FR2864086A1 - Facteur cytotoxique isole associe a la sclerose en plaques et procede de detection dudit facteur cytotoxique - Google Patents
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Abstract
Facteur cytotoxique isolé, associé à la sclérose en plaques, choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP muté/GM2/MRP14 et son procédé de détection dans un échantillon biologique à tester, selon lequel (i) on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un anticorps de capture, choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2 ; et avec au moins un anticorps de détection marqué, choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2, et (ii) on détecte et/ou quantifie le facteur cytotoxique par détection et/ou quantification de l'anticorps de détection marqué.
Description
La sclérose en plaques est une maladie chronique du système nerveux
central de l'homme, évoluant par succession de phases de rémission et de poussée ou selon une progression régulière, dont la caractéristique anatomopathologique consiste
en la formation de zones de démyélinisation bien délimitées dans la substance blanche du cerveau et de la moelle épinière.
Au niveau histologique, ces zones présentent au stade précoce du processus lésionnel, une dégradation de la myéline péri-axonale associée à une atteinte des cellules gliales responsable de cette démyélinisation. Une activation macrophagique inflammatoire impliquant les cellules microgliales (macrophages tissulaires résidants du système nerveux central), ainsi que, probablement, des macrophages provenant de monocytes sanguins infiltrés, est associée à ce processus de démyélinisation et contribue à la destruction des feuillets myélinisés. Au centre de la zone démyélinisée, une déplétion relative en cellules gliales est retrouvée alors qu'une prolifération d'astrocytes se développe à la périphérie et peut envahir la plaque démyélinisée pour générer une plaque fibreuse ou gliotique. Ces structures sclérotiques sont à l'origine du nom donné à la maladie.
Une autre caractéristique de ces plaques est leur association quasi systématique avec un élément vasculaire autour duquel elles se développent.
Au niveau histologique, on observe une altération fréquente de la barrière hémato-encéphalique (BHE) constituée par l'endothélium capillaire. Un des éléments déterminants dans le maintien de la BHE est constitué par la présence sous-jacente d'extensions cytoplasmiques des astrocytes, appelées pieds astrocytaires. Vraisemblablement, les pieds astrocytaires induisent la formation ou permettent le maintien de structures de jonction étanches qui assurent la cohésion de la barrière endothéliale capillaire concrétisant la BHE. Or, différents modèles pathologiques font état de l'altération de la BHE et d'une déplétion des pieds astrocytaires.
2864086 2 Par ailleurs, dans le processus lésionnel de la SEP, l'altération de la BHE contribue à amplifier la réponse inflammatoire associée, par l'afflux de cellules lymphoïdes provenant de la circulation sanguine. La contribution de l'inflammation associée aux cellules immunitaires est importante dans la SEP et participe au processus lésionnel.
L'étiologie de la SEP est source d'un débat d'actualité car la maladie pourrait avoir des origines diverses. Des hypothèses ont été émises sur une origine bactérienne et/ou virale. Par ailleurs, comme décrit dans la demande de brevet WO 95/21859, H. Perron et al. ont été conduits à rechercher un ou des agents effecteurs du processus pathogénique aboutissant à la formation typique de plaques de démyélinisation et à une gliose astrocytaire. Dans le cadre de cette étude, ils ont mis en évidence la présence dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le sérum de patients SEP d'au moins un facteur qui présente une activité toxique vis à vis des cellules astrocytaires et oligodendrocytaires humaines ou animales. Cette activité toxique se caractérise par une désorganisation cytomorphologique du réseau de filaments intermédiaires et/ou une dégradation des protéines desdits filaments et/ou une mort cellulaire par apoptose des cellules gliales. Ils ont établi une corrélation significative entre la détection in vitro de cette activité toxique dans des échantillons de LCR et de sérum de patients SEP et la sclérose en plaques par un dosage colorimétrique quantitatif au bromure de méthyltétrazolium (MTT) des cellules vivantes, comme décrit dans la demande de brevet WO 95/21859. Par ailleurs, C. Malcus-Vocanson et a1.1,4 ont montré que l'urine est un fluide biologique très favorable pour la détection de l'activité de ce facteur toxique et développé un procédé utilisant la cytométrie de flux pour détecter et/ou quantifier les cellules gliales adhérentes mortes par apoptose. Toutes les informations concernant ce procédé sont décrites dans la demande de brevet WO 98/11439.
Des essais ont été réalisés à partir d'une fraction protéique de LCR et d'urine de patients SEP pour tenter d'identifier ce facteur toxique. Le contenu protéique de chaque fraction a été séparé sur gel SDS-PAGE 12 % et observé après coloration du gel à l'argent. Parmi les protéines observées, une fraction protéique centrée sur un poids moléculaire apparent d'environ 21 kD a été trouvée minoritairement associée à l'activité toxique détectée in vitro et une fraction centrée sur un poids moléculaire apparent d'environ 17 kD a été trouvée majoritairement associée à cette activité toxique.
Une injection de la fraction provenant de LCR de patients SEP dans le cerveau de rat Lewis et une observation histologique post-mortem de coupes de cerveau des rats a permis d'observer, trois mois après l'injection, une apoptose de la population astrocytaire et la formation de plaques de démyélinisation. Toutes les informations sont contenues dans la demande de brevet WO 97/33466. Ces observations sont conformes à celles qui ont pu être faites sur des coupes de cerveau de patients atteints de SEP, après biopsie5.
Des protéines potentiellement associées à cette activité toxique vis à vis des cellules gliales dans des échantillons biologiques de patients SEP ont été étudiées comme décrit dans la demande de brevet WO 01/05422. Les protéines GM2AP (précurseur de l'activateur du ganglioside GM2) et la saposine B ont ainsi été dosées dans les urines de patients SEP et non SEP. Les résultats présentés dans la demande de brevet WO 01/05422 montraient que le GM2AP et la saposine B étaient présents à de fortes concentrations dans les urines de patients SEP par rapport aux concentrations retrouvées chez des individus non SEP et que ces deux protéines qui sont codétectées dans les urines de patients SEP pouvaient représenter un marqueur de la pathologie. Les inventeurs avaient également établi une corrélation entre la détection des protéines GM2AP et saposine B dans les urines et la gliotoxicité mesurée dans ces urines par le test MTT et montré qu'il existait une corrélation entre concentration urinaire élevée et gliotoxicité 2864086 4 pour ces deux protéines. Les inventeurs en concluaient que les protéines GM2AP et/ou saposine B étaient impliquées dans le mécanisme de gliotoxicité et qu'elles pouvaient vraisemblablement agir en combinaison pour induire la gliotoxicité.
Les présents inventeurs ont maintenant voulu connaître l'activité des protéines identifiées dans la demande de brevet WO 01/05422 par utilisation du test MTT et voir si la gliotoxicité découverte dans les urines de patients atteints de sclérose en plaques était liée aux protéines identifiées.
Contre toute attente, les présents inventeurs ont montré que ce n'était ni les protéines identifiées dans WO 01/05422 prises individuellement, ni l'association des protéines GM2AP/saposine B qui étaient impliquées dans la gliotoxicité et que de manière tout à fait surprenante l'agent responsable de l'activité gliotoxique et impliqué dans la cytotoxicité correspondait à un hétérocomplexe GM2AP/GM2/ MRP14 (calgranuline B) ou GM2AP mutée/GM2/MRP14, comme décrit dans les exemples qui suivent. GM2 ou ganglioside GM2 est un lipide complexe présent dans le tissu cérébral.
Aussi, la présente invention a pour objet le facteur cytotoxique isolé, purifié, associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRP14. Ces hétérocomplexes isolés, purifiés, sont utiles comme marqueurs de la pathologie SEP et plus précisément d'une forme de la maladie, d'un stade de la maladie, d'une période d'activité de la maladie, ainsi que dans le suivi de patients traités pour cette pathologie.
Les présents inventeurs ont alors mis au point un procédé et une composition pour détecter et/ou quantifier les hétérocomplexes GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MRP14 dans des échantillons d'individus susceptibles d'être atteints de sclérose en plaques ou présentant des signes cliniques de cette pathologie.
Le procédé consiste à (i) disposer d'un échantillon biologique à tester, (ii) mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un anticorps de capture, ledit anticorps de capture étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2; avec au moins un anticorps de détection marqué, ledit anticorps de détection étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2, et (iii) détecter et/ou quantifier le facteur cytotoxique par détection et/ou quantification de l'anticorps de détection marqué.
L'anticorps ou les anticorps de détection sont marqués par tout marqueur approprié. Le marquage peut ainsi être un marquage radioactif, un marquage par une enzyme, un marquage par une molécule fluorescente, un marquage par une vitamine, un marquage colorimétrique. Dans la présente invention le marqueur est de préférence une vitamine, la biotine, la détection est réalisée par l'addition de streptavidine couplée à la peroxydase de raifort et la révélation est effectuée par addition de dihydrochlorure d' orthophénylènediamine.
L'anticorps ou les anticorps de capture sont immobilisés directement ou indirectement sur une phase solide.
Le terme anticorps utilisé dans la présente invention englobe les anticorps, leurs fragments et leurs dérivés. Par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab', sFv d'un anticorps natif6" et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif8'9. Ces fragments d'anticorps et dérivés d'anticorps conservent la capacité de se lier sélectivement à l'antigène cible. Il peut être avantageux d'utiliser des anticorps humanisés. Les formes humanisées d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles 2864086 6 des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l'immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine10,1"2 Le terme anticorps utilisé dans la présente invention englobe également les anticorps anti-complexe, monoclonaux et polyclonaux, qui sont capables de se lier spécifiquement au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2. De tels anticorps sont utilisés soit en capture, soit en détection.
Le procédé sandwich de l'invention est réalisé en une ou plusieurs étapes, c'est à dire sans étape de lavage ou avec une ou plusieurs étapes de lavage.
