TW202405005A

TW202405005A - 人源化醣基化gm2ap抗體

Info

Publication number: TW202405005A
Application number: TW112126328A
Authority: TW
Inventors: 陳水田; 林子文
Original assignee: 浩峰生物科技股份有限公司
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2023-07-14
Publication date: 2024-02-01
Also published as: WO2024012583A1

Abstract

本揭露內容係揭示能結合至醣基化抗原GM2AP-GF的抗體。本揭露內容亦提供包含此抗體的醫藥組合物，以及此類抗體的治療與診斷用途。

Description

人源化醣基化GM2AP抗體

本揭露內容係揭示能結合至醣基化抗原GM2AP-GF的抗體。本申請亦提供包含此抗體的醫藥組合物，以及此類抗體的治療與診斷用途。

肺癌在全世界癌症相關死亡原因中排名第一，占2013年美國所有男性癌症死亡人數的28%，所有女性癌症死亡人數的26%。一般可將肺癌分為兩個主要類型：小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）及非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），分別占肺癌的15%及85%。NSCLC係由三種主要組織學亞型組成：腺癌、鱗狀細胞癌及大細胞肺癌。由於缺乏有效早期偵測的工具，對於末期癌症又無法有效治療，肺癌的5年存活率只有15%。因此，對肺癌患者來說，要接受適當而具有成效的治療，早期偵測是必要且有利的。

GM2活化蛋白質（GM2-activator protein，GM2AP）是一種小的單體蛋白質，包含一用於Asn連結醣基化的單一位置。GM2AP合成出來之後在 ³²Ser位置經過醣基化、修飾、切割後，才成為成熟型式。成熟的GM2AP是一種去醣基化形式（deglycosylated form）的醣蛋白質，其分子量為17.6kDa。扮演輔助因子的GM2AP包含至少三項功能性特徵：一被稱為β-cup結構的疏水性作用區域、一寡糖結合位置，以及一會與HexA相互作用的區域。前述會與Hex A相互作用的區域可使GM2神經節苷脂（ganglioside）透過溶酶體氨基已糖酯酶A（lysosomal β-hexminidase A，Hex A）分解成GM3。然而，所合成的GM2AP只有三分之一會被分泌出去。可透過多種細胞（如表皮角質細胞和纖維母細胞）中某種與碳水化合物無關的機制（carbohydrate-independent mechanism）將GM2AP再捕捉到細胞內。缺乏具有功能的GM2AP會使GM2神經節苷脂在罹患AB型GM2神經節苷脂症（gangliosidosis，一種嚴重的溶小體儲存疾病）之患者的組織中產生異常堆積。遺傳性GM2AP缺乏也與神經節苷脂含量的變化、以及與癌症病程相關之腫瘤相關神經節苷脂（tumor-associated ganglioside）含量的變化有關。腫瘤相關神經節苷脂是起始致癌基因轉型的結果，在引發侵犯及轉移的過程中扮演一定的角色。腫瘤細胞會合成神經節苷脂，並將之釋放到其微環境中，而使血清中腫瘤相關神經節苷脂的含量增加。此外，目前已知神經節苷脂在細胞生長、貼附、細胞-細胞相互反應及訊息傳遞方面都扮演調控的角色。

本揭露內容之一目的係提供一種新穎的抗體，其對醣修飾（醣基化）之GM2AP抗原（glycosylated GM2AP, GM2AP-GF）具有高親和力，但對無醣基修飾之GM2AP抗原（non-glycosylated GM2AP, GM2AP）無親和力或僅具低親和力，亦即具有高選擇性。此具高選擇性的抗體預測對肺癌細胞有標記或治癒效果。本揭露內容之另一目的係提供包含此抗體的醫藥組合物，以及此類抗體的治療與診斷用途。

為了達成上述目的，本揭露內容提供一種經分離的抗體，包含： V _HCDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:9、15、21或27； V _HCDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:10、16、22或28； V _HCDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:11、17、23或29； V _LCDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:12、18、24或30； V _LCDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:13、19、25或31；以及 V _LCDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:14、20、26或32。

