody coupled to a group the activity of which can be measured such as an enzyme, such as alkaline phosphatase, peroxidase or ⁇ -galactosidase, or a fluorescent, luminescent or even radioactive group.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase or ⁇ -galactosidase, or a fluorescent, luminescent or even radioactive group.
  • This detection method makes it possible to reveal with high sensitivity, up to 0.1% (volume / volume) a dairy protein of a given animal species in a sample to be checked.
  • the degree of sensitivity depends, however, on the adjustment of the parameters of the assay (in particular the dilution of the immune serum, the quantity of target protein sensitizing the support, the preparation of the samples to be assayed), as well as the performance of the immune serum.
  • the parameters of the assay in particular the dilution of the immune serum, the quantity of target protein sensitizing the support, the preparation of the samples to be assayed
  • the performance of the immune serum will be obtained from one animal to another.
  • the immune serum produced will have a greater or lesser affinity for its respective epitopes.
  • the best sensitivity will be reached by using immune sera selected for their affinity, as well as by determining, for each of them, according to the current techniques available to those skilled in the art, the adequate dilution of use and the amount of antigen to be used to sensitize the support.
  • the sample to be analyzed comes from a product containing dairy proteins. It is in particular on the one hand food products, on the other hand cosmetic products and preparations containing milk proteins. Among the food products, a distinction will be made between dairy products and derivatives of milk, and in particular cheeses, as well as cold meats, confectionery such as nougat or nougat, or cookies or other pastries.
  • dairy products are first subjected to a delipidation step, followed by precipitation of the caseins and adjustment of the pH to approximately 7.4.
  • the lipids are advantageously removed by centrifugation in the case of milk and by extraction using organic solvents for the cheeses.
  • the invention also relates to a kit for the in vitro detection of the presence of a dairy protein of a given animal species in a product containing dairy proteins.
  • a suitable solid phase serving as a support for the assay such as a micro-titration plate, advantageously sensitized beforehand with the antigen of the immuniserum supplied in the kit,
  • this presentation also includes milk mixtures used for calibration.
  • the support phase used to carry out the assay use is made of a concentration of the immunological marker (purified protein or synthetic peptide) allowing the best sensitivity of the assay to be obtained.
  • the preparation of specific sera or antibodies to the milk protein to be sought is dosed. It is in lyophilized form or in liquid form, at use dilution.
  • it is stabilized by adding, for example, bactericidal agents.
  • FIG. 1 to 3 calibration curves for cheeses and sheep milk adulterated with cow's milk under different conditions.
  • FIG. 4 a calibration curve for powdered cow's milk supplemented with atomized cow rennet whey
  • FIG. 5 a calibration curve for the detection of cow rennet whey in apertized pies
  • FIG. 6 the immunoreactivity of an immuniser of the invention with different dairy proteins.
  • the solid support is a polyacrylic resin constituted by a copolymer of N-acryloylpyrrolidine and of N-acryloyl- ⁇ -alanine crosslinked with ethylene bis acrylamide.
  • a polyacrylic resin constituted by a copolymer of N-acryloylpyrrolidine and of N-acryloyl- ⁇ -alanine crosslinked with ethylene bis acrylamide.
  • the syntheses were carried out from the resin to which the Fmoc derivatives (fluorene-methoxy carbonyl) of the amino acids corresponding to the C-terminal part of the peptide chain to be synthesized are covalently attached.
  • the peptide chain is then extended towards its Nerminal end by successive coupling of the Fmoc derivatives of the different amino acids to be added and the activation of these by HoBt (1-hydroxybenzotriazole) on the carbonyl function.
  • the Fmoc group protects the amino function of amino acids; the side chains are also protected. The protections are as follows:
  • Fmoc derivatives of the protected amino acids as well as the reagents necessary for the various stages of the synthesis (rinses, deprotection reagents, etc.) are also commercially available, for example from the company Millipore.
  • the peptide syntheses were performed in continuous flow on a Milligen Pepsynthesizer model 9050 automatic device, sold for example by the company Millipore.
  • Each step of the synthesis is controlled, because an output photometer makes it possible to check both the coupling reaction and the deprotection reaction since both the Fmoc derivatives and the piperidyl dibenzofulvene, produced during the deprotection of the Fmoc derivatives, have intense absorption in the UV. The device then stops working if the coupling is incomplete. Thus, monitoring the protocol by those skilled in the art makes it possible to guarantee the predetermined peptide sequence.
  • the various protective functions of the amino acids are cleaved by treatment with TFA (trifluoroacetic acid) 95% / millipore water 5 '%, then the peptide-resin is collected, dried for 5 minutes under nitrogen, 30 minutes under vacuum with the water pump, then about 14 hours vacuum evacuated with the vane pump.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the coupling yield as well as the amino acid composition of the preparations are controlled by HPLC analysis after hydrolysis of resin-peptides 48 hours at 110 ⁇ C in HC1 6N.
  • the coupling yields obtained are, for example:
  • the resin-peptide complex at 2 mg of peptide / ml in a 0.9% NaCl solution is emulsified volume by volume in an oily adjuvant type complete or incomplete adjuvant of Freund. 0.3 to 1 mg of peptide are thus injected intradermally at multiple points in a rabbit.
  • the injection is repeated several times at intervals of 15 days to 1 month.
  • Blood samples are taken about ten days after the injection.
  • the blood is centrifuged to remove the red cells, then the serum is collected.
  • a second centrifugation makes it possible to recover a pellet rich in caseins and a serum phase.
  • the pellet is dissolved by adding 2N NaOH, diluted in PBS containing 0.05% of T een '20, then brought to a pH of 7.4.
  • the whey is neutralized in the same way by adding 2N NaOH up to pH 7.4. Increasing dilutions of each sample (caseins, whey) are then made in PBS-T een.
  • CHEESE 10 g of cheese are homogenized in 25 ml of distilled water. The extraction of the lipids is carried out by successive mixtures and decantations of this homogenate in an organic phase (for example chloroform-methanol).
  • organic phase for example chloroform-methanol
  • the aqueous phase is collected and the traces of organic solvents are evaporated under vacuum.
  • the cheese extract thus defatted is processed and analyzed under the same conditions as milk.
  • a support for example the wells of a microtitration plate, capable of noncovalently binding the proteins, is sensitized with the purified antigen, therefore the target protein to be sought in the product to be assayed ( ⁇ si casein, kappa casein or bovine caseinomacropeptide or corresponding synthetic peptide).
