WO2005063810A1 - Facteur cytotoxique isole associe a la sclerose en plaques et procede de detection dudit facteur cytotoxique - Google Patents
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Classifications
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- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
Definitions
- Multiple sclerosis is a chronic disease of the central nervous system of man, evolving by succession of remission and pushing phases or according to a regular progression, whose anatomopathological characteristic consists in the formation of well delimited zones of de yelination in the white matter of the brain and spinal cord. Histologically, these areas present at the early stage of the lesion process, a breakdown of the peri-axonal myelin associated with an attack of the glial cells responsible for this demyelination.
- Macrophagic inflammatory activation involving microglial cells tissue macrophages residing in the central nervous system
- macrophages from infiltrated blood monocytes is associated with this demyelination process and contributes to the destruction of myelinated sheets.
- tissue macrophages residing in the central nervous system tissue macrophages residing in the central nervous system
- probably macrophages from infiltrated blood monocytes is associated with this demyelination process and contributes to the destruction of myelinated sheets.
- a relative depletion in glial cells is found while a proliferation of astrocytes develops at the periphery and can invade the demyelinated plaque to generate a fibrous or gliotic plaque.
- These sclerotic structures are at the origin of the name given to the disease. Another characteristic of these plaques is their almost systematic association with a vascular element around which they develop.
- BBB blood-brain barrier
- One of the determining elements in the maintenance of the BBB is constituted by the underlying presence of cytoplasmic extensions of astrocytes, called astrocytic feet.
- the astrocytic feet induce the formation or allow the maintenance of tight junction structures which ensure the cohesion of the capillary endothelial barrier embodying the BBB.
- various pathological models report the alteration of the BBB and a depletion of the astrocytic feet.
- CSF cerebrospinal fluid
- serum of MS patients of at least one factor which exhibits toxic activity with respect to human or oligodendrocytic cells or animal.
- This toxic activity is characterized by cytomorphological disorganization of the network of intermediate filaments and / or degradation of the proteins of said filaments and / or cell death by apoptosis of glial cells.
- MTT methyltetrazolium
- GM2AP proteins precursor of the ganglioside activator GM2
- saposin B were thus measured in the urine of MS and non MS patients.
- the results presented in patent application WO 01/05422 showed that GM2AP and saposin B were present at high concentrations in the urine of MS patients compared to the concentrations found in non-MS individuals and that these two proteins which are co -detected in the urine of MS patients could represent a marker of the pathology.
- the inventors had also established a correlation between the detection of the proteins G 2AP and saposin B in the urine and the gliotoxicity measured in these urines by the MTT test and showed that there was a correlation between high urinary concentration and gliotoxicity for these two proteins.
- the inventors concluded that the GM2AP and / or saposin B proteins were involved in the mechanism of gliotoxicitis and that they could probably act in combination to induce gliotoxicitis.
- the present inventors have now wanted to know the activity of the proteins identified in patent application WO 01/05422 by using the MTT test and to see whether the gliotoxicity discovered in the urine of patients suffering from multiple sclerosis was linked to the proteins identified.
- GM2 or ganglioside GM2 is a complex lipid found in brain tissue.
- the subject of the present invention is the isolated, purified cytotoxic factor associated with multiple sclerosis, said cytotoxic factor being the heterocomplex GM2AP / GM2 / MRP1 or mutated GM2AP / GM2 / MRP14, it being understood that mutated GM2AP corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.
- cytotoxic factor being the heterocomplex GM2AP / GM2 / MRP1 or mutated GM2AP / GM2 / MRP14, it being understood that mutated GM2AP corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.
- These isolated, purified heteroco plexes are useful as markers of MS pathology and more precisely of a form of the disease, of a stage of the disease, of a period of activity of the disease, as well as in the follow-up of patients treated for this pathology.
- the present inventors then developed a method, a composition and a reaction mixture for detecting and / or quantifying the GM2AP / GM2 / MRP1 and mutated GM2AP / GM2 / MRP heterocomplexes in samples of individuals susceptible to sclerosis. in plaques or with clinical signs of this pathology.
- the method consists in detecting and / or quantifying the cytotoxic factor, associated with multiple sclerosis, in a biological sample, by isolating from said biological sample the heterocomplex GM2AP / GM2 / MRP1 or mutated GM2AP / G 2 / MRPl4.
- isolation of the heterocomplex is meant all the conditions which allow the specific detection of the heterocomplex.
- the isolation of said heterocomplex can be carried out by any appropriate means.
- any appropriate means There may be mentioned 'way of example, non-denaturing electrophoresis, the column chromatography, methods for the degradation of the biological medium compounds, with the exception of the heterocomplex (such as for example a treatment with proteinase) as well as any other method making it possible to detect a physicochemical characteristic of said heterocomplex, such as than molecular weight, isoelectric point or any other suitable means.
- At least one antibody or at least two antibodies which bind (s) specifically to the heterocomplex are used, and said cytotoxic factor is detected and / or quantified by demonstrating the formation of d 'a complex constituted by the heterocomplex and the antibody or by the demonstration of a complex constituted by the heterocomplex and the two antibodies.
- at least one of said antibodies is a capture antibody and at least the other of the antibodies is a detection antibody.
- the capture antibody is chosen from the antibodies which specifically bind to the GM2AP / GM2 complex, to the mutated GM2AP / GM2 complex, to the MRP14 / GM2 complex, to the GM2AP / MRP14 complex and to the mutated GM2AP / MRPl4 complex, and the antibody detection is chosen from the antibodies which specifically bind to the GM2AP / GM2 complex, to the mutated GM2AP / GM2 complex, to the MRP14 / GM2 complex, to the GM2AP / MRP14 complex and to the mutated GM2AP / MRP14 complex.
- the heterocomplex is isolated using at least two antibodies, at least one of which binds specifically to GM2AP or GM2AP mutated from the heterocomplex and at least the other binds specifically to MRP14 of the heterocomplex, and said cytotoxic factor is detected and / or quantified by demonstrating the formation of a complex constituted by the heterocomplex and the two antibodies.
- at least one of said abovementioned antibodies is a capture antibody and at least the other of said antibodies is a detection antibody.
- the demonstration of the formation of the complex consisting of the heterocomplex and at least one antibody or by the heterocomplex and at least two antibodies can be carried out by any appropriate means, for example by screening according to size using a sorting apparatus, by screening according to molecular weight using a separation column or by direct or indirect labeling at least one antibody or by any other suitable means.
- the method consists in (i) (i) having a biological sample to be tested, (ii) bringing said biological sample into contact with at least one capture antibody, said capture antibody being chosen from the antibodies which specifically bind to GM2AP protein, mutated GM2AP protein, MRP14 protein, GM2AP / GM2 complex, mutated GM2AP / GM2 complex and MRP14 / GM2 complex; and with at least one labeled detection antibody, said detection antibody being chosen from antibodies which specifically bind to the GM2AP protein, to the mutated GM2AP protein, to the MRP14 protein, to the GM2AP / GM2 complex, to the mutated GM2AP / GM2 and the MRP14 / GM2 complex, and (iii) the cytotoxic factor is detected and / or quantified by detection and / or quantification of the labeled detection antibody, it being understood that the mutated GM2AP corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.
- the detection and / or quantification of the cytotoxic factor is carried out using different immunoassay principles which are well known to those skilled in the art, such as ELISA and ELFA, and advantageously a sandwich type immunoassay is used.
- the sandwich immunoassay can be carried out in one or more stages, ie without a washing stage or with one or more washing stages.
- the detection antibody or antibodies are labeled with any suitable label.
- the labeling can thus be radioactive labeling, labeling with an enzyme, labeling with a fluorescent molecule, labeling with a vitamin, a colorimetric marking.
- the marker is preferably a vitamin, biotin
- the detection is carried out by the addition of streptavidin coupled to horseradish peroxidase and the development is carried out by the addition of orthophenylenediamine dihydrochloride.
- the antibody or capture antibodies are immobilized directly or indirectly on a solid phase.
- the term "antibody” used in the present invention includes monoclonal and polyclonal antibodies, their fragments and their derivatives. By antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv of a native antibody 6 ' 7 and by derivative is understood, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody 8 ' 9 .
- humanized antibodies are chimeric antibodies which comprise a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin.
- humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
- donor antibody such as mouse, rat, rabbit or non-human primate
- the residues (FR) of the Fv region of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
- humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
- the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions will be those of a human immunoglobulin.
- the optionally humanized antibodies may also comprise at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin 10 ' 11 ' 12 . Mention may in particular be made of the anti-GM2AP and anti-MRP14 antibodies described in application WO 01/05422.
- the agent responsible for gliotoxic activity and involved in cytotoxicity corresponds to the heterocomplex GM2AP / GM2 / MRP14 or mutated GM2AP / GM2 / MRP14 allows the production of anti-heterocomplex antibodies which are capable of specifically link to the GM2AP / GM2 complex, to the mutated GM2AP / GM2 complex, to the MRP14 / GM2 complex, to the GM2AP / MRP14 complex or to the GM2AP / mutated GM2AP complex.
- the production of such antibodies is well known to those skilled in the art.
- the GM2AP / GM2 / MRP14 or GM2AP / GM2 / MRP14 hererocomplex is used as an immunogen to immunize BALB / c mice by intraperitoneal injection.
- the first injection is made with complete Freund's adjuvant.
- the other injections are given 4-8 weeks apart with incomplete Freund's adjuvant.
- a final reminder is made a few days before the fusion in physiological water.
- the spleens of the immunized mice are removed and the splenocytes are collected. Then, the fusion of the spleen cells with cells of a myeloma line is carried out and the cells secreting antibodies are selected which recognize in ELISA the heterocomplex used for immunization.
- the sample to be tested is subjected to a preliminary treatment comprising: a step of digestion of the proteins of the sample with proteinase K; a step of inactivation of proteinase K, for example by precipitation with trichloroacetic acid, and a step of neutralization of the pH, for example by addition of a tris-random buffer.
- the biological sample to be tested is serum, plasma, urine or cerebrospinal fluid, preferably urine.
- the antibodies used in the process of the invention are the following monoclonal and polyclonal antibodies: 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 and 196.
- any antibody which has the characteristic of specifically binding to the GM2AP protein, to the mutated GM2AP protein, to the MRP14 protein, to the GM2AP / GM2 complex, to the mutated GM2AP / GM2 complex, to the MRP14 / GM2 complex, to the GM2AP / RP14 complex or to the complex Mutated GM2AP / MRP1 is part of the invention, the methods for obtaining such antibodies being well known to those skilled in the art, as described above.
- the antibodies used in the ELISA sandwich detection and / or quantification test of the invention are the following monoclonal and polyclonal antibodies: capture antibodies 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, and 79 detection antibody 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 and 2G12H5.
- the capture and detection antibodies are advantageously chosen from among the pairs: 2B9H2 / 10E11A11, 10E11A11 / 4A7B10 + 5H7C10, 13D1E5 + 2G12H5 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 2B9H2, 4A7B10 / 10H10 + 101071010 5H7C10 / 13H9C9 + 19C11C10, 2B9H2 / 10E11A11, 2B9H2 / 13H9C9 + 19C11C10, 13D1E5 + 2G12H5 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 2B9H2, 4A7B10 + 5H7C10 / 5E7A10 / 5E7A10 / 5E7A10 13H9C9 + 19C11C10.
- the aforementioned monoclonal and polyclonal antibodies are new and also form part of the objects of the present invention. Their mode of production will be described in more detail in the experimental part.
- the selected and preferred pairs of capture and detection antibodies are also new and also form part of the objects of the present invention.
- the present invention also relates to a composition for the detection and / or the quantification of the abovementioned cytotoxic (gliotoxic) factor in a biological sample to be tested, said composition comprising at least one antibody which specifically binds to the GM2AP / GM2 / MRP14 or GM2AP mutated / GM2 / MRP1 heterocomplex.
- said composition comprises at least two antibodies which specifically bind to the heterocomplex.
- the subject of the present invention is also a composition for the detection and / or quantification of the abovementioned cytotoxic (gliotoxic) factor in a biological sample to be tested, said composition comprising in a reaction mixture and simultaneously at least one capture antibody and at least one labeled detection antibody, said antibodies being chosen from antibodies which bind specifically to the GM2AP protein, to the mutated GM2AP protein and to the heterocomplex protein MRP14.
- the capture and detection antibodies are chosen from the following monoclonal and polyclonal antibodies: 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 and 196.
- said composition comprises at least one antibody of capture selected from antibodies 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, and 79; and at least one detection antibody chosen from detection antibodies 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 and 2G12H5.
- antibody of capture selected from antibodies 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, and 79
- detection antibody chosen from detection antibodies 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 and 2G12H5.
- compositions include the following pairs of capture and detection antibodies: 2B9H2 / 10E11A11, 10E11A11 / 4A7B10 + 5H7C10, 13D1E5 + 2G12H5 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 2B9H2, 4A7B10 + 4A7B10 + 5H7C10 / 13H9C9 + 19C11C10, 2B9H2 / 10E11A11, 2B9H2 / 13H9C9 + 19C11C10, 13D1E5 + 2G12H5 / 4A7B10 + 5H7C10, 79 / 2B9H2, 4A7B10 + 5H7C10 / 10E11A11, 4A7B10 + 5H7C10 / 13D1E5 + 22G12H5, 2B9H2 / 13D1E5 + 22G12H5, 2B
- the subject of the invention is also a reaction mixture for the detection and / or quantification of the abovementioned cytotoxic (gliotoxic) factor, said mixture comprising at least two antibodies, at least one of which binds specifically to GM2AP or GM2AP mutated from heterocomplex and at least the other specifically binds to MRP14 of the heterocomplex.
- reaction mixture is meant a homogeneous or heterogeneous medium which simultaneously comprises at least the two abovementioned antibodies.
- at least one of said antibodies is a capture antibody and at least the other of said antibodies is a detection antibody.
- Another object of the invention is a complex comprising the heterocomplex linked to at least two antibodies, of which at least one of the antibodies is specific for GM2AP or for mutated GM2AP and at least the other antibody is specific for RP14.
- the sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the sequence of the GM2AP protein.
- the sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to the sequence of the GM2AP protein mutated in exon 2, at position 40 (replacement of an aspartic acid by a phenylalanine.
- the sequence SEQ ID NO: 3 corresponds to the sequence of the mutated GM2AP protein, having mutations in both exon 1, exon 2 and exon 4.
- the sequence to take into account is the sequence identified in the sequence identifier in SEQ ID NO: 1.
- the sequence to be taken into account is the sequence identified in the sequence identifier in SEQ ID NO: 2; it being understood that in the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 can be found either at position 153 a valine or an alanine, as explained in the experimental part in Example 3.