Dans un mode réalisation préféré du procédé de 30 l'invention, l'échantillon à tester est soumis à un traitement préalable comprenant: une étape de digestion des protéines de l'échantillon par la protéinase K; une étape d'inactivation de la protéinase K, par exemple par précipitation à l'acide trichloroacétique, et une étape de neutralisation du pH, par exemple par addition d'un tampon tris- maléate. 30
2864086 7 L'échantillon biologique à tester est le sérum, le plasma, l'urine ou le liquide céphalorachidien, de préférence l'urine.
Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique sont capables de se lier spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée ou à la protéine MRP14. De préférence, les anticorps utilisés dans le procédé de l'invention sont les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants: 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196. Mais il est bien évident que tout anticorps monoclonal ou polyclonal qui présente la caractéristique de se lier spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2 fait partie de l'invention, les procédés pour l'obtention de tels anticorps monoclonaux ou polyclonaux étant bien connus de l'homme du métier, comme décrit ci- dessus.
De préférence les anticorps utilisés dans le test sandwich ELISA de détection et/ou de quantification de l'invention sont les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants: - anticorps de capture 1OE11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, et 79 - anticorps de détection 1OE11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5.
Les anticorps de capture et de détection sont avantageusement choisis parmi les couples: 2B9H2/10E11A11, 1OE11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 2864086 8 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13H9C9+19C11C10.
Les anticorps monoclonaux et polyclonaux précités sont nouveaux et font également partie des objets de la présente invention. Leur mode de production sera décrit plus en détail dans la partie expérimentale. Les couples d'anticorps de capture et de détection sélectionnés et préférés sont également nouveaux et font aussi partie des objets de la présente invention.
La présente invention a également pour objet une composition pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique (gliotoxique) précité dans un échantillon biologique à tester, ladite composition comprenant au moins un anticorps de capture qui se lie spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2, et au moins un anticorps de détection marqué qui se lie spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2.
De préférence, les anticorps de capture et de détection sont choisis parmi les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants: 1OE11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196.
Avantageusement, ladite composition comprend au moins 35 un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 1OE11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, et 79; et au moins un 2864086 9 anticorps de détection choisi parmi les anticorps de détection 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5.
- 2B9H2/10E11A11, - 1OE11A11/4A7B10+5H7C10, - 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10EllAll, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, - 2B9H2/10E11A11, - 2B9H2/13H9C9+19C11C10, - 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, - 2B9H2/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13H9C9+19C11C10.
La séquence SEQ ID NO: 1 correspond à la séquence de la protéine GM2AP.
La séquence SEQ ID NO: 2 correspond à la séquence de la protéine GM2AP mutée dans l'exon 2, à la position 40 (remplacement d'un acide aspartique par une phénylalanine.
La séquence SEQ ID NO: 3 correspond à la séquence de la protéine GM2AP mutée, présentant des mutations à la fois dans l'exon 1, dans l'exon 2 et dans l'exon 4.
Dans la description détaillée qui va suivre, lorsque l'on fait référence à la protéine GM2AP, la séquence à prendre en considération est la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO: 1. Par ailleurs, quand on fait référence à la protéine GM2AP mutée, la séquence à prendre en considération est la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO: 2; étant entendu Les compositions préférées comprennent les couples 5 d'anticorps de capture et de détection suivants 15 20 que dans les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 on peut trouver indifféremment à la position 153 une valine ou une alanine, comme expliqué dans la partie expérimentale dans l'exemple 3. Cependant, des expériences équivalentes peuvent être menées en prenant en considération la protéine GM2AP mutée présentant des mutations à la fois dans l'exon 1, dans l'exon 2 et dans l'exon 4, telle qu'identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO: 3.
Figure.
La figure annexée représente la courbe dose-réponse du complexe ternaire GM2AP+MRP14+GM2(GM2: 50 gg/ml final). Les quantités de MRP14 sont représentées en abscisse (en ng) et le pourcentage de cytotoxicité correspondant au pourcentage de cellules mortes est représenté en ordonnée. Dans la présente figure les quantités de GM2AP en ng sont respectivement représentées par les symboles suivants: : 5 ng, 7L: 10 ng, t@ : 20 ng, U: 50 ng et x: 100 ng.
Une expérience similaire a été réalisée avec la protéine GM2AP mutée au lieu de la protéine GM2. Les résultats obtenus sont similaires à ceux présentés dans la figure annexée.
Exemples.
Exemple 1: Protocole du test MTT.
(i) Coating des plaques à la poly-L-lysine.
250 gl de solution de poly-L-lysine (12,5 gg/ml) stériles sont déposés dans tous les puits de plaques 48 puits (Falcon 3078). Après une incubation de 2 heures à 37 C, la solution est aspirée et remplacée par 250 gl d'eau stérile pour laver les puits. Une fois les puits vidés par aspiration, ils sont séchés sous le flux d'air d'un poste de sécurité microbiologique.
2864086 11 (ii) Cellules utilisées Les cellules CLTT1-1 sont des astrocytes issus de souris transgéniques exprimant le gène large T du polyoma virus13. Ces cellules sont cultivées à 37 C en atmosphère humide à 5 % de CO2, en Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 medium (50/50) 4,5 g/1 de D-glucose supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) non décomplémenté, du glutamax (580 mg/1), de la pénicilline (500 unités/1) et de la streptomycine (500 gg/l).
(iii) Test de cytotoxicité Les échantillons à tester sont préparés 24 heures avant le dépôt pour le test de toxicité et incubés à 4 C.
Les plaques de 48 puits coatées à la poly-L-lysine sont ensemencées avec des cellules CLTT 1-1 à raison de 250 l de suspension cellulaire (6000 cellules/ml) par puits, soit 1500 cellules/puits.
Après 24 heures d'incubation à 37 C, en atmosphère humide et 5% de CO2 les échantillons sont déposés à la surface du milieu cellulaire. Chaque échantillon est déposé en trois exemplaires. Certains puits permettent d'évaluer des témoins (T) cellulaires (aucun dépôt d'échantillon) ou des témoins dits TUC (dépôt de 10 gl de solution TUC). Le réactif TUC (TRIS 20 mM, urée 250 mM, CaCl2 1 mM) est une solution mimant la chimie de l'urine.
Le dépôt est homogénéisé et, pour éviter toute évaporation, un film protecteur est appliqué sur le dessus des plaques.
Après 72 heures d'incubation à 37 C, en atmosphère humide et 5% de CO2i la révélation par le test MTT est réalisée. Le surnageant cellulaire est aspiré en prenant soin de ne pas retirer les cellules du fonds des puits. 250 .l de solution MTT (0.5 mg/ml dans du milieu de culture) sont déposés délicatement sur les cellules. Après 3 heures d'incubation à 37 C, la solution est aspirée et les cristaux de formazan formés dans les cellules sont solubilisés avec de l'isopropanol, HC1 1N (40 l/ml).
Une fois homogène, 70 gl de solution de chaque puits de la plaque 48 puits sont transvasés dans les puits d'une plaque 96 puits, afin de faire une lecture de densité optique.
Les absorbances sont lues à 570 nm/650 nm.
Le pourcentage de cytotoxicité peut être calculé : MoyT = moyenne des absorbances des témoins aT = écart type des absorbances des témoins CO = CutOff = MoyT - 2 aT DO = absorbance moyenne des échantillons % toxicité = (1 - (DO / CO)) x 100 Pour être valides, les absorbances de chaque échantillon (en trois exemplaires) ne doivent pas avoir un écart type supérieure à 10% de l'absorbance moyenne.
Exemple 2: Préparation de pools d'urine.
litres d'urine SEP (0,2-0,5 litre provenant de la première miction matinale de patients) ont été collectés. Les urines de patients contaminées par voie bactérienne ou celles de patients traités par des médicaments susceptibles d'interférer avec le bioessai de gliotoxicité4 ont été éliminées. Les échantillons individuels ont été testés pour la gliotoxicité et un pool final de 46 litres d'urine avec une gliotoxicité significative, par le test MTT, a été sélectionné. En parallèle, un volume équivalent d'urine de donneurs sains avec une gliotoxicité négative pour chaque échantillon a été obtenu. Les étapes de concentration et de purification de ce matériel, l'analyse protéique et la stratégie d'identification sont présentés ci-dessous.
É Purification des protéines urinaires.
Les pools d'urine SEP positifs et SEP négatifs ont été purifiés pour obtenir une concentration élevée en protéines.
- (i) Précipitation: Des précipitations au sulfate d'ammonium (Prolabo réf. 21 333 365) ont été effectuées sur les pools d'urine SEP positif et SEP négatif. Le pourcentage de 60 % de sulfate 2864086 13 d'ammonium saturé pour 40 % d'urine, soit 390 grammes de sulfate d'ammonium par litre d'urine a été utilisé. Chaque pool est réparti en fractions de 1,8 litres dans des flacons de 2 litres pour améliorer la précipitation. La précipitation a été effectuée durant 2 x 8 heures, à température ambiante, sous agitation douce. Après centrifugation des pools d'urine à 3000 tpm pendant 10 min., à une température de 10 C, le culot obtenu est repris dans un tampon Tris 20 mM contenant du CaC12 1 mM et de l'urée à 0,25 M. Le mélange a ensuite été centrifugé à 3000 tpm pendant 10 min. Le surnageant contient les protéines concentrées. Il est soit utilisé immédiatement pour l'étape suivante, soit congelé si l'étape suivante ne peut être effectuée en continu.
- (ii) Chromatographie par échange d'ions: - La solution contenant les protéines a ensuite été passée sur un gel DEAE Fast Flow (nom commercial, commercialisé par PHARMACIA). Cette étape est effectuée à basse pression sur une colonne PHARMACIA remplie de gel. Les tampons sont amenés sur la colonne par une pompe péristaltique qui permet un débit régulier. Le tampon d'équilibration de la colonne est le tampon Tris 20 mM, pH 7. La fraction correspondant au surnageant de précipitation et contenant une quantité de sels trop élevée est dialysée contre ce tampon avant dépôt sur la colonne. Une élution par un gradient salin permet de récupérer les protéines. Le gradient d'élution est effectué par palier de NaCl 100, 200, 300, 500 mM dans le tampon d'équilibration de la colonne. Les fractions d'élution sont testées par le test MTT. Seules les fractions positives, c'est à dire les fractions éluées à 200 Mm NaCl, sont conservées. Ces fractions sont traitées immédiatement ou conservées à l'état lyophilisé.