  • the sample to be assayed is then incubated on this support in the presence of a precise quantity of specific antibodies. During this incubation, there is competition for the antibodies between the target proteins adsorbed on the support and those free in the medium.
  • the antibodies fixed by the bound target protein are revealed by anti-rabbit IgG antibodies coupled to an enzyme (for example alkaline phosphatase, peroxidase or ⁇ -galactosidase), then quantified by measuring the absorbance of the colored product of the reaction of the enzyme on its substrate.
  • an enzyme for example alkaline phosphatase, peroxidase or ⁇ -galactosidase
  • the level of antigen ( ⁇ si casein, kappa casein or caseinomacropeptide) possibly present in the sample to be analyzed is quantified by its capacity to inhibit the binding of antibodies to the antigen adsorbed on the solid phase.
  • Example 5 Assays Using Immunosera According to Example 2
  • a microtiter plate for example NUNC R Maxisorb Type II is sensitized by incubation for 12 hours at 37 ° C. of a protein solution of bovine ⁇ casein on the one hand or of kappa casein (or of caseinomacropeptide or of synthetic peptide ) bovine on the other hand, these proteins being purified and used at a concentration of approximately 0.2 ⁇ g / l.
  • the purified bovine o and kappa caseins are obtained by fractionation of the total bovine acid caseins after anion exchange chromatography on DEAE-Trysacryl R.
  • the bovine caseinomacropeptide is extracted from cow rennet whey, for example by exclusion chromatography.
  • the plate is then washed in PBS-Tween and the potential non-specific protein binding sites are blocked by incubation for one hour at 37 ° C. in a saturation solution of 0.5% gelatin and 3% gelatin hydrolysates. (marketed by the company SIGMA) in PBS-Tween.
  • Tween the dilutions of the sample to be assayed, prepared as indicated in Example 3, as well as the specific immune serum diluted in PBS-Tween are introduced into the volume to volume well. The plate is then incubated, either for a few hours at 37 ° C, or overnight at 4 ° C with shaking.
  • This third incubation is followed by washing the plate in PBS-Tween, then a 2 h incubation at 37 ⁇ C, in the presence of anti-rabbit IgG antibodies labeled with an enzyme (alkaline phosphatase or peroxidase or another enzyme whose product is a chromogen), diluted in PBS-Tween.
  • an enzyme alkaline phosphatase or peroxidase or another enzyme whose product is a chromogen
  • the plate is then washed one last time, then the substrate of the enzyme used is introduced (for example para-nitrophenyl phosphate in the case of alkaline phosphatase, ortho-phenylene diamine or the like for peroxidase).
  • the substrate of the enzyme used for example para-nitrophenyl phosphate in the case of alkaline phosphatase, ortho-phenylene diamine or the like for peroxidase.
  • Incubation is carried out under optimal conditions for the catalytic activity of the enzyme used (pH, time, temperature, illumination, etc.).
  • the signal is measured by reading the optical density of each well using a microplate reader, at the wavelength of specific absorption of the product of the enzymatic reaction.
  • control tests are carried out on the same plate using samples containing, for example 0.5; 1; 2.5; 10% cow's milk.
  • Figures 1 to 3 show the calibration curves for adulterated dairy products.
  • the percentage of adulteration is indicated as a function of the total protein concentration in ⁇ g / ml.
  • Figure 1 gives the calibration curve for blue-veined cheeses (roquefort type) made from sheep's milk adulterated with raw cow's milk, up to 3 months of ripening.
  • the measurements made after 15 days are represented by the symbols (0), after 1 month by (es), and 3 months by (; ??), the average being represented by (* &).
  • Figure 2 gives the calibration curve for the same product, but adulterated with sterilized cow's milk.
  • Figure 4 shows the calibration curve for powdered cow's milk supplemented with atomized cow rennet whey.
  • the percentage of fraud is indicated on the abscissa and the concentration of total protein ( ⁇ g / ml) on the ordinate.
  • Curve (t ⁇ ) corresponds to range A, i.e. standards prepared from atomized skimmed cow's milk and atomized cow rennet sweet whey, and curve (O) to range B , that is to say to standards prepared from atomized skimmed cow milk and atomized cow rennet whey heat treated for 1 h at 110 ° C.
  • the use of the immune sera of the invention makes it possible to detect the cow rennet whey present in charcuterie type pâté, apertized.
  • liver pâté 10 g of liver pâté are diluted in 40 ml of PBS containing 0.05% of Tween 20, homogenized using an ultraturrax, then kept stirring overnight at 25 ° C.
  • the soluble extract is collected by centrifugation (20 min; 5000 g; 10 ° C) and then defatted by extraction of the fats with chloroform.
  • immunoreactivity of this immune serum is as good with native proteins which contain the peptide fragment ( ⁇ casein or mixture of caseins) as with the synthetic peptide of the invention.
  • the anti- ⁇ si cow casein immune serum allows the detection of the addition of cow's milk or caseinates to sheep's milk.
  • the anti-kappa cow casein immune serum allows the detection of the addition of milk, caseinates or cow whey (obtained by rennet coagulation of cow milk) to sheep or goat milk.
  • the antibodies produced are specific to the 139-152 fragment of kappa casein located on the bovine caseinomacropeptide. This, during the coagulation of caseins by rennet, is excised at the 106-107 bond of kappa casein and is therefore soluble in the serum phase.
  • the as ⁇ -casein, kappa casein or caseinomacropeptide markers chosen for the bovine species are thermostable; their antigenicity is therefore not. affected, regardless of the heat treatment that the dairy product added to the sample underwent whose purity is to be checked.
  • cow rennet milk or whey rennet heated 60 min. at 100 ° C is recognized in the same way as if it were believed.
  • the haptens chosen contain at least 5, preferably at least 10 amino acid residues, several continuous epitopes must be recognized on the target protein by the polyclonal antibodies produced.
  • a total disappearance of the immunoreactivity can therefore only be envisaged in the hypothesis of a total enzymatic hydrolysis, which cannot occur, for example during the ripening phase of the cheeses, even if we are addressing very refined cheeses.