- equivalent experiments can be carried out taking into consideration the mutated GM2AP protein exhibiting mutations in both exon 1, in exon 2 and in exon 4, as identified in the sequence identifier in SEQ ID NO: 3. Figure.
- the appended figure represents the dose-response curve of the ternary complex GM2AP + MRP14 + GM2 (GM2: 50 ⁇ g / ml final).
- the quantities of MRP14 are represented on the abscissa (in ng) and the percentage of cytotoxicity corresponding to the percentage of dead cells is represented on the ordinate.
- the quantities of GM2AP in ng are respectively represented by the following symbols: ⁇ : 5 ng, ⁇ : 10 ng, ⁇ : 20 ng, ⁇ : 50 ng and ⁇ : 100 ng.
- a similar experiment was carried out with the mutated GM2AP protein instead of the GM2 protein. The results obtained are similar to those presented in the appended figure.
- Example 1 MTT test protocol.
- CLTTl-1 cells are astrocytes derived from this transgenic mouse expressing the large T gene of polyoma virus 13 . These cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere at 5% C0 2 , in Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / Ham's F12 medium (50/50) 4.5 g / 1 of D-glucose supplemented with 10 % of Fetal Calf Serum (SVF) not decomplemented, gluta ax (580 mg / 1), penicillin (500 units / 1) and streptomycin (500 ⁇ g / 1).
- DMEM Dubelcco's Modified Eagle's Medium
- Ham's F12 medium 50/50
- the TUC reagent (TRIS 20 mM, urea 250 mM, CaCl 2 1 mM) is a solution mimicking the chemistry of urine.
- the deposit is homogenized and, to avoid evaporation, a protective film is applied to the top of the plates.
- the revelation by the MTT test is carried out.
- the cell supernatant is aspirated, taking care not to remove the cells from the bottom of the wells. 250 ⁇ l of MTT solution (0.5 mg / ml in culture medium) are gently deposited on the cells.
- the solution is aspirated and the formazan crystals formed in the cells are solubilized with isopropanol, HC1 IN (40 ⁇ l / ml).
- 70 ⁇ l of solution from each well of the 48-well plate are transferred to the wells of a 96-well plate, in order to read the optical density.
- the absorbances are read at 570 nm / 650 nm.
- Example 2 Preparation of urine pools. 100 liters of MS urine (0.2-0.5 liters from patients' first morning urination) were collected. The urine of patients contaminated with bacteria or that of patients treated with drugs likely to interfere with the bioassay of gliotoxicite 4 were eliminated. The individual samples were tested for gliotoxicity and a final pool of 46 liters of urine with significant gliotoxicity, by the MTT test, was selected. In parallel, an equivalent volume of urine from healthy donors with negative gliotoxicity for each sample was obtained. The stages of concentration and purification of this material, the protein analysis and the identification strategy are presented below. • Purification of urinary proteins. The SEP positive and SEP negative urine pools were purified to obtain a high protein concentration.
- Precipitation Precipitation with ammonium sulphate (Prolabo - ref. 21 333 365) was carried out on the pools of SEP positive and SEP negative urine. The percentage of 60% of saturated ammonium sulphate for 40% of urine, ie 390 grams of ammonium sulphate per liter of urine was used. Each pool is divided into 1.8 liter fractions in 2 liter flasks to improve precipitation. The precipitation was carried out for 2 x 8 hours, at ambient temperature, with gentle stirring.
- the pads are brought to the column by a peristaltic pump which allows a regular flow.
- the column equilibration buffer is the 20 mM Tris buffer, pH 7.
- the fraction corresponding to the precipitation supernatant and containing an excessively high amount of salts is dialyzed against this buffer before depositing on the column.
- Elution by a salt gradient makes it possible to recover the proteins.
- the elution gradient is carried out in steps of NaCl 100, 200, 300, 500 mM in the equilibration buffer of the column.
- the elution fractions are tested by the MTT test. Only the positive fractions, that is to say the fractions eluted at 200 Mm NaCl, are preserved.
- the elution buffer used contains 100 mM phosphate, 100 mM sodium sulfate, pH 6.8.
- the separation of the protein mixture was carried out in 60 min. Only the fraction corresponding to a mass of 15-20,000 daltons has been kept. This fraction is dialyzed in a 20 mM Tris buffer containing 0.2 mM CaCl 2 , pH 7.2, then lyophilized. At each step, only the fractions with significant toxic activity were selected for the next step. A check of the toxic activity of the proteins was carried out at each step, using the MTT test. only the fractions exhibiting significant toxic activity were retained for the additional purification step.
- the proteins were eluted with a linear gradient of 5% to 15% of buffer A in 5 min., Then from 15% to 100% of buffer B in 95 min., At a flow rate of 0.5 ml / min.
- the separation buffers A and B used are respectively the 0.1% TFA buffer (Pierce n ° 28904) / MilliQ water and the 0.09% TFA / 80% acetonitrile buffer (Baker). Detection was carried out by measuring the UV absorbance at 205 and 280 nm. The fractions were collected in 1.5 ml and 0.5-1 ml fractions in the area of interest. The fractions were frozen after collection in dry ice.
- the collection pool for fraction X76 / 43 obtained by HPLC was deposited on a 16% SDS-TRICINE gel pre-molded with 10 wells and 1 mm thick (sold by the company Novex). The conditions of use of the gel correspond to those recommended by the supplier.
- the sample is taken up in 75 ⁇ l of the sample buffer 1 time concentrated (SDS-TRICINE N ° LC 1676, 1 ml twice concentrated + 50 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol (Pierce) diluted 1/2 in water) and 25 ⁇ l of the sample are deposited on the gel three times.
- the collection pool for fraction X76 / 43 from the negative SEP pool was deposited on the gel under the same conditions as those described for the positive SEP pool.
- the migration on the two gels was carried out in parallel in the same migration tank (XCELL II NOVEX (trade name)) at a constant voltage of 125 V for 2 hours.
- the tank is placed in a container containing ice.
- the gels were stained directly after migration by zinc / imidazole staining (staining kit 161-0440 sold by the company BIORAD) to obtain a reversible negative staining. • Trypsin digestion of the gel strips. All the protein bands visualized in the deposits of fraction X76 / 43 were cut and subjected to proteolysis in a trypsin solution overnight.
- the gel strips are cut with a scalpel into 1 mm slices and transferred into eppendorf tubes.
- the eppendorfs are subjected to a centrifugation peak to bring down the pieces of gel and after centrifugation 100 ⁇ l of washing buffer (100 Mm NH 4 CO 3 /50% CH 3 CN) are added to the pieces of gel. After 30 min. stirring at room temperature, the supernatant is removed in fractions of 20 ⁇ l and the washing step is repeated twice.
- the eppendorfs are dried for 5 min. in speed vac. 20 ⁇ g of trypsin (Modified sequenal grade PROMEGA V5111) (trade name) are taken up in 200 ⁇ l of digestion buffer (5 mM TRIS, pH 8) and are dissolved for 30 min.
- Example 3 Mass spectrometry and protein sequencing. • MALDI-TOF mass spectrometry analysis of proteolytic fragments. 30 ⁇ l of extraction buffer (2% TFA / 50% acetronitrile) are added to the samples.
- the eppendorfs to be analyzed are subjected to a centrifugation of 5 min., Then to a sonication of 5 min. and finally to a centrifugation of 1 min.
- 14 deposits of 0.5 ⁇ l of matrix ⁇ -cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid saturated in acetone
- a thin uniform microcrystalline layer is obtained.
- 0.5 ⁇ l of a 2% TFA / water solution are deposited on this sublayer over the 14 deposits, then 0.5 ⁇ l of sample to be analyzed are added.
- the extractions of the gel bands, digested with trypsin, are injected on a column C18 / MZ- Vydac / (125x1, 6) mm / 5 ⁇ m (trade name).
- the elution of the peptides is done at a flow rate of 150 ⁇ l / min. and in a gradient ranging from 5% of buffer B (0.09% TFA / 80% acetronitrile) to 40% of buffer B in 40 min., then from 40% of buffer B to 100% of buffer B in 10 min.
- the detection is made by measuring the UV absorbance at 205 nm. The peaks are collected in 500 ⁇ l eppendorf tubes.
- N-terminal sequencing The fractions corresponding to a single mass peak were analyzed by Edman degradation on a sequencer (Model 477A PERKIN ELMER / Applied Biosystems). The sequencing conditions are those described by the manufacturer. A micro cartridge was used for depositing the samples and the PTH-AminoAcid are identified with an online HPLC system (Model 120A PERKIN ELMER / Applied Biosystems). •Results
- MW mean molecular weight
- ISM identification by mass spectrometry
- IS identification by sequencing
- NI remaining peaks not identified
- ND not determined *: identical to the G-terminal 20 kDa fragment of perlacan probably resulting from the previous proteolysis of the complete protein of 467 kDa in the urine or during the purification process.
- Two other mutations in exon 2 respectively at positions 59 and 69 of the amino acid sequence of GM2AP which correspond to the replacement of an isoleucine by a valine and of a methionine by a valine.
- a mutation in exon 4 which consists of replacing a valine with an alanine at position 153 of the amino acid sequence of GM2AP, appeared to be a new polymorphism not described after different sequencing of the genomic DNA of lymphocytes from healthy individuals (blood donors) and patients with multiple sclerosis. This mutation in exon 4 was found in 3 out of 27 MS patients tested, as well as in 8 out of 27 control individuals suggesting a normal polymorphism. Another mutation is found in exon 4, at position 171 of the amino acid sequence of GMPA2, where a lysine is replaced by a glutamine.
- the amino acid sequences of GM2AP and mutated GM2AP are respectively represented in the sequence identifier in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, it being understood that in these two sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 we can find either at position 153 a valine or an alanine, since the mutation in exon 4 for this position suggests a normal polymorphism.
- Example 4 Recombinant proteins. Recombinant proteins (purchased or produced by transfection) were used to assess the gliotoxic potential of the candidate proteins. The so-called “non-human” proteins, that is to say recombinant proteins produced in a prokaryotic expression system (E.
- the protein MRP14 (or Calgranulin B or S100A9) fused in N-terminal with a histidine tail and produced in E. coli; the protein MRP8 (or Calgranulin A or S100A8) produced in E. coli; and the native human heterocomplex MRP14 / MRP8 (or Calprotectin), purchased from Dr. C. Kerkhoff (University of Munster, Germany).
- the protein GM2AP (precursor of the activator of the ganglioside GM2) fused in N-terminal with a histidine tail produced in Baculovirus and the protein Sap B (Saposin B) produced in yeast, purchased from Pr K. Sandhoff (Kekule Institute, University of Bonn, Germany). These proteins have their own physiological activity described in the literature.
- the so-called “human” proteins that is to say recombinant proteins produced in a eukaryotic expression system in human cells transfected with an appropriate plasmid having integrated the insert to be expressed were produced according to the protocol described below.
- the 293T cells primary human embryonic kidney cells transformed with a type 5 adenovirus, expressing the T antigen were cultured at 37 ° C.
- the 293T cells are transfected with a “Transfectant” reagent composed of lipids which complex and transport the DNA in the cells.
- the 293T cells are trypsinized, seeded to 2 million cells per 75 cm 2 flask, and incubated overnight at 37 ° C, in a humid atmosphere and 5% C0 2 in 10 ml of culture medium (DMEM 4.5 g / 1 of D-glucose supplemented with 10% of decomplemented fetal calf serum (SVF), glutamax (580 mg / 1), penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / l)).
- DMEM 4.5 g / 1 of D-glucose supplemented with 10% of decomplemented fetal calf serum (SVF), glutamax (580 mg / 1), penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / l)
- the transfection solution is prepared extemporaneously using the ratio 3/2 [volume of Transfectant ( ⁇ l) / quantity of plasmid DNA ( ⁇ g)] qs 1ml of " medium without SVF. After 45 minutes of contact at room temperature, the solution transfection is added dropwise onto a non-confluent cell mat After 72 hours of incubation at 37 ° C., in a humid atmosphere and 5% CO 2 , the supernatants are recovered and centrifuged for 10 minutes at 2500 rpm.
- MRP Enzyme Immunoassay assay kit (trade name) marketed by BMA Biomedicals AG, Augst, Switzerland, following the instructions for the recombinant human protein MRP14, or by the technique of semi-quantitative Western Blot with antibodies polyclonal of anti-GM2AP rabbit. These techniques give indicative values for a relative comparison.
- the crude supernatants from this production will be used in particular for toxic activity and detection tests.
- Example 5 Toxicity of "non-human” proteins.
- the toxicity of the “non-human” recombinant proteins MRP14, MRP8, GM2AP, SapB was evaluated by the MTT test. Proteins were tested in a defined range from the assessment of the concentration of each protein in different urine. The ranges are produced in different buffers, either in the TUC solution, or in two types of urine: urine from patients with multiple sclerosis who were toxic by the MTT test (urine MS), and urine from '' recruitment of non-MS donors who were not toxic by the MTT test (normal urine). The urine had previously been treated 30 min. at 56 ° C and filtered.
- Combinations of GM2AP / MRP14, Saposin B / MRP14 and Saposin B / GM2AP / MRP14 proteins were then prepared in TUC eb solution in both types of urine as described above.
- the MRP14 / 8 heterocomplex or the MRP8 protein replace the MRP14 protein in the different GM2AP / MRP14 / 8, Saposin B / GM2AP / MRP8 combinations.
- the “control” combinations were prepared in the same way. All the combinations were incubated overnight at 4 ° C before being tested for their toxicity by the MTT test. The results are presented in Table 3.
- MRP14 / 8 native human heterocomplex Sap.
- B Saposin B *: average of two tests
- Table 3A show that the combinations GM2AP / MRP14, GM2AP / MRP14 / 8, Saposin B / MRP14 and GM2AP / MRP14 / Saposin B have no toxic effect in TUC, whatever the quantity tested. Only the GM2AP (10ng) / MRP14 (0.5ng) combination seemed to present a toxicity, but this toxic activity was not subsequently found in two additional comparable trials. In addition, additional tests have been carried out with the GM2AP / MRP14 combination using different amounts of GM2AP and of MRP14. The results obtained confirmed that the GM2AP / MRP14 combination has no toxic effect in TUC, whatever the quantity tested.
- Table 3B Range in normal urine.
- the GM2AP / MRP14 combination is toxic in normal urine since the toxicity increases as the amount of GM2AP protein increases. However, this toxicity appears not very stable and not very reproducible and seems to be dependent on the urine sample (see comparison of the percentage of cytotoxicity between normal urine 1 and normal urine 2, in Table 3B).
- the combination of Saposin B / MRP14 is at the limit of significance in normal urine. The results obtained with the GM2AP / MRP14 / Saposin B combination are difficult to interpret.