- (iii) Purification: - Une chromatographie d'exclusion stérique basée sur la différence de taille et de forme des protéines à éluer a été utilisée. La fraction correspondant à l'élution 200 mM NaCl est déposée sur la colonne. Au cours de l'élution, les protéines de faible masse moléculaire sont retenues et donc 2864086 14 éluées plus tardivement que les grosses molécules. Les purifications ont été effectuées sur HPLC avec une colonne TosoHaas TSK Prep G 3000 SW, d'un diamètre de 21,5 mm et d'une longueur de 300 mm. La limite d'exclusion en masse moléculaire est de 500 000 daltons. Le tampon d'élution utilisé contient du phosphate 100 mM, du sulfate de sodium 100 mM, à pH 6,8. La séparation du mélange de protéines a été effectué en 60 min. Seule la fraction correspondant à une masse de 15-20 000 daltons a été conservée. Cette fraction est dialysée dans un tampon Tris 20 mM contenant du CaC12 0,2 mM, pH 7,2, puis lyophilisée.
A chaque étape, seules les fractions présentant une activité toxique significative ont été retenues pour l'étape suivante. Un contrôle de l'activité toxique des protéines a été effectué à chaque étape, à l'aide du test MTT. Seules les fractions présentant une activité toxique significative ont été retenues pour l'étape de purification supplémentaire.
- (iv) Purification supplémentaire des protéines urinaires par chromatographie en phase inverse: - Les pools d'urine provenant de patients SEP (pool SEP positif) et de patients non SEP (pool SEP négatif), obtenus après purification, ont été repris dans de l'eau distillée, puis dilués avec une solution 0,2% TFA/10% acétonitrile pour obtenir une concentration finale d'environ 130 à 140 gg/ml.
La séparation par HPLC phase inverse C8 a été effectuée sur une colonne Brownlee Aquapore (nom commercial) commercialisée par la société Perkin Elmer (caractéristiques de la colonne: 300 angstroms/7 m/(100x4,6) mm). Deux colonnes distinctes ont été utilisées respectivement pour les pools positif et négatif. Les injections ont été réalisées par multiinjections de 250 E,tl. Les protéines ont été éluées avec un gradient linéaire de 5% à 15% de tampon A en 5 min., puis de 15% à 100% de tampon B en 95 min., à un débit de 0,5 ml/min. Les tampons de séparation A et B utilisés sont respectivement le tampon 0,1% TFA (Pierce n 28904) / eau MilliQ et le tampon 0,09% TFA/80% acétonitrile (Baker). La détection a été 2864086 15 effectuée par mesure de l'absorbance W à 205 et 280 nm. La collecte des fractions a été effectuée en fractions de 1,5 ml et de 0,5-1 ml dans la zone d'intérêt. Les fractions ont été congelées après la collecte dans de la carboglace.
Les fractions collectées ont ensuite été séchées en Speed Vac et reprises dans 100 l de 0,1% TFA/30% acétonitrile. 20 l des fractions ont été transférés dans des eppendorfs de 500 l, séchés et lavés à deux reprises avec 100 l d'eau MilliQ, puis séchés de nouveau.
L'activité toxique des protéines contenues dans chaque fraction recueillie après élution a été déterminée à l'aide du test MTT. Seule la fraction X76/43 du pool SEP positif présente une activité toxique in vitro. Le numéro de cette fraction correspond à l'ordre de l'élution en fonction des conditions d'élution énoncée dans l'exemple. Son activité toxique a été confirmée in vitro par FACS sur des cellules astrocytaires murines, comme décrit dans la demande WO 98/11439. Son profil sur SDS- PAGE révélait desbandes protéiques à 55 kDa, 35kDa, 20 kDa, 18 kDa, 14kDa et 8 kDa. La fraction correspondante X76/43 20 du pool SEP négatif, obtenue à partir des urines de contrôle, ne présentait aucune activité toxique par le test MTT. Son profil sur SDS-PAGE montrait des bandes à 55 kDa, 35 kDa et 20 kDa.
É Analyse des protéines obtenues par séparation sur 25 HPLC sur gel SDSTRICINE.
Le contenu protéique de la fraction X76/43 du pool témoin SEP négatif et de la fraction X76/43 du pool SEP positif a été 'observé après séparation sur gel SDS-TRICINE 16% et coloration du gel au zinc/imidazole.
Le pool de collecte de la fraction X76/43 obtenue par HPLC a été déposé sur un gel SDS-TRICINE 16% précoulé de 10 puits et de 1 mm d'épaisseur (commercialisé par la société Novex). Les conditions d'utilisation du gel correspondent à celles préconisées par le fournisseur. L'échantillon est repris dans 75 l du tampon d'échantillon 1 fois concentré (SDS- TRICINE N LC 1676, 1 ml deux fois concentré + 50 l de F3- 10 2864086 16 mercaptoéthanol (Pierce) dilué au 1/2 dans de l'eau) et 25 l de l'échantillon sont déposés sur le gel en trois fois. Le pool de collecte de la fraction X76/43 provenant du pool SEP négatif a été déposé sur le gel dans les mêmes conditions que celles décrites pour le pool SEP positif. La migration sur les deux gels a été effectuée en parallèle dans la même cuve de migration (XCELL II NOVEX (nom commercial)) à un voltage constant de 125 mV pendant 2 heures. La cuve est placée dans un bac contenant de la glace. Les gels ont été colorés directement après la migration par coloration au zinc/imidazole (kit de coloration 161-0440 commercialisé par la société BIORAD) pour obtenir une coloration négative réversible.
É Digestion à la trypsine des bandes de gel.
Toutes les bandes de protéines visualisées dans les dépôts de la fraction X76/43 ont été découpées et soumises à une protéolyse dans une solution de trypsine pendant une nuit.
Les bandes de gels sont découpées au scalpel en tranches de 1 mm et transférées dans des tubes eppendorfs. Les eppendorfs sont soumis à un pic de centrifugation pour faire tomber les morceaux de gel et après centrifugation 100 l de tampon de lavage (100 Mm NH4CO3/50% CH3CN) sont ajoutés aux morceaux de gel. Après 30 min. d'agitation à température ambiante, le surnageant est enlevé par fractions de 20 l et l'étape de lavage est renouvelée deux fois. Les eppendorfs sont séchés pendant 5 min. en speed vac. 20 g de trypsine (Modified sequenal grade PROMEGA V5111) (nom commercial) sont repris dans l de tampon de digestion (5 mM TRIS, pH 8) et sont dissous pendant 30 min. à température ambiante, sous agitation intermittente et 20 à 30 l de trypsine resuspendue sont ajoutés aux morceaux de gel. Les eppendorfs sont centrifugés et conservés en chambre chaude à 28 C pendant une nuit. Après digestion les bandes de gel peuvent être utilisées immédiatement pour les mesures de masse ou congelées pour usage ultérieur. Des protéines de poids moléculaires apparents élevés ont été trouvées dans les deux fractions. Par contre les bandes 2864086 17 de poids moléculaires apparents de 8, 14, 18 kDa ne sont visibles que dans la fraction X76/43 du pool SEP positif.
Exemple 3: Spectrométrie de masse et séquençage des 5 protéines.
É Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des fragments protéolytiques.
l de tampon d'extraction (2% TFA/50% acétronitrile) sont ajoutés aux échantillons. Les eppendorfs à analyser sont soumis à une centrifugation de 5 min., puis à une sonication de 5 min. et finalement à une centrifugation de 1 min. Sur un disque en acier inoxydable, 14 dépôts de 0,5 gl de matrice (acide a-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamique à saturation dans de l'acétone) sont réalisés. Une fine couche microcristalline uniforme est obtenue. 0,5 gl d'une solution de 2% TFA/eau sont déposés sur cette sous-couche sur les 14 dépôts, puis 0,5 .l d'échantillon à analyser sont ajoutés. Dans cette goutte ainsi formée, 0,5 gl d'une solution à saturation d'acide a-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamique dans 50% acétonitrile/eau sont ajoutés. Après un séchage à température ambiante pendant 30 min., les dépôts cristallins sont lavés avec 2 gl d'eau qui sont immédiatement évacués par un souffle d'air. Tous les spectres sont obtenus sur un spectromètre de masse BRUKER BIFLEX (marque de commerce) équipé d'un réflectron. Les mesures (90 à 120 tirs laser sur l'ensemble du dépôt) sont accumulées pour obtenir un spectre de masse qui soit le plus représentatif de l'ensemble des peptides présents dans le sandwich matrice-échantillon. Pour chaque dépôt, une calibration avec les peptides de l'autolyse de la trypsine a été faite afin de pouvoir utiliser une précision de mesure inférieure à 100 ppm.
Les résultats de spectrométrie de masse ont été recherchés dans les banques de données en utilisant 2864086 18 l'algorithme MS- FIT du logiciel Protein Prospector (http://prospector.ucsf.edu).
É Séquençage N-terminal des peptides de digestion.
- (i) Extraction et séparation par HPLC des peptides 5 de digestion.
Les peptides obtenus après digestion par la trypsine ont été extraits en 3 fois 30 min. dans un bain de sonication avec 0,1% TFA/60% acétonitrile. Les solutions d'extraction sont réunies et séchées jusqu'à 20 gl en speed vac. Après dilution dans 80 gl de tampon A (0,1 % TFA/eau), les extractions des bandes de gel, digérées avec de la trypsine, sont injectées sur une colonne C18/MZ-Vydac/(125x1,6)mm/5 m (nom commercial). L'élution des peptides se fait à un débit de 150 l/min. et dans un gradient allant de 5% de tampon B (0,09% TFA/80% acétronitrile) à 40% de tampon B en 40 min., puis de 40% de tampon B à 100 % de tampon B en 10 min. La détection est faite par mesure de l'absorbance UV à 205 nm. La collecte des pics est effectuée dans des tubes eppendorf de 500 l. Les pics peptidiques individuels collectés sont ensuite soumis à une analyse de la séquence en acides aminés N-terminale.