  • the invention therefore provides the means of detecting with great precision and high specificity fraud in dairy products or products containing them, such as food products or cosmetic preparations. It is thus possible to highlight adulterations resulting from the addition of milk proteins of a species different from that (s) to be used (s) to comply with manufacturing standards. One can also detect the use for example of whey hydrolysates used in these products to increase the volume, the water retention capacity or as a substitute for more expensive milk proteins. List of sequences

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Abstract

L'invention se rapporte à des peptides capables de former des anticorps susceptibles de réagir spécifiquement avec une protéine laitière d'une espèce donnée. Ces anticorps et les immunsérums les renfermant permettent de contrôler la présence d'une telle protéine laitière dans des produits par exemple alimentaires ou cosmétiques.

Description

MOYENS POUR LE CONTROLE DE PRODUITS RENFERMANT DES PROTEINES LAITIERES
L'invention a pour objet des moyens pour le contrôle de produits renfermant des protéines laitières.
Elle se rapporte plus spécialement à des peptides immunogènes et aux anticorps formés contre ces peptides ainsi qu'à l'utilisation de ces anticorps dans une méthode immunologique de détection de protéines laitières d'une espèce animale donnée dans un produit à contrôler.
Par "protéines laitières", on désigne, dans la description et les revendications, aussi bien les protéines de lait, que des fractions protéiques de lait ou des dérivés protéiques de lait, quelles que soient leur nature et leur origine ; ou les peptides dérivés. Il s'agit de protéines naturelles, ou obtenues par voie de synthèse, ou encore de protéines recombinantes telles que préparées selon les techniques du génie génétique.
L'invention vise, notamment, la détection d'adultérations ou de mélanges de produits laitiers provenant d'une espèce animale donnée avec des laits ou composants laitiers d'autres espèces.
En matière par exemple de fabrication de produits laitiers, dans les pays industrialisés, les usages vernaculaires ont peu à peu été codifiés. Dans le but de garantir au consommateur la conformité du produit, l'un des critères exigés est l'indication de l'espèce animale dont doit provenir le lait utilisé pour 1'élaboration du produit laitier.
Si, en Europe, l'essentiel des productions laitières et fromagères provient de l'espèce bovine, les pays méditerranéens produisent aussi du lait de brebis et du lait de chèvre à des coûts très différents du lait de vache, ce dernier étant par exemple trois à quatre fois moins cher que le lait de brebis. Il en résulte des risques de fraudes par coupage.
On sait que certains mélanges sont autorisés sous certaines conditions en particulier d'étiquetage, par exemple l'addition de lait de vache, ou dérivés, à du lait de chèvre. Il est donc indispensable de pouvoir contrôler le mélange effectué.
Par ailleurs, l'addition de produits laitiers issus de technologies séparatives peut être autorisée. Ces additifs, jusqu'à présent exclusivement issus du lait de vache, sont des protéines purifiées : caséinates, protéines du lactosérum. Leur utilisation constitue donc un autre type d'adultération possible.
Enfin, le marché des produits laitiers évolue :
importations de lait de brebis ou de chèvre ;
mise sur le marché de fromages mixtes (mélanges de vache ou chèvre dans brebis, de vache dans chèvre), certains en provenance de pays dans lesquels les codifications ne sont pas clairement établies.
utilisation de produits laitiers comme ingrédients dans de nombreuses préparations.
La recherche d'adultérations interspécifiques, accidentelles ou frauduleuses, des produits laitiers, ou de manière générale de produits renfermant des protéines laitières, correspond donc à une préoccupation majeure.
De nombreuses méthodes analytiques ont été proposées pour identifier le lait de différentes espèces (en particulier celui de vache, brebis et chèvre) au travers de ses composants et le détecter spécifiquement dans des produits plus ou moins remaniés comme par exemple les fromages, pour lesquels les procédés technologiques de fabrication (tels que pasteurisation, stérilisation, ultrafiltration) et les processus d'affinage amènent un remaniement qualitatif et quantitatif complet du produit.
Actuellement, les méthodes les plus sensibles et les plus rapides de mise en oeuvre font appel aux techniques d'isoélectrofocalisation et aux techniques immunologiques. Cependant, ces techniques présentent toutes des inconvénients :
- sensibilité à la protéolyse dans le cas de
1'isoélectrofocalisation, l'interprétation des éleσtro- phorégrammes devenant compliquée lorsque les protéines ont été protéolysées puisque de nombreuses bandes parasites apparaissent,
présence de faux négatifs dans le cas de 1'isoélectrofocalisation et des techniques immunologiques utilisant comme marqueurs des protéines sériques thermocoagulables, qui ne sont plus détectées si le lait de départ a subi un traitement thermique.
Le choix de marqueurs caractéristiques d'une espèce à rechercher, en l'occurence l'espèce bovine, est le principal problème à résoudre vu la faible distance phylogénétique entre les trois espèces de polygastriques considérées (bovine, ovine, caprine).
Les travaux effectués par les inventeurs dans ce domaine les ont conduits à constater que le choix dans une protéine laitière d'une séquence peptidique particulière permettait de disposer par voie de synthèse de produits se révélant de manière inattendue fortement immunogènes, et capables en conséquence de former des immunsérums monospécifiques vis-à-vis des protéines à rechercher.
L'invention a donc pour but de fournir des peptides possédant des propriétés immunogenes, capables de conduire à des immunsérums et des anticorps utilisables comme marqueurs de protéines laitières d'une espèce donnée.
Elle vise également à fournir un procédé de préparation de ces immunsérums et anticorps.
L'invention vise en outre à fournir une méthode immunologique de détection qualitative et d'évaluation quantitative d'adultérations ou de mélanges interspé- cifiques dans les produits renfermant des protéines laitières, cette méthode permettant de résoudre les problèmes posés jusqu'alors, en particulier ceux résultant de la protéolyse et des traitements thermiques, tout en maintenant les seuils de sensibilité et la rapidité de mise en oeuvre.
Les peptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de former des anticorps polyclonaux susceptibles de reconnaître de manière spécifique, en donnant lieu à une réaction du type antigène-anticorps, une protéine laitière d'une espèce donnée qui peut être présente dans un mélange renfermant des protéines laitières de différentes espèces.
L'expression "de manière spécifique" signifie que les anticorps forment un complexe avec la protéine laitière considérée, en utilisant la méthode ELISA décrite dans les exemples. De plus, ils ne réagissent pas significativement de manière croisée avec des séquences peptidiques de protéines laitières d'autres espèces.