- the toxicity of the combinations of GM2AP / MRP14 and Saposin B / MRP14 proteins was also tested against normal urine and toxic urine from patients with multiple sclerosis (MS urine). The results are presented in Table 3C.
- the combination Saposin B / MRP14 has no toxic effect in normal urine and in MS urine, regardless of the amount tested.
- the GM2AP / MRP14 combination does not have a toxic effect with respect to normal urine 1, but has a toxic effect with respect to normal urine 2 (when GM2AP increases, the toxicity of urine increases). There is also an opposite effect with respect to MS urine. When the amount of MRP14 increases, the toxicity of urine decreases.
- Example 6 Toxicity of “Human” Proteins
- the GM2AP, GM2AP proteins mutated in exon 2 and MRP14 produced as described in Example 3 were tested for their toxicity by the MTT test, using culture supernatants from 293T cells. containing them. The following combinations were also carried out using culture supernatants from 293T cells: GM2AP / MRP14, mutated GM2AP / MRP1, GM2AP / MRP14 / MRP8. The combinations prepared were then incubated overnight at 4 ° C, then they were tested for their toxicity by the MTT test.
- C% cytotoxicity in percentage ND: not determined Approximate protein concentrations in the supernatants MRP14 lots 1 and 2350 ng / ml; GM2AP batch 1: 300 ng / ml batch 2: 200 ng / ml
- GM2AP / MRP14 combinations are weakly cytotoxic (from 20 to 30% of cytotoxicity) with an optimum for the GM2AP (20 ng) / MRP14 combination (0.5 ng).
- MRP14 alone is not cytotoxic.
- GM2AP alone is not considered to be cytotoxic, even if very low toxicity was found in tests 1 and 2 carried out on batch 2. In fact, the reproducibility cannot be perfect because it depends on the production batch of the supernatants .
- C% cytotoxicity in percentage ND: not determined Approximate concentration of GM2AP and MRP14 in the supernatant: 2 ⁇ g / ml Rejection:% of cytotoxicity rejected because the standard deviation of the OD of the samples is greater than 50 *: standard deviation of the OD of the samples between 16 and 11 No comment: standard deviation of the OD of the samples less than 10.
- GM2AP protein is replaced by the GM2AP protein mutated in this combination, the same type of toxicity is obtained for certain mixtures, as shown below.
- C% percentage cytotoxicity *: standard deviation of the ODs of the samples between 14 and 11 Without comment: standard deviation of the ODs of the samples less than 10
- Approximate protein concentration in the supernatants mutated G 2AP: 200 ng / ml; MRP14: 350 ng / ml.
- the mutated GM2AP / MRPl4 combination is toxic.
- the mutated GM2AP protein alone has no cytotoxic effect.
- MRP14 alone is considered to have no cytotoxic activity.
- cytotoxicity of the combinations of supernatants containing the recombinant human proteins, GM2AP / MRP14 and mutated GM2AP / MRPl4 is found in the same order of magnitude, with greater stability depending on the production batch of the proteins, than with non-recombinant proteins. human. However, this does not correspond to the stability, reproducibility and intensity of the gliotoxic activity found in the biological fluids of MS patients. 4D table
- C% percentage cytotoxicity Approximate protein concentration in the supernatants: GM2AP (lot 1): 300 ng / ml, GM2AP (lot 2): 200 ng / ml. Concentration of native MRP14 / 8: 1.3 mg / ml. It appears from the results of Table 4D that GM2AP alone has no cytotoxic activity and that for certain values, indicated in bold, the combination GM2AP / MRP14 / MRP8 has a cytotoxic effect. This cytotoxicity is dependent on the batch of supernatant used.
- C% percentage cytotoxicity Approximate protein concentration in mutated GM2AP supernatants: 200 ng / ml. Concentration of native MRP14 / 8: 1.3 mg / ml.
- lipids in particular complex lipids, are interesting candidates in this context.
- ganglioside GM1 ganglioside GM2
- sulfatide a lipid that was tested.
- ganglioside GM2 proved to be the only convincing, as shown by the examples which follow.
- Example 7 Toxicity of “human” recombinant proteins in association with ganglioside 6M2.
- the ganglioside GM2 (supplied by Professor J. Portoukalian (Lyon France)) is added at a concentration of 50-— ⁇ g / ml final to the combinations of —recombinant “human” proteins already produced, involving the proteins MRP14, GM2AP and GM2AP mutated .
- the combinations GM2AP / MRP14 and mutated GM2AP / MRPl4 were tested in a range of proteins: 0, 5, 10, 20, 50, 100 ng for the recombinant proteins GM2AP and mutated GM2AP and up to 200 ng for the protein MRP14. These ranges were made in association or not with ganglioside GM2. After mixing, the combinations are incubated overnight at 4 ° C, their toxicity is then evaluated by the MTT test.
- Table 5A Measurement of the gliotoxic activity of “human” proteins combined and associated with the ganglioside GM2 (50 ⁇ g / ml final)
- the combination GM2AP / MRP14 associated with a constant concentration of ganglioside presents a gliotoxic effect which increases in parallel with the quantity of protein MRP14.
- GM2AP protein 20 and 10 ng
- a typical dose-response effect increasing in stages is obtained.
- GM2AP protein 20 ng
- there is no toxicity there is no toxicity.
- there are any too much GM2AP protein 50 ng and 100 ng
- there is saturation of toxicity with a plateau at around 60%.
- CLTTl-1 cells proliferating in the culture during exposure to the gliotoxic factor are sensitive. This explains that the gliotoxicity plateaus do not reach 100%.
- the mutated GM2AP / MRPl4 combinations are not gliotoxic.
- An overall increase in the cytotoxicity of the mixture with the ganglioside GM2 is observed compared to the combinations without ganglioside.
- the variability of the measurements is apparently greater with the use of the mutated GM2AP protein.
- the activity appears significant and reaches a maximum plateau (cf.: maximum reached on the pool of proliferating cells during the test, as previously discussed) for the highest concentrations, according to a two-variable dose effect, GM2AP mutated and MRP14.
- GM2 ganglioside In order to know whether the action of GM2 ganglioside is specific for the toxicity of combinations of recombinant human proteins GM2AP / MRP14 (5 ng of MRP14 and 50 ng or 100 ng of GM2AP), other lipids were tested in parallel: ganglioside GM1 and sulfatide. The concentration ranges used are 0, 10, 20, 30, 50 ⁇ g / ml final. Once the lipids have been added, the combinations are incubated overnight at 4 ° C., their toxicity is then evaluated in the MTT test.
- GM2AP 100 ng test this is an average of two tests.
- the activity is associated with a protein heterocomplex involving the proteins GM2AP or GM2AP mutated and MRP14; it is the addition of a lipid, such as ganglioside GM2, which has made it possible to obtain activity levels, reproducibility and dose-response effects, compatible with the reproduction of the desired gliotoxic activity; the mutation found on the GM2AP protein is not essential to the determinism of gliotoxin in vitro.
- Example 8 Development of an immunoassay of the gliotoxic complex - Preparation of the samples before the ELISA test.
- the samples tested are: on the one hand human recombinant proteins in combination (GM2AP + MRP14) with or without GM2 ganglioside, diluted or not in normal urine, in order to detect the active recombinant complex, on the other hand normal urine and MS for direct detection in urine.
- the samples, once prepared, are incubated for 24 hours at 4 ° C before the detection test.
- the “human” recombinant proteins are used in the form of crude production supernatants, recovered after the transient transfection of the 293T cells, with the appropriate negative controls in parallel.
- the MRP14 and GM2AP protein assay systems used are semi-quantitative and the quantities specified are indicative.
- the results are presented in the following examples.
- the detection method using anti-MRP14 and anti-GM2AP antibodies in a “sandwich” ELISA format make it possible to obtain positive results.
- the inventors have optimized this detection method by carrying out a preliminary treatment of the sample comprising a step of digestion by proteinase K of the proteins present, followed by a step of inactivation of this protease by an original method of precipitation. with trichloroacetic acid, then neutralization of the pH with a tris-maleate buffer, selected for its subsequent compatibility with an ELISA sandwich test.
- the samples (mixture of recombinant proteins or urine) are treated with proteinase K before detection of the complex according to the following protocol: 0.3 g of proteinase K is added for 100 ⁇ l of sample. After digestion for one hour at 37 ° C., precipitation with trichloroacetic acid is carried out in order to inhibit the action of proteinase K. Trichloroacetic acid 90% (90 g of trichloroacetic acid for 48 ml of distilled water ), is added to the sample (15% of the initial volume of the sample). The mixture is incubated for 30 minutes at 4 ° C.
- the pellet After centrifugation for 30 minutes at 13,000 rpm, the pellet is taken up with a volume equal to the initial volume of the sample with the 0.2 M TRIS Maleate buffer pH 6.2 (in tests without concentration factor) or in a minimum volume (to achieve a volume concentration of undigested proteins).
- a volume equal to the initial volume of the sample with the 0.2 M TRIS Maleate buffer pH 6.2 (in tests without concentration factor) or in a minimum volume (to achieve a volume concentration of undigested proteins).
- Example 9 Heterocomplex detection protocol in a sandwich ELISA assay.
- polyclonal antibodies bioMérieux
- rabbit polyclonal antibody 196 anti-pept ide MRP 14
- rabbit polyclonal antibody 79 anti-recombinant protein GM2AP.
- monclonal antibodies bioMérieux
- Anti-GM2AP monoclonal antibodies 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5.
- the mice were immunized according to the following protocol: on day D0 intraperitoneal injection of 75 ⁇ g of the GM2AP-MRP14 complex in the presence of complete Freund's adjuvant. On days D23, D37 new - intraperitoneal injection of the same amount of GM2AP-MRP14 complex in the presence of an incomplete Freund's adjuvant. Four days before fusion make an intravenous injection of 50 ⁇ g of GM2AP antigen diluted in physiological water. 1900 supernatants were screened by indirect ELISA technique.
- the plates were “coated” with 100 ⁇ l of antigen (the GM2AP-MRP14 complex) at 1 ⁇ g / ml in 0.05M bicarbonate buffer, pH 9.6.
- the “coated” plates were incubated overnight at a temperature of 18-22 ° C.
- the plates were saturated with 200 ⁇ l of PBS-1% milk and incubated for 1 hour at 37 ° +/- 2 ° C.
- 100 ⁇ l of supernatants or ascites liquid diluted in PBS-tween 20 buffer, 0.05% were added and the plates were incubated for 1 hour at 37 ° +/- 2 ° C.
- mice were immunized according to the following protocol: on day D0 an intraperitoneal injection of 75 ⁇ g of the GM2AP-MRP14 complex in the presence of complete Freund's adjuvant. On days D23 and D37 intraperitoneal injection of Aa the same amount of complex in the presence of incomplete Freund's adjuvant.
- the rabbits were immunized according to the following protocol: on OJ day, the 1st blood test of 10 ml, 75 ⁇ g of GM2AP were injected intraperitoneally in the presence complete Freund's adjuvant (AFC) (75 ⁇ g of immunogen + qs 0.5 ml of physiological water 9 ° / oo + 0.5 ml AFC). On days D28 and D56 the same amount of immunogen was injected intraperitoneally under the same conditions in the presence of 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant (AFI). In a 2 nd day J63 jack da blood of 30 ml was performed by ear without anticoagulant. A 3 * my blood test was performed under the same conditions on day J70.
- AFC complete Freund's adjuvant
- Rabbit polyclonal antibody 196 (anti-peptide MRP14). Rabbits were immunized according to the following protocol: Rabbits were immunized according to the following protocol: at day, the ere taken 10 ml of blood, 80 ug of immunogen was injected intraperitoneally in the presence of adjuvant Complete Freund (AFC) (80 ⁇ g of immunogen + qs 0.5 ml of physiological water 9 ° / 00 4- 0.5 ml AFC). On days D28 and D56 the same amount of immunogen was injected intraperitoneally under the same conditions in the presence of 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant (AFI).
- AFC adjuvant Complete Freund
- ELISA sandwich test The treatment of the samples (proteinase K and TCA precipitation), if any, is carried out after the overnight incubation at 4 ° C. and before the sandwich ELISA detection test.
- the capture antibody is “coated” with 1 ⁇ g in carbonate-bicarbonate buffer (50 mM) pH 9.5, 100 ⁇ l are deposited in the wells of a 96-well microplate.
- the plate is covered with a protective film and incubated overnight at room temperature. After 3 washes in PBS (Phosphate Buffered Saline) Tween 0.05%, the non-specific sites are blocked by PBS Tween 0.05%, goat serum (1/10 °) for monoclonal antibodies or 100 ⁇ l of hydrolyzate of casein for polyclonal antibodies. After 3 washes in 0.05% Tween PBS, the samples, treated or not, are deposited at the rate of 100 ⁇ l per well and incubated for 1 hour 30 minutes at 37 ° C. with shaking.
- PBS Phosphate Buffered Saline
- the GM2AP / GM2 / MRP14 or mutated GM2AP / GM2 / MRPl4 hererocomplex is used as an immunogen to immunize BALB / c mice by intraperitoneal injection. The first injection is made with complete Freund's adjuvant.
- the other injections are given 4-8 weeks apart with incomplete Freund's adjuvant. A final reminder is made a few days before the fusion in physiological water.
- the spleens of the immunized mice are removed and the splenocytes are collected. Then we carry out the cell fusion splenic with cells of a myeloma line and the cells secreting antibodies are selected which recognize in ELISA the heterocomplex used for immunization. Finally, the clones producing antibodies specific for the immune heterocomplex are selected, that is to say which do not recognize either GM2AP, or mutated GM2AP, nor MRP14, alone.
- Example 10 Detection of the human recombinant heterocomplex.
- the immunoenzymatic assays of the gliotoxic activity characterized molecularly in the previous examples pass through an antigen / antibody system involving only the proteins involved (the proteins GM2AP, GM2AP mutated and MRP14) and by antibodies (alone or in combination) able to detect this molecular complex.
- the recombinant complex corresponds to the association of the supernatants of recombinant proteins GM2AP (1000 ng) and MRP14 (50 ng) associated with 50 ⁇ g / ml final of ganglioside GM2.
- Example 11 Detection of the heterocomplex in the urine of patients. Direct detection of the complex in the urine of patients was tested on two representative urines: MS urine and normal urine. The results are described in Table 8. These results show that the anti-MRP1 4 / anti-GM2AP detection antibody couples [4A7B10 + 5H7C10] / [13D1E5 + 2G12H5], [4A7B10 + 5H7C10] / 10E11A11, 2B9H2 / [ 13D1E5 + 2G12H5] and 2B9H2 / [13H9C9 + 19C11C10] detect the complex.