- (ii) Séquençage N-terminal: Les fractions correspondant à un seul pic de masse ont été analysées par dégradation d'Edman sur un séquenceur (Modèle 477A PERKIN ELMER/Applied Biosystems). Les conditions de séquençage sont celles décrites par le constructeur. Une micro cartouche a été utilisée pour le dépôt des échantillons et les PTH-AminoAcid sont identifiés avec un système HPLC online (Modèle 120A PERKIN ELMER/Applied Biosystems).
É Résultats Les résultats de l'analyse par spectrométrie de masse et du séquençage sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
MW (kDa) ISM IS SEP Contrôle SEP Contrôle Albumine Albumine ND ND sérique sérique humaine humaine Inhibiteur de Inhibiteur de ND ND la trypsine la trypsine inter-alpha inter-alpha Perlecan* Perlecan* Perlecan* Perlecan NI NI Protéine de Protéine de liaison au liaison au rétinol rétinol NI NI Protéine Pas présente activatrice du Pas détectée GM2 18 Protéine Pas de bande Protéine Pas de bande activatrice du sur le gel activatrice du sur le gel GM2 GM2 14 MRP14 Pas de bande MRP14 Pas de bande sur le gel sur le gel 8 Non identifiée Pas de bande Saposine B Pas de bande sur le gel sur le gel MW: poids moléculaire moyen ISM: identification par spectrométrie de masse IS: identification par séquençage NI: pics restants non identifiés ND: non déterminé * : identique au fragment C-terminal de 20 kDa du perlacan probablement résultant de la protéolyse antérieure de la protéine complète de 467 kDa dans les urines ou 10 pendant le procédé de purification.
Un mélange de protéines co-purifiées était encore présent à la fois dans la fraction finale de purification SEP et dans la fraction contrôle correspondante. Les protéines identifiées dans ces deux échantillons ont été considérées comme étant non pertinentes en raison de l'absence d'activité gliotoxique dans ces deux fractions.
En conséquence, GM2AP (18kDa), MRP14 ou calgranuline B (14kDa), et saposine B (10 kDa) ont été considérées comme des 20 candidats potentiels pour l'activité gliotoxique.
Par ailleurs, le séquençage N-terminal des fragments digérés par la trypsine de la bande de 18 kDa dans la fraction SEP a montré la présence de polymorphisme dans différentes positions de GM2AP. Une mutation dans l'exon i, à la position 19 de la séquence en acides aminés de GM2AP, où une alanine est remplacée par une thréonine. Une mutation dans l'exon 2, où un acide aspartique est remplacé par une phénylalanine à la position 40 de la séquence en acides aminés de GM2AP. Cette mutation n'a jamais été retrouvée dans l'ADN génomique de donneurs sains ou de malades. Deux autres mutations dans l'exon 2, respectivement aux positions 59 et 69 de la séquence en acides aminés de GM2AP qui correspondent au remplacement d'une isoleucine par une valine et d'une méthionine par une valine. Une mutation dans l'exon 4 qui consiste en un remplacement d'une valine par une alanine à la position 153 de la séquence en acides aminés de GM2AP s'est révélé être un nouveau polymorphisme non décrit après différents séquençages de l'ADN génomique de lymphocytes provenant d'individus sains (donneurs de sang) et de patients atteints de sclérose en plaques. Cette mutation dans l'exon 4 a été retrouvée chez 3 sur 27 patients SEP testés, ainsi que chez 8 sur 27 individus de contrôle suggérant un polymorphisme normal. Une autre mutation est retrouvée dans l'exon 4, à la position 171 de la séquence en acides aminés de GMPA2, où une lysine est remplacée par une glutamine.
Les séquences en acides aminés de GM2AP et de GM2AP mutée sont respectivement représentées dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, étant entendu que dans ces deux séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 on peut trouver indifféremment à la position 153 une valine ou une alanine, puisque la mutation dans l'exon 4 pour cette position suggère un polymorphisme normal.
Exemple 4: Protéines recombinates.
Des protéines recombinantes (achetées ou produites par 30 transfection) ont été utilisées pour évaluer le potentiel gliotoxique des protéines candidates.
Les protéines dites non humaines , c'est à dire des protéines recombinantes produites dans un système d'expression procaryote (E. cou) par transformation avec un plasmide contenant l'insert à exprimer, ou dans un système d'expression eucaryote dans des levures ou cellules d'insectes infectées par 2864086 21 le baculovirus ayant intégré l'insert à exprimer, suivantes ont été utilisées: La protéine MRP14 (ou Calgranuline B ou S100A9) fusionnée en N-terminal avec une queue histidine et produite dans E. coli; la protéine MRP8 (ou Calgranuline A ou S100A8) produite dans E. coli; et l'hétérocomplexe MRP14/MRP8 (ou Calprotectine) natif humain, achetés au Dr C. Kerkhoff (université de Münster, Allemagne).
La protéine GM2AP (précurseur de l'activateur du ganglioside GM2) fusionnée en N-terminal avec une queue histidine produite en Baculovirus et la protéine Sap B (Saposine B) produite en levure, achetées au Pr K. Sandhoff (Institut Kekule, université de Bonn, Allemagne) . Ces protéines possèdent leur propre activité physiologique 15 décrite dans la littérature.
Les protéines dites humaines , c'est à dire des protéines recombinantes produites dans un système d'expression eucaryote dans des cellules humaines transfectées par un plasmide approprié ayant intégré l'insert à exprimer ont été produites selon le protocole décrit ci- dessous.
Les cellules 293T (cellules primaires embryonnaires humaines de rein transformées par un adénovirus de type 5, exprimant l'antigène T) ont été cultivées à 37 C en atmosphère humide à 5% de CO2, en DMEM 4,5 g/1 de Dglucose supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) décomplémenté, du glutamax (580 mg/1), de la pénicilline (500 unités/1) et de la streptomycine (500 g/1).
Pour réaliser la transfection transitoire, des plasmides appropriés contenant le cDNA des protéines d'intérêt, MRP14, GM2AP et GM2AP mutée (Acide aspartique/Phénylalanine/position 40) précédés d'un peptide de sécrétion (IgK) en N terminal, ont été utilisés.
Les cellules 293T sont transfectées avec un réactif Transfectant composé de lipides qui complexent et transportent l'ADN dans les cellules. Les cellules 293T sont trypsinées, ensemencées à 2 millions de cellules par flacon de 2864086 22 cm2, et incubées 1 nuit à 37 C, en atmosphère humide et 5% CO2 dans 10 ml de milieu de culture (DMEM 4,5 g/1 de D-glucose supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté, du glutamax {580 mg/1), de la pénicilline (100 unités/ml) et de la streptomycine (100 .g/ml)).
La solution de transfection est préparée extemporanément en utilisant le rapport 3/2 [volume de Transfectant ( l)/quantité d'ADN plasmidique ( g)] qsp lml de milieu sans SVF.
Après 45 minutes de contact à température ambiante, la solution de transfection est ajoutée goutte à goutte sur un tapis cellulaire non confluent.
Après 72 heures d'incubation à 37 C, en atmosphère humide et 5% CO2, les surnageants sont récupérés, centrifugés 15 10 minutes à 2500 tpm.
La quantification de protéine produite est alors réalisée soit par le kit de dosage MRP Enzyme Immunoassay (nom commercial) commercialisé par BMA Biomedicals AG, Augst, Switzerland, en suivant la notice pour la protéine recombinante humaine MRP14, soit par la technique du Western Blot semi quantitatif avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-GM2AP. Ces techniques donnent des valeurs indicatives pour une comparaison relative.
Les surnageants bruts issus de cette production seront 25 utilisés notamment pour les tests d'activité toxique et de détection.
Exemple 5: Toxicité des protéines non humaines . La toxicité des protéines recombinantes non humaines MRP14, MRP8, GM2AP, SapB a été évaluée par le test MTT.
Les protéines ont été testée dans une gamme définie à partir de l'évaluation de la concentration de chaque protéine dans différentes urines. Les gammes sont réalisées dans différents tampons, soit dans la solution TUC, soit dans deux types d'urine: des urines provenant de patients atteints de 2864086 23 sclérose en plaques et qui étaient toxiques par le test MTT (urine SEP), et des urines provenant d'un recrutement de donneurs non SEP qui n'étaient pas toxiques par le test MTT (urine normale). Les urines avaient au préalable été traitées 30 min. à 56 C et filtrées.
Les résultats montrent que, prises individuellement, les protéines testées dans la solution TUC et dans les urines normales ne sont pas toxiques par le test MTT. Aucun effet significatif des protéines GM2AP, MRP14 et Saposine B n'est mis en évidence dans les urines SEP par le test MTT. On note une inhibition de la toxicité avec une dose MRP8 égale ou supérieure à 3 ng.
Ces résultats sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 2A: Gamme dans la solution TUC Protéine Quantité en ng Cytotoxicité en % GM2AP 5 -48 2,5 -19 1,25 -122 0 -55 MRP14 10 -20 -22 2,5 -34 0 -11 Saposine B 50 -9 -8 -16 -3 -16 0 -18 MRP8 3 -18 1,5 -19 0, 5 -14 0 -19 Tableau 2B: Gamme dans les urines Protéine Quantité en ng Urine SEP Urine normale Cytotoxicité en % Cytotoxicité en % GM2AP 5 34 -11 2,5 41 -7 1,25 32 -13 0 42 -4 MRP14 10 29 -8 29 10 2,5 33 9 0 37 7 Saposine B 100 44 ND 54 ND 58 ND 67 ND 70 ND 69 ND 0 62 ND MRP8 3 -18* 8 1,5 50 5 0,5 46 10 0 40 8 Pour MRP14 et MRP8 il s'agit d'un pourcentage de cytotoxicité moyen sur 2 essais ND: non déterminé *dans une autre urine SEP, la même inhibition de toxicité est observée Des combinaisons de protéines GM2AP/MRP14, Saposine B/MRP14 et Saposine B/GM2AP/MRP14 ont ensuite été préparées dans la solution TUC et dans les deux types d'urine comme décrit ci-dessus. En combinaisons contrôles , l'hétérocomplexe MRP14/8 ou la protéine MRP8 remplacent la protéine MRP14 dans les différentes combinaisons GM2AP/MRP14/8, Saposine B/GM2AP/MRP8. Les combinaisons contrôles ont été préparées de la même manière. Toutes les combinaisons ont été incubées une nuit à 4 C avant d'être testées pour leur toxicité par le test MTT.
Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3A: Gamme dans la solution TUC Combinaisons de protéines Cytotoxicité % GM2AP (ng) MRP14 (ng) 1 -12 0,5 -8 1 -9 0,5 18* 0 0 0 GM2AP (ng) MRP14/8 (ng) 20 -14 10 -21 20 -12 10 -16 0 0 0 Sap. B (ng) MRP14 (ng) 1 -17 0,5 -19 1 -9 0,5 -8 0 0 0 GM2AP (ng) MRP14 (ng) Sap. B (ng) 1 30 -11 1 15 -4 0,5 30 -15 0,5 15 -14 1 30 -9 1 15 -5 0, 5 30 -21 0,5 15 -17 o o 0 o MRP14/8: hétérocomplexe natif humain Sap. B: Saposine B *: moyenne de deux essais Les résultats du tableau 3A montrent que les combinaisons GM2AP/MRP14, GM2AP/MRP14/8, Saposine B/MRP14 et GM2AP/MRP14/Saposine B n'ont aucun effet toxique dans le TUC, quelque soit la quantité testée. Seule la combinaison GM2AP(lOng)/MRP14(0,5ng) semblait présenter une toxicité, mais cette activité toxique n'a ensuite pas été retrouvée dans deux essais supplémentaires comparables. De plus, des essais additionnels ont été réalisés avec la combinaison GM2AP/MRP14 en utilisant différentes quantités de GM2AP et de MRP14. Les résultats obtenus ont confirmés que la combinaison GM2AP/MRP14 n'a pas d'effet toxique dans le TUC, quelque soit la quantité testée.
Tableau 3 B: Gamme dans les urines normales.
Combinaison de protéines Cytotoxicité % Cytotoxicité % Quantités en ng Urine normale 1 Urine normale 2 GM2AP MRP14 1 -10 26 0,5 0 25 1 3 8 0, 5 -6 20 0 0 -19 10 Sap.B MRP14 1 0 16 0,5 -4 15 1 -10 13 0,5 3 11 0 0 -19 10 GM2AP MRP14 Sap. B 1 30 -19 19 1 15 8 9 0,5 30 -27 25 0,5 15 16 13 1 30 7 17 1 15 5 32 0,5 30 14 23 0,5 15 4 22 0 0 0 -88 12 ap. B: Saposine B Comme cela ressort du tableau 3B, la combinaison GM2AP/MRP14 est toxique dans l'urine normale puisque la toxicité augmente en fonction de l'augmentation de la quantité 10 2864086 26 de protéine GM2AP. Mais cette toxicité apparaît peu stable et peu reproductible et semble être dépendante de l'échantillon d'urine (voir comparaison du pourcentage de cytotoxicité entre urine normale 1 et urine normale 2, dans le tableau 3B).
La combinaison Saposine B/MRP14 est à la limite de la significativité dans l'urine normale.
Les résultats obtenus avec la combinaison GM2AP/MRP14/Saposine B sont difficilement interptétables.
La toxicité des combinaisons de protéines GM2AP/MRP14 et Saposine B/MRP14 a également été testée vis à vis d'urines normales et d'urines toxiques issues de patients atteints de sclérose en plaques (urine SEP).
Les résultats sont présentés dans le tableau 3C.
Tableau 3C: Gamme dans les urines non SEP et SEP Combinaisons de Cytotoxicité % Cytotoxicité % Cytoxocité % protéines (ng) Urine normale 1 Urine normale 2 Urine SEP GM2AP MRP14 1 -10 26 7 0,5 0 25 12 1 3 8 8 0,5 -6 20 9 0 0 -19 10 22 Sap.B MRP14 1 0 16 32 0,5 -4 15 28 1 -10 13 16 0,5 3 11 14 0 0 -19 10 22 Sap. B: saposine B La combinaison Saposine B/MRP14 n'a aucun effet 20 toxique dans les urines normales et dans l'urine SEP, quelque soit la quantité testée.
La combinaison GM2AP/MRP14 ne présente pas d'effet toxique vis à vis de l'urine normale 1, mais présente un effet toxique vis à vis de l'urine normale 2 (quand GM2AP augmente, ela toxicité de l'urine augmente). On constate par ailleurs un effet inverse vis à vis de l'urine SEP. Quand la quantité de MRP14 augmente, la toxicité de l'urine diminue.
Exemple 6: Toxicité des protéines humaines Les protéines GM2AP, GM2AP mutée dans l'exon 2 et MRP14 produites comme décrit dans l'exemple 3 ont été testées pour leur toxicité par le test MTT, à partir des surnageants de culture des cellules 293T les contenant.
Les combinaisons suivantes ont également été effectuées à partir des surnageants de culture des cellules 293T: GM2AP/MRP14, GM2AP mutée/MRP14, GM2AP/MRP14/MRP8. Les combinaisons préparées ont ensuite été incubées une nuit à 4 C, puis elles ont été testées pour leur toxicité par le test MTT.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4A GM2AP (ng) MRP14 (ng) C % lot 1 C % lot 1 C % lot 2 C % lot 2 essai 1 essai 2 essai 1 essai 2 1 4 23 11 12 0,5 31 29 20 20 0 -26 -26 8 8 1 -13 -13 0 8 0,5 -14 -11 6 24 0 -25 -25 0 0 0 1 -24 -24 ND ND 0 0,5 -8 -8 ND ND C % : cytotoxicité en pourcentage ND: non déterminé Concentrations approximatives en protéines dans les surnageants: MRP14 lots 1 et 2: 350 ng/ml; GM2AP lot 1: 300 ng/ml lot 2: 200 ng/ml Pour certaines valeurs, indiquées en caractères gras, certaines combinaisons GM2AP/MRP14 sont faiblement cytotoxiques (de 20 à 30% de cytotoxicité) avec un optimum pour la combinaison GM2AP(20 ng)/MRP14(0,5 ng).
MRP14 seule n'est pas cytotoxique. GM2AP seule n'est pas considérée comme étant cytotoxique, même si une très faible toxicité est retrouvée dans les essais 1 et 2 effectués sur le lot 2. En effet, la reproductibilité ne peut pas être parfaite car elle dépend du lot de production des surnageants.
2864086 28
Tableau 4B
GM2AP (ng) MRP14 (ng) C % lot 3 essai 1 C % lot 3 essai 2 100 29 41 50 36 17 10 10 8 5 31 1 1 rejet 9 0 18 2 100 rejet 28 50 31 16 10 21* -4 5 11 -6 1 -14 -7 0 2 -3 100 12* 13 50 rejet 22 10 -13 4 5 -30 4 1 -22 -4 0 ND ND 100 29* 18 50 15 6 10 -2 - 16 5 -22 -7 1 -21* -17 0 ND ND 100 22* 32 50 -9 9 10 -11 1 5 -29 -6 1 - 18 -4 0 ND ND 0 100 31 33 0 50 41* 22 0 10 4 11 0 5 ND ND 0 1 ND ND C % : cytotoxicité en pourcentage ND: non déterminé Concentration approximative de GM2AP et MRP14 dans le surnageant: 2 gg/ml Rejet: % de cytotoxicité rejeté car l'écart type des DO des échantillons est supérieur à 50 * : écart type des DO des échantillons compris entre 16 et 11 Sans commentaire: écart type des DO des échantillons inférieur à 10.
Les résultats montrent que les protéines seules, dans les surnageants, ne sont pas toxiques, sauf de manière non spécifique à de très fortes quantités (100 ng de MRP14). Seule la combinaison GM2AP (100 ng)/MRP14 (100 ng) peut être considérée comme présentant une cytotoxicité relative.
Si la protéine GM2AP est remplacée par la protéine GM2AP mutée dans cette combinaison, le même type de toxicité est obtenue pour certains mélanges, comme montré ci-dessous.
Tableau 4C
GM2AP mutée MRP14 (ng) C % lot 2 C % lot 2 C % lot 2 (ng) essai 1 essai 2 essai 3 1 16 25 53 0,5 18* 18 50 1 12 15* 21 0,5 10 20 25* 0 -7 0 -7 0 1 -9 13 -16 C % : cytotoxicité * : écart type des Sans commentaire: en pourcentage DO des échantillons compris entre 14 et 11 écart type des DO des échantillons inférieur à 10 Concentration approximative en protéines dans les surnageants: GM2AP mutée: 200 10 ng/ml; MRP14: 350 ng/ml.
Pour de nombreuses valeurs, indiquées en caractères gras, la combinaison GM2AP mutée/MRP14 est toxique. La protéine GM2AP mutée seule n'a pas d'effet cytotoxique. MRP14 seule est 15 considérée comme ne présentant pas d'activité cytotoxique.
La cytotoxicité des combinaisons de surnageants contenant les protéines recombinantes humaines, GM2AP/MRP14 et GM2AP mutée/MRP14 est retrouvée dans un même ordre de grandeur, 20 avec une stabilité plus importante en fonction du lot de production des protéines, qu'avec les protéines recombinantes non humaines. Mais cela ne correspond pas à la stabilité, la reproductibilité et l'intensité de l'activité gliotoxique retrouvée dans les fluides biologiques de patients SEP. 25
Tableau 4D
GM2AP MRP14/18 (ng) C % lot 1 C % lot 1 C % lot 2 (ng) essai 1 essai 2 essai 1 20 17 -13 16 10 6 -2 23 0 -26 -26 8 20 -14 -16 1 10 -15 -24 12 0 -25 -25 0 C % : cytotoxicite en pourcentage Concentration approximative en protéines dans les surnageants: GM2AP (lot 1) : 300 ng/ml, GM2AP (lot 2) : 200 ng/ml. Concentration de MRP14/8 native: 1,3 mg/ml.