本揭露內容亦提供一種經分離的抗體，其中V _H包含具有與SEQ ID NO:1、3、5或7至少90%等同度之序列；以及V _L包含具有與SEQ ID NO:2、4、6或8至少90%等同度之序列。

本揭露內容又提供一種醫藥組合物，其包含前述經分離的抗體及醫藥上可接受的載體。

接著，本揭露內容提供一種經分離之多核苷酸，其編碼前述之經分離的抗體。在某些實施例中，該多核苷酸包含第一序列，其具有與SEQ ID NO:1、3、5或7至少90%之等同度，其編碼抗體之V _H；以及第二序列，其具有與SEQ ID NO:2、4、6或8至少90%之等同度，其編碼抗體之V _L。

本揭露內容亦提供一種包含前述之多核苷酸之載體。

本揭露內容更提供一種治療肺癌之方法，包含：投予有需要之個體有效劑量之前述經分離的抗體。

對於本文和所附請求項中的描述，單數形式「一（a）」和「一個（an）」包括複數指示物，除非上下文另有明確指示。因此，例如，「一蛋白質」係指包括多於一種蛋白質，且「一化合物」係指多於一種化合物。「包含（comprise）」、「包含（comprises）」、「包含（「comprising）」、「包括（include）」、「包括（includes）」、「包括（including）」的使用是可互換的，而非限制性的。更應理解的是，各具體實施例之描述中，使用術語「包括（comprising）」的情況下，本領域通常知識者將理解，在一些特定情況下，可以使用語言「基本上由......組成」或「由......組成」替代。

當提供一定範圍的數值，除非上下文另有明確規定，否則應當理解，該數值區間的整數以及該數值區間的每個整數的十分之一，介於該範圍的上限與下限之間，以及在該範圍內的任何其他陳述值或中間值，都涵蓋在本揭露內容內。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在該較小範圍內，同時也包含在本揭露內容內，受限於所述範圍內的任何特別排除的限制。當陳述的範圍包括該限制的一或二者，排除這些限制之（i）或（ii）的範圍也包括在本揭露內容中。例如，「1至50」包括「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。

所有文獻、專利、專利申請案和本揭露內容中引用的其他文件，皆完整併入本文以作為參考資料，其內容如同每一獨立文獻、專利、專利申請案或其他文件所分別指出，皆併入本文以作為參考目的。

應當理解的是，包括附圖，以上一般性描述和以下詳細描述僅是示範性和解釋性的，並非用於限制本揭露內容。

本文描述中使用的技術和科學術語將具有本領域通常知識者通常理解的含義，除非另有明確定義。

術語「抗體」於此係包括完整抗體，以及其任一抗原結合片段（即「抗原結合部分」）或其單鏈。「抗體」係指一醣蛋白，包含透過雙硫鍵相互連結的至少二重（H）鏈與二輕（L）鏈，或其抗原結合部位。每條重鏈由重鏈可變區（於此縮寫為V _H）和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（於此縮寫為V _L）和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。V _H和V _L區可進一步細分為稱作互補決定區（CDR）的高度變異區，並穿插有更具保留性的區域，稱為框架區（FR）。每個V _H和V _L由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞（例如效應細胞）和典型之補體系統的第一成分（C1q）。

框架區域與CDR之內容係依據Kabat等人（請見Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991），以及ImMunoGeneTics數據庫（IMGT）（請見Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001；以及線上imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg）定義。

「Kabat系統」在本揭露內容中表示根據Kabat（1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH publication no. 91- 3242U.S. Department of Health and Human services），以及Chothia （1987; J. Mol. Biol. 196, 901-917）方式編號胺基酸的標準。此編號系統被本領域通常知識者廣泛使用，其係以對抗原結合活性相當重要的可變結構域序列之序列變異性和三維環部分為基礎。在Kabat系統中，輕鏈或重鏈的所有胺基酸皆具有明確的位置；即Kabat系統適用於CDR以及框架區域。任何抗體的特定胺基酸位置可根據Kabat系統進行編號。根據Kabat系統辨識V _H和V _L鏈的CDR區之規則顯示於www.bioinf.org.uk/abs.。