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Abstract
Facteur cytotoxique isolé, associé à la sclérose en plaques, choisi parmi l’hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MRP14 et son procédé de détection dans un échantillon biologique à tester, selon lequel (i) on met en contact l'échantillon biologique avec au moins un anticorps de capture, choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2 ; et avec au moins un anticorps de détection marqué, choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, et au complexe MRP14/GM2, et (ii) on détecte et/ou quantifie le facteur cytotoxique par détection et/ou quantification de l'anticorps de détection marqué.
Description
FACTEUR CYTOTOXIQUE ISOLE ASSOCIE A LA SCLEROSE EN PLAQUES ET PROCEDE DE DETECTION DUD T FACTEUR CYTOTOXIQUE
La sclérose en plaques est une maladie chronique du système nerveux central de l'homme, évoluant par succession de phases de rémission et de poussée ou selon une progression régulière, dont la caractéristique anatomopathologique consiste en la formation de zones de dé yélinisation bien délimitées dans la substance blanche du cerveau et de la moelle épinière. Au niveau histologique, ces zones présentent au stade précoce du processus lésionnel, une dégradation de la myéline péri-axonale associée à une atteinte des cellules gliales responsable de cette démyélinisation. Une activation macrophagique inflammatoire impliquant les cellules microgliales (macrophages tissulaires résidants du système nerveux central) , ainsi que, probablement, des macrophages provenant de monocytes sanguins infiltrés, est associée à ce processus de démyélinisation et contribue à la destruction des feuillets myélinisés. Au centre de la zone démyélinisée, une' déplétion relative en cellules gliales est retrouvée alors qu'une prolifération d' astrocytes se développe à la périphérie et peut envahir la plaque démyélinisée pour générer une plaque fibreuse ou gliotique. Ces structures sclérotiques sont à l'origine du nom donné à la maladie. Une autre caractéristique de ces plaques est leur association quasi systématique avec un élément vasculaire autour duquel elles se développent. Au niveau histologique, on observe une altération fréquente de la barrière hémato-encéphalique (BHE) constituée par l' endothélium capillaire. Un des éléments déterminants dans le maintien de la BHE est constitué par la présence sous-jacente d'extensions cytoplasmiques des
astrocytes, appelées pieds astrocytaires . Vraisemblablement, les pieds astrocytaires induisent la formation ou permettent le maintien de structures de jonction étanches qui assurent la cohésion de la barrière endothéliale capillaire concrétisant la BHE. Or, différents modèles pathologiques font état de l'altération de la BHE et d'une déplétion des pieds astrocytaires . Par ailleurs, dans le processus lésionnel de la SEP, l'altération de la BHE contribue à amplifier la réponse inflammatoire associée, par l'afflux de cellules lymphoïdes provenant de la circulation sanguine. La contribution de l'inflammation associée aux cellules immunitaires est importante dans la SEP et participe au processus lésionnel. L'étiologie de la SEP est source d'un débat d'actualité car la maladie pourrait avoir des origines diverses. Des hypothèses ont été émises sur une origine bactérienne et/ou virale. Par ailleurs, comme décrit dans la demande de brevet WO 95/21859, H. Perron et al. ont été conduits à rechercher un ou des agents effecteurs du processus pathogénique aboutissant à la formation typique de plaques de démyélinisation et à une gliose astrocytaire . Dans le cadre de cette étude, ils ont mis en évidence la présence dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le sérum de patients SEP d'au moins un facteur qui présente une activité toxique vis à vis des cellules astrocytaires et oligodendrocytaires humaines ou animales. Cette activité toxique se caractérise par une désorganisation cytomorphologique du réseau de filaments intermédiaires et/ou une dégradation des protéines desdits filaments et/ou une mort cellulaire par apoptose des cellules gliales. Ils ont établi une corrélation significative entre la détection in vitro de cette activité toxique dans des échantillons de LCR et de sérum de patients SEP et la sclérose en plaques par un dosage colorimétrique quantitatif au bromure de
méthyltétrazolium (MTT) des cellules vivantes, comme décrit dans la demande de brevet WO 95/21859. Par ailleurs, C. Malcus-Vocanson et al . 1, Λ ont montré que l'urine est un fluide biologique très favorable pour la détection de 1' activité de ce facteur toxique et développé un procédé utilisant la cytométrie de flux pour détecter et/ou quantifier les cellules gliales adhérentes mortes par apoptose. Toutes les informations concernant ce procédé sont décrites dans la demande de brevet WO 98/11439. Des essais ont été réalisés à partir d'une fraction proteique de LCR et d'urine de patients SEP pour tenter d'identifier ce facteur toxique. Le contenu proteique de chaque fraction a été séparé sur gel SDS-PAGE 12 % et observé après coloration du gel à l'argent. Parmi les protéines observées, une fraction proteique centrée sur un poids moléculaire apparent d'environ 21 D a été trouvée minoritairement associée à l'activité toxique détectée in vitro et une fraction centrée sur un poids moléculaire apparent d'environ 17 kD a été trouvée majoritairement associée à cette activité toxique. Une injection de la fraction provenant de LCR de patients SEP dans le cerveau de rat Lewis et une observation histologique post-mortem de coupes de cerveau des rats a permis d'observer, trois mois après l'injection, une apoptose de la population astrocytaire et la formation de plaques de démyélinisation. Toutes les informations sont contenues dans la demande de brevet WO 97/33466. Ces observations sont conformes à celles qui ont pu être faites sur des coupes de cerveau de patients atteints de SEP, après biopsie5. Des protéines potentiellement associées à cette activité toxique vis à vis des cellules gliales dans des échantillons biologiques de patients SEP ont été étudiées comme décrit dans la demande de brevet WO 01/05422. Les
protéines GM2AP (précurseur de l'activateur du ganglioside GM2) et la saposine B ont ainsi été dosées dans les urines de patients SEP et non SEP. Les résultats présentés dans la demande de brevet WO 01/05422 montraient que le GM2AP et la saposine B étaient présents à de fortes concentrations dans les urines de patients SEP par rapport aux concentrations retrouvées chez des individus non SEP et que ces deux protéines qui sont co-détectées dans les urines de patients SEP pouvaient représenter un marqueur de la pathologie. Les inventeurs avaient également établi une corrélation entre la détection des protéines G 2AP et saposine B dans les urines et la gliotoxicite mesurée dans ces urines par le test MTT et montré qu' il existait une corrélation entre concentration urinaire élevée et gliotoxicite pour ces deux protéines. Les inventeurs en concluaient que les protéines GM2AP et/ou saposine B étaient impliquées dans le mécanisme de gliotoxicite et qu'elles pouvaient vraisemblablement agir en combinaison pour induire la gliotoxicite. Les présents inventeurs ont maintenant voulu connaître l'activité des protéines identifiées dans la demande de brevet WO 01/05422 par utilisation du test MTT et voir si la gliotoxicite découverte dans les urines de patients atteints de sclérose en plaques était liée aux protéines identifiées. Contre toute attente, les présents inventeurs ont montré que ce n'était ni les protéines identifiées dans WO 01/05422 prises individuellement, ni l'association des protéines GM2AP/saposine B qui étaient impliquées dans la gliotoxicite et que de manière tout à fait surprenante l'agent responsable de l'activité gliotoxique et impliqué dans la cytotoxicité correspondait à un hétérocomplexe GM2AP/GM2/ MRP14 (calgranuline B) ou GM2AP mutée/GM2/MRP14, comme décrit dans les exemples qui suivent. GM2 ou
ganglioside GM2 est un lipide complexe présent dans le tissu cérébral. Aussi, la présente invention a pour objet le facteur cytotoxique isolé, purifié, associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP1 ou GM2AP mutée/GM2/MRP14, étant entendu que GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2. Ces hétéroco plexes isolés, purifiés, sont utiles comme marqueurs de la pathologie SEP et plus précisément d'une forme de la maladie, d'un stade de la maladie, d'une période d'activité de la maladie, ainsi que dans le suivi de patients traités pour cette pathologie. Les présents inventeurs ont alors mis au point un procédé, une composition et un mélange réactionnel pour détecter et/ou quantifier les hétérocomplexes GM2AP/GM2/MRP1 et GM2AP mutée/GM2/MRPl dans des échantillons d'individus susceptibles d'être atteints de sclérose en plaques ou présentant des signes cliniques de cette pathologie. Le procédé consiste à détecter et/ou de quantifier le facteur cytotoxique, associé à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, en isolant dudit échantillon biologique l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP1 ou GM2AP mutéee/G 2/MRPl4. Par isolement de l'hétérocomplexe on entend toutes les conditions qui permettent la détection spécifique de l'hétérocomplexe. L'isolement dudit hétérocomplexe peut être effectué par tous moyens appropriés. On peut citer à' titre d'exemple les électrophorèses non dénaturantes, les chromatographies sur colonne, les méthodes permettant la dégradation des composés du milieu biologique, à l'exception de l'hétérocomplexe (tel que par exemple un traitement à la protéinase ) , ainsi que toute autre méthode permettant de détecter une caractéristique physico-chimique dudit hétérocomplexe, telle
que la masse moléculaire, le point isoélectrique ou tout autres moyens appropriés. Dans mode de réalisation de l'invention on utilise au moins un anticorps ou au moins deux anticorps qui se lie (nt) spécifiquement à l'hétérocomplexe, et ledit facteur cytotoxique est détecté et/ou quantifié par la mise en évidence de la formation d'un complexe constitué par l'hétérocomplexe et l'anticorps ou par la mise en évidence d'un complexe constitué par l'hétérocomplexe et les deux anticorps. De préférence au moins l'un desdits anticorps est un anticorps de capture et au moins l'autre des anticorps est un anticorps de détection. L' anticorps de capture est choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, au complexe MRP14/GM2, au complexe GM2AP/MRP14 et au complexe GM2AP mutée/MRPl4, et l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, au complexe MRP14/GM2, au complexe GM2AP/MRP14 et au complexe GM2AP mutée/MRP14. Dans un autre mode de réalisation, on isole l'hétérocomplexe à l'aide d'au moins deux anticorps dont au moins l'un se lie spécifiquement à GM2AP ou GM2AP mutée de l'hétérocomplexe et au moins l'autre se lie spécifiquement a MRP14 de l'hétérocomplexe, et on détecte et/ou quantifie ledit facteur cytotoxique par la mise en évidence de la formation d'un complexe constitué par l'hétérocomplexe et les deux anticorps. De préférence, au moins l'un desdits anticorps précités est un anticorps de capture et au moins l'autre desdits anticorps est un anticorps de détection. Dans les modes de réalisation précités, la mise en évidence de la formation du complexe constitué par l'hétérocomplexe et au moins un anticorps ou par l'hétérocomplexe et au moins deux anticorps peut être
réalisée par tous moyens appropriés, par exemple par criblage en fonction de la taille à l'aide d'un appareil de tri, par criblage en fonction de la masse moléculaire à l'aide d'une colonne de séparation ou par marquage direct ou indirect d' au moins un anticorps ou par tout autre moyen approprié . Dans un mode de réalisation le procédé consiste à (i) (i) disposer d'un échantillon biologique à tester, (ii) mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un anticorps de capture, ledit anticorps de capture étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2 ; et avec au moins un anticorps de détection marqué, ledit anticorps de détection étant choisi parmi les anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2 et au complexe MRP14/GM2, et (iii) on détecte et/ou quantifie le facteur cytotoxique par détection et/ou quantification de l'anticorps de détection marqué, étant entendu que GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2. De préférence, on réalise la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique en utilisant différents principes d' immunoessais qui sont bien connus de l'homme du métier, tels que ELISA et ELFA et avantageusement on utilise un immunoessai de type « sandwich ». L' immunoessai « sandwich » peut être réalisé en une ou plusieurs étapes, c'est à dire sans étape de lavage ou avec une ou plusieurs étapes de lavage. L'anticorps ou les anticorps de détection sont marqués par tout marqueur approprié. Le marquage peut ainsi être un marquage radioactif, un marquage par une enzyme, un marquage par une molécule fluorescente, un marquage par une
vitamine, un marquage colorimétrique . Dans la présente invention le marqueur est de préférence une vitamine, la biotine, la détection est réalisée par l'addition de streptavidine couplée à la peroxydase de raifort et la révélation est effectuée par addition de dihydrochlorure d' orthophénylènediamine . L' anticorps ou les anticorps de capture sont immobilisés directement ou indirectement sur une phase solide. Le terme « anticorps » utilisé dans la présente invention englobe les anticorps monoclonaux et polyclonaux, leurs fragments et leurs dérivés. Par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab' , sFv d'un anticorps natif6'7 et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif8'9. Ces fragments d'anticorps et dérivés d'anticorps conservent la capacité de se lier sélectivement à l'antigène cible. Il peut être avantageux d'utiliser des anticorps humanisés. Les formes « humanisées » d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l' immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains . De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général,
l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine10'11'12. On peut citer notamment les anticorps anti- GM2AP et anti-MRP14 décrits dans la demande WO 01/05422. Mais la découverte surprenante que l'agent responsable de l'activité gliotoxique et impliqué dans la cytotoxicité correspond à l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRP14 permet la production d'anticorps anti-hétérocomplexe qui sont capables de se lier spécifiquement au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, au complexe MRP14/GM2, au complexe GM2AP/MRP14 ou au complexe GM2AP mutée/MRPl4. La production de tels anticorps est bien connue de l'homme de l'art. L'hérérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRP14 est utilisé comme immunogène pour immuniser des souris BALB/c par injection par voie intrapéritonéale. La première injection est réalisée avec de l'adjuvant complet de Freund. Les autres injections sont réalisées à 4-8 semaines d'intervalle avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Un dernier rappel est effectué quelques jours avant la fusion en eau physiologique. Après ce rappel on prélève les rates des souris immunisées et on recueille les splénocytes. Puis, on réalise la fusion des cellules spléniques avec des cellules d'une lignée myélomateuse et on sélectionne les cellules sécrétant des anticorps qui reconnaissent en ELISA l'hétérocomplexe utilisé pour l'immunisation. On sélectionne finalement les clones produisant des anticorps spécifiques
de l'hétérocomplexe immun, c'est à dire qui ne reconnaissent pas ni GM2AP, ou GM2AP mutée, ni MRP14, seuls. Les anticorps précités peuvent être utilisés dans le procédé de détection et/ou de quantification du facteur cytotoxique soit seuls ou en combinaison. Dans un mode réalisation préféré du procédé de l'invention, l'échantillon à tester est soumis à un traitement préalable comprenant : une étape de digestion des protéines de l'échantillon par la protéinase K ; une étape d' inactivation de la protéinase K, par exemple par précipitation à l'acide trichloroacétique, et une étape de neutralisation du pH, par exemple par addition d'un tampon tris- aléate . L'échantillon biologique à tester est le sérum, le plasma, l'urine ou le liquide céphalorachidien, de préférence l'urine. De préférence, les anticorps utilisés dans le procédé de l'invention sont les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants : 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196. Mais il est bien évident que tout anticorps qui présente la caractéristique de se lier spécifiquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée, à la protéine MRP14, au complexe GM2AP/GM2, au complexe GM2AP mutée/GM2, au complexe MRP14/GM2, au complexe GM2AP/ RP14 ou au complexe GM2AP mutée/MRPl4 fait partie de l'invention, les procédés pour l'obtention de tels anticorps étant bien connus de l'homme du métier, comme décrit ci- dessus . De préférence les anticorps utilisés dans le test sandwich ELISA de détection et/ou de quantification de l'invention sont les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants : anticorps de capture 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, et 79
anticorps de détection 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5.