Dans une disposition préférée de l'invention, la séquence en acides aminés des peptides est formée par un fragment de la protéine laitière reconnue par les anticorps polyclonaux. Ce fragment correspond plus spécialement à une région de la séquence primaire de la protéine laitière d'une espèce donnée où le nombre d'acides aminés différents est important par rapport à la région correspondante dans les séquences primaires de cette même protéine dans d'autres espèces. Il s'agit en particulier d'un fragment de 5 à 20 acides aminés environ.
Compte tenu des applications immunologiques envisagées pour la détection de protéines laitières bovines, des peptides préférés de l'invention sont constitués par des fragments de telles protéines.
Ces peptides correspondent avantageusement à un fragment de la kappa caséine bovine ou de caséinomacropeptide ou de l'αsi caséine bovine. En variante, il s'agit de fragments da la β caséine.
L'invention vise également les peptides ci-dessus dans lesquels un ou plusieurs acides aminés de leurs séquences sont différents, substitués, ou délétés, par rapport au fragment correspondant de la protéine laitière, dès lors que ces » altérations n'affectent pas la reconnaissance spécifique avec les anticorps comme défini ci-dessus.
Les peptides de l'invention sont aisément obtenus selon les techniques classiques de synthèse peptidique en phase solide telles que celles décrites par Hanin V. Thèse Université de Montpellier II, 1990. La chaîne peptidique est construite sur un support, en particulier une résine du type des résines acryliques. La présence de liaisons amides dans la composition de ces résines polyacryliques les rend relativement proches d'une structure protéique. On peut alors faire jouer à la résine le rôle de la protéine porteuse en utilisant directement le complexe résine- peptide comme immunogène, sachant que les peptides seuls sont trop courts pour induire une réponse immunitaire appréciable. Cette méthodologie présente l'avantage de conduire à une configuration plus homogène du complexe peptide-résine par rapport à celle d'un complexe peptide- protéine porteuse.
L'invention vise également, en tant que nouveaux produits, les immunsérums contenant des anticorps capables de reconnaître spécifiquement une protéine laitière d'une espèce donnée dans un mélange la renfermant et les anticorps per se.
Les immunsérums et anticorps polyclonaux sont avantageusement tels qu'obtenus, de manière classique, par immunisation d'animaux avec un peptide tel que défini ci- dessus.
En suivant les méthodes usuelles, on administre un complexe peptide-support, notamment peptide-résine à l'animal, par voie intradermique, à raison d'environ 0,3 à 1 mg de peptide, en émulsion dans un adjuvant capable de stimuler au maximum la réponse immunitaire, tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund. L'injection est renouvelée plusieurs fois, à intervalles de temps, généralement de 15 jours à 1 mois.
Le peptide utilisé comme agent immunogène correspond avantageusement à un fragment peptidique sélectionné sur la protéine laitière avec laquelle on recherche une reconnaissance immunologique.
Les immunsérums sont obtenus à partir des prélèvements sanguins, effectués sur les animaux immunisés, après élimination des hématies par coagulation et centrifugation. Ils sont conservés dans les conditions habituelles par exemple sous forme congelée ou lyophilisée. L'estimation du taux d'anticorps spécifiques, présents dans les immunsérums totaux recueillis tout au long du progamme d'immunisation, est réalisée par exemple grâce à une technique immunométrique dite "par capture d'anticorps", en utilisant le complexe résine-peptide comme antigène. L'apparition des anticorps est relativement rapide à partir de la première injection et leur production est croissante au cours du programme d'immunisation jusqu'à atteindre un maximum au-delà duquel elle décroit. Il a. donc été possible de vérifier que le lapin, par exemple, produit des anticorps à partir d'une séquence peptidique de synthèse dont la taille est inférieure ou égale à quinze résidus d'acides aminés.
Les immunsérums et anticorps de l'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils donnent lieu à une réaction du type antigène-anticorps aussi bien avec un peptide tel que défini ci-dessus, qu'avec la protéine mère renfermant la même séquence, mais qui présente une structure plus complexe avec des repliements dans 1'espace de la chaîne polypeptidique, pouvant rendre les épitopes concernés inaccessibles pour les anticorps.
De manière avantageuse, les immunsérums et anticorps anti-peptides de l'invention, confrontés aux caséines totales ainsi qu'aux différentes caséines individuelles constitutives bovines (respectivement α et kappa caséines) reconnaissent leurs épitopes dans chaque cas.
Dans les mêmes conditions, cette reconnaissance n'est pas retrouvée quand les protéines homologues ovines ou caprines sont utilisées.
L'invention vise en particulier des immunsérums et anticorps anti-αsi caséine bovine et des immunsérums et anticorps anti-caséino-macropeptide bovin. Les anticorps polyclonaux sont récupérés à partir des immunsérums selon les techniques classiques. Ils peuvent être purifiés par exemple par chromatographie d'affinité.
Les anticorps monoclonaux tels qu'obtenus en opérant selon la technique de Kôhler et Milstein dans Nature, vol 256, p. 495., 1975, font également partie de l'invention.
Celle-ci vise également tout fragment de ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux dès .lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec des épitopes de la protéine laitière à détecter.
Les études immunologiques réalisées avec les immunsérums et anticorps de l'invention mettent en évidence leur monospécificité vis-à-vis d'une protéine laitière d'une espèce donnée. Elles montrent .également, comme illustré dans les exemples, que leur immunoréactivité n'est pas affectée par un traitement thermique ou une hydrolyse partielle des antigènes.
L'invention vise donc également l'application de ces immunsérums et anticorps en tant que bioréactifs pour la détection in vitro d'une protéine laitière donnée dans un produit à contrôler.
Dans cette application, les anticorps sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support immunologiquement inerte.
La méthode de contrôle de la présence de protéines' laitières dans un produit est caractérisée par - la mise en contact du produit à contrôler avec une préparation d'immunsérums ou d'anticorps tels que définis ci-dessus, immobilisés sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe du type antigène-anticorps avec la protéine laitière, suivie de
- la mise en évidence de la formation d'un tel complexe.
Pour révéler la réaction immunologique, on utilise avantageusement un deuxième anticorps couplé à un groupement dont 1'activité peut être mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline, la peroxydase ou le β-galactosidase, ou un groupement fluorescent, luminescent ou encore radioactif.
Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité, jusqu'à 0,1 % (volume/volume) une protéine laitière d'une espèce animale donnée dans un échantillon à contrôler.