術語「抗原結合片段」於此是指一抗體片段，例如雙抗體、Fab、Fab'、F（ab’） ₂、Fv片段、雙硫鍵穩定化Fv片段（dsFv）、（dsFv） ₂、雙特異性dsFv （dsFv- dsFv’）、雙硫鍵穩定化雙抗體（ds diabody）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv雙體（雙價雙抗體）、由包含一或多個CDR的抗體部分形成的多特異性抗體，或結合至抗原但不包含全長或完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段可結合至與原始抗體或原始抗體片段（如原始scFv）相同的抗原。在某些具體實施例中，抗原結合片段可包含來自特定人類抗體的一或多個CDR，其與來自一或多個不同人類抗體的框架區嫁接。

在上述抗原結合片段中，Fab具有輕鏈和重鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈第一恆定區（CH1）之結構，並具有一個抗原結合位置。Fab’ 不同於Fab之處在於Fab’具有一鉸鏈區（hinge region），在重鏈CH1結構域的C端包括至少一個半胱胺酸殘基。當Fab'的鉸鏈區之半胱胺酸殘基經由二硫鍵連接時，會產生F（ab’） ₂。

Fv是最小的抗體片段，僅具有重鏈可變區和輕鏈可變區。用於產生Fv片段的重組技術在本領域中為已知。「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由輕鏈可變區和重鏈可變區組成的改造抗體，該輕鏈可變區和重鏈可變區直接或經由胜肽連結序列彼此連接。雙鏈Fv可具有其中重鏈可變區經由非共價鍵與輕鏈可變區連接的結構。單鏈Fv通常可以形成如在雙鏈Fv中的二聚體結構，其中重鏈可變區經由胜肽連結片段共價結合至輕鏈可變區，或是重鏈和輕鏈可變區在其C-端彼此直接連接。連結片段可為包括1至100，或2至50個胺基酸的胜肽連結片段，且其合適序列在本領域中為已知。

抗原結合片段可使用蛋白酶獲得（例如，可用木瓜蛋白酶切割完整抗體以獲得Fab片段，或可用胃蛋白酶切割以獲得F（ab’） ₂片段），或可藉由基因重組技術來製備。

「經分離的抗體」，例如特異性結合GM2AP-GF的經分離的抗體會對其他抗原，如來自其他物種的GM2AP-GF分子，具有交叉反應性。亦可能會對類似抗原GM2AP具有反映性。此外，經分離的抗體可實質上不含其他細胞材料，及/或化學物質。

術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」於此係指具均質分子組成的抗體分子製劑。單株抗體組成物展現出對特定表位的單一結合特異性與親和力。

術語「人類抗體」於此係指其可變區之框架區和CDR區均衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。此外，如果該抗體含有恆定區，該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。本揭露內容之人類抗體可包括非衍生自人類免疫球蛋白序列編碼的胺基酸（例如經由體外隨機或位點特異性突變或經由體內體細胞突變引入的突變）。然而，術語「人類抗體」於此並不包括衍生自另一種哺乳動物物種（如小鼠）的CDR序列移植到人類框架序列上的抗體。

術語「人類單株抗體」是指展現單一結合特異性，且其可變區之框架區和CDR區均衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。

術語「重組人類抗體」於此包括所有經由重組技術製備、表現、產生或分離的人類抗體，例如（a）從用於人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體的動物（例如小鼠）分離的抗體或由其製備的融合瘤（下面進一步描述），（b）從宿主細胞分離的抗體，該宿主細胞係經轉化而用於表現人類抗體，例如來自轉染瘤，（c）由重組、組合性人類抗體庫分離出的抗體，以及（d）以涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他技術製備、表現、產生或分離的抗體。此種重組人類抗體具有可變區，其中框架區和CDR區衍生自人類免疫球蛋白序列。然而，在某些具體實施例中，可對於此類重組人類抗體進行體外突變（或者當使用人類Ig序列轉殖的動物時，進行體內體細胞突變），且因此，重組人類抗體的V _H和V _L區胺基酸序列，雖然係衍生自且相關於人類種系V _H和V _L，可能非天然存在於體內人類抗體種系庫內者。