Les anticorps de capture et de détection sont avantageusement choisis parmi les couples : 2B9H2/10E11A11, 10E11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13H9C9+19C11C10.
Les anticorps monoclonaux et polyclonaux précités sont nouveaux et font également partie des objets de la présente invention. Leur mode de production sera décrit plus en détail dans la partie expérimentale. Les couples d'anticorps de capture et de détection sélectionnés et préférés sont également nouveaux et font aussi partie des objets de la présente invention. La présente invention a également pour objet une composition pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique (gliotoxique) précité dans un échantillon biologique a tester, ladite composition comprenant au moins un anticorps qui se lie spécifiquement à
l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRP1 . De préférence, ladite composition comprend au moins deux anticorps qui se lient spécifiquement à l'hétérocomplexe. La présente invention a aussi pour objet une composition pour la détection et/ou la quantification du facteur cytotoxique (gliotoxique) précité dans un échantillon biologique à tester, ladite composition comprenant dans un mélange réactionnel et simultanément au moins un anticorps de capture et au moins un anticorps de détection marqué, lesdits anticorps étant choisis parmi les anticorps qui se qui se lient spéci iquement à la protéine GM2AP, à la protéine GM2AP mutée et à la protéine MRP14 de l'hétérocomplexe. De préférence, les anticorps de capture et de détection sont choisis parmi les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants : 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5, 79, 2B9H2, 4A7B10, 5H7C10 et 196. Avantageusement, ladite composition comprend au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 10E11A11, 13D1E5, 2G12H5, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2, et 79 ; et au moins un anticorps de détection choisi parmi les anticorps de détection 10E11A11, 4A7B10, 5H7C10, 2B9H2 13H9C9, 19C11C10, 13D1E5 et 2G12H5. Les compositions préférées comprennent les couples d'anticorps de capture et de détection suivants : 2B9H2/10E11A11, 10E11A11/4A7B10+5H7C10, 13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13H9C9+19C11C10, 2B9H2/10E11A11, 2B9H2/13H9C9+19C11C10,
13D1E5+2G12H5/4A7B10+5H7C10, 79/2B9H2, 4A7B10+5H7C10/10E11A11, 4A7B10+5H7C10/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13D1E5+22G12H5, 2B9H2/13H9C9+19C11C10.
L'invention a encore pour objet un mélange réactionnel pour la détection et/ou de quantification du facteur cytotoxique (gliotoxique) précité, ledit mélange comprenant au moins deux anticorps dont au moins l'un se lie spécifiquement à GM2AP ou GM2AP mutée de l'hétérocomplexe et au moins l'autre se lie spécifiquement à MRP14 de l'hétérocomplexe. Par mélange réactionnel on entend un milieu homogène ou hétérogène qui comprend simultanément au moins les deux anticorps précités. De préférence, au moins l'un desdits anticorps est un anticorps de capture et au moins l'autre desdits anticorps est un anticorps de détection. Un autre objet de l'invention est un complexe comprenant l'hétérocomplexe lié à au moins deux anticorps, dont au moins l'un des anticorps est spécifique de GM2AP ou de GM2AP mutée et au moins l'autre anticorps est spécifique de RP14. La séquence SEQ ID NO : 1 correspond à la séquence de la protéine GM2AP . La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à la séquence de la protéine GM2AP mutée dans l'exon 2, à la position 40 (remplacement d'un acide aspartique par une phénylalanine. La séquence SEQ ID NO : 3 correspond à la séquence de la protéine GM2AP mutée, présentant des mutations à la fois dans l'exon 1, dans l'exon 2 et dans l'exon 4. Dans la description détaillée qui va suivre, lorsque l'on fait référence à la protéine GM2AP, la séquence à
prendre en considération est la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO : 1. Par ailleurs, quand on fait référence à la protéine GM2AP mutée, la séquence à prendre en considération est la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO : 2 ; étant entendu que dans les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 on peut trouver indifféremment à la position 153 une valine ou une alanine, comme expliqué dans la partie expérimentale dans l'exemple 3. Cependant, des expériences équivalentes peuvent être menées en prenant en considération la protéine GM2AP mutée présentant des mutations à la fois dans l'exon 1, dans l'exon 2 et dans l'exon 4, telle qu'identifiée dans l'identificateur de séquence en SEQ ID NO : 3. Figure . La figure annexée représente la courbe dose-réponse du complexe ternaire GM2AP+MRP14+GM2 (GM2 : 50 μg/ml final) . Les quantités de MRP14 sont représentées en abscisse (en ng) et le pourcentage de cytotoxicité correspondant au pourcentage de cellules mortes est représenté en ordonnée. Dans la présente figure les quantités de GM2AP en ng sont respectivement représentées par les symboles suivants : φ : 5 ng, π : 10 ng, Ψ : 20 ng, υ : 50 ng et χ: 100 ng. Une expérience similaire a été réalisée avec la protéine GM2AP mutée au lieu de la protéine GM2. Les résultats obtenus sont similaires à ceux présentés dans la figure annexée.
Exemples .
Exemple 1 : Protocole du test MTT. (i) « Coating » des plaques à la poly-L-lysine.
250 μl de solution de poly-L-lysine (12,5 μg/ l) stériles sont déposés dans tous les puits de plaques 48 puits (Falcon 3078) . Après une incubation de 2 heures à 37 °C, la solution est aspirée et remplacée par 250 μl d'eau stérile pour laver les puits. Une fois les puits vidés par aspiration, ils sont séchés sous le flux d'air d'un poste de sécurité microbiologique.
(ii) Cellules utilisées Les cellules CLTTl-1 sont des astrocytes issus ce souris transgéniques exprimant le gène large T du polyoma virus13. Ces cellules sont cultivées à 37°C en atmosphère humide à 5 % de C02, en Dubelcco's Modified Eagle's Médium (DMEM) /Ham' s F12 médium (50/50) 4,5 g/1 de D-glucose supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) non décomplémenté, du gluta ax (580 mg/1) , de la pénicilline (500 unités/1) et de la streptomycine (500 μg/1) . (iii) Test de cytotoxicité Les échantillons à tester sont préparés 24 heures avant le dépôt pour le test de toxicité et incubés à 4°C. Les plaques de 48 puits « coatées » à la poly-'L- lysine sont ensemencées avec des cellules CLTT 1-1 à raison de 250 μl de suspension cellulaire (6000 cellules/ml) par puits, soit 1500 cellules/puits. Après 24 heures d'incubation à 37 °C, en atmosphère humide et 5% de CO2 les échantillons sont déposés à la surface du milieu cellulaire. Chaque échantillon est déposé en trois exemplaires. Certains puits permettent d'évaluer des témoins (T) cellulaires (aucun dépôt d'échantillon) ou des témoins dits TUC (dépôt de 10 μl de solution TUC) . Le réactif TUC (TRIS 20 mM, urée 250 mM, CaCl2 1 mM) est une solution mimant la chimie de l'urine.
Le dépôt est homogénéisé et, pour éviter toute évaporation, un film protecteur est appliqué sur le dessus des plaques . Après 72 heures d'incubation à 37°C, en atmosphère humide et 5% de C02, la révélation par le test MTT est réalisée. Le surnageant cellulaire est aspiré en prenant soin de ne pas retirer les cellules du fonds des puits. 250 μl de solution MTT (0.5 mg/ml dans du milieu de culture) sont déposés délicatement sur les cellules. Après 3 heures d'incubation à 37 °C, la solution est aspirée et les cristaux de formazan formés dans les cellules sont solubilisés avec de l'isopropanol, HC1 IN (40 μl/ml) . Une fois homogène, 70 μl de solution de chaque puits de la plaque 48 puits sont transvasés dans les puits d'une plaque 96 puits, afin de faire une lecture de densité optique . Les absorbances sont lues à 570 nm/650 nm. Le pourcentage de cytotoxicité peut être calculé : MoyT = moyenne des absorbances des témoins σT = écart type des absorbances des témoins CO "= CutOff = MoyT - 2 σT DO = absorbance moyenne des échantillons % toxicité = (1 - (DO / CO) ) x 100 Pour être valides, les absorbances de chaque échantillon (en trois exemplaires) ne doivent pas avoir un écart type supérieure à 10% de l' absorbance moyenne.
Exemple 2 : Préparation de pools d'urine. 100 litres d'urine SEP (0,2-0,5 litre provenant de la première miction matinale de patients) ont été collectés. Les urines de patients contaminées par voie bactérienne ou celles de patients traités par des médicaments susceptibles d'interférer avec le bioessai de gliotoxicite4 ont été éliminées. Les échantillons individuels ont été testés pour
la gliotoxicite et un pool final de 46 litres d'urine avec une gliotoxicite significative, par le test MTT, a été sélectionné. En parallèle, un volume équivalent d'urine de donneurs sains avec une gliotoxicite négative pour chaque échantillon a été obtenu. Les étapes de concentration et de purification de ce matériel, l'analyse proteique et la stratégie d'identification sont présentés ci-dessous. • Purification des protéines urinaires. Les pools d'urine SEP positifs et SEP négatifs ont été purifiés pour obtenir une concentration élevée en protéines . (i) Précipitation : Des précipitations au sulfate d'ammonium (Prolabo - réf. 21 333 365) ont été effectuées sur les pools d'urine SEP positif et SEP négatif. Le pourcentage de 60 % de sulfate d'ammonium saturé pour 40 % d'urine, soit 390 grammes de sulfate d'ammonium par litre d'urine a été utilisé. Chaque pool est réparti en fractions de 1,8 litres dans des flacons de 2 litres pour améliorer la précipitation. La précipitation a été effectuée durant 2 x 8 heures, à température ambiante, sous agitation douce. Après centrifugation des pools d'urine à 3000 tpm pendant 10 min., à une température de 10 °C, le culot obtenu est repris dans un tampon Tris 20 mM contenant du CaCl2 1 mM et de l'urée à 0,25 M. Le mélange a ensuite été centrifugé à 3000 tpm pendant 10 min. Le surnageant contient les protéines concentrées. Il est soit utilisé immédiatement pour l'étape suivante, soit congelé si l'étape suivante ne peut être effectuée en continu. (ii) Chromatographie par échange d'ions : La solution contenant les protéines a ensuite été passée sur un gel DEAE Fast Flow (nom commercial, commercialisé par PHARMACIA) . Cette étape est effectuée à basse pression sur une colonne PHARMACIA remplie de gel. Les
tampons sont amenés sur la colonne par une pompe péristaltique qui permet un débit régulier. Le tampon d'équilibration de la colonne est le tampon Tris 20 mM, pH 7. La fraction correspondant au surnageant de précipitation et contenant une quantité de sels trop élevée est dialysée contre ce tampon avant dépôt sur la colonne. Une élution par un gradient salin permet de récupérer les protéines. Le gradient d'elution est effectué par palier de NaCl 100, 200, 300, 500 mM dans le tampon d'équilibration de la colonne. Les fractions d'elution sont testées par le test MTT. Seules les fractions positives, c'est à dire les fractions éluées à 200 Mm NaCl, sont conservées. Ces fractions sont traitées immédiatement ou conservées à l'état lyophilisé, (iii) Purification : Une chromatographie d'exclusion stérique basée sur la différence de taille et de forme des protéines à éluer a été utilisée. La fraction correspondant à l' élution 200 mM NaCl est déposée sur la colonne. Au cours de 1' élution, les protéines de faible masse moléculaire sont retenues et donc éluées plus tardivement que les grosses molécules. Les purifications ont été effectuées sur HPLC avec une colonne TosoHaas TSK Prep G 3000 SW, d'un diamètre de 21,5 mm et d'une longueur de 300 mm. La limite d'exclusion en masse moléculaire est de 500 000 daltons . Le tampon d'elution utilisé contient du phosphate 100 mM, du sulfate de sodium 100 mM, à pH 6,8. La séparation du mélange de protéines a été effectué en 60 min. Seule la fraction correspondant à une masse de 15-20 000 daltons a été conservée. Cette fraction est dialysée dans un tampon Tris 20 mM contenant du CaCl20,2 mM, pH 7,2, puis lyophilisée. A chaque étape, seules les fractions présentant une activité toxique significative ont été retenues pour l'étape suivante. Un contrôle de l'activité toxique des protéines a été effectué à chaque étape, à l'aide du test MTT. Seules
les fractions présentant une activité toxique significative ont été retenues pour l'étape de purification supplémentaire . (iv) Purification supplémentaire des protéines urinaires par chromatographie en phase inverse : Les pools d'urine provenant de patients SEP (pool SEP positif) et de patients non SEP (pool SEP négatif) , obtenus après purification, ont été repris dans de l'eau distillée, puis dilués avec une solution 0,2% TFA/10% acétonitrile pour obtenir une concentration finale d'environ 130 à 140 μg/ml. La séparation par HPLC phase inverse C8 a été effectuée sur une colonne Brownlee Aquapore (nom commercial) commercialisée par la société Perkin Elmer (caractéristiques de la colonne : 300 angstroms/7 μm/ (100x4, 6) mm). Deux colonnes distinctes ont été utilisées respectivement pour les pools positif et négatif. Les injections ont été réalisées par multi-injections de 250 μl . Les protéines ont été éluées avec un gradient linéaire de 5% à 15% de tampon A en 5 min., puis de 15% à 100% de tampon B en 95 min., à un débit de 0,5 ml/min. Les tampons de séparation A et B utilisés sont respectivement le tampon 0,1% TFA (Pierce n° 28904)/ eau MilliQ et le tampon 0,09% TFA/80% acétonitrile (Baker) . La détection a été effectuée par mesure de 1' absorbance UV à 205 et 280 nm. La collecte des fractions a été effectuée en fractions de 1,5 ml et de 0,5—1 ml dans la zone d'intérêt. Les fractions ont été congelées après la collecte dans de la carboglace. Les fractions collectées ont ensuite été séchées en Speed Vac et reprises dans 100 μl de 0,1% TFA/30% acétonitrile. 20μl des fractions ont été transférés dans des eppendorfs de 500 μl, séchés et lavés à deux reprises avec 100 μl d'eau MilliQ, puis séchés de nouveau.