Le degré de sensibilité dépend toutefois de l'ajustement des paramètres du dosage (notamment de la dilution de l'immunsérum, de la quantité de protéine cible sensibilisant le support, de la préparation des échantillons à doser), ainsi que des performances de l'immunsérum. Ainsi d'un animal à l'autre, l'immunsérum produit aura une plus ou moins grande affinité pour ses épitopes respectifs. La meilleure sensibilité sera atteinte en utilisant des immunsérums sélectionnés pour leur affinité, ainsi qu'en déterminant, pour chacun d'eux, selon les techniques courantes dont dispose l'homme de l'art, la dilution adéquate d'utilisation et la quantité d'antigène à utiliser pour sensibiliser le support.
L'échantillon à analyser provient d'un produit renfermant des protéines laitières. Il s'agit en particulier d'une part de produits alimentaires, d'autre part de produits et préparations cosmétiques renfermant des protéines laitières. Parmi les produits alimentaires, on distinguera les produits laitiers ou dérivés du lait, et notamment les fromages, ainsi que la charcuterie, la confiserie comme le nougat ou les tourons, ou encore les biscuits ou autres pâtisseries.
En vue de leur dosage, les produits laitiers sont au préalable soumis à une étape de délipidation, suivie de précipitation des caséines et d'ajustement du pH à environ 7,4. Les lipides sont avantageusement éliminés par centrifugation dans le cas du lait et par extraction à l'aide de solvants organiques pour les fromages.
L'invention vise également un kit pour la détection in vitro de la présence d'une protéine laitière d'une espèce animale donnée dans un produit renfermant des protéines laitières.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, avantageusement sensibilisée au préalable avec l'antigène de 1'immunsérum fourni dans le kit,
- une préparation d'immunsérums ou d'anticorps selon l'invention comme définis ci-dessus, libres ou immobilisés,
- une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur, des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Le cas échéant, cette présentation comporte en outre des mélanges laitiers servant à l'étalonnage.
Pour la sensibilisation de la phase support utilisée pour réaliser le dosage, on utilise une concentration du marqueur immunologique (protéine purifiée ou peptide de synthèse) permettant d'obtenir la meilleure sensibilité du dosage. La préparation d'immunsérums ou d'anticorps spécifiques de la protéine laitière à rechercher est dosée. Elle se présente sous forme lyophilisée ou sous forme liquide, à la dilution d'utilisation.
Avantageusement, on la stabilise en ajoutant par exemple des agents bactéricides.
On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.
Les figures 1 à 6 auxquelles il est fait référence représentent respectivement :
les figures 1 à 3, des courbes d'étalonnage de fromages et de lait de brebis adultérés avec du lait de vache dans différentes conditions.
- la figure 4, une courbe d'étalonnage de lait de vache en poudre additionné de lactosérum présure de vache atomisé,
la figure 5, une courbe d'étalonnage pour la détection du lactosérum présure de vache dans les pâtés apertisés, et
la figure 6, 1'immunoréactivité d'un immunsérum de 1'invention avec différentes protéines laitières.
Exemple 1 : Peptides synthétiques
Deux types de peptides, synthétisés sur résine polyacrylique, sont donnés en exemple.
* Fragment 139-152 de la kappa caséine bovine (14 résidus d'acides aminés) appelé SEQ ID Nβ 1 dans la liste des séquences :
139 152 Val-Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val— RESINE
* Fragment 140-149 de l'αsi caséine bovine (10 résidus d'acides aminés) ou SEQ ID N° 2
140 149 Gln-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu—RESINE
Le support solide est une résine polyacrylique constituée par un copolymère de N-acryloylpyrrolidine et de N-acryloyl-β-alanine réticulés par l'éthylène bis acrylamide. On utilise par exemple la résine commercialisée sous la marque Expansive ou encore les résines PepSyn K,KA,KB ou KH, telles que commercialisées par la société Millipore S.A.
Les synthèses ont été réalisées à partir de la résine sur laquelle sont fixés de façon covalente les dérivés Fmoc (fluorène-méthoxy carbonyl) des acides aminés correspondant à la partie C-terminale de la chaîne peptidique à synthétiser.
Par exemple :
* Fmoc-Ala-PepSyn-KA pour le peptide synthétique correspondant à la kappa caséine bovine.
* Fmoc-Leu-PepSyn-KA pour le peptide synthétique correspondant à l'αsχ caséine bovine.
La chaîne peptidique est alors allongée vers son extrémité N- erminale par couplage successif des dérivés Fmoc des différents acides aminés à ajouter et l'activation de ceux-ci par le HoBt (1-hydroxybenzotriazole) sur la fonction carbonyle. Le groupement Fmoc protège la fonction aminé des acides aminés ; les chaînes latérales sont également protégées. Les protections sont les suivantes :
Glu > OtBu ; Tyr > tBu ; Ser > tBu ; Asp > OtBu ; Thr > tBu (tBu - Tertiobutyl)
Les dérivés Fmoc des acides aminés protégés ainsi que les réactifs nécessaires aux différentes étapes de la synthèse (rinçages, réactifs de déprotection...) sont également disponibles commercialement par exemple chez la société Millipore.
Les synthèses peptidiques ont été réalisées en flux continu sur un appareil automatique Milligen Pepsynthesizer model 9050, commercialisé par exemple par la société Millipore.
Chaque étape de la synthèse est contrôlée, car un photomètre en sortie permet de vérifier à la fois la réaction de couplage et la réaction de déprotection puisqu'aussi bien les dérivés Fmoc que le pipéridyl dibenzofulvène, produit lors de la déprotection des dérivés Fmoc, ont une intense absorption dans l'UV. L'appareil s'arrête alors de fonctionner si le couplage est incomplet. Ainsi, le suivi du protocole par l'homme de l'art permet de garantir la séquence peptidique prédéterminée.
Une fois la synthèse effectuée, les différentes fonctions protectrices des acides aminés sont clivées par traitement au TFA (acide trifluoroacétique) 95 % / eau millipore 5' %, puis le peptide-résine est recueilli, séché 5 minutes sous azote, 30 minutes sous-vide à la trompe à eau, puis 14 heures environ sous-vide poussé à la pompe à palettes.
Le rendement de couplage ainsi que la composition en acides aminés des préparations sont contrôlés par analyse HPLC après hydrolyse des résine-peptides 48 heures à 110βC dans HC1 6N.