術語「人源化抗體」係指由非人類物種所產生的抗體，並包含已被修飾以增加它們與人類天然產生的抗體變異物之相似性的蛋白質序列。當在人類中使用非人類來源的抗體時，人源化過程是必要的，以避免不欲免疫原性效應。相較之下，術語「嵌合性抗體」於此係指經由將來自某一物種的抗原結合區（即V _H和V _L）與來自另一物種的恆定區互相融合的抗體。

術語「K _assoc」或「K _a」於此係指一特定抗體-抗原相互作用的結合率，術語「K _dis」或「K _d」於此係指一特定抗體-抗原相互作用的解離率。術語「K _D」於此表示解離常數，其由K _d與K _a的比率（即K _d/K _a）獲得，並以莫耳濃度（M）表示。可使用本領域中已建立的方法來測定抗體的K _D值。

於本文中所述，抗體「醣基化修飾之GM2活化蛋白」係指該抗體與GM2AP-GF的結合常數 K _D小於1×10 ^-7M、小於1×10 ^-8M、小於1×10 ^-9M、小於1×10 ^-10M、小於1×10 ^-11M或更低。

實施例一 人源化醣基化 GM2AP 抗體之製備

產生及選擇對醣基化GM2AP抗原具有專一性之人源化抗體

此實例展現對醣基化GM2AP具有專一性之人源化抗體之產生。簡言之，以GM2AP-GF以及GM2AP抗原蛋白，自臺灣財團法人生物技術開發中心（Development Center for Biotechnology, DCB）擁有的全合成人源抗體庫DSyn 2.1進行抗體淘選（bio-panning）。

1. 淘選

用緩衝液稀釋GM2AP-GF及GM2AP抗原後，轉移至ELISA盤，於4℃下反應1晚。以PBS洗滌，加入MPBS與噬菌體反應，之後進行顯色與回收。

將回收的噬菌體加入大腸桿菌TGI菌液中反應，鋪在2YT-AG培養基上培養。刮去培養基上的細菌，加入2YT-AG培養基至菌液中，培養至OD600約0.5。加入輔助噬菌體反應。離心除去上清液，加入2YT-AK培養基重新溶解並培養。離心取上清液，加入PEG/NaCl混勻，然後再次離心。去除上清液，用PBS重新溶解沉澱，得到下一輪的噬菌體庫。每輪重複上述步驟。

2. 用於篩選的噬菌體 ELSIA

挑取細菌至96孔板中培養（每孔含2YT-AG培養基）。取菌液加入2YT-A培養基中再次培養。加入輔助噬菌體反應。添加2YT-AK培養基再次培育（噬菌體庫）。同時將GM2AP-GF和GM2AP以緩衝液稀釋後轉移至ELISA盤反應。用PBS洗滌後，加入MPBS、噬菌體庫反應。用PBST洗滌後，添加噬菌體綴合緩衝液反應。用PBST洗滌後，加入TMB反應。加入緩衝停止液後，以OD450量測。

3. 將人類 IgG1 基因複製到蛋白質表達載體

以專為噬菌體上的VH和VL設計的特異性引物（specific primer），通過PCR製備各IgGl的插入DNA。蛋白表達載體與限制酶DraIII-HF和BsiWI-HF反應，然後通過凝膠萃取試劑盒純化。添加NheI-HF和MluI-HF並反應。DNA連接反應由T4 DNA聚合酶介導，將連接的質體轉化至DH5α宿主中進行分離和放大。

4. 人類 IgG1 抗體的暫時性表達（ transient expression ）

將純化的表達質體溶解在NaCl溶液中。將聚乙烯亞胺（PEI）溶解在NaCl溶液中。混合兩種溶液，並在室溫下靜置。將混合液放入預先裝有Freestyle293細胞培養物的125ml搖瓶中，培養4次後補充新鮮培養基。將轉染的細胞放入軌道振盪培養箱中培養7～8天後，收集細胞培養上清液離心並過濾。