L'activité toxique des protéines contenues dans chaque fraction recueillie après élution a été déterminée à l'aide du test MTT. Seule la fraction X76/43 du pool SEP positif présente une activité toxique in vitro . Le numéro de cette fraction correspond à l'ordre de l' élution en fonction des conditions d'elution énoncée dans l'exemple. Son activité toxique a été confirmée in vitro par FACS sur des cellules astrocytaires murines, comme décrit dans la demande WO 98/11439. Son profil sur SDS-PAGE révélait des bandes protéiques à 55 kDa, 35kDa, 20 kDa, 18 kDa, 14kDa et 8 kDa. La fraction correspondante X76/43 du pool SEP négatif, obtenue à partir des urines de contrôle, ne présentait aucune activité toxique par le test MTT. Son profil sur SDS- PAGE montrait des bandes à 55 kDa, 35 kDa et 20 kDa. • Analyse des protéines obtenues par séparation sur HPLC sur gel SDS-TRICINE. Le contenu proteique de la fraction X76/43 du pool témoin SEP négatif et de la fraction X76/43 du pool SEP positif a été observé après séparation sur gel SDS-TRICINE 16% et coloration du gel au zinc/imidazole. Le pool de collecte de la fraction X76/43 obtenue par HPLC a été déposé sur un gel SDS-TRICINE 16% précoulé de 10 puits et de 1 mm d'épaisseur (commercialisé par la société Novex) . Les conditions d'utilisation du gel correspondent à celles préconisées par le fournisseur. L'échantillon est repris dans 75 μl du tampon d'échantillon 1 fois concentré (SDS-TRICINE N° LC 1676, 1 ml deux fois concentré + 50μl de β-mercaptoéthanol (Pierce) dilué au 1/2 dans de l'eau) et 25μl de l'échantillon sont déposés sur le gel en trois fois. Le pool de collecte de la fraction X76/43 provenant du pool SEP négatif a été déposé sur le gel dans les mêmes conditions que celles décrites pour le pool SEP positif. La migration sur les deux gels a été effectuée en parallèle dans la même cuve de migration (XCELL II NOVEX
(nom commercial) ) à un voltage constant de 125 V pendant 2 heures. La cuve est placée dans un bac contenant de la glace. Les gels ont été colorés directement après la migration par coloration au zinc/imidazole (kit de coloration 161-0440 commercialisé par la société BIORAD) pour obtenir une coloration négative réversible. • Digestion à la trypsine des bandes de gel. Toutes les bandes de protéines visualisées dans les dépôts de la fraction X76/43 ont été découpées et soumises à une protéolyse dans une solution de trypsine pendant une nuit. Les bandes de gels sont découpées au scalpel en tranches de 1 mm et transférées dans des tubes eppendorfs . Les eppendorfs sont soumis à un pic de centrifugation pour faire tomber les morceaux de gel et après centrifugation 100 μl de tampon de lavage (100 Mm NH4CO3/50% CH3CN) sont ajoutés aux morceaux de gel. Après 30 min. d'agitation à température ambiante, le surnageant est enlevé par fractions de 20 μl et l'étape de lavage est renouvelée deux fois. Les eppendorfs sont séchés pendant 5 min. en speed vac. 20 μg de trypsine (Modified sequenal grade PROMEGA V5111) (nom commercial) sont repris dans 200 μl de tampon de digestion (5 mM TRIS, pH 8) et sont dissous pendant 30 min. à température ambiante, sous agitation intermittente et 20 à 30 μl de trypsine resuspendue sont ajoutés aux morceaux de gel. Les eppendorfs sont centrifugés et conservés en chambre chaude à 28 °C pendant une nuit. Après digestion les bandes de gel peuvent être utilisées immédiatement pour les mesures de masse ou congelées pour usage ultérieur. Des protéines de poids moléculaires apparents élevés ont été trouvées dans les deux fractions. Par contre les bandes de poids moléculaires apparents de 8, 14, 18 kDa ne sont visibles que dans la fraction X76/43 du pool SEP positif.
Exemple 3 : Spectrométrie de masse et séquençage des protéines . • Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des fragments protéolytiques . 30 μl de tampon d'extraction (2% TFA/50% acétronitrile) sont ajoutés aux échantillons. Les eppendorfs à analyser sont soumis à une centrifugation de 5 min., puis à une sonication de 5 min. et finalement à une centrifugation de 1 min. Sur un disque en acier inoxydable, 14 dépôts de 0,5 μl de matrice (acide α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamique à saturation dans de l'acétone) sont réalisés. Une fine couche microcristalline uniforme est obtenue. 0,5 μl d'une solution de 2% TFA/eau sont déposés sur cette sous-couche sur les 14 dépôts, puis 0,5 μl d'échantillon à analyser sont ajoutés. Dans cette goutte ainsi formée, 0,5 μl d'une solution à saturation d'acide Oc-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamique dans 50% acétonitrile/eau sont ajoutés. Après un séchage à température ambiante pendant 30 min., les dépôts cristallins sont lavés avec 2 μl d'eau qui sont immédiatement évacués par un souffle d'air. Tous les spectres sont obtenus sur un spectromètre de masse BRUKER BIFLEX (marque de commerce) équipé d'un réflectron. Les mesures (90 à 120 tirs laser sur l'ensemble du dépôt) sont accumulées pour obtenir un spectre de masse qui soit le plus représentatif de l'ensemble des peptides présents dans le sandwich matrice-échantillon. Pour chaque dépôt, une calibration avec les peptides de l'autolyse de la trypsine a été faite afin de pouvoir utiliser une précision de mesure inférieure à 100 ppm. Les résultats de spectrométrie de masse ont été recherchés dans les banques de données en utilisant l'algorithme MS-FIT du logiciel Protein Prospector (http A/prospector .ucsf.edu) .
• Séquençage N-terminal des peptides de digestion. - (i) Extraction et séparation par HPLC des peptides de digestion. Les peptides obtenus après digestion par la trypsine ont été extraits en 3 fois 30 min. dans un bain de sonication avec 0,1% TFA/60% acétonitrile. Les solutions d'extraction sont réunies et séchées jusqu'à 20 μl en speed vac. Après dilution dans 80 μl de tampon A (0,1 % TFA/eau) , les extractions des bandes de gel, digérées avec de la trypsine, sont injectées sur une colonne C18/MZ- Vydac/ (125x1, 6) mm/5 μm (nom commercial). L' élution des peptides se fait à un débit de 150 μl/min. et dans un gradient allant de 5% de tampon B (0,09% TFA/80% acétronitrile) à 40% de tampon B en 40 min., puis de 40% de tampon B à 100 % de tampon B en 10 min. La détection est faite par mesure de l' absorbance UV à 205 nm. La collecte des pics est effectuée dans des tubes eppendorf de 500 μl. Les pics peptidiques individuels collectés sont ensuite soumis à une analyse de la séquence en acides aminés N- terminale . - (ii) Séquençage N-terminal : Les fractions correspondant à un seul pic de masse ont été analysées par dégradation d'Edman sur un séquenceur (Modèle 477A PERKIN ELMER/Applied Biosystems) . Les conditions de séquençage sont celles décrites par le constructeur. Une micro cartouche a été utilisée pour le dépôt des échantillons et les PTH-AminoAcid sont identifiés avec un système HPLC online (Modèle 120A PERKIN ELMER/Applied Biosystems) .
•Résultats
Les résultats de l'analyse par spectrométrie de masse et du séquençage sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous .
Tableau 1
Un mélange de protéines co-purifiées était encore présent à la fois dans la fraction finale de purification SEP et dans la fraction contrôle correspondante. Les protéines identifiées dans ces deux échantillons ont été considérées comme étant non pertinentes en raison de l'absence d'activité gliotoxique dans ces deux fractions. En conséquence, GM2AP (18kDa) , MRP14 ou calgranuline B (14kDa) , et saposine B (10 kDa) ont été considérées comme des candidats potentiels pour l'activité gliotoxique. Par ailleurs, le séquençage N-terminal des fragments digérés par la trypsine de la bande de 18 kDa dans la
fraction SEP a montré la présence de polymorphisme dans différentes positions de GM2AP . Une mutation dans l'exon 1, à la position 19 de la séquence en acides aminés de GM2AP, où une alanine est remplacée par une thréonine. Une mutation dans l'exon 2, où un acide aspartique est remplacé par une phénylalanine à la position 40 de la séquence en acides aminés de GM2AP . Cette mutation n'a jamais été retrouvée dans l'ADN génomique de donneurs sains ou de malades. Deux autres mutations dans l'exon 2, respectivement aux positions 59 et 69 de la séquence en acides aminés de GM2AP qui correspondent au remplacement d'une isoleucine par une valine et d'une méthionine par une valine. Une mutation dans l'exon 4 qui consiste en un remplacement d'une valine par une alanine à la position 153 de la séquence en acides aminés de GM2AP s'est révélé être un nouveau polymorphisme non décrit après différents séquençages de l'ADN génomique de lymphocytes provenant d'individus sains (donneurs de sang) et de patients atteints de sclérose en plaques. Cette mutation dans l'exon 4 a été retrouvée chez 3 sur 27 patients SEP testés, ainsi que chez 8 sur 27 individus de contrôle suggérant un polymorphisme normal. Une autre mutation est retrouvée dans l'exon 4, à la position 171 de la séquence en acides aminés de GMPA2, où une lysine est remplacée par une glutamine. Les séquences en acides aminés de GM2AP et de GM2AP mutée sont respectivement représentées dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, étant entendu que dans ces deux séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 on peut trouver indifféremment à la position 153 une valine ou une alanine, puisque la mutation dans l'exon 4 pour cette position suggère un polymorphisme normal.
Exemple 4 : Protéines recombinantes . Des protéines recombinantes (achetées ou produites par transfection) ont été utilisées pour évaluer le potentiel gliotoxique des protéines candidates. Les protéines dites « non humaines », c'est à dire des protéines recombinantes produites dans un système d'expression procaryote (E . coli) par transformation avec un plasmide contenant l' insert à exprimer, ou dans un système d'expression eucaryote dans des levures ou cellules d'insectes infectées par le baculovirus ayant intégré 1' insert à exprimer, suivantes ont été utilisées : La protéine MRP14 (ou Calgranuline B ou S100A9) fusionnée en N-terminal avec une queue histidine et produite dans E. coli ; la protéine MRP8 (ou Calgranuline A ou S100A8) produite dans E. coli ; et l'hétérocomplexe MRP14/MRP8 (ou Calprotectine) natif humain, achetés au Dr C. Kerkhoff (université de Munster, Allemagne) . La protéine GM2AP (précurseur de l'activateur du ganglioside GM2) fusionnée en N-terminal avec une queue histidine produite en Baculovirus et la protéine Sap B (Saposine B) produite en levure, achetées au Pr K. Sandhoff (Institut Kekule, université de Bonn, Allemagne) . Ces protéines possèdent leur propre activité physiologique décrite dans la littérature. Les protéines dites « humaines », c'est à dire des protéines recombinantes produites dans un système d'expression eucaryote dans des cellules humaines transfectées par un plasmide approprié ayant intégré 1' insert à exprimer ont été produites selon le protocole décrit ci-dessous. Les cellules 293T (cellules primaires embryonnaires humaines de rein transformées par un adénovirus de type 5, exprimant l'antigène T) ont été cultivées à 37 °C en atmosphère humide à 5% de C02, en DMEM 4,5 g/1 de D-glucose
supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) décomplémenté, du glutamax (580 mg/1) , de la pénicilline (500 unités/1) et de la streptomycine (500 μg/1) . Pour réaliser la transfection transitoire, des plasmides appropriés contenant le cDNA des protéines d'intérêt, MRP14, GM2AP et GM2AP mutée (Acide aspartique/Phénylalanine/position 40) précédés d'un peptide de sécrétion (IgK) en N terminal, ont été utilisés. Les cellules 293T sont transfectées avec un réactif « Transfectant » composé de lipides qui complexent et transportent l'ADN dans les cellules. Les cellules 293T sont trypsinées, ensemencées à 2 millions de cellules par flacon de 75 cm2, et incubées 1 nuit à 37 °C , en atmosphère humide et 5% C02 dans 10 ml de milieu de culture (DMEM 4,5 g/1 de D-glucose supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté, du glutamax (580 mg/1) , de la pénicilline (100 unités/ml) et de la streptomycine (100 μg/ l) ) . La solution de transfection est préparée extemporanément en utilisant le rapport 3/2 [volume de Transfectant (μl) /quantité d'ADN plasmidique (μg) ] qsp 1ml de "milieu sans SVF. Après 45 minutes de contact à température ambiante, la solution de transfection est ajoutée goutte à goutte sur un tapis cellulaire non confluent. Après 72 heures d'incubation à 37°C, en atmosphère humide et 5% C02, les surnageants sont récupérés, centrifugés 10 minutes à 2500 tpm. La quantification de protéine produite est alors réalisée soit par le kit de dosage MRP Enzyme Immunoassay (nom commercial) commercialisé par BMA Biomedicals AG, Augst, Switzerland, en suivant la notice pour la protéine recombinante humaine MRP14, soit par la technique du Western Blot semi quantitatif avec des anticorps polyclonaux de
lapin anti-GM2AP . Ces techniques donnent des valeurs indicatives pour une comparaison relative. Les surnageants bruts issus de cette production seront utilisés notamment pour les tests d'activité toxique et de détection.
Exemple 5 : Toxicité des protéines « non humaines ». La toxicité des protéines recombinantes « non humaines » MRP14, MRP8, GM2AP, SapB a été évaluée par le test MTT. Les protéines ont été testée dans une gamme définie à partir de l'évaluation de la concentration de chaque protéine dans différentes urines. Les gammes sont réalisées dans différents tampons, soit dans la solution TUC, soit dans deux types d'urine : des urines provenant de patients atteints de sclérose en plaques et qui étaient toxiques par le test MTT (urine SEP), et des urines provenant d'un recrutement de donneurs non SEP qui n'étaient pas toxiques par le test MTT (urine normale) . Les urines avaient au préalable été traitées 30 min. à 56°C et filtrées. Les résultats montrent que, prises individuellement, les protéines testées dans la solution TUC et dans les urines normales ne sont pas toxiques par le test MTT. Aucun effet significatif des protéines GM2AP, MRP14 et Saposine B n'est mis en évidence dans les urines SEP par le test MTT. On note une inhibition de la toxicité avec une dose MRP8 égale ou supérieure à 3 ng. Ces résultats sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 2A : Gamme dans la solution TUC
Des combinaisons de protéines GM2AP/MRP14, Saposine B/MRP14 et Saposine B/GM2AP/MRP14 ont ensuite été préparées dans la solution TUC eb dans les deux types d'urine comme décrit ci—dessus. En combinaisons « contrôles », l'hétérocomplexe MRP14/8 ou la protéine MRP8 remplacent la protéine MRP14 dans les différentes combinaisons GM2AP/MRP14/8, Saposine B/GM2AP/MRP8. Les combinaisons « contrôles » ont été préparées de la même manière. Toutes
les combinaisons ont été incubées une nuit à 4°C avant d'être testées pour leur toxicité par le test MTT. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3A Gamme dans la solution TUC
Tableau 3 B: Gamme dans les urines normales.