Les rendements de couplage obtenus sont, par exemple :
* Peptide synthétique de kappa caséine bovine :
0,351. 10"3 mole peptide/g de peptide-résine.
* Peptide synthétique de l'αsi caséine bovine : 0,354. 10-3 mole peptide/g de peptide-résine.
Ex.»π. i -=>- ?. : Procédure d'immunisation et préparation des immunsérums
Le complexe résine-peptide à 2 mg de peptide/ml dans une solution de NaCl 0,9% est émulsionné volume à volume dans un adjuvant huileux type adjuvant complet ou incomplet de Freund. 0,3 à 1 mg de peptide sont ainsi injectés par voie intradermique en points multiples à un lapin.
L'injection est renouvelée plusieurs fois à intervalle de temps de 15 jours à 1 mois.
Les prélèvements sanguins sont effectués une dizaine de jours après l'injection. Le sang est centrifugé pour éliminer les hématies, puis le sérum est récolté.
F.y πφi.* 3 : Préparation des échantillons
LAIT r Le lait est dégraissé par centrifugation, puis les caséines sont précipitées par acidification.
Une deuxième centrifugation permet de récupérer un culot riche en caséines et une phase sérique. Le culot est dissous par addition de NaOH 2N, dilué dans du PBS contenant 0,05% de T een' 20, puis amené à un pH de 7,4. Le lactosérum est neutralisé de la même façon par addition de NaOH 2N jusqu'à pH 7,4. Des dilutions croissantes de chaque échantillon (caséines, lactosérum) sont alors réalisées dans du PBS- T een.
FROMAGE : 10 g de fromage sont homogénéisés dans 25ml d'eau distillée. L'extraction des lipides est effectuée par mélanges et décantations successives de cet homogénat dans une phase organique (par exemple chloroforme-méthanol).
La phase aqueuse est collectée et les traces de solvants organiques sont évaporées sous vide. L'extrait de fromage ainsi dégraissé est traité et analysé dans les mêmes conditions que le lait.
Ex iiipl 4 : Méthode de détection de protéines laitières d'une espèce donnée selon la technique ELISA
Le principe du dosage est le suivant :
Un support, par exemple les cupules d'une plaque de microtitration, susceptible de lier de façon non covalente les protéines, est sensibilisé avec l'antigène purifié, donc la protéine cible à rechercher dans le produit à doser (αsi caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide bovin ou peptide synthétique correspondant). L'échantillon à doser est alors incubé sur ce support en présence d'une quantité précise d'anticorps spécifiques. Au cours de cette incubation, il y a compétition pour les anticorps entre les protéines cibles adsorbées sur le support et celles libres dans le milieu.
A l'équilibre, les anticorps fixés par la protéine cible liée sont révélés par des anticorps anti-IgG de lapin couplés à une enzyme (par exemple la phosphatase alcaline, la peroxydase ou la β-galactosidase), puis quantifiés par la mesure de l'absorbance du produit coloré de la réaction de l'enzyme sur son substrat.
Le taux d'antigène (αsi caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide) éventuellement présent dans l'échantillon à analyser est quantifié par sa capacité d'inhiber la fixation des anticorps sur l'antigène adsorbé sur la phase solide.
L'analyse en dilution croissante de 1'échantillon inconnu, comparativement à des échantillons témoins, permet donc de déterminer la protéine étrangère présente dans 1'échantillon.
Exemple 5 : Dosages à 1'aide d'immunsérums selon l'exemple 2
Une plaque de microtitration (par exemple NUNC R Maxisorb Type II) est sensibilisée par incubation 12 heures à 37°C d'une solution protéique d'α caséine bovine d'une part ou de kappa caséine (ou de caséinomacropeptide ou de peptide de synthèse) bovine d'autre part, ces protéines étant purifiées et utilisées à une concentration d'environ 0,2 μg/ l.
Les caséines o et kappa bovines purifiées sont obtenues par fractionnement des caséines totales acides bovines après chromatographie d'échange d'anions sur DEAE- Trysacryl R. Le caséinomacropeptide bovin est extrait de lactosérum présure de vache, par exemple par chromatographie d'exclusion.
La plaque est ensuite lavée dans du PBS-Tween et les sites potentiels de fixation non spécifiques de protéines sont bloqués par incubation une heure à 37°C dans une solution de saturation à 0,5% de gélatine et 3% d'hydrolysats de gélatine (commercialisés par la société SIGMA) dans du PBS-Tween.
Après un deuxième lavage de la plaque dans du PBS-
Tween, les dilutions de 1'échantillon- à doser, préparé comme indiqué dans l'exemple 3, ainsi que l'immunsérum spécifique dilué dans du PBS-Tween sont introduits dans les puits volume à volume. La plaque est alors incubée, soit quelques heures à 37°C, soit une nuit à 4°C sous agitation.
Cette troisième incubation est suivie d'un lavage de la plaque dans le PBS-Tween, puis d'une incubation de 2h à 37βC, en présence d'anticorps anti-IgG de lapin marqués par une enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase ou une autre enzyme dont le produit est un chromogène), dilués dans du PBS-Tween. •
La plaque est ensuite lavée une dernière fois, puis le substrat de l'enzyme utilisé est introduit (par exemple para-nitrophenyl phosphate dans le cas de la phosphatase alcaline, ortho-phénylène diamine ou analogue pour la peroxydase). L'incubation est réalisée dans les conditions optimales pour 1'activité catalytique de l'enzyme utilisée (pH, temps, température, éclairement... ).
La mesure du signal est effectuée par lecture de la densité optique de chaque puits à l'aide d'un lecteur de microplaques, à la longueur d'onde d'absorption spécifique du produit de la réaction enzymatique.
Pour étalonner la réaction, on effectue sur la même plaque des essais témoins en utilisant des échantillons contenant par exemple 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 10% de lait de vache.
. Etude de produits laitiers adultérés en lait de vache
Sur les figures 1 à 3, on a représenté les courbes d'étalonnages de produits laitiers adultérés.
Le pourcentage d'adultération (abscisses) est indiqué en fonction de la concentration en protéines totales en μg/ml. La figure 1 donne la courbe d'étalonnage relative à des fromages à pâte persillée (type roquefort) fabriqués à partir de lait de brebis adultéré avec du lait de vache cru, jusqu'à 3 mois d'affinage.