5. 純化人類 IgG1 抗體，並以 SDS-PAGE 檢查蛋白質品質

6. 酶聯免疫吸附試驗 ELISA

用緩衝液將抗原稀釋至4 μg/ml。將100 μl溶液添加至96 孔ELISA 盤後，放入4°C冷藏過夜。96孔ELISA盤用300μl PBS洗滌3次，然後加入300 μl 脫脂牛奶-磷酸鹽緩衝液（MPBS），37℃反應2小時。將每種抗體透過3倍系列稀釋液，獲得12個點（第1個點是10 ^-7M）。連續添加100μl的系列稀釋樣品於96孔盤中，並在37°C下反應90分鐘。用300μl PBS洗滌3次，加入100μl綴合緩衝液，於37℃下反應1小時。用300μl PBS洗滌3次後，加入100μl TMB，37℃反應 10分鐘。最後添加100 μl緩衝停止液並測量OD450與OD655。

實施例二 GM2AP-GF 與 GM2AP ELISA 親和力測試

利用DSyn2.1人源抗體庫篩選抗GM2AP-GF之抗體，經過3～4回合的淘選後，結果如圖1所示。顯示在第3c、4Ca、4Cb回合中，相較於控制組（抗原GM2AP），表現單鏈抗體之噬菌體群對實驗組（抗原GM2AP-GF）有較高之ELISA值，OD ₄₅₀-OD ₆₅₅約為2.0～2.7，且實驗組與控制組（抗原GM2AP）訊號有明顯差異，推測此些噬菌體群中可能含有對GM2AP-GF具親和力的單鏈抗體。

將篩選出的噬菌體群（3a, 3b, 3c及4Ca）進行單一噬菌體ELISA assay試驗，以挑選出可辨認GM2AP-GF的噬菌體。總共篩選出288株，經定序後獲得13種抗體序列，如表1-1、1-2所示（皆以Kabat系統表示）。

表1-1 重鏈（Heavy chain）

#	ID	CDRH1	CDRH2	CDRH3	完整序列
1	GM2AP-GF3B-2A1	GFTFSSYYMH （SEQ ID NO:9）	TIYPYSGNTYYADSVKG （SEQ ID NO:10）	SFAY （SEQ ID NO:11）	SEQ ID NO:3
2	GM2AP-GF3B-2A12	GFTFRDYGMS （SEQ ID NO:15）	TIKPDDSNIYYADSVKG （SEQ ID NO:16）	NFVY （SEQ ID NO:17）	SEQ ID NO:7
3	GM2AP-GF3B-2A2	GFTFSSTWMG （SEQ ID NO:21）	YISPDDRSTGYADSVKG （SEQ ID NO:22）	STHMQKQPWVMDY （SEQ ID NO:23）	SEQ ID NO:5
4	GM2AP-GF3B-A9	GFTFSTSAMH （SEQ ID NO:27）	VISGSGSKIYYADSVKG （SEQ ID NO:28）	TYSMKYGMDY （SEQ ID NO:29）	SEQ ID NO:1
5	GM2AP-GF3A-F3	GFTFNNHAMH （SEQ ID NO:33）	SIKPSGSYTYYADSVKG （SEQ ID NO:34）	KPERGFGY （SEQ ID NO:35）
6	GM2AP-GF3B-2A10	GFTFSDYWMT （SEQ ID NO:36）	VISSNGTKTYYADSVKG （SEQ ID NO:37）	FRTFSRGRYAMDY （SEQ ID NO:38）
7	GM2AP-GF3B-2A7	GFTFSTYDMG （SEQ ID NO:39）	YIRPDGSNTHYADSVKG （SEQ ID NO:40）	HYQIWNRSVMDY （SEQ ID NO:41）
8	GM2AP-GF3B-2B12	GFTFRETGMG （SEQ ID NO:42）	IISGSGGRTNYADSVKG （SEQ ID NO:43）	NHRVFGKWVMDY （SEQ ID NO:44）
9	GM2AP-GF3B-2C9	GFTFSNYGMG （SEQ ID NO:45）	IIYDSSSTIYADSVKG （SEQ ID NO:46）	HYHVGDRAVMDY （SEQ ID NO:47）
10	GM2AP-GF3B-2H2	GFTFSTYAMG （SEQ ID NO:48）	IISGYGSYTYYADSVKG （SEQ ID NO:49）	GRPTGYYAGPILDV （SEQ ID NO:50）
11	GM2AP-GF3B-A11	GFTFSQTAMG （SEQ ID NO:51）	IISPKGGWKNYADSVKG （SEQ ID NO:52）	SYGMRWKSVMDY （SEQ ID NO:53）
12	GM2AP-GF4Ca-C1	GFTFTSYYMA （SEQ ID NO:54）	MINPDGGNTNYADSVKG （SEQ ID NO:55）	KRFMAPTYVMDY （SEQ ID NO:56）
13	GM2AP-GF4Ca-E1	GFTFSSYAMS （SEQ ID NO:57）	AIRPSGSSTYYADSVKG （SEQ ID NO:58）	LSKYIGGGFDV （SEQ ID NO:59）