Il ressort des résultats du tableau 4D que GM2AP seule n'a pas d'activité cytotoxique et que pour certaines valeurs, indiquées en caractères gras, la combinaison GM2AP/MRP14/MRP8 a un effet cytotoxique. Cette cytotoxicité est dépendante du lot de surnageant utilisé.
Tableau 4E
GM2AP mutée (ng) MRP14/18 (ng) C % lot 2 essai 1 20 5 10 6 0 15 20 -18 10 4 0 -2 C % : cytotoxicité en pourcentage Concentration approximative en protéines dans les surnageants: GM2AP mutée: 200 10 ng/ml. Concentration de MRP14/8 native: 1,3 mg/ml.
Il ressort du tableau 4E que la combinaison GM2AP mutée/MRP14/MRP8 ne présente pas d'activité cytotoxique.
Ces études montrent qu'aucune des protéines identifiées dans la fraction gliotoxique purifiée à partir d'urines SEP ne reproduisait, seule, l'activité gliotoxique recherchée et que les combinaisons de protéines produites sous forme de recombinants non-humains ou humains ne reproduisent que faiblement et de manière peu reproductible (même si une amélioration est notée avec les recombinants humains ) l'activité gliotoxique. Les résultats obtenus ne répondent pas à l'ensemble des critères caractérisant l'activité gliotoxique (activité élevée, stabilité, reproductibilité, effet dose-réponse).
Les résultats montrent qu'il manque un composant essentiel qui n'a pas été identifié dans l'analyse protéique.
Les inventeurs ont alors trouvé de manière surprenante que des lipides, notamment des lipides complexes, sont des candidats intéressants dans ce contexte. A cet effet, le ganglioside GM1, le ganglioside GM2 et le sulfatide ont été testés. Parmi ces lipides, le ganglioside GM2 s'est avéré le seul probant, comme le montrent les exemples qui suivent.
Exemple 7: Toxicité des protéines recombinantes 5 humaines en association avec le ganglioside GM2.
Le ganglioside GM2 (fourni par le Professeur J. Portoukalian (Lyon France) ) est ajouté à une concentration de 50 g/ml final aux combinaisons de protéines recombinantes humaines déjà réalisées, impliquant les protéines MRP14, GM2AP et GM2AP mutée.
Les combinaisons GM2AP/MRP14 et GM2AP mutée/MRP14 ont été testées dans une gamme de protéine: 0, 5, 10, 20, 50, 100 ng pour les protéines recombinantes GM2AP et GM2AP mutée et jusqu'à 200 ng pour la protéine MRP14. Ces gammes ont été faites en association ou non avec le ganglioside GM2.
Après mélange, les combinaisons sont incubées une nuit à 4 C, leur toxicité est ensuite évaluée par le test MTT.
Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau 5 20 et dans la figure annexée.
Tableau 5A
Mesure de l'activité gliotoxique des protéines humaines combinées et associées au ganglioside GM2 (50 /g/ml final) GM2AP (ng) MRP14 (ng) C % avec gM2G lot 3 100 56* 10 58 5 71 1 49 0 20 100 64* 10 33 5 29 1 32* 0 17 100 56 10 14 5 6 1 6 0 -5 100 43 10 26 5 8 1 4 0 -15 100 13 10 7 5 - 2 1 -16 0 -10 0 100 30 0 10 -23 0 5 -19 0 1 -8 0 0 8 C %: cytotoxicité en pourcentage gGM2: ganglioside GM2 * : Ecart type DO des échantillons compris entre 13 et 11 Sans commentaire: Ecart type DO des échantillons inférieur à 10 Concentrations approximatives dans les surnageants: GM2AP et MRP14: 2 gg/ml La combinaison GM2AP/MRP14 associée à une concentration constante de ganglioside présente un effet gliotoxique qui augmente parallèlement à la quantité en protéine MRP14. De plus, pour des quantités croissantes de la protéine GM2AP (20 et 10 ng), un effet de dose-réponse typique s'élevant par paliers, est obtenu. Cependant aux points extrêmes, lorsqu'il n'y a pas assez de protéine GM2AP (5 ng) il n'y a pas de toxicité. Au contraire, s'il y en a trop de protéine GM2AP (50 ng et 100 ng) il y a saturation de la toxicité avec un plateau vers 60%. En effet, seules les cellules CLTT1-1 en prolifération dans la culture pendantl'exposition au facteur gliotoxique sont sensibles. Ceci explique que les plateaux de gliotoxicité n'atteignent pas 100%.
Tableau 5B
Mesure de l'activité gliotoxique des protéines humaines combinées, associées ou non, au ganglioside GM2 (50 g/ml 25 final) GM2AP mutée MRP14 (ng) C % lot 4 C % lot 4 C % lot 4 C % lot 4 (ng) sans gGM2 sans gGM2 avec gGM2 avec gGM2 essai 1 essai 2 essai 1 essai 2 200 ND 10 ND 32 100 -15 -8 40 55 50 -5 -18 37 7 10 -8 -33 32 -19 5 -15 -33 20 -9 1 -5 -26 31 -14 0 -11 -44 11 -61 200 ND 19 ND 25 100 3 5 30 4 2864086 33 50 2 -1 18 -21 10 -10 -23 17 -28 5 -9 -15 -2 -21 1 -23 -11 12* -18 0 -7 -40 9 -57 200 ND 8 ND 5 100 -7 -3 32 -13 50 -18 -16 34 -15 10 -18 -19 19 -8 5 -23 -8 17 13 1 -12 -12 16 -20 0 -4 -26 1 -33 200 ND -2 ND 33 100 -10 -9 24 8 50 -12 -19 2 -8 10 -17 -16 -6 -34 5 -14 -13 -4 -11 1 -30 -37 -20 -12 0 ND ND ND ND 200 NID -10 ND 26 100 -5 -1 39 -17 50 -8 -3* 32 -18 10 -14 -7 12 -25 5 -27 -11 16 -29 1 -26 -15 15 -39 0 NID NID NID NID 0 200 ND 45 NID 72 0 100 16 12 32 21 0 50 -14 -8 24 -6 0 10 0 -5 8 -6 0 5 ND ND ND NID 0 1 ND ND ND ND 0 0 ND NID -21 -21
C _
: cytotoxicite en pourcentage gGM2: ganglioside GM2 * : Ecart type DO des échantillons compris entre 13 et 11 Sans commentaire: Ecart type DO des échantillons inférieur à 10 Sans ganglioside GM2, les combinaisons GM2AP mutée/MRP14 ne sont pas gliotoxiques. Une augmentation globale de la cytotoxicité du mélange avec le ganglioside GM2 est observée par rapport aux combinaisons variabilité des mesures est apparemment l'utilisation de la protéine GM2AP l'activité apparaît significative et (cf. : maximum atteint sur le prolifération pendant le test, comme les concentrations les plus fortes, variables, GM2AP mutée et MRP14.
sans ganglioside. La plus importante avec mutée. Globalement, atteint un plateau maximum pool des cellules en discuté précédemment) pour selon un effet-dose à deux 2864086 34 Afin de savoir si l'action du ganglioside GM2 est bien spécifique de la toxicité des combinaisons de protéines recombinantes humaines GM2AP/MRP14 (5 ng de MRP14 et 50 ng ou 100 ng de GM2AP), d'autres lipides ont été testés en parallèles: le ganglioside GM1 et le sulfatide. Les gammes de concentration utilisées sont 0, 10, 20, 30, 50 g/ml final. Une fois les lipides ajoutés, les combinaisons sont incubées une nuit à 4 C, leur toxicité est ensuite évaluée dans le test MTT. Les résultats, présentés dans les tableaux 5C et 5D, montrent que seules les associations avec le ganglioside GM2 pour les combinaisons GM2AP/MRP14 aux doses 30 .g/ml et 50 g/ml sont toxiques pour les cellules gliales (respectivement 27% et 30%). Les autres lipides ne montrent aucune toxicité avec les combinaisons protéiques.
Tableau 5C
Influence du ganglioside GM2 dans l'activité gliotoxique des protéines recombinantes humaines combinées GM2AP/MRP14 GM2AP (ng) MRP14 (ng) Concentration en Cytotoxicité % gGM2 (gg/ml) 5 0 -14 5 5 -1 5 10 4 5 20 15 5 30 28 5 50 34 5 0 10 5 5 12 5 10 21 5 20 24 5 30 25 5 50 37 - 5 - -26 - -5 - - -10 - 0 -29 - 5 -91 - 10 -11 - 20 -18 - 30 -12 - 50 - 9 - 5 0 -25 - 5 30 -29 - 5 50 -51 Pour 1 essai GM2AP 100 ng, il s'agit d'une moyenne de deux essais. 20 gGM2: ganglioside GM2
Tableau 5D
Influence du ganglioside GM2 dans l'activité gliotoxique des protéines recombinantes humaines combinées GMA2AP/MRP14 GM2AP (100 ng)/MRP14 (5 ng) Cytotoxicité % Sans lipide -12 Avec GM2 (10 gg/ml) -4 Avec GM2 {20 gg/ml) 2 Avec GM2 {30 gg/ml) 17 Avec GM2 (50 gg/ml) 25 Avec GM1 (10 gg/ml) -12 Avec GM1 (20 g/ml) -4 Avec GM1 (30 gg/ml) -1 Avec GM1 (50 gg/ml) 2 Avec sulfatide (10 g/ml) -12 Avec sulfatide (20 g/ml) -19 Avec sulfatide(30 g/ml) -13 Avec sulfatide (50 gg/ml) 5 Contrôle -19 GM2AP (100 ng) Contrôle -32 GM2AP (50 ng) Contrôle -18 MRP14 (5 ng) Contrôle GM2 3 Contrôle GM1 rejet Contrôle sulfatide -21 Les résultats de l'étude montrent que: l'activité est associée à un hétérocomplexe protéique impliquant les protéines GM2AP ou GM2AP mutée et MRP14; c'est l'ajout d'un lipide, tel que le ganglioside GM2, qui a permis d'obtenir des niveaux d'activité, une reproductibilité et des effets dose-réponse, compatibles avec la reproduction de l'activité gliotoxique recherchée; la mutation trouvée sur la protéine GM2AP n'est pas indispensable au déterminisme de la gliotoxine in vitro. Cependant, in vivo, elle peut être déterminante si elle est nécessaire pour le processus de biodisponibilité de la protéine GM2AP (par exemple dans le milieu extra- cellulaire du système nerveux central).