Les mesures effectuées au bout de 15 jours sont représentées par les symboles (0), au bout de 1 mois par ( es ), et de 3 mois par ( ;?? ), la moyenne étant représentée par ( *& ) .
La figure 2 donne la courbe d'étalonnage du même produit, mais adultéré avec du lait de vache stérilisé.
L'examen de ces courbes montre d'une part que la protéolyse qui se produit pendant l'affinage n'a pas d'incidence sur les mesures. De même, ces dernières ne sont pas affectées par le traitement thermique subi par le lait.
Ces résultats sont corroborés par ceux obtenus avec un lait de brebis adultéré avec du lait de vache cru ou chauffé une heure à 110°C.
La courbe d'étalonnage correspondante est donnée sur la figure 3.
On notera également que même après 8 mois d'affinage, donc avec des fromages fortement protéolysés, on n'observe pas de variation dans les mesures.
. Dosage de lactosérum dans du lait de vache en poudre.
On rapporte sur la figure 4 la courbe d'étalonnage de lait de vache en poudre additionné de lactosérum présure de vache atomisé. Le pourcentage de fraude est indiqué en abscisses et la concentration en protéines totales (μg/ml) en ordonnées. La courbe (t≈ ) correspond à la gamme A, c'est-à- dire à des étalons préparés à partir de lait de vache écrémé atomisé et de lactosérum doux présure de vache atomisé, et la courbe ( O ) à la gamme B, c'est-à-dire à des étalons préparés à partir de lait de vache écrémé atomisé et de lactosérum présure de vache atomisé traité thermiquement 1 h à 110°C.
. Dosage de lactosérum dans des charcuteries
L'utilisation des immunsérums de l'invention permet de détecter le lactosérum présure de vache présent dans des charcuteries type pâté, apertisées.
Sur la figure 5, on rapporte la courbe d'étalonnage pour la détection du lactosérum présure de vache dans des pâtés apertisés 80 min à 110°C. La concentration en protéines (μg/ml) est donnée en abscisses et le pourcentage de mélange en ordonnées ( eu ) représente la droite de régression et ( • ) les résultats expérimentaux).
10 g de pâté de foie sont dilués dans 40 ml de PBS contenant 0,05 % de Tween 20, homogénéisés à l'aide d'un ultraturrax, puis maintenus sous agitation une nuit à 25°C.
L'extrait soluble est recueilli par centrifugation (20 min ; 5000 g ; 10°C) puis délipidé pair extraction des graisses au chloroforme.
La phase aqueuse est récupérée et les traces de chloroforme sont évaporées sous vide. L'extrait soluble ainsi dégraissé est analysé dans les mêmes conditions que le lait ou le fromage. Ky τnplc> fi : Etude de la réactivité de l'immunsérum anti-αsl caséine bovine
Sur la figure 6, on a rapporté les résultats de l'étude de l'immunoréactivité de l'immunsérum ci-dessus avec 1) le peptide fabriqué selon l'exemple 1 ; 2) l'a caséine bovine ; 3) l'a caséine ovine ; 4) l'a caséine caprine ; 5) la caséine totale ovine et 7) la caséine totale caprine.
Pour chacun de ces composés indiqués en abscisses, on rapporte en ordonnées, le pourcentage de réponses.
On constate à l'examen de cette figure que
1'immunoréactivité de cet immunsérum est aussi bonne avec les protéines natives qui contiennent le fragment peptidique (α caséine ou mélange de caséines) qu'avec le peptide de synthèse de l'invention.
De manière avantageuse, on n'observe pas de réaction croisée notable avec les fractions protéiques homologues des autres espèces, ce qui met en évidence la monospécificité des anticorps polyclonaux de l'invention.
L'immunsérum anti-αsi caséine de vache permet la détection de l'addition de lait ou de caséinates de vache à un lait de brebis.
L'immunsérum anti-kappa caséine de vache pemet la détection de l'addition de lait, de caséinates ou de lactosérum de vache (obtenu par coagulation présure de lait de vache) à des laits de brebis ou de chèvre. Les anticorps fabriqués sont spécifiques du fragment 139-152 de la kappa caséine situé sur le caséinomacropeptide bovin. Celui-ci, lors de la coagulation des caséines par la présure, est excisé au niveau de la liaison 106-107 de la kappa caséine et se trouve donc soluble dans la phase sérique. Il faut aussi noter que les marqueurs asι-caséine, kappa caséine ou caséinomacropeptide choisis pour 1'espèce bovine sont thermostables ; leur antigénicité n'est donc pas. affectée, quel que soit le traitement thermique qu'a subi le produit laitier ajouté à l'échantillon dont on veut contrôler la pureté.
Par exemple, un lait ou un lactosérum présure de vache chauffé 60 min. à 100° C est reconnu de la même façon que s'il était cru.
D'autre part, sachant que les haptènes choisis contiennent au moins 5, de préférence au moins 10 résidus d'acides aminés, plusieurs épitopes continus doivent être reconnus sur la protéine cible par les anticorps polyclonaux produits. Une disparition totale de 1'immunoréactivité ne peut donc être envisagée que dans l'hypothèse d'une hydrolyse enzymatique totale, ce qui ne peut se produire, par exemple au cours de la phase d'affinage des fromages, même si on s'adresse à des fromages très affinés.
L'invention fournit donc les moyens de détecter avec une grande précision et une spécificité élevée des fraudes sur des produits laitiers ou de produits les renfermant, tels que les produits alimentaires ou les préparations cosmétiques. Il est ainsi possible de mettre en évidence des adultérations résultant de 1'addition de protéines laitières d'une espèce différente de celle(s) devant être utilisée(s) pour se conformer aux normes de fabrication. On peut également détecter l'utilisation par exemple d'hydrolysats de lactosérum utilisés dans ces produits pour augmenter le volume, la capacité de rétention d'eau ou comme succédané à des protéines laitières plus coûteuses. Liste des séquences
SEQ ID N° 1
139 152
Val-Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val-
RESINE
SEQ ID N° 2
140 149 Gin-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu—RESINE

Claims

REVENDICATIONS
1/ Peptides, caractérisés en ce qu'ils sont capables de former des anticorps polyclonaux susceptibles de reconnaître de manière spécifique, en donnant lieu à une réaction du type antigène-anticorps, une protéine laitière d'une espèce donnée qui peut être présente dans un mélange renfermant des protéines laitières de différentes espèces.