Comme cela ressort du tableau 3B, la combinaison GM2AP/MRP14 est toxique dans l'urine normale puisque la toxicité augmente en fonction de l'augmentation de la quantité de protéine GM2AP . Mais cette toxicité apparaît peu stable et peu reproductible et semble être dépendante de l'échantillon d'urine (voir comparaison du pourcentage de cytotoxicité entre urine normale 1 et urine normale 2, dans le tableau 3B) . La combinaison Saposine B/MRP14 est à la limite de la significativité dans l'urine normale. Les résultats obtenus avec la combinaison GM2AP/MRP14/Saposine B sont difficilement interptétables .
La toxicité des combinaisons de protéines GM2AP/MRP14 et Saposine B/MRP14 a également été testée vis à vis d'urines normales et d'urines toxiques issues de patients atteints de sclérose en plaques (urine SEP) . Les résultats sont présentés dans le tableau 3C.
Tableau 3C Gamme dans les urines non SEP et SEP
La combinaison Saposine B/MRP14 n'a aucun effet toxique dans les urines normales et dans l'urine SEP, quelque soit la quantité testée. La combinaison GM2AP/MRP14 ne présente pas d'effet toxique vis à vis de l'urine normale 1, mais présente un effet toxique vis à vis de l'urine normale 2 (quand GM2AP augmente, ela toxicité de l'urine augmente). On constate par ailleurs un effet inverse vis à vis de l'urine SEP. Quand la quantité de MRP14 augmente, la toxicité de l'urine diminue.
Exemple 6 : Toxicité des protéines « humaines » Les protéines GM2AP, GM2AP mutée dans l'exon 2 et MRP14 produites comme décrit dans l'exemple 3 ont été testées pour leur toxicité par le test MTT, à partir des surnageants de culture des cellules 293T les contenant.
Les combinaisons suivantes ont également été effectuées à partir des surnageants de culture des cellules 293T : GM2AP/MRP14, GM2AP mutée/MRPl4, GM2AP/MRP14/MRP8. Les combinaisons préparées ont ensuite été incubées une nuit à 4°C, puis elles ont été testées pour leur toxicité par le test MTT.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4A
Pour certaines valeurs, indiquées en caractères gras, certaines combinaisons GM2AP/MRP14 sont faiblement cytotoxiques (de 20 à 30% de cytotoxicité) avec un optimum pour la combinaison GM2AP(20 ng) /MRP14 ( 0, 5 ng) . MRP14 seule n'est pas cytotoxique. GM2AP seule n'est pas considérée comme étant cytotoxique, même si une très faible toxicité est retrouvée dans les essais 1 et 2 effectués sur le lot 2. En effet, la reproductibilité ne peut pas être parfaite car elle dépend du lot de production des surnageants.
T able au 4B
Les résultats montrent que les protéines seules, dans les surnageants, ne sont pas toxiques, sauf de manière non spécifique à de très fortes quantités (100 ng de MRP14) .
Seule la combinaison GM2AP (100 ng) /MRP14 (100 ng) peut être considérée comme présentant une cytotoxicité relative.
Si la protéine GM2AP est remplacée par la protéine GM2AP mutée dans cette combinaison, le même type de toxicité est obtenue pour certains mélanges, comme montré ci-dessous.
Tableau 4C
Pour de nombreuses valeurs, indiquées en caractères gras, la combinaison GM2AP mutée/MRPl4 est toxique. La protéine GM2AP mutée seule n'a pas d'effet cytotoxique. MRP14 seule est considérée comme ne présentant pas d'activité cytotoxique.
La cytotoxicité des combinaisons de surnageants contenant les protéines recombinantes humaines, GM2AP/MRP14 et GM2AP mutée/MRPl4 est retrouvée dans un même ordre de grandeur, avec une stabilité plus importante en fonction du lot de production des protéines, qu'avec les protéines recombinantes non humaines. Mais cela ne correspond pas à la stabilité, la reproductibilité et l'intensité de l'activité gliotoxique retrouvée dans les fluides biologiques de patients SEP.
Table au 4D
Tableau 4E
Il ressort du tableau 4E que la combinaison GM2AP mutée/MRP14 /MRP8 ne présente pas d'activité cytotoxique.
Ces études montrent qu' aucune des protéines identifiées dans la fraction gliotoxique purifiée à partir d'urines SEP ne reproduisait, seule, l'activité gliotoxique recherchée et que les combinaisons de protéines produites sous forme de recombinants « non-humains » ou « humains » ne reproduisent que faiblement et de manière peu reproductible (même si une amélioration est notée avec les recombinants « humains ») l'activité gliotoxique. Les résultats obtenus
ne répondent pas à l'ensemble des critères caractérisant l'activité gliotoxique (activité élevée, stabilité, reproductibilité, effet dose-réponse) .
Les résultats montrent qu'il manque un composant essentiel qui n' a pas été identifié dans l' analyse proteique .
Les inventeurs ont alors trouvé de manière surprenante que des lipides, notamment des lipides complexes, sont des candidats intéressants dans ce contexte. A cet effet, le ganglioside GMl, le ganglioside GM2 et le sulfatide ont été testés. Parmi ces lipides, le ganglioside GM2 s'est avéré le seul probant, comme le montrent les exemples qui suivent.
Exemple 7 : Toxicité des protéines recombinantes « humaines » en association avec le ganglioside 6M2. Le ganglioside GM2 (fourni par le Professeur J. Portoukalian (Lyon France) ) est ajouté à une concentration de 50-— μg/ml final aux combinaisons de —protéines recombinantes « humaines » déjà réalisées, impliquant les protéines MRP14, GM2AP et GM2AP mutée. Les combinaisons GM2AP/MRP14 et GM2AP mutée/MRPl4 ont été testées dans une gamme de protéine: 0, 5, 10, 20, 50, 100 ng pour les protéines recombinantes GM2AP et GM2AP mutée et jusqu'à 200 ng pour la protéine MRP14. Ces gammes ont été faites en association ou non avec le ganglioside GM2. Après mélange, les combinaisons sont incubées une nuit à 4°C, leur toxicité est ensuite évaluée par le test MTT.
Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau 5 et dans la figure annexée. Tableau 5A
Mesure de l'activité gliotoxique des protéines «humaines » combinées et associées au ganglioside GM2 (50 μg/ml final)
La combinaison GM2AP/MRP14 associée à une concentration constante de ganglioside présente un effet gliotoxique qui augmente parallèlement à la quantité en protéine MRP14. De plus, pour des quantités croissantes de la protéine GM2AP (20 et 10 ng) , un effet de dose-réponse typique s' élevant par paliers, est obtenu. Cependant aux points extrêmes, lorsqu'il n'y a pas assez de protéine GM2AP (5 ng) il n'y a pas de toxicité. Au contraire, s'il y en a
trop de protéine GM2AP (50 ng et 100 ng) il y a saturation de la toxicité avec un plateau vers 60%. En effet, seules les cellules CLTTl-1 en prolifération dans la culture pendant l'exposition au facteur gliotoxique sont sensibles. Ceci explique que les plateaux de gliotoxicite n' atteignent pas 100%.
Tableau 5B Mesure de l'activité gliotoxique « des protéines «humaines » combinées, associées ou non, au ganglioside GM2 (50 μg/ml final)
Sans ganglioside GM2, les combinaisons GM2AP mutée/MRPl4 ne sont pas gliotoxiques . Une augmentation globale de la cytotoxicité du mélange avec le ganglioside GM2 est observée par rapport aux combinaisons sans ganglioside. La variabilité des mesures est apparemment plus importante avec l'utilisation de la protéine GM2AP mutée. Globalement, l'activité apparaît significative et atteint un plateau maximum (cf. : maximum atteint sur le pool des cellules en prolifération pendant le test, comme discuté précédemment) pour les concentrations les plus fortes, selon un effet-dose à deux variables, GM2AP mutée et MRP14.
Afin de savoir si l'action du ganglioside GM2 est bien spécifique de la toxicité des combinaisons de protéines recombinantes humaines GM2AP/MRP14 (5 ng de MRP14 et 50 ng ou 100 ng de GM2AP) , d'autres lipides ont été testés en parallèles : le ganglioside GM1 et le sulfatide. Les gammes de concentration utilisées sont 0, 10, 20, 30, 50 μg/ml final. Une fois les lipides ajoutés, les combinaisons sont incubées une nuit à 4°C, leur toxicité est ensuite évaluée dans le test MTT. Les résultats, présentés dans les tableaux 5C et 5D, montrent que seules les associations avec le ganglioside GM2 pour les combinaisons GM2AP/MRP14 aux doses 30 μg/ml et 50 μg/ml sont toxiques pour les cellules gliales
(respectivement 27% et 30%) . Les autres lipides ne montrent aucune toxicité avec les combinaisons protéiques.
Tableau 5C Influence du ganglioside GM2 dans l'activité gliotoxique des protéines recombinantes « humaines » combinées GM2AP/MRP14
Tableau 5D Influence du ganglioside GM2 dans l'activité gliotoxique des protéines recombinantes « humaines » combinées GMA2AP/MRP14
Les résultats de l'étude montrent que : l'activité est associée à un hétérocomplexe proteique impliquant les protéines GM2AP ou GM2AP mutée et MRP14 ; c'est l'ajout d'un lipide, tel que le ganglioside GM2 , qui a permis d'obtenir des niveaux d'activité, une reproductibilité et des effets dose—réponse, compatibles avec la reproduction de l'activité gliotoxique recherchée ; la mutation trouvée sur la protéine GM2AP n'est pas indispensable au déterminisme de la gliotoxine in vitro . Cependant, in vivo, elle peut être déterminante si elle est nécessaire pour le processus de biodisponibilité de la protéine GM2AP (par exemple dans le milieu extra-cellulaire du système nerveux central) . Ces éléments démontrent donc qu'un hétérocomplexe MRP14/GM2AP ou MRP14/GM2AP mutée associé au ganglioside GM2 est le vecteur principal, voire unique, de l'activité gliotoxique .
Exemple 8 : Mise au point d' n immunodosage du complexe gliotoxique - Préparation des échantillons avant le test ELISA. (i) Echantillons testés. Les échantillons testés sont : d'une part les protéines recombinantes humaines en combinaison (GM2AP+MRP14) avec ou sans ganglioside GM2, dilués ou non dans des urines normales, afin de détecter le complexe recombinant actif, d'autre part des urines normales et SEP pour une détection directe dans les urines. Les échantillons, une fois préparés, sont incubés 24 heures à 4°C avant le test de détection. Les protéines recombinantes « humaines » sont utilisées sous forme de surnageants de production bruts, récupérés après la transfection transitoire des cellules 293T, avec les contrôles négatifs appropriés en parallèle. Les systèmes de dosage des protéines MRP14 et GM2AP utilisés sont semi-quantitatifs et les quantités précisées, indicatives. Les résultats sont présentés dans les exemples qui suivent . (ii) Traitement des échantillons. Comme cela est montré, dans les exemples suivants, le procédé de détection utilisant les anticorps anti-MRP14 et anti-GM2AP dans un format ELISA « sandwich », permettent d'obtenir des résultats positifs. Toutefois, les inventeurs ont optimisé ce procédé de détection en réalisant un traitement préalable de l'échantillon comprenant une étape de digestion par la protéinase K des protéines en présence, suivie d'une étape d' inactivation de cette protéase par un procédé original de précipitation à l'acide trichloroacétique, puis d'une neutralisation du pH avec un tampon tris-maléate,
sélectionné pour sa compatibilité ultérieure avec un essai ELISA sandwich. Ce traitement de l'échantillon, original dans ses différentes étapes a été appliqué par la suite aux analyses qui sont présentées dans les exemples suivants et est décrit en détail ci-dessous. Les échantillons (mélange de protéines recombinantes ou urines) sont traités à la protéinase K avant une détection du complexe selon le protocole suivant : 0,3 g de protéinase K est ajouté pour 100 μl d'échantillon. Après digestion une heure à 37 °C, une précipitation à l'acide trichloracetique est réalisée afin d'inhiber l'action de la protéinase K. L'acide trichloracetique 90% (90 g d'acide trichloracetique pour 48 ml d'eau distillée), est ajouté à l'échantillon (15% du volume initial de l'échantillon). Le mélange est incubé 30 minutes à 4°C. Après centrifugation de 30 minutes à 13 000 tpm, le culot est repris avec un volume égal au volume initial de l'échantillon par le tampon TRIS Maléate 0.2M pH 6,2 (dans les essais sans facteur de concentration) ou dans un volume minimum (pour réaliser une concentration volumique des protéines non digérées) . Après contrôle par la technique de Western Blot des échantillons traités à la protéinase K, une observation peut être faite et le traitement peut être optimisé en augmentant la quantité de protéinase K et son temps d'action.