表1-2 輕鏈（Light chain）

#	ID	CDRH1	CDRH2	CDRH3	完整序列
1	GM2AP-GF3B-2A1	RASQSIGTYLA （SEQ ID NO:12）	VASNLQS （SEQ ID NO:13）	QQYNNYPMT （SEQ ID NO:14）	SEQ ID NO:4
2	GM2AP-GF3B-2A12	RASQSVGTYLA （SEQ ID NO:18）	AVTNLQS （SEQ ID NO:19）	QQYSTYPIT （SEQ ID NO:20）	SEQ ID NO:8
3	GM2AP-GF3B-2A2	RASQVISTNLN （SEQ ID NO:24）	RASKLQS （SEQ ID NO:25）	QQRYSYPRT （SEQ ID NO:26）	SEQ ID NO:6
4	GM2AP-GF3B-A9	RASQGTNSYLH （SEQ ID NO:30）	DASNLQS （SEQ ID NO:31）	MQIGSWPPT （SEQ ID NO:32）	SEQ ID NO:2
5	GM2AP-GF3A-F3	RASQSINNYLN （SEQ ID NO:60）	GASTLQS （SEQ ID NO:61）	QRTSSYPET （SEQ ID NO:62）
6	GM2AP-GF3B-2A10	RASQSISNNLA （SEQ ID NO:63）	GASHLQS （SEQ ID NO:64）	QQLGTTPFT （SEQ ID NO:65）
7	GM2AP-GF3B-2A7	RASQSVSNNLN （SEQ ID NO:66）	KASRLQS （SEQ ID NO:67）	QQRHNNPRT （SEQ ID NO:68）
8	GM2AP-GF3B-2B12	RASQSINRYLA （SEQ ID NO:69）	AASTLQS （SEQ ID NO:70）	QQYTNSPLT （SEQ ID NO:71）
9	GM2AP-GF3B-2C9	RASQSISSYLA （SEQ ID NO:72）	GASSLQS （SEQ ID NO:73）	QQRNQSPYT （SEQ ID NO:74）
10	GM2AP-GF3B-2H2	RASQSVSSPLA （SEQ ID NO:75）	DASTLQS （SEQ ID NO:76）	QQSNSWPYT （SEQ ID NO:77）
11	GM2AP-GF3B-A11	RASQGISNNLN （SEQ ID NO:78）	DASRLQS （SEQ ID NO:79）	QQYNDFPRT （SEQ ID NO:80）
12	GM2AP-GF4Ca-C1	RASQSISSYLS （SEQ ID NO:81）	DASNLQS （SEQ ID NO:82）	MQYSNSLVT （SEQ ID NO:83）
13	GM2AP-GF4Ca-E1	RASQSISNRLN （SEQ ID NO:84）	GNSILQS （SEQ ID NO:85）	QQYFSSPST （SEQ ID NO:86）

選出的13種序列轉構築成full-IgG1型式的抗體，經小量表現純化後，進行ELISA的專一性和親和力測試，結果如圖2。其中有6株抗體（GF3B-2A1、GF3B-2A12、GF3B-A9、GF3B-2A7、GF3B-2A2、GF4Ca-E1）對GM2AP-GF的OD ₄₅₀-OD ₆₅₅讀值大於0.2，但GF4Ca-E1對GM2AP結合的OD. ₄₅₀-OD ₆₅₅讀值為3，與其對GM2AP-GF的讀值相近，沒有專一性，故排除。抗體GF3B-2A7表現量小於3，且在ELISA OD ₄₅₀-OD ₆₅₅的讀值最低只有0.2，故也排除。最終選出4株抗體：GF3B-2A1、GF3B-2A12、GF3B-A9、GF3B-2A2。