Ces éléments démontrent donc qu'un hétérocomplexe MRP14/GM2AP ou MRP14/GM2AP mutée associé au ganglioside GM2 est 20 le vecteur principal, voire unique, de l'activité gliotoxique.
Exemple 8: Mise au point d'un immunodosage du complexe gliotoxique Préparation des échantillons avant le test ELISA.
2864086 36 (i) Echantillons testés.
Les échantillons testés sont: d'une part les protéines recombinantes humaines en combinaison (GM2AP+MRP14) avec ou sans ganglioside GM2, dilués ou non dans des urines normales, afin de détecter le complexe recombinant actif, d'autre part des urines normales et SEP pour une détection directe dans les urines.
Les échantillons, une fois préparés, sont incubés 24 10 heures à 4 C avant le test de détection.
Les protéines recombinantes humaines sont utilisées sous forme de surnageants de production bruts, récupérés après la transfection transitoire des cellules 293T, avec les contrôles négatifs appropriés en parallèle. Les systèmes de dosage des protéines MRP14 et GM2AP utilisés sont semi-quantitatifs et les quantités précisées, indicatives. Les résultats sont présentés dans les exemples qui suivent.
(ii) Traitement des échantillons.
Comme cela est montré, dans les exemples suivants, le procédé de détection utilisant les anticorps anti-MRP14 et anti-GM2AP dans un format ELISA sandwich , permettent d'obtenir des résultats positifs.
Toutefois, les inventeurs ont optimisé ce procédé de détection en réalisant un traitement préalable de l'échantillon comprenant une étape de digestion par la protéinase K des protéines en présence, suivie d'une étape d'inactivation de cette protéase par un procédé original de précipitation à l'acide trichloroacétique, puis d'une neutralisation du pH avec un tampon tris-maléate, sélectionné pour sa compatibilité ultérieure avec un essai ELISA sandwich.
Ce traitement de l'échantillon, original dans ses différentes étapes a été appliqué par la suite aux analyses qui sont présentées dans les exemples suivants et est décrit en détail ci-dessous.
2864086 37 Les échantillons (mélange de protéines recombinantes ou urines) sont traités à la protéinase K avant une détection du complexe selon le protocole suivant: 0,3 mg de protéinase K est ajouté pour 100 gl d'échantillon. Après digestion une heure à 37 C, une précipitation à l'acide trichloracétique est réalisée afin d'inhiber l'action de la protéinase K. L'acide trichloracétique 90% (90 g d'acide trichloracétique pour 48 ml d'eau distillée), est ajouté à l'échantillon {15% du volume initial de l'échantillon). Le mélange est incubé 30 minutes à 4 C.
Après centrifugation de 30 minutes à 13 000 tpm, le culot est repris avec un volume égal au volume initial de l'échantillon par le tampon TRIS Maléate 0.2M pH 6,2 (dans les essais sans facteur de concentration) ou dans un volume minimum (pour réaliser une concentration volumique des protéines non digérées).
Après contrôle par la technique de Western Blot des échantillons traités à la protéinase K, une observation peut être faite et le traitement peut être optimisé en augmentant la quantité de protéinase K et son temps d'action.
Exemple 9: Protocole de détection de l'hétérocomplexe dans un essai ELISA sandwich.
(i) Obtention des anticorps: les anticorps suivants 25 ont été produits selon les protocoles décrits ci-dessous: - anticorps polyclonaux (bioMérieux) : - anticorps polyclonal de lapin 196 (anti-peptide MRP14) anticorps polyclonal de lapin 79 (anti-protéine recombinante GM2AP).
- anticorps monclonaux (bioMérieux) : - 4A7B10 - 5H7C10 - 2B9H2 - 10E11A11 - 13H9C9 - 19C11010 - 13D1E5 - 2G12H5 Anticorps monoclonaux anti- GM2AP: 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19011010, 2G12H5.
Les souris ont été immunisées selon le protocole suivant: au jour JO injection intrapéritonale de 75 g du complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund complet. Aux jours J23, J37 nouvelle injection intrapéritonéale de la même quantité de complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund imcomplet. Quatre jours avant la fusion faire une injection intraveineuse de 50 g d'antigène GM2AP dilué en eau physiologique.
1900 surnageants ont été criblés par technique d'ELISA indirect. Les plaques ont été coatées avec 100 l d'antigène (le complexe GM2APMRP14) à l g/ml en tampon bicarbonate 0.05M, pH 9.6. Les plaques coatées ont été incubées une nuit à la température de 18-22 C. Les plaques ont été saturées avec 200 l de PBS-lait 1% et soumises à incubation 1 heure à 37 +/-2 C. 100 l de surnageants ou de liquide d'ascites dilués en tampon PBS-tween 20, 0.05% ont été ajoutés et les plaques ont été incubées 1 heure à 37 +/-2 C. 100 l d'anticorps polyclonal de chèvre anti-Ig(H+L) de souris conjugué à la phosphatase alcaline (Jackson Immunoresearch réf:115-055-062), dilué en tampon PBS- BSA 1% au 1/2000, ont été ajoutés et les plaques ont ensuite été incubées 1 heure à 37 +/-2 C. 100 l de PNPP (Biomérieux réf 60002990) à la concentration de 2mg/ml dans de la DEA-HCL (Biomérieux réf 60002989), pH=9,8, ont été ajoutés. Les plaques ont été soumises à incubation pendant 30 minutes à 37 +/-2 C. La réaction a été bloquée par addition de 100 l de NaOH, IN. Trois lavages sont effectués entre chaque étape avec 300 l de PBS-tween 20, 0,05%. Un lavage supplémentaire en eau distillée est effectué avant d'ajouter le PNPP.
2864086 39 surnageants se sont révélés positifs en ELISA indirect avec une DO > 0.9. Après les tests de spécificité les cinq anticorps précités sont produits.
Anticorps monoclonaux anti-MRP14: 2E9112, 4A7B10,.5H7C10.
Les souris ont été immunisées selon le protocole suivant: au jour JO une injection intrapéritonéale de 75 gg du complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund complet. Aux jours J23 et J37 injection intrapéritonéale de la même quantité de complexe en présence d'adjuvant de Freund incomplet. Quatre jours avant la fusion une injection intraveineuse de 50 gg d'antigène MRP14 dilué en eau physiologique.
1100 surnageants ont été testés et criblés par la technique d'ELISA indirect, telle que décrite ci-dessus. 300 surnageants se sont révélés positifs avec une DO >1. Après les tests de spécificité les trois anticorps précités sont produits.
Anticorps polyclonal de lapin 79 (anti-protéine 20 recombinante GM2AP).
Les lapins ont été immunisés selon le protocole suivant: au jour JO, lère prise de sang de 10 ml, 75 g de GM2AP ont été injectés par voie intrapéritonéale en présence d'adjuvant de Freund complet (AFC) (75 gg d'immunogène + qsp 0,5 ml d'eau physiologique 90/00+ 0,5 ml AFC). Aux jours J28 et J56 la même quantité d'immunogène a été injectée par voie intrapéritonéale dans les mêmes conditions en présence de 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet (AFI). Au jour J63 une 2ème prise da sang de 30 ml a été effectuée à l'oreille sans anticoagulant. Une 3ème prise de sang a été effectuée dans les mêmes conditions au jour J70.
Anticorps polyclonal de lapin 196 (anti-peptide MRP14).
Les lapins ont été immunisés selon le protocole 35 suivant: 2864086 40 Les lapins ont été immunisés selon le protocole suivant: au jour JO, lère prise de sang de 10 ml, 80 gg d'immunogène ont été injectés par voie intrapéritonéale en présence d'adjuvant de Freund complet (AFC) (80 g d'immunogène + qsp 0,5 ml d'eau physiologique 9 /00 + 0,5 ml AFC). Aux jours J28 et J56 la même quantité d'immunogène a été injectée par voie intrapéritonéale dans les mêmes conditions en présence de 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet (AFI). Au jour J63 une 2ème prise de sang de 30 ml a été effectuée à l'oreille sans anticoagulant. Une 3ème prise de sang a été effectuée dans les mêmes conditions au jour J70.
Ces anticorps sont utilisés en capture ou en détection. Quand ils sont utilisés en détection dans le test sandwich ELISA, les anticorps sont biotinylés.
(ii) Test ELISA sandwich: Le traitement des échantillons (protéinase K et précipitation TCA), s'il a lieu, est réalisé après la nuit d'incubation à 4 C et avant le test de détection ELISA sandwich.
L'anticorps de capture est coaté à 1 mg en tampon carbonatebicarbonate (50mM) pH 9.5, 100 l sont déposés dans les puits d'une microplaque à 96 puits. La plaque est recouverte d'un film protecteur et incubée une nuit à température ambiante. Après 3 lavages en PBS (Phosphate Buffered Saline) Tween 0,05%, les sites non spécifiques sont bloqués par PBS Tween 0,05%, sérum de chèvre (1/10 ) pour les anticorps monoclonaux ou 100 gl d'hydrolysat de caséine pour les anticorps polyclonaux. Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, les échantillons traités ou non sont déposés à raison de 100 l par puits et incubés ainsi 1 heure 30 minutes à 37 C sous agitation.
Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 l d'anticorps de détection biotinylés à 1 g/ml sont déposés dans chaque puits et incubés 1 heure 30 minutes à 37 C.
Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 l de streptavidine couplée à la HRP (peroxydase de raifort) à 0,2 2864086 41 gg/ml sont déposés dans chaque puits et incubés 1 heure 30 minutes à 37 C afin d'amplifier le signal.
Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 gl de solution d'OPD (dihydrochlorure d'orthophenylène diamine) à 2 g/1 sont déposés dans chaque puit et incubés 10 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée avec 100 l de H2SO4 1N. La lecture de la densité optique est effectuée à 492 nm.
Exemple 10: Détection de l'hétérocomplexe recombinant 10 humain.
Les dosages immuno-enzymatiques de l'activité gliotoxique caractérisée moléculairement dans les exemples précédents passent par un système antigène/anticorps mettant seulement en jeu les protéines impliquées (les protéines GM2AP, GM2AP mutée et MRP14) et par des anticorps (seuls ou en association) capables de détecter ce complexe moléculaire.
Le complexe recombinant correspond à l'association des surnageants de protéines recombinantes GM2AP (1000 ng) et MRP14 (50 ng) associées à 50 gg/ml final de ganglioside GM2.
(i) Détection de l'hétérocomplexe gliotoxique recombinant sans traitement à la protéinase K. Afin de savoir si les combinaisons toxiques étaient directement détectables, les protéines recombinantes humaines MRP14 et GM2AP sont combinées avec le ganglioside GM2, incubées une nuit à 4 C et testées par le test ELISA sandwich en utilisant les anticorps anti-MRP14 et anti-GM2AP.
Les combinaisons [MRP14, GM2AP et ganglioside GM2] sont diluées dans des urines normales (non gliotoxiques dans le test de toxicité MTT). Les résultats sont présentés dans le tableau 6. Ces résultats montrent que des couples d'anticorps de capture anti-GM2AP/détection anti-MRP14 reconnaissent le complexe recombinant de façon extrêmement reproductible. Les résultats sont présentés dans le tableau 6.
Tableau 6
Anticorps capture Anticorps détection Essais Total positifs essais 1OE11A11 0 3 4A7B10 + 5H7C10 13D1E5 + 2G12H5 0 1 13H9C9 + 19C11C10 0 3 79 0 1 1OE11A11 1 3 2B9H2 13D1E5 + 2G12H5 0 1 13H9C9 + 19C11C10 0 3 79 0 2 4A7B10 +5H7C10 2 1 1OE11A11 2B9H2 0 2 196 0 1 4A7B10 +5H7C10 1 2 13D1E5 + 2G12H5 2B9H2 0 2 196 0 2 4A7B10 +5H7C10 0 1 13H9C9 +19C11C10 2B9H2 0 1 196 0 1 4A7B10 +5H7C10 2 2 79 2B9H2 2 2 196 0 1 Essais positives: nombre d'essais positifs Total essais: nombre total d'essais (ii) Détection de l'hétérocomplexe gliotoxique recombinant après traitement à la protéinase K. Comme décrit précédemment, l'activité gliotoxique résiste à la protéinase K. Aussi, en traitant les échantillons (combinaison GM2AP+MRP14+GM2) à la protéinase K, les protéines non complexées sont détruites, et le bruit de fond est diminué.
Comme dans la partie précédente, les combinaisons sont incubés à 4 C durant une nuit. Mais avant de les tester, les échantillons sont traités à la protéinase K et précipités au TCA (acide trichloroacétique), suivant le protocole décrit dans l'exemple 8 (ii).
Les résultats sont présentés dans le tableau 7. Ces résultats montrent notamment que les couples de capture anti-MRP14/détection anti-GM2AP [4A7B10+5H7C10]/[13H9C9+19C11C10], [4A7B10+5H7C10]/10E11A11, 2B9H2/10E11A11 et 2B9H2/[13H9C9+19C11C10] détectent le complexe recombinant dans les surnageants dilués dans les urines, après traitement à la protéinase K, de façon extrêmement reproductible. Le bruit de fond est significativement atténué.
2864086 43
Tableau 7
Anticorps capture Anticorps détection Essais Total positifs essais 10E11A11 2 3 4A7B10 + 5H7C10 13D1E5 + 2G12H5 0 1 13H9C9 + 19C11C10 2 3 79 0 1 1OE11A11 2 3 2B9H2 13D1E5 + 2G12H5 0 1 13H9C9 + 19C11C10 2 3 79 0 2 4A7B10 + 5H7C10 0 2 1OE11A11 2B9H2 0 1 196 0 1 4A7B10 +5H7C10 1 2 13D1E5 + 2G12H5 2B9H2 0 2 196 0 2 4A7B10 +5H7C10 0 1 13H9C9 +19C11C10 2B9H2 0 1 196 0 1 4A7B10 +5H7C10 0 2 79 2B9H2 1 2 196 0 1 Essais positives: nombre d'essais positifs Total essais: nombre total d'essais 5 Exemple 11: Détection de l'hétérocomplexe dans les urines de patients.
La détection directe du complexe dans les urines de patients a été testée sur deux urines représentatives: une 10 urine SEP et une urine normale.
Les résultats sont décrits le tableau 8. Ces résultats montrent que les couples d'anticorps de capture anti-MRP14/détection anti-GM2AP [4A7B10+ 5H7C10]/[13D1E5+2G12H5], [4A7B10+5H7C10]/10E11A11, 2B9H2/[13D1E5+2G12H5] et 2B9H2/[13H9C9+19C11C10] détectent le complexe.
Tableau 8
Anticorps de Anticorps de Nombre Urines sans capture détection d'essais traitement à la protéinase K SEP normale 2B9H2 13H9C9 + 19C11C10 1 0 0 2 0 0 4A7B10 +5H7C10 1OE11A11 1 0,102 0,067 2 0,030 0,011 4A7B10 +5H7C10 13D1E5 + 2G12H5 1 0,117 0 2B9H2 13D1E5 + 2G12H5 J. 0,152 0,006 2864086 44 Anticorps de Anticorps de Nombre Urine après capture détection d'essais traitement à la protéinase K SEP normale 239H2 13H9C9 + 19C11C10 1 0,149 0,060 2 0,141 0,020 4A7B10 +5H7C10 1OE11A11 1 0,130 0,087 2 0,741 0,563 4A7B10 +5H7C10 13D1E5 + 2G12H5 1 0,467 0,328 2B9H2 13D1E5 + 2G12H5 1 0,111 0,12 Pour les urines traitées à la protéinase K, il n'y a pas de concentration avec le
TCA
Les procédés décrits dans les exemples sont utiles comme outils de diagnostic, permettant le dosage d'un marqueur biologique de la sclérose en plaques, puisque les corrélations entre l'activité gliotoxique et la clinique se sont avérées très bonnes"3'4 Références bibliographiques: 1. Malcus-Vocanson, C. et al.(1998) A urinary marker for multiple sclerosis [letter]. Lancet 351, 1330.
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Claims (2)
- 46 REVENDICATIONS1. Facteur cytotoxique isolé, associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP muté/GM2/MRP14 dans lequel GM2AP muté correspond à la séquence SEQ ID NO: 2.2. Procédé de détection et/ou de quantification d'un facteur cytotoxique associé à la sclérose en plaques, tel que défini a 10 la revendication 1, selon lequel: (i) on dispose d'un échantillon biologique à tester, (ii) on met en contact ledit échantillon biologique avec: au moins un anticorps de capture, ledit anticorps de capture étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2, GM2AP mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 2, au moins un anticorps de détection marqué, ledit anticorps de détection étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2, GM2AP mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 2, et (iii) on détecte et/ou quantifie le facteur cytotoxique par détection et/ou quantification de l'anticorps de détection marqué.3. Procédé selon la revendication 2, selon lequel l'échantillon à tester est soumis à un traitement préalable comprenant: une étape de digestion des protéines de l'échantillon par la protéinase K, une étape d'inactivation de la protéinase K, et une étape de neutralisation du pH.
- 2864086 47 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape d'inactivation de la protéinase K est réalisée par précipitation à l'acide trichloroacétique, et l'étape de neutralisation du pH est réalisée par addition d'un tampon tris-maléate.5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, dans lequel les anticorps de capture et de détection sont choisis parmi les anticorps 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196.6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, dans lequel l'anticorps de capture est choisi parmi les anticorps monoclonaux et polyclonaux 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, 196 et 79; l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps monoclonaux 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5.7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel les anticorps de capture et de détection sont choisis parmi les couples suivants 2B9H2/10EllAll, 10E11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+ 5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5 et 2B9H2/13H9C9+19C11C10.8. Composition pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, ladite composition comprenant au moins un anticorps de capture qui se lie spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2, GM2AP mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 2, et 2864086 48 au moins un anticorps de détection marqué qui se lie spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2.9. Composition selon la revendication 8, pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, ladite composition comprenant au moins un anticorps de capture et au moins un anticorps de détection choisis parmi les anticorps 1OE11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10,.5H7C10 et 196.10. Composition selon la revendication 9, pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, ladite composition comprenant au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps monoclonaux et polyclonaux 1OE11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, et 79, et au moins anticorps de détection choisi parmi les anticorps 20 monoclonaux 1OE11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5.11. Composition selon la revendication 10, dans laquelle les anticorps de capture et de détection sont choisis parmi les couples suivants 2B9H2/10E11A11, 1OE11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5 et 2B9H2/13H9C9+19C11C10.12. Anticorps monoclonal ou polyclonal pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la 35 revendication 1, capable de se lier spécifiquement à la 2864086 49 protéine GM2AP ou à la protéine GM2AP mutée, GM2AP mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 2.13. Anticorps selon la revendication 12, choisi parmi les 5 anticorps 1OE11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19011010, 2G12H5 et 79.14. Anticorps monoclonal ou polyclonal pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, capable de se lier spécifiquement à la protéine MRP14.15. Anticorps selon la revendication 14, choisi parmi les anticorps 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196.16. Anticorps monoclonaux et polyclonaux pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, choisis parmi les couples d'anticorps suivants 2B9H2/10E11A11, 1OE11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12115/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10, 13D1E5+2G12H5/4A71310+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5 et 2B9H2/13H9C9+19C11C10.17. Anticorps monoclonal ou polyclonal pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique tel que défini à la revendication 1, capable de se lier spécifiquement au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2, GM2AP mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 2.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20110831 |