2/ Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que leur séquence en acides aminés est formée par un fragment de la protéine laitière reconnue par lesdits anticorps polyclonaux.
3/ Peptides selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un fragment de protéine bovine, notamment d'un fragment renfermant de 5 à 20 acides aminés environ.
4/ Peptides selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un fragment de la kappa caséine bovine.
5/ Peptides selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un fragment correspondant à la séquence 139-152 de la kappa caséine bovine, ou SEQ ID Nβ 1, dont l'enchaînement en acides aminés est le suivant :
139 152
Val-Glu-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp-Ser-Pro-Glu-Val— RESINE
6/ Peptides selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'.il s'agit d'un fragment de l'αsl caséine bovine.
7/ Peptides selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un fragment correspondant à la séquence 140-149 de l'αsl caséine bovine, ou SEQ ID N" 2, dont 1'enchaînement en acides aminés est le suivant : 140 149
Gln-Glu-Leu-Ala-Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu—RESINE
8/ Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'un ou plusieurs acides aminés de leurs séquences sont différents, ou substitués, ou délêtés, par rapport au fragment correspondant de la protéine laitière, ces altérations n'affectant pas la reconnaissance spécifique par les anticorps telle que définie dans la revendication 1.
9/ Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisés en ce qu'ils sont couplés à un support, en particulier à une résine, telle qu'une résine acrylique.
10/ Immunsérums contenant des anticorps monospécifiques dans leur capacité de reconnaissance d'une protéine laitière d'une espèce donnée dans un mélange renfermant des protéines laitières de différentes espèces, tels qu'obtenus par immunisation d'animaux avec un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et anticorps de ces immunsérums.
11/ Immunsérums et anticorps selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils sont, anti-αsi caséine bovine, ou anti-caséinomacropeptide bovin.
12/ Procédé d'obtention d'immunsérums selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'on administre un complexe peptide-support, notamment peptide- résine, à l'animal, par voie intradermique, à raison d'environ 0,3 à 1 mg de peptide, en émulsion dans un adjuvant capable de stimuler au maximum la réponse immunitaire, tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund, qu'on renouvelle l'injection à intervalles de temps, généralement de 15 jours à 1 mois, puis qu'on élimine les hématies.
13/ Procédé d'obtention d'immunsérums selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend 1'utilisation comme immunogenes de peptides correspondant à des fragments peptidiques sélectionnés sur la protéine laitière avec laquelle on recherche une reconnaissance immunologique.
14/ Méthode de contrôle de produits renfermant des protéines laitières, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact de l'échantillon provenant du produit à analyser avec une préparation d'immunsérum ou 1'anticorps tels que définis dans l'une des revendications 9 ou 10, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et
- la détection de la réaction immunologique.
15/ Kit pour la détection in vitro de la présence de protéines laitières d'une espèce donnée dans un échantillon de produit à analyser, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, avantageusement sensibilisée au préalable avec l'antigène de l'immunsérum fourni dans le kit,
- une préparation d'immunsérums ou d'anticorps selon l'une des revendications 10 ou 11, libres ou immobilisés,
- une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. 16/ Application des immunsérums et anticorps selon l'une des revendications 10 ou 11 au contrôle de produits renfermant des protéines laitières en vue de détecter une protéine laitière d'une espèce donnée.
17/ Application selon la revendication 14 au contrôle de produits alimentaires tels que les produits laitiers ou dérivés de lait, notamment les fromages, ainsi que la charcuterie, la confiserie ou la pâtisserie.
18/ Application selon la revendication 14, au contrôle de produits et préparations cosmétiques.
PCT/FR1993/000200 1992-02-28 1993-02-26 Moyens pour le controle de produits renfermant des proteines laitieres WO1993017042A1 (fr)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1063091C (zh) * 1997-09-01 2001-03-14 黄河 一种功能食品免疫牛奶
CN103884792A (zh) * 2013-04-03 2014-06-25 西北大学 基于液相色谱法对乳制品蛋白含量和种类的图形表征方法
CN113311156A (zh) * 2021-04-09 2021-08-27 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2558612C (fr) * 2004-03-05 2013-10-01 Prima Meat Packers, Ltd. Methodes et anticorps permettant de detecter la presence d'allergenes du lait

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0049666A1 (fr) * 1980-10-03 1982-04-14 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nouvelles substances biologiquement actives, leur obtention à partir de caséine humaine et compositions les contenant

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0049666A1 (fr) * 1980-10-03 1982-04-14 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nouvelles substances biologiquement actives, leur obtention à partir de caséine humaine et compositions les contenant

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS. vol. 154, no. 3, 15 Août 1988, DULUTH, MINNESOTA US pages 876 - 882 AKIO AMETANI ET AL. 'Antibody response of three different strains of mice to alpha S1-Casein anlyzed by using proteolytic and synthetic peptides.' *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 105, no. 11, 15 Septembre 1986, Columbus, Ohio, US; abstract no. 93613b, KUMAKURA,MINORU ET AL. 'Immobilization of biologically active substances.' page 289 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 106, no. 15, 13 Avril 1987, Columbus, Ohio, US; abstract no. 118237t, ALAIS,CHARLES 'Determination of skimmed milk powder in animal feed mixtures.' page 509 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 113, no. 5, 30 Juillet 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 37431u, KUBOTA,TAKAAKI ET AL. 'Casein degradation products in immunoassays to remove interferences' page 315 ; *
DATABASE WPIL Section Ch, Week 9229, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class D13, AN 92 235927 *
HELVETICA CHIMICA ACTA. vol. 55, no. 291, 1972, BASEL CH pages 2872 - 2883 JACQUELINE JOLLES ET AL. 'Studies on the primary structure of cow kappa-casein.Structural features of para-kappa-casein;N-terminal sequence of kappa-caseinoglycopeptide studied with a sequencer.' *
JOURNAL OF DAIRY SCIENCE vol. 73, no. 10, 1990, CHAPAIGN, ILLINOIS US pages 2741 - 2748 KUZMANOFF,KONRAD ET AL. 'Isolation of monoclonal antibodies monospecific for bovine kappa-casein.' *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1063091C (zh) * 1997-09-01 2001-03-14 黄河 一种功能食品免疫牛奶
CN103884792A (zh) * 2013-04-03 2014-06-25 西北大学 基于液相色谱法对乳制品蛋白含量和种类的图形表征方法
CN113311156A (zh) * 2021-04-09 2021-08-27 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用

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