最後使用ELISA進行抗體親和力分析，結果如圖3A～D所示。GF3B-A9（圖3A）和GF3B-A12（圖3B）兩株抗體對GM2AP有較高的背景值，推測可能會辨識GM2AP-GF靠GF位置，或是辨識GM2AP的一小部分位置。

圖3A～D的ELISA親和力分析結果顯示，本揭露內容篩選出的4株抗體，對於醣基化的GM2AP-GF抗原具有較高的親和力，KD值較低，而對未醣化的GM2AP抗原之親和力較差或無親和力，KD值較高或未檢出。因此，此4株抗體對GM2AP-GF具高選擇性。一般而言， KD小於10 ^-7或10 ^-8即表示具有高親和力。此外，本揭露內容的4株抗體，其對GM2AP-GF的KD值皆小於對GM2AP的KD值。

由於此4株抗體對GM2AP-GF具高選擇性，根據文獻Potprommanee L, Ma HT, Chen CH, Aobchey P, Boonyapranai K, et al. （2013） Human Urinary GM2-activator Protein as a Potential Biomarker for Lung Cancer. J Proteomics Bioinform6:264-270.的內容，可預期該些抗體具有對癌化細胞來源之GM2AP蛋白有專一性，可作為生物標記或治療用途。

實施例三 抗體之醫藥組合物

本揭露內容更提供包含本揭露抗體之醫藥組合物。在一具體實施例中，該組成物為用於治療肺癌的醫藥組合物。該肺癌包含但不限於小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）及非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。

在一具體實施例中，該醫藥組合物包含本揭露之抗體與一載劑。該抗體可以 有效量存在於該組成物中以用於達到該組成物的目的。該「有效量」使用於此係指，於一個體中達到所欲效果（如治療肺癌）所需之活性成分的量，不論是單獨或與一或多種其他活性試劑組合。如本領域通常知識者所知，有效量係根據所治療的特定病症、病況的嚴重程度、個體患者參數（包括年齡、身體狀況、體型、性別和體重、治療持續時間、併行治療的性質（若有）、特定的投藥途徑以及健康從業者的知識和專業中的類似因素）而變化。這些因素對於本領域通常知識來說是習知的，並且可以用不超過常規的實驗來解決。通常較佳使用單一成分或其組合的最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。然而，本領域通常知識者應理解的是，出於醫療因素、心理因素或實際上任何其他原因，患者可能堅持較低劑量或可耐受劑量。

此種抗體醫藥組合物可藉由將具有所需純度的本揭露抗體與一或多種載劑混合而製備。典型地，此類抗體醫藥組合物可製備為水性溶液（請見如美國專利號6,171,586與WO2006/044908），或凍乾製劑（請見美國專利號6,267,958）。

用於本揭露抗體醫藥組合物之載劑可為醫藥上可接受之載劑，一般包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、防腐劑、溶劑、分散介質、膜衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑，以及生理上相容的類似物。載劑最好是應適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸胃、脊柱或表皮施用（例如通過注射或輸注）。醫藥上可接受之載劑通常在所使用的劑量和濃度下，對於接受它們的受試者而言是無毒的。

各種此類醫藥上可接受之載劑在本領域中為已知（請見如 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。用於本揭露抗體組成物中之示範性醫藥上可接受之載劑包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲銨氯化物；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(少於約10個胺基酸)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽類之相反離子如鈉；金屬錯合物 (如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑如聚乙二醇(PEG)。

用於本揭露抗體醫藥組合物的醫藥上可接受的載劑尚可包括間隙性藥物分散劑（interstitial drug dispersion），例如可溶性中性-活性透明質酸酶醣蛋白（sHASEGP）（請見如美國專利公開第2005/0260186號與第2006/0104968號），如人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白（如rHuPH20或HYLENEX® , Baxter International, Inc.）。

該組成物可更包括醫藥上可接受之賦形劑，如崩解劑、黏合劑、潤滑劑、防腐劑或其組合。

圖 1說明了以DCB噬菌體庫Dsyn2.1進行抗體淘選的結果。每回合會先經過100 μg/ml GM2AP進行預清潔，去除與GM2AP結合的抗體。每回合塗覆（coating）抗原的濃度為5 μg/ml（實驗組與對照組相同）。各回合右側的長條圖表示GM2AP，左側的長條圖表示GM2AP-GF。