Exemple 9 : Protocole de détection de l'hétérocomplexe dans un essai ELISA sandwich. (i) Obtention des anticorps : les anticorps suivants ont été produits selon les protocoles décrits ci-dessous : anticorps polyclonaux (bioMérieux) :
anticorps polyclonal de lapin 196 ( anti-pept ide MRP 14 ) anticorps polyclonal de lapin 79 (anti-protéine recombinante GM2AP) . anticorps monclonaux (bioMérieux) : - 4A7B10 - 5H7C10 - 2B9H2 - 10E11A11 - 13H9C9 - 19C11C10 - 13D1E5 - 2G12H5
Anticorps monoclonaux anti-GM2AP : 10E11A11, 13D1E5, 13H9C9, 19C11C10, 2G12H5. Les souris ont été immunisées selon le protocole suivant : au jour J0 injection intrapéritonale de 75 μg du complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund complet. Aux jours J23, J37 nouvelle - injection intrapéritonéale de la même quantité de complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund imcomplet. Quatre jours avant la fusion faire une injection intraveineuse de 50 μg d'antigène GM2AP dilué en eau physiologique. 1900 surnageants ont été criblés par technique d' ELISA indirect. Les plaques ont été « coatées » avec 100 μl d'antigène (le complexe GM2AP-MRP14) à lμg/ml en tampon bicarbonate 0.05M, pH 9.6. Les plaques « coatées » ont été incubées une nuit à la température de 18-22°C. Les plaques ont été saturées avec 200μl de PBS-lait 1% et soumises à incubation 1 heure à 37°+/-2°C. 100 μl de surnageants ou de liquide d'ascites dilués en tampon PBS-tween 20, 0.05% ont été ajoutés et les plaques ont été incubées 1 heure à 37°+/- 2°C. 100 μl d'anticorps polyclonal de chèvre anti-Ig(H+L) de
souris conjugué à la phosphatase alcaline (Jackson Immunoresearch réf : 115-055-062) , dilué en tampon PBS-BSA 1% au 1/2000, ont été ajoutés et les plaques ont ensuite été incubées 1 heure à 37°+/-2°C. lOOμl de PNPP (Biomérieux réf 60002990) à la concentration de 2mg/ml dans de la DEA-HCL (Biomérieux réf 60002989), pH=9,8, ont été ajoutés. Les plaques ont été soumises à incubation pendant 30 minutes à 37°+/-2°C. La réaction a été bloquée par addition de 100 μl de NaOH, IN. Trois lavages sont effectués entre chaque étape avec 300μl de PBS-tween 20, 0,05%. Un lavage supplémentaire en eau distillée est effectué avant d'ajouter le PNPP. 150 surnageants se sont révélés positifs en ELISA indirect avec une DO > 0.9. Après les tests de spécificité les cinq anticorps précités sont produits. Anticorps monoclonaux anti-MRPl4 : 2B9H2, 4A7B10, .5H7C10. Les souris ont été immunisées selon le protocole suivant : au jour J0 une injection intrapéritonéale de 75 μg du complexe GM2AP-MRP14 en présence d'adjuvant de Freund complet. Aux jours J23 et J37 injection intrapéritonéale de Aa même quantité de complexe en présence d'adjuvant de Freund incomplet. Quatre jours avant la fusion une injection intraveineuse de 50 μg d'antigène MRP14 dilué en eau physiologique . 1100 surnageants ont été testés et criblés par la technique d' ELISA indirect, telle que décrite ci-dessus. 300 surnageants se sont révélés positifs avec une DO >1. Après les tests de spécificité les trois anticorps précités sont produits . Anticorps polyclonal de lapin 79 (anti-protéine recombinante GM2AP) . Les lapins ont été immunisés selon le protocole suivant : au jour JO, lère prise de sang de 10 ml, 75 μg de GM2AP ont été injectés par voie intrapéritonéale en présence
d'adjuvant de Freund complet (AFC) (75 μg d' immunogene + qsp 0,5 ml d'eau physiologique 9°/oo + 0,5 ml AFC). Aux jours J28 et J56 la même quantité d' immunogene a été injectée par voie intrapéritonéale dans les mêmes conditions en présence de 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet (AFI) . Au jour J63 une 2eme prise da sang de 30 ml a été effectuée à l'oreille sans anticoagulant . Une 3*me prise de sang a été effectuée dans les mêmes conditions au jour J70. Anticorps polyclonal de lapin 196 (anti-peptide MRP14) . Les lapins ont été immunisés selon le protocole suivant : Les lapins ont été immunisés selon le protocole suivant : au jour JO, lere prise de sang de 10 ml, 80 μg d' immunogene ont été injectés par voie intrapéritonéale en présence d'adjuvant de Freund complet (AFC) (80 μg d' immunogene + qsp 0,5 ml d'eau physiologique 9°/004- 0,5 ml AFC) . Aux jours J28 et J56 la même quantité d' immunogene a été injectée par voie intrapéritonéale dans les mêmes conditions en présence de 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet (AFI) . Au jour J63 une 2ême prise de sang de 30 ml a été effectuée à l'oreille sans anticoagulant. Une 3ème prise de sang a été effectuée dans les mêmes conditions au jour J70. Ces anticorps sont utilisés en capture ou en détection. Quand ils sont utilisés en détection dans le test sandwich ELISA, les anticorps sont biotinylés. (ii) Test ELISA sandwich: Le traitement des échantillons (protéinase K et précipitation TCA) , s'il a lieu, est réalisé après la nuit d'incubation à 4 °C et avant le test de détection ELISA sandwich. L'anticorps de capture est « coaté » à 1 μg en tampon carbonate-bicarbonate (50mM) pH 9.5, 100 μl sont
déposés dans les puits d'une microplaque à 96 puits. La plaque est recouverte d'un film protecteur et incubée une nuit à température ambiante. Après 3 lavages en PBS (Phosphate Buffered Saline) Tween 0,05%, les sites non spécifiques sont bloqués par PBS Tween 0,05%, sérum de chèvre (1/10°) pour les anticorps monoclonaux ou 100 μl d'hydrolysat de caséine pour les anticorps polyclonaux. Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, les échantillons traités ou non sont déposés à raison de 100 μl par puits et incubés ainsi 1 heure 30 minutes à 37 °C sous agitation. Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 μl d'anticorps de détection biotinylés à 1 μg/ml sont déposés dans chaque puits et incubés 1 heure 30 minutes à 37 °C. Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 μl de streptavidine couplée à la HRP (peroxydase de raifort) à 0,2 μg/ml sont déposés dans chaque puits et incubés 1 heure 30 minutes à 37 °C afin d'amplifier le signal. Après 3 lavages en PBS Tween 0,05%, 100 μl de solution d'OPD (dihydrochlorure d' orthophenylène diamine) à 2 g/1 sont déposés dans chaque puit et incubés 10 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée avec 100 μl de H2S04 IN. La lecture de la densité optique est effectuée à 492 nm. De la même façon pour la production d' anticorps anti- hétérocomplexe on utilise l'hérérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRPl4 comme immunogene pour immuniser des souris BALB/c par injection par voie intrapéritonéale. La première injection est réalisée avec de l'adjuvant complet de Freund. Les autres injections sont réalisées à 4-8 semaines d'intervalle avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Un dernier rappel est effectué quelques jours avant la fusion en eau physiologique. Après ce rappel on prélève les rates des souris immunisées et on recueille les splénocytes. Puis on réalise la fusion des cellules
spléniques avec des cellules d'une lignée myélomateuse et on sélectionne les cellules sécrétant des anticorps qui reconnaissent en ELISA l'hétérocomplexe utilisé pour l'immunisation. On sélectionne finalement les clones produisant des anticorps spécifiques de l'hétérocomplexe immun, c'est à dire qui ne reconnaissent pas ni GM2AP, ou GM2AP mutée, ni MRP14, seuls.
Exemple 10 : Détection de l'hétérocomplexe recombinant humain. Les dosages immuno-enzymatiques de l'activité gliotoxique caractérisée moléculairement dans les exemples précédents passent par un système antigène/anticorps mettant seulement en jeu les protéines impliquées (les protéines GM2AP, GM2AP mutée et MRP14) et par des anticorps (seuls ou en association) capables de détecter ce complexe moléculaire . Le complexe recombinant correspond à l'association des surnageants de protéines recombinantes GM2AP (1000 ng) et MRP14 (50 ng) associées à 50 μg/ml final de ganglioside GM2. (i) Détection de l'hétérocomplexe gliotoxique recombinant sans traitement à la protéinase K. Afin de savoir si les combinaisons toxiques étaient directement détectables, les protéines recombinantes « humaines » MRP14 et GM2AP sont combinées avec le ganglioside GM2, incubées une nuit à 4°C et testées par le test ELISA sandwich en utilisant les anticorps anti-MRP14 et anti-GM2AP. Les combinaisons [MRP14, GM2AP et ganglioside GM2] sont diluées dans des urines normales (non gliotoxiques dans le test de toxicité MTT) . Les résultats sont présentés dans le tableau 6. Ces résultats montrent que des couples d' anticorps de capture anti-GM2AP/détection anti-MRP14
reconnaissent le complexe recombinant de façon extrêmement reproductible. Les résultats sont présentés dans le tableau 6.
Tableau 6
(ii) Détection de l'hétérocomplexe gliotoxique recombinant après traitement à la protéinase K. Comme décrit précédemment, l'activité gliotoxique résiste à la protéinase K. Aussi, en traitant les échantillons (combinaison GM2AP+MRP14+GM2) à la protéinase K, les protéines non complexées sont détruites, et le bruit de fond est diminué. Comme dans la partie précédente," les combinaisons sont incubés à 4°C durant une nuit. Mais avant de les tester, les échantillons sont traités à la protéinase K et précipités au TCA (acide trichloroacétique) , suivant le protocole décrit dans l'exemple 8 (ii) .
Les résultats sont présentés dans le tableau 7. Ces résultats montrent notamment que les couples de capture anti-MRPl4/détection anti-GM2AP [4A7B10+5H7C10] / [13H9C9+19C11C10 ] , [4A7B10+5H7C10] /10E11A11, 2B9H2/10E11A11 et 2B9H2/ [13H9C9+19C11C10] détectent le complexe recombinant dans les surnageants dilués dans les urines, après traitement à la protéinase K, de façon extrêmement reproductible. Le bruit de fond est significativement atténué .
Tableau 7
Exemple 11 : Détection de l'hétérocomplexe dans les urines de patients . La détection directe du complexe dans les urines de patients a été testée sur deux urines représentatives: une urine SEP et une urine normale .
Les résultats sont décrits le tableau 8. Ces résultats montrent que les couples d'anticorps de capture anti-MRPl4/détection anti-GM2AP [4A7B10+5H7C10] / [13D1E5+2G12H5] , [4A7B10+5H7C10 ] /10E11A11, 2B9H2/ [13D1E5+2G12H5] et 2B9H2/ [13H9C9+19C11C10] détectent le complexe .
Tableau 8
Pour les urines traitées à la protéinase K, il n'y a pas de concentration avec le TCA
Les procédés décrits dans les exemples sont utiles comme outils de diagnostic, permettant le dosage d'un marqueur biologique de la sclérose en plaques, puisque les corrélations entre l'activité gliotoxique et la clinique se sont avérées très bonnes1'3'4.
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Claims
1. Facteur cytotoxique isolé, associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MRP14 dans lequel GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2.
2. Procédé de détection et/ou de quantification d'un facteur cytotoxique, associé à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, selon lequel on isole dudit échantillon biologique un hétérocomplexe choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MRP14 dans lequel GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2.
3. Procédé selon la revendication 2, selon lequel on isole l'hétérocomplexe à l'aide d'au moins un anticorps qui se lie spécifiquement à l'hétérocomplexe, et on détecte et/ou quantifie ledit facteur cytotoxique par la mise en évidence de la formation d'un complexe constitué"~'par l'hétérocomplexe et l'anticorps.
4. Procédé selon la revendication 3, selon lequel on isole l'hétérocomplexe à l'aide d'au moins deux anticorps qui se lient spécifiquement à l'hétérocomplexe, et on détecte et/ou quantifie ledit facteur cytotoxique par la mise en évidence de la formation d'un complexe constitué par l'hétérocomplexe et les deux anticorps.
5. Procédé selon la revendication 4, selon lequel au moins l'un desdits anticorps est un anticorps de capture et au moins l'autre desdits anticorps est un anticorps de détection.
6. Procédé selon la revendication 2, selon lequel on isole l'hétérocomplexe à l'aide d'au moins deux anticorps dont au moins l'un se lie spécifiquement à GM2AP ou GM2AP mutée de l'hétérocomplexe, et au moins l'autre se lie spécifiquement à MRP14 de l'hétérocomplexe, et on détecte et/ou quantifie ledit facteur cytotoxique par la mise en évidence de la formation d'un complexe constitué par l'hétérocomplexe et les deux anticorps.
7. Procédé selon la revendication 6, selon lequel au moins l'un desdits anticorps est un anticorps de capture et au moins l'autre desdits anticorps est un anticorps de détection.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendication 2 à 7, selon lequel l'échantillon à tester est soumis à un traitement préalable comprenant : une étape de digestion des protéines de l'échantillon par la protéinase K, une étape d' inactivation de la protéinase K, et une étape de neutralisation du pH.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape d' inactivation de la protéinase K est réalisée par précipitation à l'acide trichloroacétique, et l'étape de neutralisation du pH est réalisée par addition d'un tampon tris-maléate .
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel l'échantillon biologique est choisi parmi le sérum, le plasma, l'urine et le liquide céphalorachidien.
11. Composition pour la détection et/ou de quantification d'un facteur cytotoxique associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MRP14 dans lequel GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps qui se lie spécifiquement à l'hétérocomplexe.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps qui se lient spécifiquement à l'hétérocomplexe.
13. Mélange réactionnel pour la détection et/ou de quantification d'un facteur cytotoxique associé à la sclérose en plaques, ledit facteur cytotoxique étant choisi parmi l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 et GM2AP mutée/GM2/MR 14 dans lequel GM2AP mutée correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, caractérisée en ce qu'il comprend au moins deux anticorps dont au moins l'un se lie spécifiquement à GM2AP ou GM2AP mutée de l'hétérocomplexe et au moins l'autre se lie spécifiquement à MRP14 de 1' hétérocomplexe.
14. Mélange réactionnel selon la revendication 13 caractérisé en ce que au moins l'un desdits anticorps est un anticorps de capture et au moins l'autre desdits anticorps est un anticorps de détection.
15. Complexe comprenant l'hétérocomplexe GM2AP/GM2/MRP14 ou GM2AP mutée/GM2/MRPl4, ledit hétérocomplexe étant lié à au moins deux anticorps, dont au moins l'un des anticorps est spécifique de GM2AP ou de GM2AP mutée et au moins l'autre anticorps est spécifique de MRP14.
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| MALCUS-VOCANSON C ET AL: "Glial toxicity in urine and multiple sclerosis", MULTIPLE SCLEROSIS, vol. 7, no. 6, December 2001 (2001-12-01), pages 383 - 388, XP009034098, ISSN: 1352-4585 * |
| MENARD ARMELLE ET AL: "A gliotoxic factor and multiple sclerosis", JOURNAL OF THE NEUROLOGICAL SCIENCES, vol. 154, no. 2, 5 February 1998 (1998-02-05), pages 209 - 221, XP002289708, ISSN: 0022-510X * |
| RIEGER F ET AL: "UN FACTEUR GLIOTOXIQUE ET LA SCLEROSE EN PLAQUES GLIOTOXICITY IN MULTIPLE SCLEROSIS", COMPTES RENDUS DES SEANCES DE L'ACADEMIE DES SCIENCES. SERIE III: SCIENCES DE LA VIE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 319, no. 4, 1 April 1996 (1996-04-01), pages 343 - 350, XP000602023, ISSN: 0764-4469 * |
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