圖 2為以ELISA分析篩選出來的13種抗GM2AP-GF抗體專一性的結果。各抗體中右側的長條圖表示GM2AP，左側的長條圖表示GM2AP-GF。

圖 3為最後選出的4株抗體，其以ELISA進行抗體親和力分析的結果。圖3A-D中，上方的線段表示GM2A-GF，下方的線段表示GM2A。

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Claims

一種經分離的抗體，其包含： V _HCDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:9、15、21或27； V _HCDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:10、16、22或28； V _HCDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:11、17、23或29； V _LCDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:12、18、24或30； V _LCDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:13、19、25或31；以及 V _LCDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO:14、20、26或32。
如請求項1之經分離的抗體，其中該V _HCDR1、V _HCDR2、及V _HCDR3分別為SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11；其中該V _LCDR1、V _LCDR2、及V _LCDR3分別為SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、及SEQ ID NO:14。
如請求項1之經分離的抗體，其中該V _HCDR1、V _HCDR2、及V _HCDR3分別為SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、及SEQ ID NO:17；其中該V _LCDR1、V _LCDR2、及V _LCDR3分別為SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、及SEQ ID NO:20。
如請求項1之經分離的抗體，其中該V _HCDR1、V _HCDR2、及V _HCDR3分別為SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、及SEQ ID NO:23；其中該V _LCDR1、V _LCDR2、及V _LCDR3分別為SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、及SEQ ID NO:26。
如請求項1之經分離的抗體，其中該V _HCDR1、V _HCDR2、及V _HCDR3分別為SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:29；其中該V _LCDR1、V _LCDR2、及V _LCDR3分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、及SEQ ID NO:32。
如請求項1之經分離的抗體，其中V _H包含具有與SEQ ID NO:1、3、5或7至少90%等同度之序列；以及V _L包含具有與SEQ ID NO:2、4、6或8至少90%等同度之序列。
如請求項1至6項中任一項之經分離的抗體，其中該抗體為人源化抗體。
如請求項1至6項中任一項之分離的抗體，其中該抗體為全長抗體或其抗原結合片段。
如請求項8之分離的抗體，其中該抗體為全長抗體，其為IgG分子。
如請求項1-6項中任一項之經分離的抗體，其中該抗體特異性地結合至醣基化修飾之GM2活化蛋白（GM2-activator protein，GM2AP-GF）。
如請求項10之經分離的抗體，其與醣基化修飾之GM2活化蛋白的結合值K _D小於1×10 ^-7M、1×10 ^-8M、小於1×10 ^-9M、小於1×10 ^-10M或更低。
如請求項第10之經分離的抗體，該抗體與GM2活化蛋白的結合值K _D1大於該抗體與醣基化修飾之GM2活化蛋白的結合值K _D2。
如請求項12之經分離的抗體，其中該結合值K _D1、K _D2係以酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）測量。
如請求項1之經分離的抗體，其中該抗體係更綴合至可檢測標記、免疫黏附分子、顯像劑、治療劑、或細胞毒性劑。
如請求項14之經分離的抗體，其中該顯像劑係選自於下列組成之群組：放射線標記、酵素、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記、及生物素。
如請求項14之經分離的抗體，其中該治療劑或細胞毒性劑係選自於下列組成之群組：抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環類、毒素、及細胞凋亡劑。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任一項之經分離的抗體及醫藥上可接受的載體。
如請求項17之醫藥組合物，其中該醫藥上可接受的載體包含緩衝劑、界面活性劑、鹽、胺基酸、抗氧化劑、糖衍生物、或其組合。
一種經分離的多核苷酸，其編碼如請求項1至6項中任一項之抗體；該多核苷酸包含第一序列，其具有與SEQ ID NO:1、3、5或7至少90%之等同度，其編碼抗體之V _H；以及第二序列，其具有與SEQ ID NO:2、4、6或8至少90%之等同度，其編碼抗體之V _L。
一種載體，包含如請求項19之經分離的多核苷酸。